MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE
PRÁCTICAS DE
BIOQUÍMICA Dr. Ricardo Yáñez Ávila
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
Manual de Prácticas de Bioquímica
Dr. Ricardo Yáñez Ávila D.R. © 1996 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ISBN 968-7724-43-9 Primera Edición Impreso en México
PRESENTACIÓN
La actividad editorial desarrollada por el Instituto Politécnico Nacional, está encaminada al cumplimiento de objetivos fundamentales, tales como: el abatimiento del costo de los textos de apoyo para los planes de estudio de las diversas carreras y disciplinas que se cursan en la institución, y el estímulo al profesorado para que su esfuerzo en el campo de la investigación técnica y científica y su experiencia en la cátedra, se plasmen en volúmenes que circulen entre el mayor número de estudiantes, docentes e investigadores. En este contexto, iniciamos la publicación de una nueva colección de libros institucionales de carácter académico y costo reducido, que ofrece a los jóvenes estudiantes de los niveles medio superior y superior un acceso más directo hacia el conocimiento forjado en el esfuerzo y la dedicación de los docentes e investigadores del propio Instituto. Este material bibliográfico especializado, se nutre en parte de trabajos originales de nuestra planta de profesores, lo que reviste la mayor importancia puesto que además de contemplar de forma particular los
aspectos pedagógicos específicos que desarrollan en su práctica diaria, permite incentivarlos y demuestra que en México contamos con la suficiencia científico-técnica que nos permitirá impulsar el desarrollo del país. Este programa editorial pretende abarcar gran parte de las materias que integran el conjunto de planes de estudio del Instituto y reflejar en sus publicaciones la unificación de esfuerzos y voluntades que, sin lugar a dudas, repercutirán en una entusiasta aceptación estudiantil. Además, se inserta en el espíritu que ha distinguido siempre al Politécnico, de realizar la encomiable tarea de llevar el conocimiento científico y tecnológico a los sectores mayoritarios de nuestro país. En un periodo histórico como el que vivimos, esta tarea reviste suma importancia, ya que se hace en extremo urgente extender la ayuda institucional para que nuestros educandos encuentren los apoyos que les faciliten el continuar sus estudios profesionales, tan necesarios para el desarrollo de la nación. Este proyecto editorial seguramente marcará un nuevo rumbo en el proyecto académico del Instituto Politécnico Nacional, e impactará en la educación tecnológica y en el desarrollo integral del México del siglo XXI.
Diódoro Guerra Rodríguez
ÍNDICE DE PRACTICAS
Práctica:
Pág.:
SOLUCIONES.................................... ...................................................3 ELECTROLITOS y pH.......................................................................... 13 SOLUCIONES REGULADORAS......................................................... 23 PROTEÍNAS ........................................................................................ 30 CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS.......................................................41 ENZIMAS ............................................................................................. 51 OXIDACIONES BIOLÓGICAS ............................................................. 59 ÁCIDOS NUCLEICOS..........................................................................68 GLÚCIDOS........................................................................................... 75 FENÓMENOS DE INTERFASE Y SISTEMAS DISPERSOS ................ 85 LÍPIDOS............................................................................................... 98 DIGESTIÓN........................................................................................ 107 METABOLISMO..................................................................................115
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SOLUCIONES En esta práctica se estudiarán las soluciones, formas de expresar su concentración y sus principales propiedades. Se puede definir una solución como un sistema monofásico formado por dos o más sustancias químicas. Un sistema monofásico es aquel que presenta las mismas propiedades físicas y químicas en todas sus partes. Por ejemplo si se mezclan agua y cloruro de sodio (NaCI), el NaCI se distribuye en el solvente (agua), hasta que la concentración sea la misma en cualquier parte de la solución, es decir hasta que se alcanza la homogeneidad. Generalmente se acostumbra denominar soluto a la sustancia que se disuelve o se dispersa molecularmente en otra a la cual se le denomina solvente. Sin embargo, cuando se trata de líquidos miscibles en todas sus proporciones, por ejemplo alcohol y agua, cualquiera de los dos puede ser solvente o soluto. Debido a ésto se acostumbra nombrar solvente al componente que se encuentra en mayor cantidad. La relación que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una solución se llama concentración. Mol. Se define como el peso molecular de una sustancia expresado en gramos, o sea; la masa de una sustancia que contiene el mismo número de átomos o moléculas que hay en 12 g de 12C. Experimentalmente este número es igual a 6.022 x 10 23 (número de Avogadro). La masa molecular o peso molecular (P.M.) de una sustancia es la suma de los pesos atómicos de los componentes de la sustancia; por ejemplo: P.M. del ácido sulfúrico (H2SO4)98gmor 1. Equivalente químico (Eq). Se define según el tipo de reacción que se está examinando. Para las reacciones ácido-base, un equivalente de un ácido es la cantidad expresada en gramos que suministra un mol de iones hidrógeno (H+); un equivalente de una base es la cantidad que reacciona con un mol de iones hidrógeno; por ejemplo: el Eq del H 2SO4 es 49 g Eq1. Existen varias formas de expresar la concentración de una solución. Las de uso más frecuente son: MOLARIDAD (M). Número de Moles de soluto en un litro de solución. Un mol es el peso molecular expresado en gramos. MOLALIDAD (m). Número de Moles de soluto en 1000 gramos de solvente. NORMALIDAD (N). Número de equivalentes químicos de soluto en un litro de solución. FRACCIÓN MOLAR (Xi). Número de moles de una sustancia en una solución, entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma.
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PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solución y existen diferentes tipos Porciento en peso (%p/p). Número de gramos de soluto en 100 gramos de solución. Porciento en volumen (%v/v). Número de mililitros de soluto en 100 mililitros de solución. Porciento en peso-volumen (%p/v) Número de gramos de soluto en 100 mililitros de solución. Porciento en moles (%mol). Número de moles de soluto disuelto en 100 mililitros de solución.
PROPIEDADES DE LAS SOLUCIONES Las propiedades físicas de las soluciones se pueden dividir en tres categorías: constitutivas, aditivas y coligativas. Propiedades constitutivas. Son aquellas que dependen exclusivamente de la naturaleza de las moléculas que la forman, es decir, de su constitución química (presencia de grupos funcionales, tipo y disposición de los átomos, etc.). Son propiedades constitutivas: El carácter ácido, básico, oxidante, reductor, radiactivo, dulce, insípido, colorido, etc. Propiedades aditivas. Son aquellas que dependen de la suma de las propiedades correspondientes a los constituyentes de la solución. La única propiedad rigurosamente aditiva es el peso molecular, ya que es igual a la suma de los pesos de los átomos que la constituyen. Propiedades coligativas. Son todas aquellas que dependen del número de moléculas por unidad de volumen o sea, de la concentración del soluto. Estas propiedades, muy importantes para las soluciones biológicas son: descenso de la presión de vapor, descenso del punto de congelación, elevación del punto de ebullición, y presión osmótica.
PARTE EXPERIMENTAL. PREPARACIÓN DE DIFERENTES TIPOS DE SOLUCIONES. EXPERIMENTO 1 a Preparación de una solución 0.5M de ácido acético (CH 3COOH). Prepare 100 mi. de una solución de ácido acético 0.5M tomando como base para sus cálculos los siguientes datos: El ácido acético tiene un peso molecular de 60, la pureza del reactivo comercial es de 99.5% y la densi4
dad a 20fiC es de 1.05 gml'.Una vez preparada consérvela para utilizarla en el experimento No.2 1).- Describa los cálculos que hizo para conocer el volumen de ácido acético concentrado que utilizó para preparar 100 mi. de dicha solución.
2).- Al considerar que la solución es 0.5M calcule lo siguiente:
Preparación de una solución de cloruro de sodio (NaCI) al 5% (p/v). EXPERIMENTO 1b. Utilice la cantidad que se proporciona en el sobre de NaCI con el material, prepare una cantidad determinada de solución de NaCI al 5% considerando que la pureza del reactivo es de 100%. 1).- Describa los cálculos para conocer la cantidad de agua destilada que es necesario añadir al NaCI del sobre en cada c aso para que la solución sea al 5%. 2).- Al considerar que la solución es al 5%, calcule lo siguiente:
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DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE UNA SOLUCIÓN POR TITULACIÓN. EXPERIMENTO 2. En este experimento se utilizará la solución de ácido acético (solución problema) que se preparó en el experimento 1a. En un matraz Erlenmeyer de 250 mi. se colocan 10 mi. de la solución de ácido acético problema, midiéndolos con la máxima exactitud posible. Añada de 3 a 5 gotas de solución de fenolftaleína y titule utilizando solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.2N. Recuerde que el punto de equivalencia se observará cuando persista, por más de un minuto, un ligero color rosa. f
1).- ¿Cuántos mi. de NaOH 0.2N gastó para neutralizar los 10 mi. de la solución de ácido acético? R= ______________mi. 2).- Según los resultados que obtuvo y considerando que la solución de NaOH es exactamente 0.2N, ¿Cuál es la verdadera normalidad del ácido acético problema? R=_____________ 3).- Escriba el concepto de titulación ácido-base:
PROPIEDADES COLIGATIVAS DE LAS SOLUCIONES EXPERIMENTO 3. Elevación del punto de ebullición. Determine la temperatura de ebullición de las siguientes soluciones: NaCI 2m, NaCI 4m y H 2O destilada. Deposite 20 mi. de las soluciones mencionadas en sendos vasos de precipitados de 100 mi. Caliente directamente con la llama del mechero y mida la temperatura a la cual cada solución hierve. Determine el incremento en la temperatura de ebullición para cada solución. Calcule el valor teórico de la Teb.y compare sus resultados . Para calcular el punto teórico de ebullición se usa la formula: Teb= Teb solvente puro + A Teb en la cual:
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donde: Keb = constante ebulloscópica = 0.52 CC mol1 kg\ m = molalidad Fd = factor de disociación, que para sustancias de: dos partículas = 1.73 tres partículas = 2.35 cuatro partículas = 3.35 SOLUCIÓN
Teb Teórica
Teb experimental
H2O dest. NaCI 2m NaCI 4m
DIFUSIÓN, DIÁLISIS Y OSMOSIS La difusión, la diálisis y la osmosis constituyen las propiedades dinámicas de las soluciones. Difusión es el proceso físico químico por el cual las moléculas, ya sea en estado de gas ó líquido, tienden a distribuirse uniformemente por todo el espacio del que disponen formando un medio homogéneo. En el caso de los gases, la difusión está sujeta a la "Ley de la distribución general de la energía", la cual establece que la velocidad con que se mueve una partícula es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de su masa. En los líquidos la velocidad de difusión es afectada por varios factores. Entre ellos tenemos: a) naturaleza de la sustancia que difunde
c) tamaño y concentración de las partículas
b) área de difusión
d) temperatura
Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusión y Fick, de acuerdo con los mismos estableció la siguiente relación: V = (dm / dt) * K * Q * (dc / ds) V = Velocidad de difusión. K = Constante de difusión, dm = cantidad de sustancia que difunde. dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusión. de = concentración de la sustancia que difunde. ds = espacio que recorre la sustancia al difundir. Q = área de difusión Así, la velocidad de difusión es directamente proporcional al gradiente de concentración y al área de sección. A temperatura, gradiente de con7
centración y área constante, cada sustancia tiene una velocidad de difusión característica en relación al peso molecular por lo que se incluye una constante K, llamada constante de difusión.
DIFUSIÓN EN LÍQUIDOS EXPERIMENTO 4. Llene casi completamente una probeta con agua de la llave, enseguida espolvoree.con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno sobre la superficie del agua y observe qué ocurre. Anote sus observaciones. A continuación acerque la llama del mechero a la probeta en cualquier punto y nuevamente observe que ocurre al aplicar calor. Anote sus observaciones. Una vez homogenizado el colorante, la difusión se ha efectuado. 1).- ¿Es uniforme el descenso del colorante a través de la columna de agua? 2).- ¿Qué sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta? 3).- ¿Qué es disolución, convección y difusión?
DIFUSIÓN A TRAVÉS DE MEMBRANAS Cuando se interpone una membrana dialítica en el sistema, la sustancia sigue difundiendo dependiendo de los factores ya señalados, pero la naturaleza de la membrana será un factor adicional. En estos casos, K recibe el nombre de constante de permeabilidad. En 1861 Graham colocó una membrana dialítica de pergamino entre una solución y un solvente puro, encontró que las sustancias que difunden lo hacen como si la membrana no existiera y esta difusión es inversamente proporcional a su peso molecular. Las membranas dialíticas son aquellas permeables al agua y a solutos cristaloides (no a coloides) y como ejemplo tenemos el celofán y el colodión.
DIÁLISIS EXPERIMENTO 5. Humedezca un tubo de colodión o de celofán de aproximadamente 6 cm de largo por 2.5 cm de diámetro en agua destilada y cierre un extremo atándolo con hilo. Agregúele una mezcla de 1 mi de solución de NaCI al 1% y 10 mi de solución de almidón al 1%. Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspéndalo en un vaso de precipitados con agua destilada. Se determinarán almidón por medio de la prueba de lodo, y de cloruros con solución de nitrato de plata, en el líquido del vaso de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas. 8
Después de este tiempo repita las dos pruebas en el líquido contenido en el saco. a).- ¿Ha dializado el almidón a través de la membrana? b).¿Dializó el cloruro de sodio? c).- Explique este fenómeno
OSMOSIS Y PRESIÓN OSMÓTICA Cuando se colocan dos soluciones de diferente concentración, separadas por una membrana semipermeable, se lleva a cabo la difusión del solvente de la solución de menor concentración a la de mayor concentración. De no existir una fuerza que se oponga al paso del solvente, se alcanzará el equilibrio de concentración por dilución de la solución más concentrada y concentración de la más diluida. El fenómeno, conocido como osmosis, desarrolla una presión que se llama presión osmótica, una de las propiedades coligativas que tiene mayor importancia fisiológica. Podemos definir presión osmótica como la fuerza ejercida por una sustancia disuelta en virtud del movimiento de sus moléculas o bien, de la presión necesaria para impedir el paso del solvente hacia la solución concentrada. Para explicar el paso del solvente de la solución diluida a la concentrada se han emitido varias teorías. Termodinámicamente se considera que la solución diluida tiene una tendencia de escape o presión de vapor muy grande. Esta tendencia de escape o presión de vapor es muy baja cuando la solución está concentrada. De aquí que esté más favorecido el paso de solvente de la solución más diluida (que se concentra y disminuye su presión de vapor) hacia la solución más concentrada, y entre mayor sea la concentración mayor será el descenso.
MEDIDA DE LA PRESIÓN OSMÓTICA. MÉTODO DIRECTO EXPERIMENTO 6. La medición directa de la presión osmótica es posible gracias a las membranas semipermeables artificiales hechas por Traube y utilizadas y perfeccionadas por Pfeffer. No existe membrana semipermeable perfecta, pero las que más se acercan a esto son las de ferrocianuro de cobre y las de pergamino. La elaboración de membranas de ferrocianuro es laboriosa por lo que en este experimento se utilizará una membrana dialítica (colodión o celofán) que nos dará una medida aproximada de presión osmótica usando el dispositivo llamado osmómetro. El osmómetro consiste en un saco de colodión o celofán previamente preparado (humedecido y atado de un extremo) lleno con una solución problema de sacarosa 1M teñida con rojo neutro. Este saco se fija a un tapón de hule que tiene insertado un tubo capilar. 9
Una vez hecho ésto, se marca el nivel de la sacarosa en el tubo capilar, se sumerge el dispositivo en un vaso de precipitados con agua y se marca cada 10 minutos el nivel ascendido hasta que se detenga el proceso. Nota: cualquier error e,n el montaje del osmómetro se manifestará por la salida de la solución coloreada de la bolsa. ¿Cuándo deberá detenerse el proceso osmótico?
CALCULO DE LA PRESIÓN OSMÓTICA La columna de sacarosa ejercerá finalmente una presión que se opone al paso del agua (Presión Hidrostática),. Calculando esta presión se puede conocer la presión osmótica, puesto que en este momento ambas presiones son iguales. P.O.= P.H. Sabemos que: P = fuerza / área y como fuerza = masa * aceleración entonces P = masa * aceleración / área y como densidad (D) = masa / volumen de donde masa = densidad * volumen y el volumen de un cilindro = T]V*h y el área de una circunferencia = U*r 2 al sustituir estos valores en la formula de presión (P) tenemos: P = (densidad * volumen)*aceleración/área o P = (densidad * área * altura) * aceleración / área y al simplificar nos queda que: P.H.= densidad*altura*aceleración o P.O.= D * h * g Donde: r = radio del capilar h = Altura a la que asciende la solución de sacarosa D = Densidad de la solución (1.088 gcnr 3) g = Aceleración debida a la gravedad (9.81 m s 2) m = masa v = volumen a).- ¿Depende sólo de la altura la P.O.? Explique b).- ¿Influye el radio del capilar en la P.O.? Explique c).- Al observar el saco de colodión en el seno del agua, ¿Hay algún indicio de que salga el contenido del saco? d).¿La sacarosa y el colorante dializan? MINUTOS
ALTURA
0 10 20 30 40 50 60 10
TONICIDAD El estudio de la presión osmótica es una característica fácil de determinar en los eritrocitos; su membrana es comparable a la membrana semipermeable ideal y el efecto del paso de agua a través de ella es fácilmente observable al microscopio cuando el glóbulo rojo se encuentra en medios hipotónico ó hipertónico. EXPERIMENTO 7. En un tubo de ensaye recoja 1.5 mi. de sangre sobre 30 mg. de citrato de sodio, diluya con 9.5 mi. de solución de NaCI al 0.86% y homogenice. (Esta solución servirá para todo el grup o). Deposite una gota de la dilución de sangre en un portaobjetos y observe al microscopio el aspecto y el tamaño de los eritrocitos. Inmediatamente después aplique, con una pipeta Pasteur, una o dos gotas de solución de NaCI al 0.6% y observe. Repita lo anterior agregando a la solución original solución salina al 1.2%. Anote sus observaciones y dibuje esquemas de lo observado. a) ¿Cuál es la solución hipotónica, la hipertónica y la isotónica? b) ¿Qué cambios morfológicos experimenta el eritrocito en cada una de estas soluciones? c) ¿Qué es turgencia, y qué es plasmólisis?
PERMEABILIDAD La permeabilidad es una propiedad intrínseca de las membranas que se debe únicamente a la naturaleza de las mismas. Si una membrana celular se deja atravesar por una sustancia, se dice que es permeable a esa sustancia. Los métodos que se utilizan para el estudio de la permeabilidad en membranas celulares pueden ser cualitativos y cuantitativos. En los cualitativos es posible percibir la entrada de solutos a las células por la aparición de color, precipitados, cambios de color, entre otros, dentro de ellas. Un método cuantitativo para estudiar la permeabilidad de las membranas es la determinación de la velocidad de plasmólisis o de desplasmolisis de las células.
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PENETRACIÓN DE ÁCIDOS Y BASES AL INTERIOR DE LAS CÉLULAS EXPERIMENTO 8. Coloque en un portaobjetos un filamento de Spirogyra teñida previamente con rojo neutro, que actuará como indicador (rojo en medio ácido y amarillo en medio alcalino).Seque la preparación con la punta de un papel filtro y en seguida agregue dos gotas de NH4OH 0.01 N, midiendo el tiempo de vire. Enseguida seque la preparación y agregue dos gotas de HCI 0.01 N, mida el tiempo de vire, compárelo con el anterior y anote sus resultados: SUSTANCIA
Tiempo de vire
Vire (cambio de color)
NH4OH 0.01 N HCI
0.01 N
¿Cuál de las dos sustancias penetró más rápidamente a la célula y por qué?
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ELECTROLITOS Y pH 1. ELECTROLITOS A principios del siglo XIX el científico inglés Mlchael Faraday, observó que cuando conectaba dos electrodos de material inerte a una batería y los sumergía en una solución acuosa de sal, se desprendía hidrógeno (H 2) en el electrodo positivo, el estudio de este fenómeno le permitió en 1834 concluir que cuando una corriente eléctrica circula por una solución, hay una transferencia de materia, una parte circula con la corriente y otra §e mueve en sentido contrario. Faraday llamó a los transportadores de corriente "ioneó' y denominó "ánodo' al electrodo conectado con el polo positivo de la batería, y "cátodo" al conectado con el polo negativo de la batería. Los iones que se mueven hacia el ánodo los denominó aniones, y a los que migran hacia el cátodo los llamó cationes, y designó "electrólisis al proceso total. Refirió también a las sustancias que en solución acuosa permiten el paso de la corriente como "electrolito^' y a los que no manifiestan esta capacidad como "no electrolito^'. A la capacidad de dar paso a la electricidad se le conoce como "conductancia". Los electrolitos se clasifican en fuertes y débiles, según su potencia para conducir la corriente eléctrica, la cual va paralela a su grado de disociación; sin embargo, no se encuentran definidas con exactitud las dos clases, encontrándose todos los grados intermedios. En general se puede decir, que las sales minerales, los hidróxidos de metales alcalinos y los ácidos minerales son electrolitos fuertes. En los líquidos del organismo encontramos como ejemplos al cloruro de sodio (NaCI), cloruro de potasio (KCI), cloruro de calcio (CaCI2), etc. La mayor parte de los compuestos orgánicos como ácidos (láctico, pirúvico, etcj.compuestos nitrogenados, etc., son electrolitos débiles. En el agua corporal tenemos muchos ejemplos de compuestos no electrolitos como glucosa, urea y creatinina.
2. CONDUCTIVIDAD. Posteriormente en 1887 Svante Arrehenius, científco sueco, afirmó que la conductividad de las soluciones electrolíticas depende exclusivamente de las "moléculas activas" o sea de las moléculas disociadas; y por lo tanto depende del grado de disociación y de la concentración de los electrolitos presentes. Entre mayor sea la concentración mayor será la conductividad, hasta un límite determinado en el cual se hace constante y luego dlsminu13
ye, explicándose ésto porque cuando la concentración de cationes y aniones es grande, interfieren entre sí, y en tal caso, los cationes tienen una menor libertad para desplazarse, debido a la interacción con los aniones cercanos en la solución, y visceversa. Esta explicación se puede aprovechar para explicar la fuerza iónica de una solución, ya que al no desplazarse libremente las partículas en la solución, la "concentración activa" o "actividad" de las soluciones es menor que la concentración real, por lo tanto ^i = Vz ZCZ2 (la fuerza iónica es la semisuma del producto de la concentración del ion por la valencia al cuadrado). Se sabe que las fuerzas de atracción, entre iones de carga opuesta disminuye rápidamente al aumentar la distancia 1. En las soluciones concentradas, en las que los iones se encuentran más cercanos, se hace mayor y por lo tanto la actividad se hace menor; en las soluciones muy diluidas la actividad y la concentración efectiva son equivalentes entre s í.
PARTE EXPERIMENTAL Electrólisis del agua. EXPERIMENTO 1 En un cristalizador colocar 50 mi de una solución de NaCI al 10%, agregar unas gotas de azul de timol o anaranjado de metilo como indicador y mezclar bien, introducir en la solución electrodos de carbón provenientes de una fuente de energía como el Puente de Wheatstone. Observe la formación de gas y los cambios de color en la solución cercana a los electrodos, en el electrodo positivo se tornará amarilla, indicando la presencia de un ácido y en el electrodo negativo se tornará roja, demostrando la formación de una base. a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos b) Esquematice el proceso de la electrólisis del agua.
Conducción de corriente en electrolitos fuertes y débiles. EXPERIMENTO 2 a) Coloque solución de NaCI al 10% en un cristalizador (en cantidad suficiente para que tenga contacto con los electrodos en una tercera parte de su longitud). Introduzca los electrodos de carbón provenientes de una fuente de energía y obsérvese el paso de la corriente eléctrica, manifesta14
do por la intensidad de luz emitida por el foco. Obsérvese también la intensidad en relación a la distancia a que se coloquen los electrodos. b) Repita el experimento, empleando acetato de sodio (CH 3COONa) al 10%. Resultados: Solución
Luminosidad
Cloruro de sodio (NaCI) al 10 % Acetato de sodio (CH3COONa) al 10%.
Conductividad entre electrolitos débiles y fuertes. Para este experimento emplearemos también el puente de Wheatstone, solo que en la parte de resistencias. Cuando se hace pasar una corriente eléctrica a través de un conductor, se produce una diferencia de potencial (E) que según la ley de Ohm es igual al producto de la resistencia (R) por la intensidad (I) y se puede representar como sigue: E= I x R
...(1)
En las soluciones electrolíticas el paso de corriente eléctrica, dependerá del grado de disociación y de la concentración de los electrolitos presentes. Entre mayor sea la concentración, mayor será la conductividad, hasta un límite determinado en el cual se hace constante y luego disminuye . Para explicar este fenómeno, Arrhenius afirma que la conductividad depende de las "moléculas activas" exclusivamente. La conductividad de una solución se puede medir en forma indirecta, determinando su resistencia y utilizando el principio de Kirchoff, el cual establece que en toda red de resistencias, la suma de las caídas de tensión o diferencia de potencial es igual a la suma de los productos de cada resistencia por la intensidad de la corriente en dicha resistencia. El puente de Wheatstone, consta de un sistema de cuatro resistencias, tres de las cuales son variables (previamente graduadas) y una resistencia desconocida (resistencia de la solución problema). Cuando se hace pasar una corriente eléctrica y el sistema no está en equilibrio, el registrador indicará una diferencia de potencial. En cambio, cuando las cuatro resistencias estén en equilibrio no habrá paso de corriente. La resistencia de la solución problema se calcula a partir de las lecturas que nos dé el aparato. Ya que la conductividad (C) es la recíproca de la resistencia (R), la conductividad será: ...(2)
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Sin embargo, generalmente se acostumbra reportar la conductividad en forma de "conductividad específica", entendiéndose ésta, por la inversa de la resistencia específica. Para determinar la resistencia específica se debe usar una celda con electrodos de 1 cm 2 de sección, separados entre sí por una distancia de 1 cm. Cuando no se cuenta con una celda de este tipo debe calcularse la constante de la celda disponible aplicando la siguiente fórmula:
despejando conductividad
K= R x L
...(3)
L= K / R
...(4)
donde: K = Constante de la celda, L = Conductividad específica en mhos, R= Resistencia en ohms Para calcular la constante de la celda (K) se utiliza una solución de conductividad eléctrica específica conocida, como la de KCI 0.02N, cuya L a 18° C = 0.002394 mhos, y se determina su resistencia (R) en la celda que se va a utilizar. Aplicando la fórmula (3) se puede calcular la conductividad eléctrica específica de cualquier solución, simplemente determinando su resistencia en la celda cuya constante ya se conoce.
Comprobación de la ley de ohm Demostración de la diferencia de conductividad entre electrolitos débiles y fuertes. EXPERIMENTO 3 Al emplear la solución de KCI 002 N y el dispositivo como le Indicó el maestro, determine la constante de la celda y posteriormente determine la conductividad eléctrica específica de las soluciones de H 2SO4 al 1.0 % y CH3COOH al 1.0%, empleando la fórmula indicada. a) Compare sus resultados y concluya.
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EXPERIMENTO 4 Efecto de la concentración sobre la conductividad Utilizando una solución de KCI 0.02 N determine previamente la constante de la celda que va usar y luego proceda a determinar la conductividad eléctrica específica de soluciones de H 2SO4 al 5,10,15, 20 y 25 %, respectivamente, usando el puente de Wheatstone y siguiendo las instrucciones ya expuestas.
pH La concentración de iones hidrógeno, es un factor importante en una gran variedad de procesos químicos, pues intervienen determinando el equilibrio iónico de los electrolitos, modificando así la constitución molecular de las sustancias que actúan entre sí. Además conviene recordar que las propiedades de los anfolítos, y por ende de las proteínas, que son los componentes fundamentales de la materia viva, dependen generalmente del pH del medio en que se encuentran. Por ejemplo, conocemos que todas las enzimas tienen un rango específico de pH para su actividad. La concentración de iones hidrógeno en la sangre humana y demás mamíferos tiene un valor constante, el pH normal de la sangre, medido potenciométricamente oscila entre 7.35 y 7.45 a temperatura de 37° C. Podría decirse que todos los fenómenos biológicos necesitan, para su realización, condiciones óptimas dadas por determinados factores de los cuales uno de los más importantes es, el pH. Se sa6e que el agua pura es un mal conductor de la corriente eléctrica lo cual significa que su disociación es muy baja. Esta se ha determinado y se conoce que a 22° C es de 1.8 x 10 16; o sea:
La concentración molar del agua en un litro de ésta se puede calcular como: masa/ PM. Puesto que un litro de agua pesa aproximadamente un kilogramo, es decir 1 000 g, al s ustituir resulta 1 000 g /18 g mol1 = 55.5 mol se tiene entonces que: [H +][HO] = [H 2O](1.8x10" 16 ) = (55.5mol|-1)(1.8x10-16molr 1) = 1 x10 1 4 (molí1)2 =Kw En el agua pura por cada ion hidrógeno existe un ion hidroxilo. Es decir, que [H+] = [HO']; por tanto podemos escribir: [H+] [HO] = [H+] [H+] = [H+]2 = 1 x 10"14 [ H+] = (1 x 1Cr 14)1'2 = 1 x 10"7 = 0.000 000 1 mol I 1 [HO] = (1 x 1014)1'2 = 1 x 10"7 = 0.000000 1 mol I 1 17
Dicho de otro modo, existen 1 x 107 moles de iones hidrógeno y 1 x 10' 7 moles de iones hidroxilo por cada litro de agua pura. Sin embargo, como resulta laborioso trabajar con potencias negativas Sórensen propuso que se usará el logaritmo decimal de la inversa de la concentración molar de iones hidrógeno (H +); para expresar la concentración del ion hidrógeno. A este valor se le da el nombre de pH, lo cual se puede también expresar como el valor negativo del logaritmo decimal de la concentración molar de iones hidrógeno. Del mismo modo, para expresar la concentración de iones hidroxilo se emplea el valor negativo del logaritmo decimal de la concentración molar del ion hidroxilo (HO), valor conocido como pOH. Existen dos métodos para medir el pH de una solución: 1) Método colorimétrico. Es el más sencillo pero no el más exacto. Está basado en el uso de indicadores, comparando el color de la sustancia de pH desconocido con el de una serie de soluciones de pH conocido. Los indicadores de pH son, generalmente, colorantes orgánicos constituidos por ácidos o bases débiles o sus sales, cuyas moléculas no disociadas ofrecen un color determinado, en tanto que sus moléculas disociadas presentan otro diferente. Cuando el indicador se comporta como un ácido débil se presenta el equilibrio siguiente:
El color que el indicador presente dependerá de las proporciones relativas en que se encuentren las dos formas del mismo, lo que a su vez es debido a la proporción [ H+]/K. Pero como K es una constante propia de cada indicador, el color dependerá únicamente de la concentración de iones hidrógeno que existe en la solución. Hasta hace poco tiempo se empleaban con más frecuencia soluciones diluidas de los indicadores para la determinación del pH, comparándolas con soluciones tipo. Este método tiene varios incovenientes, como los siguientes: se desperdicia un poco de muestra en cada determinación, interfieren la turbidez y la coloración de las soluciones, etc. Por lo que en la actualidad es más frecuente el uso de estos indicadores en tiras de papel filtro, en las cuales se encuentran adsorbidos los indicadores, éstas se introducen en las soluciones de pH desconocido y se compara la coloración obtenida con el patrón que acompaña a cada empaque. 2) Método potenciométrico. El método potenciométrico se basa en las llamadas pilas o celdas de concentración. Al introducir una varilla metálica en una solución del mismo metal se establece un equilibrio entre la llamada 18
presión de disociación y la presión osmótica. La presión de disociación es la tendencia que tiene el metal a liberar iones a la solución y la presión osmótica tiende a fijar los iones a la barra. El equilibrio se alcanza cuando la presión osmótica es igual a la presión de disolución. Cuando estas dos fuerzas son desiguales se establece una diferencia de potencial proporcional a la diferencia de concentraciones. La medicón de este potencial constituye el fundamento del método potenciométrico.
Determinación del pH. EXPERIMENTO 5 a) Prepare una serie de tubos de ensaye y numéralos del 2 al 11 b) Coloque en cada uno 9 mi de agua hervida destilada c) Agregue al tubo 2 de la serie, 1 mi de solución de HCI 0.1 N y mezcle bien d) Coloque 1 mi de esta solución en el tubo 3 e) Repita la misma operación con los tubos 4, 5, y 6, mezclando bien f) El tubo 7 únicamente contendrá agua destilada hervida g) Adicione al tubo 11, 1 mi de solución de KOH 0.01 N y mezcle bien h) tome 1 mi de la solución del tubo 11 y páselo al tubo 10 i) Repita la operación con los tubos 9 y 8, mezclando bien Al tomar en cuenta las cantidades de ácido y base agregadas a cada tubo, calcule el pH teórico de toda la serie. Compruebe sus resultados por los métodos colorimétrico y potenciométrico. NOTA. Con el propósito de lograr resultados satisfactorios, extreme sus precauciones al medir las soluciones y asegure la limpieza de los tubos y pipetas y no agite demasiado los tubos. Con sus resultados llene el s iguiente cuadro: No. tubo 2 3 4 5 6.
pH teórico
pH por los métodos colorimétrico (papel pH) Potenciométrico
7
8 9 10 11
I 19
Los ácidos o las bases se clasifican en fuertes y débiles según su grado de disociación, así los electrolitos fuertes serán los que están más disociados y por lo tanto la concentración molar del ion hidrógeno (H +), o del ion hidroxilo (HO) en sus soluciones será igual a la normalidad del ácido o base respectivamente, lo que simplifica el cálculo de pH como: pH = -log [H +]
y
pOH = -log [HO]
además en toda solución acuosa pH + pOH = 14 Pero en el caso de los ácidos y bases débiles; los cuales están parcialmente disociados, además de conocer la molaridad del ácido o base, deberá conocerse el grado de disociación de la sustancia, o sea, la constante de disociación acida (ka) o básica (kb), la cual es específica para cada sustancia. En el cálculo de pH o pOH se deberá aplicar la fórmula en la cual se toman en cuenta la constante de disociación respectiva y la molaridad de la solución (C). pH = 1/2 pka -1/2 log C
pOH = Vz pkb -1/2 log C
y
Preparación de soluciones de pH conocido con electrolitos fuertes y débiles EXPERIMENTO 6 Empleando la fórmula que corresponda, calcule teóricamente las cantidades adecuadas para preparar 250 mi de cada una de las siguientes soluciones de ácido clorhídrico a pH = 1.2 a 1.8; a partir de HCI al 36% de pureza, densidad de 1.18 g crrr 3, y 250 mi de cada una de las siguientes soluciones de ácido acético a pH = 2.8, a 4.0; a partir de CH 3COOH al 50 % de pureza, densidad igual al 1.032 g cnr 3, pka = 4.74 Determine el valor de pH de cada solución por los métodos colorimétrico y potenciométrico pH/sustancia teórico colorimétrico potenciométrico
ácido clorhídrico
20
ácido acético
Acidez verdadera y acidez de titulación EXPERIMENTO 7 a) Determine potenciométricamente los pH de las soluciones de HCI 0.01 N yCH3COOH0.01 M b) Mida exactamente 20 mi de cada solución y colóquelós en sendos matraces Erlenmeyer. c) Adicione 2 gotas de fenolftaleína y titule ambas muestras con NaOH 0.1 N d) Anote sus resultados en el cuadro siguiente: Solución teórico
PH experimental
HCI 0.01 N CH3COOH 0.01 M
gasto de NaOH al 0.1 N teórico experimental !
Curvas de titulación Las curvas de titulación se originan cuando, un ácido fuerte o a un ácido débil se le adiciona una base, produciendo la eliminación de iones hidrógeno. Esto nos lleva al concepto ácido-base de Brónsted y Lowry, que nos dice que, "un ácido es toda sustancia que puede donar protones y una base como toda sustancia que puede aceptar protones". Existe otro tipo de electrolitos, muy importantes en bioquímica, que pueden comportarse como ácidos o como bases, tal es el caso de los aminoácidos, que se conocen como moléculas anfotéricas, como se demostrará en la próxima práctica EXPERIMENTO 8 a) Coloque 30 mi de HCI 0.1 N en un vaso de precipitados de 150 mi y póngalo sobre el agitador magnético b) Mida el pH de esta solución original c) Titule con NaOH 0.1 N como se indica en la tabla siguiente, midiendo el pH después de cada adición. d) Repita el procedimiento anterior con ácido acético 0.1 N
21
mldeNaOHO.IN adicionados 0 2 3 5 5 5 5 1 1 1 1 0.5 0.5
30 mi de HCI 0.1 N pH
30mldeCH3COOH0.1 N pH
a) Grafique los resultados obtenidos en la titulación de cada ácido. b) Describa las diferencias entre la curva obtenida para el ácido fuerte y para el ácido débil.
22
SOLUCIONES REGULADORAS Existen ciertas soluciones a las cuales se pueden adicionar cantidades relativamente grandes de ácidos o álcalis sin alterar de manera significativa su pH. Por tal motivo se les denomina soluciones reguladoras, amortiguadoras, buffer o tampón. Lo que resulta evidente es que dichas soluciones tienen una acción amortiguadora, entendiéndose por ésta la capacidad de resistir la adición o pérdida de iones hidrógeno o de iones hidroxilo sin que se produzca un cambio acentuado en su pH. Si bien es cierto que los ácidos y las bases fuertes pueden actuar como amortiguadores, en circunstancias ordinarias la acción amortiguadora se debe a la presencia en la solución de un sistema formado por un ácido o por una base débil y su sal correspondiente (ácido-base conjugado). Si se toma como ejemplo una solución que contenga un ácido débil, al que representaremos por "HA", y su sal, representada por "BA" los iones hidrógeno existentes en ella procederán únicamente de las moléculas acidas, que se disocian como sigue: HA o H + + A-El equilibrio de la disociación está dado por la siguiente ecuación: = Ka
donde: Ka es la constante de disociación acida
De esta ecuación se deduce que la concentración de iones hidrógeno es:
La relación de estas dos cantidades es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentración de la base conjugada A" es igual a la concentración de la SAL. Sustituyendo una expresión por otra en la ecuación anterior tenemos:
23
Si se toma el valor negativo del logaritmo decimal en ambos términos de la ecuación queda así:
Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analogía podemos decir que log Ka es igual a pKa, por lo que:
Por otra parte, por las leyes de los logaritmos, las expresiones:
son iguales y la segunda puede reemplazar a la primera, de tal modo que hechas todas las modificaciones la ecuación queda finalmente como sigue:
Esta ecuación se conoce con el nombre de ecuación de Henderson Hasselbalch y nos indica que el pH de una solución que contenga un ácido débil y su sal, está determinado por el valor de pKa (constante para cada ácido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentración de la sal entre la concentración del ácido. Por ejemplo, el valor de la constante de disociación, Ka del ácido acético es de 1.8 x 10 5. El valor de su pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solución reguladora que posea iguales cantidades de ácido acético y acetato de sodio en concentración 0.1 N, el pH de esa solución estaría dado por la ecuación:
Además de servir para la preparación de soluciones de pH conocido, las soluciones reguladoras tienen en el organismo un papel de importancia capital que es el evitar que aumente o disminuya de manera importante la concentración de iones hidrógeno, ya que la vida humana es sólo posible en límites muy estrechos de pH, es decir para la sangre arterial un pH de 7.40 y para sangre venosa y líquidos intersticiales 7.35. Este último es menor por tener más CO2 y por lo tanto mas H2CO3 producido metabólicamente. Se sabe que los límites máximos de pH en los que por algunos minutos, puede permanecer el organismo sin sufrir muchas alteraciones es de 7.0 a 7.8. En los líquidos donde existen y actúan al mismo tiempo varios siste24
mas amortiguadores, como sucede en la sangre, el ácido o la base que entra es amortiguado por todos los sistemas presentes de manera proporcional a la eficacia de cada uno de ellos. La regulación fisicoquímica tiene lugar en todos los medios que contienen reguladores, constituidos principalmente por ácidos o bases débiles y sus sales. Por ejemplo el de fosfatos H 2PCy/HP04=con un pKa2 de 7.2 (o de 6.8 a la temperatura corporal), es el principal amortiguador intracelular. El principal amortiguador extracelular en la sangre y líquidos intersticiales es el sistema bicarbonato H2CO;)/ HC0'3 con un pKa, de 6.1. Otros sistemas son los de proteínas y aminoácidos. En el interior del eritrocito además del bicarbonato el amortiguador de mayor importancia es el de Hemoglobina reducida / Oxihernoglobinato (HHb / HbO 2). Todos estos sistemas funcionan de manera inmediata cuando existe exceso de álcali o ácido ya que un cambio del pH afecta la estructura y la actividad de las proteínas, la distribución de otros iones entre las células y el líquido extracelular, la actividad de hormonas y fármacos, etc.
PARTE EXPERIMENTAL APRECIACIÓN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN EXPERIMENTO 1 Disponga 3 series de cuatro tubos de ensayo cada una. Numere los tubos del 1 al 4. Coloque en los tubos número uno de cada serie 5 mi de agua destilada hervida. En los tubos número 2; 5 mi de solución de cloruro de potasio (KCI) 0.5 M. en tanto que en los tubos número 3 ponga una mezcla formada por 2 mi de solución de fosfato diácido de potasio (KH 2PO4) y 3 mi de solución de fosfato monoácido disódico (Na 2HPO4) de concentración 0.01 M. En los tubos número 4 poner 2 mi de solución KH 2PO4 y 3 mi de solución Na2HPO4 de concentración 0,1 M.. A continuación, compruebe en la serie I, que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello haga uso del método colorimétrico empleando rojo de fenol; agregue una gota de indicador a cada uno de los tubos de la serie y observe el color característico amarillo o rojo (pH 6.8 a 8.2). A los cuatro tubos de la serie II, adicione una gota de verde de bromocresol, que es un indicador de zona acida. A continuación; agregue 10 gotas de HCI 0.01 M. al tubo número 1 y observe el cambio de color que se opera (de verde a amarillo). Enseguida determine cuántas gotas de la misma solución de HCI es necesario agregar a los tubos 2, 3 y 4 de la serie en cuestión, para igualar la coloración con el tubo número 1. A los cuatro tubos de la serie lll.adicione una gota de azul de timol, que es un indicador de zona alcalina, que vira de amarillo a azul fuerte (pH 8.0 a 9.6) a continuación; agregue 10 gotas de solución de NaOH 0.01 M al tubo número 1 y observe también el cambio de coloración (de amarillo a azul). 25
Investigue cuántas gotas de la misma solución de NaOH es necesario agregar a los tubos número 2, 3, 4 de esta serie para que adquieran el mismo color del tubo número 1. Ver instrucciones del cuadro siguiente: INDICADOR: Rojo de fenol Tubo No. 1
SERIE I
Tubo No. 2
Tubo No. 3
Tubo No. 4
KH2PO4
KH2PO4
KCI
0.01 M
0.1 M
H2O
0.5 M
2 mi
2 mi
5 mi
5 mi
NaaHPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
INDICADOR: Verde de bromocresol Tubo No. 1 ■
'
Tubo No. 2
Tubo No. 3
Tubo No. 4
KH2PO4
KH2PO4
KCI
0.01 M
0.1 M
v -
SERIEN
H2O
0.5 M
2 mi
2 mi
HCI0.01N
5,ml
5 mi
Na2HPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
Tubo No. 3
Tubo No. 4
KH2PO4
KH2PO4
KCI
0.01 M
0.1 M
INDICADOR: Azul de timol Tubo No. 1
Tubo No. 2
SERIE III
H2O
0.5 M
2 mi
2 mi
NaOH 0.01 N
5 mi
5 mi
Na2HPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
a) ¿Qué indica el cambio de color en cada una de las series ? b) ¿Cómo explica usted la diferencia en las cantidades de ácido y base que hay que agregar a los tubos 2, 3 y 4 de las series correspondientes para igualar la coloración con el tubo 1?
26
COMPROBACIÓN DE LA PRESENCIA DE SISTEMAS AMORTIGUADORES EN LÍQUIDOS BIOLÓGICOS DETERMINACIÓN DEL pH DE LA ORINA HUMANA. EXPERIMENTO 2a Para hacer esta determinación debe emplearse orina recién emitida, teniendo cuidado de medir el pH lo más rápidamente posible. Determine el pH por el método potenciométrico. a).- ¿Cuáles son los valores normales del pH de la orina y cuál es la que obtuvo experimentalmente?
pH DE LA LECHE DE VACA. EXPERIMENTO 2b Mida el pH de una muestra de leche de vaca, enseguida, en un vaso de precipitados, coloque 2 mi de leche y adicione 38 mi de agua destilada hervida. Determine el pH de esta dilución. EXPERIMENTO 2c De la misma manera que trató la leche, haga una determinación del pH de una solución de ácido clorhídrico 0.1N sin diluir y después de diluir. Compare y analice sus resultados Muestra
pH normal
pH experimental
Orina Leche Leche diluida Muestra HCI0.1 N HCI diluido
pH teórico
27
pH experimental
CURVAS DE TITULACIÓN. Como ya mencionamos en la práctica de electrolitos y pH existen sustancias de mucha importancia en bioquímica como son los aminoácidos y las proteínas, que también poseen grupos titulables y que actúan como anfolitos aceptando iones H+ o iones OH". En esta práctica se determinará la curva de titulación de la glicina con HCI y con NaOH y se hará la comparación de las curvas obtenidas en la práctica de electrolitos y pH obtenidas con el ácido fuerte y el ácido débil para reafirmar los conceptos. EXPERIMENTO 3 En dos vasos de precipitados de 150 mi coloque 30 mi de solución de glicina 0.1 N, agregue una barra magnética y colóquela sobre el agitador, determíneles el pH y titule como se indica en la tabla, un vaso con NaOH 0.1 N y el otro con HCI 0.1 N. Con los valores obtenidos hacer las gráficas correspondientes, poniendo en las ordenadas el valor de pH y en las abscisas los mililitros gastados de HCI y de NaOH. Agregar HCI 0.1N 0 2 3 5 5 5 5 1 1 1 1 0.5 0.5
30 mi Glicina 0.1N PH
Agregar NaOH 0.1N
30 mi ¡ Glicina 0.1 N PH
0 2 3 5 5 5 5 1 1 1
H 0.5 0.5
Compare las curvas obtenidas para los ácidos fuertes y débiles con ésta y diga cuales son sus pKa y además calcule el punto isoeléctrico sabiendo que:
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PREPARACIÓN DE SOLUCIONES REGULADORAS Empleando la formula de Henderson-Hasselbalch ya conocida vamos a calcular teóricamente, teóricamente, los volúmenes necesarios para preparar soluciones amortiguadoras y posteriormente comprobar prácticamente sus resultados. EXPERIMENTO 4 Calcule teóricamente 5 mezclas para soluciones amortiguadoras seleccionando volumen y valores de pH diferentes, empleando para ello ácido acético 0.1 N y acetato de sodio 0.05 N. Prepárelos y compruebe sus resultados con el potenciómetro. a) Explique detalladamente el procedimiento que siguió para preparar cada mezcla.
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PROTEÍNAS El nombre de proteínas deriva del griego "protos" que significa "primero", "primordial" o fundamental. Este nombre fue propuesto en 1940 por Müller para asignar a ciertas sustancias orgánicas de extrema complejidad, son las sustancias de mayor trascendencia en los seres vivos, ya que son quizá las macromoléculas más versátiles, responsables en gran parte de las capacidades metabólicas y de la morfología de los seres vivos. Las proteínas son los constituyentes principales del protoplasma y las membranas celulares, tanto de animales como de vegetales. Las proteínas contienen en su molécula C, H, O, N y en ocasiones P y S; el nitrógeno en ellas se encuentra aproximadamente en un 16%; por hidrólisis se desdoblan dando como producto final, alfa aminoácidos, los cuales varían en número, cantidad y posición en cada proteína. Existen diferentes tipos de proteínas en un organismo, cada una con una función específica; algunas son estructurales, otras actúan como catalizadores, hormonas, transportadores de gases, transportadoras de solutos a través de la membrana, de electrones, en mecanismos de defensa, mecanismos genéticos, en el mantenimiento del balance hidroelectrolítico, etc. Las diferencias entre una proteína y otra se deben a: 1) el número total y estructura de los aminoácidos que contenga y 2) del orden o secuencia en que estén unidos estos aminoácidos. Esto quiere decir que el simple análisis químico no sirve para caracterizarlas individualmente, ya que es posible que existan proteínas que tengan el mismo peso molecular, el mismo tipo de aminoácidos y sin embargo exhiban propiedades y funciones completamente diferentes. Esto se comprenderá si se recuerda que la estructura de una proteína esta determinada por cuatro niveles de organización, o niveles estructurales que se designan como estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. La estructura primaria depende del número y secuencia de aminoácidos que se unen entre sí por el enlace peptídico (-CO-NH) covalente. La cadena polipeptídica puede enrollarse sobre si misma formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformación, estabilizada por puentes de hidrógeno (entre los enlaces peptídicos). Esta ordenación espacial de la molécula se conoce como estructura secundaria. La cadena polipeptídica ya enrollada adopta en el espacio la conformación más estable, p sea, sufre un super enrollamiento que se designa como estructura terciaria. En la mayoría de las ocasiones una proteína biológicamente activa puede estar constituida por más de una cadena polipeptídica. La asociación de estas cadenas en el espacio para adoptar una estructura tridimensional característica es lo que se llama estructura cuaternaria. Tanto la estructura terciaria como la cuaternaria carecen de enlaces definidos, ya que participan to30
dos los tipos de enlaces químicos, fuertes o débiles, en estos niveles estructurales. La actividad de una proteína depende fundamentalmente de su conformación espacial, más que de su estructura química. Existe una gran cantidad de agentes físicos y químicos capaces de modificar la conformación de las proteínas al alterar los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos agentes se denominan agentes desnaturalizantes, algunos de los más comunes son: ácidos, bases, detergentes, metales pesados, solventes orgánicos, alcaloides, calor, radiación ultravioleta, rayos x, ondas ultrasónicas, sales inorgánicas, sustancias orgánicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc. Las proteínas tal como existen en la naturaleza se denominan proteínas nativas; si se modifican por cualquiera de los agentes anteriores en su conformación, se transforman en proteínas desnaturalizadas, las cuales generalmente pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan.
PARTE EXPERIMENTAL ALGUNAS ALGUNAS PROPIE PROPIEDADE DADES S QUÍMICA QUÍMICAS S DE LAS PROTEÍNAS Como ya se explicó, las proteínas están formadas por aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos y aunque presentan propiedades fisicoquímicas y biológicas características éstas son reflejo de las de los aminoácidos que las constituyen. Muchas de las reacciones coloridas que se utilizan para el análisis de las proteínas en realidad se deben a la presencia de un aminoácido específico.
REACCIÓN DE MILLÓN La reacción de Millón es específica para el grupo fenólico y por lo tanto, la dan positiva todas las sustancias que poseen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y todas aquellas proteínas que contengan tirosina. EXPERIMENTO 1 Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados.coloque en cada uno, 2ml de una de las s oluciones siguientes: TUBO No 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina Albúmina 31
Posteriormente añada 5 gotas del reactivo de Millón. Caliente ligeramente hasta que la solución hierva. ¡PRECAUCIÓN! La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado blanco el cual por acción del calor se vuelve rojo. La presencia de sales así como soluciones muy alcalinas pueden interferir en esta reacción. a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. b).- Explique en qué consiste el reactivo de Millón y cual es el mecanismo que se ha propuesto para esta reacción.
REACCIÓN DE BIURET Todas las moléculas que contengan dos o más uniones peptídicas, por lo tanto todas las proteínas y todos los péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva la reacción de Biuret. •„ El nombre se debe al compuesto biurea (NH 2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre en solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta. El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis proteica, la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa. EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 4tubos de ensaye numerados coloque en cada uno 1ml de una de las s iguientes TUBO No. 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Añada 2 mi de solución NaOH al 10% ¡PRECAUCIÓN! y 3 a 5 gotas de solución de sulfato de cobre al 1%. Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. La aparición de una coloración violeta o rosa, en no más de 20 minutos, debe considerarse como prueba positiva. Esta reacción también puede llevarse a cabo en base sólida, colocando unas gotas de cada solución de prueba sobre unos cuadros de papel filtro que previamente se han tratado con una mezcla formada por 25 mi de una solución de sulfato de cobre al 3% en un litro de solución de hidróxido de potasio al 10%. 32
a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo, b).- ¿Se puede considerar al biuret como una reacción característica para todas las proteínas? ¿Por qué? c).Escriba la reacción.
REACCIÓN XANTOPROTEICA Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptofano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, agregue en cada uno 2 mi de una de las siguientes soluciones: TUBO No. 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Añada 1 mi de ácido nítrico concentrado (HNO3), caliente ligeramente y observe una coloración amarilla característica. Se deja enfriar esta solución y se añaden gotas de hidróxido de amonio (NH 4OH) concentrado cuidadosamente para estratificar. En la interíase se observará un anillo naranja. a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo, b).- ¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas?, c).- Explique por qué se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO 3.
REACCIÓN DE HOPKINS-COLE La reacción de Hopkins-Cole es específica para el aminoácido triptofano y el color violeta que se produce se debe a la condensación del anillo indólico del triptofano con el aldehido presente en el reactivo de Hopkins- Colé. Esta reacción la darán positiva los péptidos y proteínas que contengan triptofano en su molécula.
33
EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada uno 2 mi de una de las siguientes soluciones: TUBO No. 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Agregue 3 mi del reactivo de Hopkins-Coíe y mezcle vigorosamente. Añada cuidadosamente resbalando por las paredes 1 mi de ácido sulfúrico (H2SO4)concentrado ¡ PRECAUCIÓN! procurando que se formen dos capas. Introduzca los tubos en un vaso con agua caliente y si la reacción es positiva a los dos minutos aparecerá un anillo violeta en la interfase. a) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. b) Escriba la reacción que se ha producido.
REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS. Los aminoácidos cistina y cisteína y las proteínas que los contengan, cuando se tratan con álcalis concentrados desprenden ácido sulfhídrico, el cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negro de sulfuro de plomo (PbS). EXPERIMENTO 5 Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada uno 2 mi de una de las siguientes soluciones: TUBO No. 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Agregue 2 mi de solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 10% ¡PRECAUCIÓN! caliente ligeramente. Añada a todos 0.5 mi de solución de acetato de plomo (Pb (CH3-COO)2). Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 min. El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro indica la presencia de aminoácidos azufrados.
34
a) Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. b) Escriba la reacción química que se ha efectuado. c) ¿Qué sustancias pueden interferir en esta reacc ión?
REACCIÓN DE NINHIDRINA. Esta es una de las reacciones mas sensibles que se conocen para identificar aminoácidos en general (se puede detectar una parte de alanina en 1 500 000 partes de agua). Por su sensibilidad esta reacción se emplea para valoración cuantitativa de aminoácidos por colorimetría. La valoración de aminoácidos en orina, por ejemplo, tiene importancia en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatías, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacidemia se ve acompañada por hiperaminoaciduria paralela. Algunas enfermedades metabólicas congénitas también dan lugar a eliminación anormal de algunos aminoácidos en la orina. Los aminoácidos y muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla. EXPERIMENTO 6 Se utilizarán rectángulos de papel filtro Whatman No 1 ,de 2 x 2 cm, sobre los cuales se colocarán gotas de una de las siguientes soluciones: Cuadro de papel 1 2 3 4 5
Sustancia Glicina Peptona Gelatina Caseína Albúmina
¡PRECAUCIÓN! use guantes o pinzas para manipular el papel. Anote debajo de cada muestra el nombre del compuesto y añádale una gota de solución de ninhidrina en butanol al 0.1%.Coloque el papel en el horno a 110fiC durante 5 minutos. a)Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo. b)Escriba la reacción química que se ha efectuado. c)¿Qué sustancias dan positiva la reacción de la ninhidrina, además de las proteínas, péptidos y aminoácidos?
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TABLA DE RESULTADOS DE ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS REACCIÓN-» XANTO- HOPKINS- AMINOÁCIDOS MILLÓN BIURET NINHIDRINA SUSTANCIAD COLE AZUFRADOS PROTEICA GELATINA PEPTONA CASEÍNA ALBÚMINA
PROPIEDADES FISICO-QUIMICAS DE LAS PROTEÍNAS. Como ya se explicó, muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a varias especies debido a que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que es necesario estudiar sus propiedades físicas y biológicas si se desea caracterizar una proteína. Las propiedades físicoquímicas de las proteínas dependen fundamentalmente del peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula (estructura 2a, 3a y 4a).
DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Las propiedades físico-químicas y biológicas de las proteínas se alteran profundamente cuando se someten a la acción de agentes físico-químicos capaces de romper los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras 2a. 3a. y 4a. de las proteínas. De tal forma que la estructura altamente ordenada de una proteína queda reducida al llamado polímero estadístico formado por la cadena de aminoácidos. Estos agentes pueden ser muy diversos y se denominan, en general, agentes desnaturalizantes. En esta práctica se estudiarán algunos de los que se consideran más importantes.
EFECTO DEL CALOR. El calor es uno de los agentes primordiales de desnaturalización, la mayor parte de las proteínas en solución son inestables a temperaturas superiores a 60° C.Las alteraciones que sufre la molécula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insoluoles. Esta propiedad de las proteínas se denomina: coagulación.
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EXPERIMENTO 7 Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, coloque en cada uno 3 mi de una de las siguientes soluciones: TUBO Nc 1 2 3 4
Proteína Peptona Caseína Gelatina Albúmina
Añádales 2 mi de NaCI al 5% . Caliente todos los tubos en baño maría a ebullición por 5 min. Observe cuidadosamente lo que ha ocurrido en cada tubo y escriba: a) sus resultados en la tabla que aparece al final del capítulo. b) ¿Qué papel desempeña el agua en el fenómeno de coagulación?. c) Explique la diferencia entre desnaturalización y coagulación.
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR METALES PESADOS Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinatos insolubles. EXPERIMENTO 8 Coloque en tubos de ensayo numerados, 1 mi de las siguientes soluciones: peptona, gelatina al 2%. Añada 2 gotas de solución de cloruro férrico (FeCI3) al 3 %. Observe lo que sucede en cada caso y a continuación añada un exceso de FeCI3 (si no ocurre precipitación compruebe el pH). Repita este experimento utilizando nitrato de plata (AgNO 3) cloruro mercúrico (HgCI2) y acetato básico de plomo (Pb(CH3-COO)2) todos ai 2%. a)Anote sus resultados en la tabla que aparece al final del capítulo. b) ¿ Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas ? c) ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas?
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PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES. Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando productos de desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas. EXPERIMENTO 9a. Coloque en tubos de ensaye numerados, 3 mi de las siguientes soluciones: peptona, gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de ácido tricloroacético (CCI3COOH) al 5%. a).- Anote sus resultados al final del capítulo b).- ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del ácido tricloroacético y, en general, de cualquier ácido? EXPERIMENTO 9b. Prepare dos tubos de ensaye y márquelos como "orina normal" y "orina de paciente nefrótico", coloque en ellos 3 mi de la orina correspondiente. Agregue en seguida, resbalando cuidadosamente por la pared del tubo para estratificar, 2 mi de la mezcla HNCymetanol. Observe: a)¿ Qué ocurre en la interíase? b)¿Qué explicación le da al fenómeno?
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE SALES. Por regla general, las proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4) Sin embargo, la concentración para precipitar diferentes proteínas es variable. Esta diferencia en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar proteínas, por ejemplo las albúminas y globulinas a,b,g de la clara de huevo. EXPERIMENTO 10. Coloque en tubos de ensaye numerados, 2 mi de las siguientes soluciones: peptona 2% y clara de huevo fresca diluida 1:2. Añada a cada tubo 2 38
mi de solución saturada de sulfato de amonio, agitar y c entrifugar a 3000 rpm durante 5 min. ¿Qué sustancias constituyen el precipitado? Disolver el precipitado en 2 mi de agua destilada y hacer la prueba del biuret (utilizando NaOH al 10% y CuSO4 al 1%) ¿Es negativa o positiva la prueba del biuret? Repita la prueba con un mi del sobrenadante. ¿Qué resultado obtuvo? Al resto del sobrenadante agregúele poco a poco sulfato de amonio sólido agitando para disolverlo en cada caso hasta que la solución se sature. ¿Se forma nuevamente precipitado y por qué? Centrifugar a 3000 rpm por 5' repetir la prueba del biuret en el precipitado y la solución disolviendo el precipitado en un mi de agua destilada. ¿Qué resultado obtuvo en ambos casos? ¿Cuál es la interpretación y la conclusión final con los resultados?
PRECIPITACIÓN POR ALCOHOL Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de proteínas ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatación y por lo tanto las precipitan. EXPERIMENTO 11 Coloque en tubos de ensayo 2 mi de las siguientes soluciones: peptona, caseína, gelatina, albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente agregue 3 mi de alcohol de 96 S y observe lo que ocurre en la interfase. a) ¿Observa turbidez o precipitación en todos los tubos? b) Anote sus resultados en la tabla: c) ¿Qué entiende por fuerza iónica de una solución ? d) Mencione otras sales que se puedan utilizar para precipitar las pro teínas.
TABLA DE RESULTADOS DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS AGENTES -^
CALOR
Fe
Hg
Pb
SUSTANCIASI Peptona Albúmina Gelatina Caseína
39
SULFATO ACIDO TRICLORO- DE AMONIO ACETICO
ALCOHOL 9
DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO Las proteínas, al igual que los aminoácidos son moléculas anfotéricas, es decir, pueden reaccionar con ácidos o con álcalis. En medio ácido las proteínas se combinan con los iones hidrógeno y quedan con carga positiva. En medio alcalino liberan protones y quedan con carga negativa. El pH en el cual una proteína no posee carga eléctrica neta se denomina PUNTO ISOELÉCTRICO, a este pH la proteína presenta su mínima solubilidad y generalmente precipita, teniendo además una viscosidad máxima, propiedades que tomaremos en cuenta para el siguiente experimento. EXPERIMENTO 12 Preparar una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla: Añada primero la caseína, posteriormente el agua y al final el ácido acético. Agite todos los tubos y observe el grado de turbidez o la precipitación que se produce en cada tubo inmediatamente y después de 15' y 30'. a) Anote sus observaciones en la tabla, valorando con cruces. b) Calcule el pH teórico de cada tubo y anótelo en la tabla, aplicando la ecuación de Hendersson-Hasselbalch. No. Tubo-» SUSTANCIAS^
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
1
1
1
1
1
7.8
8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
--
---
---
--
--
---
---
---
1.6
--
---
0.2
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
.----
0.6
1.2
---
---
---
---
---
---
---
Caseína 5% en 1 Acetato de Sodio 0.1N Agua Destilada 8.4 Acido Acético 1N Ácido Acético I 0.1N Acido Acético 0.01 N pH Teórico Observación a los 15 min. Observación a los 30 min.
40
CINÉTICA QUÍMICA Y CATÁLISIS Según la Ley de Acción de Masas, la velocidad de una reacción química depende de la concentración de las sustancias que intervienen en la reacción. Esta ley fue enunciada por Güldberg y Waage en 1867 y establece que: "La magnitud de una reacción es proporcional a la masa activa de las sustancias reaccionantes presentes en ese momento." El término masa activa significa la concentración molecular o sea, cantidad presente por unidad de volumen. Si reaccionan:
La velocidad v, con que reaccionan A y B para producir C y D, depende de la concentración de cada reactivo y de la afinidad que tengan para reaccionar entre sí, pero como ésto se puede considerar constante, podemos decir que: La velocidad v2 con que reaccionan C y D para producir A y B, depende a su vez, de la concentración de C y D y de la afinidad. Por lo tanto podemos decir también que:
Cuando se alcanza el equilibrio químico, las dos velocidades son iguales; es decir: v, = v2
sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:
Como el cociente de dos constantes es siempre igual a una constante, podemos decir que:
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Que es la expresión matemática de la Ley de Acción de Masas y Keq se conoce como Constante de Equilibrio.
PARTE EXPERIMENTAL COMPROBACIÓN DE LA LEY DE ACCIÓN DE MASAS. EXPERIMENTO 1 En un vaso de precipitados de 500 mi de capacidad, añada 100 mi de agua destilada, 0.5 mi de solución de sulfocianuro de amonio (NH 4SCN)0.2 M y 0.5 mi de solución de Cloruro férrico (FeCI 3 0.2 M) en HCI 0.1N mezclando hasta lograr la homogeneidad. Observará la aparición de una coloración roja, debido a la formación de sulfocianuro férrico(Fe(SCN) 3). En cuatro vasos de precipitados de 100 mi. de capacidad, coloque en cada uno 25 mi de la mezcla reaccionante anterior, después de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguida agregue a cada vaso los reactivos descritos en la tabla siguiente: Reactivos-»
Vasoi 1 2 3
L
4
FeC 3(HCI) mi 0.5 1.0 — T E S
NH.SCN mi
T
0.5 1.0 — I G O
NH4CI mi — — 5.0 —
a) Escriba la reacción química que se ha efectuado: b) Observe la intensidad de la coloración en cada vaso y según la ley de Acción de Masas y el Principio de Le Chetelier trate de explicar sus resultados.
CINÉTICA QUÍMICA El objetivo de la cinética química es predecir la velocidad de las reacciones químicas y describir el curso de las mismas. La velocidad de una reacción química puede medirse por varios métodos. Uno de los más utilizados consiste en tomar muestras de la mezcla reaccionante, a un tiempo dado, suspender la reacción y analizar los componentes de la mezcla en ese momento. Esto en ocasiones no es fácil, ya que muchas reacciones en solución acuosa son instantáneas.
42
REACCIONES QUÍMICAS INSTANTÁNEAS La mayor parte de los compuestos inorgánicos y muchos orgánicos que son capaces de ionizarse en agua presentan una elevada reactividad química por lo que solo con técnicas de extremada sensibilidad es posible medir la velocidad de tales reacciones.
EXPERIMENTO 2 2a.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de una solución de nitrato de plata (AgNO3) 0.1 M y añada 1 mi de solución de cloruro de sodio (NaCI) al 1%. Observe la aparición del precipitado, como resultado de la reacción que se efectúa. 2b.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0.1 N agregue 1 gota de solución de fenolftaleína al 0.1% y añada finalmente 6 mi de ácido clorhídrico (HCI) 0.1 N. Agite el tubo.Observe la decoloración que ocurre debido a la reacción. 2c.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de la solución de cloruro férrico (FeCI3) al 1% y añada 5 mi de solución NaOH 0.5 N.Observe la formación del floculado. Escriba en cada caso la reacción química que se ha efectuado: 2a)
2b) 2c) ¿En que condiciones experimentales cree que sea posible medir la velocidad de estas reacciones?
VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA Las reacciones químicas de acuerdo a la teoría del complejo activado, por el número de moléculas que toman parte en ellas se clasifican en: Monomoleculares, cuando participa una sola molécula. Ejemplo: Bimoleculares, cuando participan dos moléculas. Ejemplo: Trimoleculares, cuando participan tres moléculas simultáneamente. Ejemplo:
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Las reacciones trimoleculares son muy raras y reacciones de más de tres reaccionantes no se conocen. Cuando se estudia la cinética de una reacción, tiene más importancia conocer el orden de la reacción que el tipo. El orden de una reacción nos indica la relación entre velocidad y la concentración de los reactivos, por lo que se clasifican en reacciones de: Orden Cero
En estas reacciones la velocidad no es afectada por la concentración. Está determinada por algún otro factor limitante como absorción de luz, velocidad de difusión, etc.
Primer orden
Son aquellas en las que, se ha demostrado experimentalmente, que la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de una de las sustancias reaccionantes.
Segundo orden Son aquellas en las cuales la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de dos sustancias reaccionantes. Tercer orden
Son aquellas en las cuales la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de tres sustancias reaccionantes.
La mayor parte de las reacciones enzimáticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden. Matemáticamente, la reacción puede representarse así: dc/dt = kc dt = tiempo de = concentración del material Kc = constante específica de velocidad de reacción. Si representamos por (a) la concentración inicial de material y por (x) la cantidad que ha reaccionado en el tiempo (t), la expresión (a-x) significa concentración del material en el tiempo (t). La ecuación anterior puede expresarse en función de (a), (x) y (t) y al integrarla nos queda:
Cuando se ha completado la descomposición de la mitad del material, la ecuación se simplifica:
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Donde t/2 es el período de vida media, es decir, el tiempo necesario para que se descomponga la mitad de una cantidad dada de material reaccionante.
DETERMINACIÓN DEL ORDEN DE REACCIÓN. VELOCIDAD DE DESCOMPOSICIÓN DEL H 2O2. EXPERIMENTO 3 a) Coloque en un matraz erlenmeyer de 250mlde capacidad 5 mi de una solución problema de peróxido de hidrógeno (H 2O2) y 2 mi de ácido sulfúrico (H2SO4) 1:6. Caliente la mezcla hasta casi ebullición ¡PRECAUCIÓN! y así, en caliente, titule con una solución de permanganato de potasio (KMnO 4) 0.01 M. El punto final de la titulación lo obsevará cuando persista un ligero color rosa, por exceso de la solución de permanganato. El H2SO4, y el calentamiento tienen por objeto impedir la formación de MnO2. Haga esta determinación por duplicado y si sus resultados no coinciden repita el procedimiento. b) A continuación prepare una mezcla de 50 mi de sangre desfibrinada al 0.06 % y 50 mi de la solución problema de peróxido de hidrógeno. A los 5, 10, 20 y 30 minutos tome alícuotas de 10 mi., trasnfiéralas a un matraz erlenmeyer de 250 mi de capacidad, añada 2 mi de solución de H 2SO41:6, caliente a ebullición y titule con solución de permanganato de potasio 0.01 M, en la forma ya explicada. c) Escriba las reacciones químicas que se han efectuado. d) Resuma sus resultados en la siguiente tabla. t(segundos) 0 300 500 1200 1800
KMnO4 (mi)
(a-x)mol I1
log a/a-x
Kc
Para calcular la Kc a cada tiempo debe utilizar la siguiente ecuación:
e) Determine gráficamente el orden de reacción.
45
INFLUENCIA DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA Desde hace muchos años se sabía en forma empírica que la velocidad de muchas reacciones aumenta cuando se eleva la temperatura. Arrhenius encontró una relación que expresa matemáticamente la forma como la temperatura afecta la velocidad de una reacción, la cual está dada por la siguiente ecuación: La cual indica que el cambio en el logaritmo natural de la constante de velocidad de una reacción, es inversamente proporcional al cuadrado de la temperatura absoluta multiplicada por la constante de los gases. "Ea" es la "energía de activación". Actualmente se considera que, para que las moléculas puedan reaccionar deben ser primero activadas, es decir, requieren una determinada cantidad de energía. Integrando entre límites la ecuación de Arrhenius nos queda:
Si consideramos que Ea = 12000 calorías al aumentar la temperatura de 22aC (295 K) a 32BC, (305 K) tendríamos:
Esto quiere decir que por cada 10°C de incremento, la velocidad de una reacción aumenta al doble. En la mayor parte de las reacciones se observa este aumento bajo ciertas temperaturas límites.
EXPERIMENTO 4 4a) Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mi de capacidad 0.25 g de yoduro de potasio (Kl) y añada 25 mi de solución de H 2SO4 1:6. Agite hasta disolución completa y agregue agua destilada hasta completar 50 mi. 46
Esta solución se denominará "solución de ácido yodhídrico (Hl)", que se utilizará en este experimento y en el siguiente. 4b) Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mi y agregue los reactivos según la tabla que se muestra a continuación:
Hl Na2S2O3 0.02N Almidón Preincubar 5 min a: H2O2 0.2% tiempo de reacción
1
2
3
4
5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 gotas 5aC
5 gotas 25SC
5 gotas 40QC
5 gotas 60sC
5 gotas 90sC
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
Deberá medir con la mayor precisión posible el tiempo desde el momento de añadir el H 2O2 al 0.2 % hasta el momento en que aparece súbitamente un color azul intenso. a) Escriba las reacciones químicas que se han efectuado:
b) Trace la gráfica de tiempo de reacción en las ordenadas contra temparatura en las abscisas.
EFECTO DE LA [H +] SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN QUÍMICA Se sabe que muchas reacciones químicas son afectadas por el pH del medio, sobre todo aquellas en las que participan ácidos. Actualmente se acepta que las moléculas deben ser activadas antes de que puedan reaccionar. Aparentemente el pH ácido favorece la ionización y el estado iónico se puede considerar como un estado activado. EXPERIMENTO 5 a) Prepare una serie de 5 vasos de precipitados de 100 mi de capacidad, numérelos del 1 al 5 y agregue los reactivos según se indican en la tabla siguiente: 47
Hl Na2S2O3 0.02N Almidón H20 dest. HCI.0.01N HCI0.1N HCI1 N HCI2N H2O20.2% tiempo de reacción
1
2
3
4
5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 mi 1.5
5 gotas 5 mi
5 gotas
5 gotas
5 gotas
5 gotas
5 mi 5 mi 5 mi 2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
5 mi 2 mi
b) Según sus resultados trace una gráfica con el tiempo (en segundos), en las ordenadas y [H+] en las abscisas.
Velocidad de reacción y catalizadores La velocidad de una reacción química frecuentemente es afectada por la presencia de "sustancias extrañas" que permanecen inalteradas al terminar la reacción. Cualquier sustancia que sea capaz de acelerar una reacción química y que no sea consumida por ellas, se denomina catalizador y el proceso se conoce con el nombre de catálisis. La función de un catalizador es disminuir la energia de activación, por lo que las moléculas son activadas con menor cantidad de energía produciéndose reacciones más rápidas. En un principio se supuso que los catalizadores actuaban por "presencia", es decir, que no intervenían en los procesos que catalizaban. Sin embargo, actualmente se acepta que el catalizador se combina con el sustrato formando un complejo intermediario inestable y altamente reactivo. Supongamos la reacción:
Esta reacción, en condiciones normales se efectúa muy lentamente, pero si se agrega un catalizador "C" apropiado, tenemos:
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Estas reacciones son rápidas y el catalizador puede ser usado una y otra vez. Estas sustancias pueden ser de naturaleza inorgánica o bien sustancias biológicas producidas por las células, denominadas enzimas.
EFECTO DE UN CATALIZADOR INORGÁNICO SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA La sacarosa es un disacárido no reductor, pero al hidrolizarse, por cada molécula libera una molécula de glucosa y una de fructosa, ambas reductoras. En base a esto es posible visualizar y cuantificar la hidrólisis de la sacarosa midiendo la concentración de azúcares reductores con algún reactivo apropiado. EXPERIMENTO 6 Utilice dos tubos de ensaye y coloque en cada uno 5 mi de solución de sacarosa 0.05M. Un tubo quedará como testigo y al otro se agregarán 3 gotas de H2SO4 1:6. Se colocan ambos tubos en baño maría a ebullición durante 15 minutos, complete el volumen si es necesario. Emplearemos el reactivo de Fehling para revelar la presencia de azúcares reductores, por lo que al tubo que contiene el H 2SO4 se le agrega NaOH al 10% para neutralizar, usando papel indicador para comprobarlo y, posteriormente se añaden a ambos tubos 2 mi de una mezcla del reactivo de Fehling. Debiendo prepararse éste, al momento de usarse, de la siguiente manera: En un tubo de ensaye se colocan 2 mi de la solución "A" y 2 mi de la solución "B" del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente. Una vez agregado el reactivo de Fehling a ambos tubos, se mezclan, se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos, al cabo de los cuales se sacan del baño, se dejan enfriar y se observa si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos a) ¿Se puede considerar al H2SO4 como un catalizador?. ¿Por qué?
EFECTO DE UN CATALIZADOR BIOLÓGICO (ENZIMA) SOBRE LA VELOCIDAD DE HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA Una de las principales diferencias entre los catalizadores inorgánicos y las enzimas es que los primeros sólo son capaces de acelerar un proceso que ya está en marcha, mientras que las enzimas son capaces de iniciar una nueva reacción.
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En este experimento emplearemos como enzima la sacarasa, también conocida como invertasa o fructofuranosidasa la cual es una de las enzimas mejor conocidas y estudiadas. Actúa hidrolizando los azúcares que contienen fructosa. Así, hidroliza la estaquiosa (tetrasacárido), la rafinosa (trisacárido), y alcanza su máxima velocidad con la sacarosa (disacárido).Se puede medir la hidrólisis observando el cambio en la rotación óptica o valorando el poder reductor de los productos obtenidos. EXPERIMENTO 7 Utilice dos tubos de ensaye y coloque en cada uno 2 mi de solución de sacarosa 0.05 M y un mi de solución reguladora de acetato 0.05M a pH de 4.7. Un tubo quedará como testigo y al otro se le agregan 0.2 mi de la solución de invertasa (solución enzimática). Después de mezclar bien el contenido de ambos tubos se colocan en baño maría a 40sC, durante 15 minutos; cuando se ha completado el tiempo se les agrega, a ambos tubos, 2 mi de la solución "A" y 2 mi de la solución "B" del reactivo de Fehling mezclándolos perfectamente. Se colocan en baño maría a ebullición por 5 minutos al cabo de los cuales se sacan del baño y se dejan enfriar. Observe si existe un precipitado rojo de óxido cuproso (Cu2O) en ambos tubos a) Compare este experimento con el anterior y explique qué sucede.
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ENZIMAS FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA La vida depende de una serie de reacciones químicas cuyo curso y velocidad están determinados por la presencia de diversos catalizadores orgánicos denominados enzimas: (del griego: en=en, zymo=fermento). La definición de enzimas dada por Woldschmidt y Leitz las describe como: catalizadores producidos por las células pero que pueden actuar fuera de ellas a diferencia de vitaminas y hormonas. La mayor parte de las reacciones biológicas serían cinéticamente insignificantes si no fuera por las enzimas. La mayor parte de las enzimas desde el punto de vista químico son compuestos que pertenecen al grupo de las proteínas (aunque algunas solo funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prostético o coenzima). Debido a su carácter proteínico, las enzimas son muy sensibles a cualquier cambio físico, químico o fisicoquímico. Así, cualquier cambio en la temperatura, el pH, la fuerza iónica, la adición de sales, la presencia de agentes oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier factor que sea capaz de desnaturalizar a las proteínas será capaz de alterar su actividad.
NATURALEZA QUÍMICA DE LAS ENZIMAS Como ya se dijo, la mayor parte de las enzimas son proteínas simples o complejas. La parte proteínica de las enzimas se denomina APOENZIMA; la parte no proteínica puede ser coenzima, si se separa fácilmente de la proteína. Las coenzimas pueden ser comunes a varias enzimas y no actúan como catalizadores ya que se transforman en la reacción que catalizan y requieren de otra enzima para regenerar su actividad. La mayor parte de las coenzimas están relacionadas con las vitaminas. Si la parte no proteínica se encuentra firmemente unida a la proteína (enlace covalente) y no es posible separarla por diálisis, se denomina grupo prostético. Hay varios factores que afectan la velocidad de una reacción catalizada por enzimas. Algunos de ellos son: temperatura, pH,concentración de sustrato.concentración de enzima e inhibidores.
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Temperatura Las velocidades de las reacciones químicas aumentan al incrementar la temperatura, originando aumento en la energía cinética y en las velocidades medias de las moléculas con el resultado de una mayor probabilidad de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una temperatura óptima, en la cual catalizan con una velocidad máxima. PH La actividad de la mayoría de las enzimas depende del pH, debido a la participación de iones H + o de iones HO en las reacciones, además de que se afecta la de los grupos funcionales. La mayoría de las enzimas tienen un pH óptimo en el cual su actividad es máxima. Concentración de la enzima La velocidad de una reacción aumenta en proporción directa a la concentración de la enzima que la cataliza. La interacción enzima-sustrato cumple la Ley de Acción de Masas. Se emplea con frecuencia la velocidad de una reacción como medida de concentración de la enzima manteniendo fija la concentración de sustrato. Concentración de sustrato Si se trabaja con una concentración fija de enzima la velocidad inicial de reacción aumenta al incrementar la concentración del sustrato, hasta que se alcanza un máximo y la adición de más sustrato ya no influye sobre la velocidad, ya que la enzima se ha saturado.
PARTE EXPERIMENTAL Nota: Recuerde la necesidad de lavar el material de vidrio y de enjuagar con agua destilada.
EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA La velocidad de cualquier reacción cambia al modificarse la temperatura, debido a los cambios de energía cinética. Generalmente por cada 10 s C de cada aumento en la temperatura se duplica la velocidad, esto se conoce como la relación de Van't Hoff, o coeficiente de temperatura QT 10=2.
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Sin embargo, debido a la constitución proteínica de las enzimas, las temperaturas altas producen desnaturalización y una marcada disminución en la actividad catalítica. Para la gran mayoría de enzimas de animales homotermos, la temperatura óptima está alrededor de 37°C; cerca de 60°C. lá mayor parte de las enzimas se inactivan.
EXPERIMENTO 1. Se prepara una serie de siete tubos como se indica:
Sustrato Almidón 8 mg/ml Solución reguladora de fosfatos 0.02M pH == 7.0 Agua Preincubar 5 minutos a: Enzima (Sol. de amilasa salival)*
1
2
—
5 25fi
3
4
5
6
7
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
3 5B
3 25fi
3 40a
3 50a
3 60a
3 92a
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
*La solución de amilasa salival se prepara diluyendo 0.25 mi de saliva en 19.75 mi de H 2O destilada. Esta solución (1:80) debe prepararse utilizando material perfectamente limpio y usarse inmediatamente, ya que las enzimas en soluciones diluidas se inactivan con facilidad. Conservar esta solución en baño de hielo. Todos los tubos se agitan muy bien y se colocan en sus respectivos baños dejándolos durante 15 minutos al final de los cuales se les agrega, incluyendo al tubo No.1 o testigo, 1ml del reactivo 3,5 dinitro salicílico (este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores). Se agitan bien y se colocan en baño maría, a ebullición por 5 minutos, después de lo cual se enfrían y se leen en el fotocolorímetro Klett a 540 nm. usando filtro verde. Se emplea el tubo No. 1 c omo blanco.
RESULTADOS: Temperatura (°C)
5
25
40
50
60
92 í
D.O. a) Con los datos obtenidos trace una gráfica anotando la densidad óp tica en las ordenadas y la temperatura en las abscisas. b) Interprete la gráfica obtenida.
53
EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA El pH es uno de los factores que más afecta la actividad de las enzimas, ya que afecta la estabilidad de la molécula por desnaturalización, o bien afecta su carga eléctrica. Muchos de los grupos ionizables presentes en la molécula de la enzima pueden ser necesarios para la catálisis y los cambios de pH afectan el grado de ionización. Para que se realice la unión en el complejo enzima-sustrato es necesaria una adecuada distribución de cargas en ambas moléculas. El pH óptimo es aquel en el cual ciertos grupos funcionales poseen la carga apropiada para asegurar la formación del complejo ES en las mejores condiciones. Además, como ya se mencionó, los pH extremos provocan desnaturalización de la molécula enzimática y por tanto, inactivación de la misma. Cada enzima posee un pH óptimo en el cual su actividad es máxima; para la mayoría de las enzimas la actividad óptima se encuentra entre los valores de pH de 6 a 8. Sin embargo existen excepciones, por ejemplo, para la pepsina del jugo gástrico es máxima a un pH de 1.5 que es muy ácido, o para la fosfatasa alcalina que se encuentra en huesos y otros órganos cuyo pH óptimo es de 9.5. EXPERIMENTO 2 Prepare una serie de 8 tubos de ensayo, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:
Sustrato (Sol. de almidón 8mg./ml) Sol. Reguladora al pH indicado: mi: Enzima (sol. de amilasa salival) mi:
1
2
3
4
5
6
7
8
—
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
pH=7
H=3 4 H=5 4 H=6 4 H=7 4 H=8 4 H=9 4 =10 4 0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Mezclar e incubar a 40eC por 15 minutos. Terminado este lapso se añade a todos los tubos 0.5 mi de NaOH 2N, se agitan y se les agrega 1 mi de reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico. Colóquelos en un baño de agua a ebullición durante 5 minutos, este reactivo desarrolla un color rojo caoba en presencia de azúcares reductores. Determinar la concentración del azúcar reductor liberado, leyendo la densidad óptica en un colorímetro ó espectrofotómetro a 540 nm. (puede ser necesario diluir la mezcla reaccionante 1 a 6 veces con agua destilada antes de leer),empleando el tubo No. 1 como blanco. 54
RESULTADOS: pH D.O. a).- En base a sus resultados diga ¿Cuál es el pH óptimo de la amilasa salival?
b).- ¿Cuál es el azúcar que se libera en la hidrólisis de este polisacárido? c).- Con los datos obtenidos trace la gráfica correspondiente a D.O. contra pH. d).- Interprete la gráfica obtenida.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA Y DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN Actualmente se acepta que la reacción enzimática se efectúa a través de la formación de un complejo enzima-sustrato, lo cual puede representarse en forma simplificada asi:
Si [E] es la concentración total de enzima y [ES] es la enzima combinada, entonces [E - ES] es la concentración de enzima libre. Recordando la Ley de Acción de Masas, tenemos:
La velocidad de formación (Vf ) del complejo [ES] depende de v, mientras que la velocidad de degradación (Vd) depende de v2+v3. Por lo tanto en el equilibrio tenemos:
Sustituyendo sus valores nos queda:
Dividiendo ambos miembros entre K, y [ES] nos queda:
55
La constante de Michaelis-Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de afinidad. La KM se define como la concentración de sustrato cuando la reacción adquiere la mitad de su velocidad máxima. Cuando ésto sucede:
y por lo tanto, sustituyendo:
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO Si en una reacción enzimática se mantiene constante la concentración de la enzima y todos los demás factores que puedan modificar la actividad, se observa experimentalmente que al aumentar la concentración del sustrato, aumenta progresivamente la velocidad de la reacción hasta llegar a un máximo (velocidad máxima) después del cual ya no se afecta la velocidad aunque se utilicen concentraciones más altas de sustrato. En algunas enzimas se observa incluso una disminución en la actividad si se aumenta demasiado la concentración de sustrato. EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 8 tubos de ensaye como se indica en la siguiente tabla:
Sustrato (sol. alm¡dón)8mg/ml Sol. reguladora 0.02 M.PO4 pH=7.0 Preincubar 5 minutos Sol. enzima (amilasa salival)
1
2
3
4
5
6
7
8
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
7.5 0.0
7.0
6.5
5.5
4.5
3.5
2.5
0.0
8.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
—
Mezclar bien e incubar a 40a C. durante 15 min. Transcurrido este tiempo se añade a todos los tubos con objeto de detener la reacción enzimática, 1 mi del reactivo del ácido 3,5 Dinitrosalicílico; calentar por 5' en baño maría a ebullición. Enfriar y leer cada tubo en el, fotocolorímetro a 540 nm con filtro verde empleando el tubo No. 8 c omo blanco.
56
RESULTADOS: [S] mg/ml D.O. a) En base a sus resultados, trace la gráfica c orrespondiente a D.O. contra concentración de sustrato en mg/ml b) Determinar el valor de la K M para el sistema almidón/amilasa en es tas condiciones.
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA ENZIMA. Durante mucho tiempo se pensó que los catalizadores eran sustancias que actuaban por presencia debido a que presentaban actividad a concentraciones muy pequeñas y a que podían recuperarse inalterados al final de la reacción. Sin embargo.se sabe que la velocidad de reacción de acuerdo a Ley de Acción de Masas, depende de su concentración, de tal manera que la velocidad es directamente proporcional a la concentración de enzima, lo que se expresa como: V = K[E]
La gráfica que se obtiene al expresar la velocidad de reacción en función de la concentración de e nzima es una recta con pendiente positiva. EXPERIMENTO 4 Prepare una serie de 6 tubos siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla: 1
2
3
4
5
6
Sol.sustrato de almidón 8mg/ml
—
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Sol.reguladora fosfatos 0.02M pH=6.9
—
1
1
1
1
1
5
4.9
4.8
4.6
4.2
3.4
0
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Agua Preincubar a 40a durante 5 minutos Sol.enzima (amilasa salival).
57
Después de mezclar el contenido de los tubos, se colocan a baño maría a 409C. por 15 minutos. Pasado este tiempo añada a cada tubo 1 mi del reactivo de ácido 3,5 dinitrosalicílico. Se colocan los tubos en baño maría a ebullición por 5 min. Enfriar y leer la intensidad del color como densidad óptica en el fotocolorímetro a 540 nm. (filtro verde), empleando el tubo No.1 como blanco. RESULTADOS: [E]ml D.O. a) En base a sus resultados trace una gráfica con los valores de D.O. en las ordenadas y la concentración de enzima expresada en mi en las abscisas. b) Interprete la gráfica obtenida.
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OXIDACIONES BIOLÓGICAS De todas las propiedades que posee un ser vivo, quizá la más característica es su capacidad para utilizar y transformar la energía del medio ambiente. Todos los procesos químicos y físicos que están relacionados con la obtención de la energía en un ser vivo se denomina respiración. Sin embargo, este término se utiliza para designar simplemente la entrada y salida de aire de un compartimiento a otro. Un término que cada día se utiliza más como sinónimo bioquímico de respiración es bioenergética, aunque este término es más amplio que respiración, ya que quedan incluidos los procesos fotosintéticos. Todos los procesos químicos que constituyen la respiración conducen a la oxidación de substancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O. Por regla general todas las reacciones de oxidación son reacciones exergónicas, es decir, liberan energía cuando se efectúan; en ocasiones toda la energía se libera como calor, como ocurre cuando se quema u oxida un pedazo de madera. Sin embargo, un organismo viviente no es una máquina térmica y, por tanto, debe poseer un mecanismo enzimático que le permita capturar y almacenar la energía liberada en los procesos de oxidación. La utilización o captura de la energía involucra la participación de enzimas específicas, capaces de catalizar la conversión del ADP en ATP (reacción endergónica). AUMENTOS
ADP + P PROCESOS
-ENERGIA- -ENERGIA-
[OJ
ENDERGONICOS
CO2 + H2O
ATP
REACCIONES DE OXIDO-REDUCCION Un compuesto químico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidación típica es aquella en la cual el oxígeno se une a un compuesto (oxigenación). Otra forma de oxidación es la pérdida de hidrógeno (deshidrogenación). También se oxida un compuesto cuando pierde electrones, o cuando gana valencias positivas.
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Siempre que se efectúa una oxidación, simultáneamente se efectúa una reducción. Es decir, cuando un compuesto se oxida, otro forzosamente debe reducirse. Como son fenómenos que ocurren simultáneamente se denominan fenómenos de óxido-reducción o reacciones REDOX.
OXIDACIÓN POR PERDIDA DE ELECTRONES EXPERIMENTO 1 Coloque en un matraz provisto de tapón con válvula de Bunsen, 0.5g de fibra de fierro (Fe°) y 5 mi de H 2SO4 al 10%. Caliente a ebullición y observe la disolución parcial del Fe. Deje enfriar y diluya el sulfato ferroso (FeSO 4) obtenido con 50ml de agua destilada. La válvula ha dejado escapar el hidrógeno, pero ha impedido la entrada de aire evitando así la oxidación de la sal ferrosa formada mediante la siguiente reacción: Fe0 + H2SO4 => FeSO 4 + H 2 T Para comprobar la presencia de sales ferrosas se coloca en una cápsul a de porcelana 1 mi de solución de sulfato ferroso y unas gotas de ferricianuro de potasio (K3[Fe(CN)6]). La obtención de una coloración o precipitado azul indicará la presencia de sales ferrosas. En otra cápsula de porcelana coloque 1 mi de la solución de sulfato ferroso y unas gotas de solución de sulfocianuro de potasio (KSCN) al 0.5%. La aparición de un color rojo intenso indicará la presencia de sales férricas. A continuación se oxidará la sal ferrosa a sal férrica, para lo cual se colocarán en un matraz erlenmeyer 10 mi de la solución de sulfato ferroso y 3 mi de H2SO4 al 10%, caliente a ebullición y, en caliente, agregue gota a gota una solución de permanganato de potasio (KMnO 4) 0.1 M hasta que persista un color rosa pálido. Para comprobar el paso de sal ferrosa a sal férrica, repita las reacciones con ferricianuro de potasio al 0.5% y sulfocianuro de potasio 0.5%. a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla. Soluciones de: Sulfato ferroso Sulfato Férrico
K3( Fe(CN)6)
60
KSCN
b) Escriba las reacciones de identificación que se han efectuado en cada caso. c) Si el KMnO 4 es capaz de oxidar al sulfato ferroso. ¿Qué compuesto se reduce?. d) Escriba la reacción de oxido-reducción que s e ha efectuado.
OXIDACIÓN POR DESHIDROGENACION EXPERIMENTO 2 La acción de una sustancia reductora como el hidrosulfito de sodio (NaHSO3), forma leucobases (incoloras) cuando actúa sobre colorantes (oxidados) como el azul de metileno (indicador de óxido-reducción). El proceso inverso ( oxidación por perdida de hidrógeno) se puede realizar en diferente condiciones y determinar el tiempo de reacción. Prepare una serie de cinco tubos de ensaye y numérelos. Añada a cada uno 5 mi de una solución diluida de azul de metileno. A todos los tubos agregúeles gota a gota una solución recién preparada de hidrosulfito de sodio y cuente el número de gotas necesario para decolorar completamente la solución de azul de metileno. El tubo número 1 quedará como testigo en reposo, el tubo número 2 se colocará en baño maría a ebullición y se anotará el tiempo necesario para recuperar su color azul. El tubo número 3 se agitará enérgicamente a temperatura ambiente hasta que recupere su color. Al tubo número 4, sin agitarlo y a temperatura ambiente, se le agregarán gotas de peróxido de hidrógeno (H2O2) al 0.4 % y finalmente, al tubo número 5 se le agregarán gotas de cloruro férrico (FeCI3) al 1 % contando el número de éstas, necesario para reoxidar al azul de metileno. a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla. Tubo numero:
1 Testig
3 2 Calor Temp. 4H2O2 5FeCI Amb. 3
Tiempo de re-oxidación del azul de metileno ó número de gotas: b) Escriba la reacción química que se ha efectuado en cada caso.
REACCIONES DE OXIDO-REDUCCION BIOLÓGICAS La importancia del estudio de los fenómenos de oxido-reducción en Biología, se debe a que la mayor parte de energía que utilizan los seres vivos deriva de los procesos de oxidación, considerando a la vida como una
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combustión constante. Es decir, desde el punto de vista químico, la vida es simplemente una cadena de oxidaciones y, en cada oxidación se desprende una determinada cantidad de energía que el or ganismo aprovecha para rea' lizar las funciones vitales y para efectuar fenómenos sintéticos endergónicos. Todas las oxidaciones biológicas se caracterizan por su rapidez y por la suavidad con que se realizan, todas se llevan a cabo en medio acuoso, a pH generalmente neutro y a bajas temperaturas. Esto hace pensar que todos estos procesos son catalizados por enzimas. Warburg fue uno de los primeros investigadores que trató de explicar las oxidaciones biológicas suponiendo una activación del oxígeno. Comprobó que la velocidad de oxidación de varios aminoácidos era aumentada si añadía al sistema "carbón de sangre", pero no, si agregaba "carbón vegetal". Posteriormente pudo comprobar que el hierro que llevaba como impureza el carbón de sangre era el responsable de la catálisis. Su teoría fue demostrada plenamente al lograr aislar una enzima que contiene hierro.Actualmente se sabe que en los tejidos existe un sistema de enzimas que contienen hierro, mediante el cual el oxígeno molecular se activa y actúa como un agente oxidante. Wieland observó que la activación del oxígeno era insuficiente para explicar las oxidaciones tisulares. Consideraba que el proceso básico en la oxidación de los metabolitos es la activación del hidrógeno por la acción de enzimas denominadas deshidrogenasas, las cuales transportan el hidrógeno a diferentes aceptares que pueden ser el oxígeno u otros agentes oxidantes. Szent Gyórgyi concilio las dos teorías al suponer que es necesaria la activación del hidrógeno y también la del oxígeno. Keillin supuso que interviene, como eslabón intermediario, el citocromo. Sin embargo.las oxidaciones biológicas no son tan sencillas, pues se ha comprobado que en la oxidación de cada metabolito intervienen una gran cantidad de aceptores de hidrógeno. La glucosa es el más común de los metabolitos, debido a que es una molécula altamente reducida. Cuando se oxida y pierde sus hidrógenos, la liberación de energía de oxidación no se realiza en forma brusca, sino que intervienen varios transportadores de hidrógeno, y se inicia por la acción de una deshidrogenasa específica que no reacciona directamente con el oxígeno, sino que requiere de intermediarios como el NAD +, flavoproteínas y citocromos. En esta práctica estudiaremos tres complejos enzimáticos; dos que actúan como deshidrogenasas (LDH y DHS) y una oxidasa (citocromooxidasa). Se verá también el efecto de los inhibidores y de cofactores que actúan sobre estas proteínas con actividad catalítica. La demostración de la actividad de las deshidrogenasas se basa en la reducción del azul de metileno (aceptar de electrones), simultánea a la oxidación del sustrato correspondiente.
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DESHIDROGEENASA LÁCTICA EXPERIMENTO 3 Se mata una rata, se disecan los músculos de las patas traseras 8 g; 4 g para la enzima (LDH) y 4 g. para la coenzima (NAD +) además se extrae el hígado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo en otro experimento. 3a).-PREPARACION DE LA COENZIMA ( NAD + ) Se colocan en un matraz erlenmeyer de 125 mi 4 g. de músculo de las patas traseras (cortados en fragmentos pequeños) y se agrega agua destilada en proporción de 1 a 6 ; enseguida se hierve durante 5 minutos, colocarlos en un mortero y triturar perfectamente. Se centrifuga a 3000 r.p.m. durante 15 minutos. Recoger el sobrenadante etiquetarlo como coenzima NAD + y desechar el precipitado . 3b).-PREPARACIÓN DE LA ENZIMA DESHIDROGENASA LÁCTICA (LDH) En un mortero, que previamente se ha mantenido en hielo, colocar los otros 4 g. de músculo de las patas de la rata. Triturar perfectamente agregando una solución fría de NaCI al 0.9% en proporción de 8 mi por gramo de tejido. Este homogenado se transfiere a un vaso de precipitados y se deja reposar en frío durante 30 minutos. Posteriormente centrifugar en frío a 3000 r.p.m durante 15 minutos; el sobrenadante se recupera y se etiqueta como deshidrogenasa láctica (LDH), el precipitado se desecha. Para este experimento se emplea como aceptor de electrones un colorante oxidado (azul de metileno), el cual al reducirse se decolora (leucobase); esta observación podrá hacerse de manera cuantitativa.
63
DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LDH PROCEDIMIENTO: Preparar una serie de tubos como se indica a continuación:
KCN 0.5 % LACTATO1% AZUL DE METILENO 0.002 M AGUA DESTILADA SOBRENADANTE "COENZIMA NAD+" SOBRENADANTE "ENZIMA LDH"
1
2
3
4
1.0 1.0
1.0 1.0
1.0 0
1.0 1.0
0.3
0.3
0.3
0.3
0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
MEZCLAR BIEN EL CONTENIDO DE CADA TUBO. VASELINA
0.5
0.5
0.5
|
0.5
Una vezagregada la vaselina, no agitar el contenido de los tubos e ina cubar en baño maría a 37 C y hacer las observaciones en los tiempos indicados; anote en el cuadro siguiente el "grado de coloración" con "cruces" (de una a tres). a).- RESULTADOS
1
2
3
0 10 20 30 b) Explique sus resultados en base al contenido de cada tubo.
DESHIDROGENASA SUCCINICA (DHS). La deshidrogenasa succínica cataliza la siguiente reacción:
64
4
OBTENCIÓN DE LA FRACCIÓN MITOCONDRIAL DEL HÍGADO DE RATÓN. EXPERIMENTO 4 Cuando el tejido hepático se dispersa en soluciones isotónicas, el núcleo y las mitocondrias permanecen relativamente Inalterados y pueden separarse con facilidad por centrifugación diferencial. A la rata recién sacrificada se le extrae el hígado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo. Pese el hígado obtenido y fracciónelo finamente con las tijeras y prepare cuidadosamente un homogeneizado en un mortero previamente enfriado, añadiendo 9 volúmenes de cloruro de potasio (KCI) 0.15 M frío, por cada gramo de hígado. Realice ésto dentro de una cuba de hielo para mantener la temperatura de la preparación a 4°C. Centrifugue el homogeneizado en frío a 500 rpm por 15 minutos, separe el sobrenadante y nuevamente centrifugue éste ahora a 3000 rpm por 15 minutos, separe el sobrenadante y consérvelo en frío anotando en la etiqueta "SOBRENADANTE DE HÍGADO". El residuo se suspende en 10 mi de KCI 0.15 M y se conserva también en frío, anotando en la etiqueta correspondiente "SUSPENSIÓN DE HÍGADO"
PROCEDIMIENTO: Prepare una serie de tubos de ensaye, numérelos y añada los reactivos correspondientes, de acuerdo con las instrucciones de la tabla siguiente: TUBOS No.^> REACTIVOS EN mil AZUL DE METILENO 0.002 M SUCCINATO DE SODIO 0.1 M MALONATO DE SODIO O.1 M AGUA DESTILADA SUSPENSIÓN DE HÍGADO SOBRENADANTE DE HÍGADO
1
2
3
4
5
6
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.0
0.5
0.5
0.0
0.5
0.5
0.0
0.0
0.5
0.0
0.0
0.5
0.5 0.5
0.5 0.5
0.5 0.5
0.5 0.0
0.5 0.0
0.5 0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
0.5
0.5
MEZCLAR BIEN EL CONTENIDO DE CADA TUBO [VASELINA | O.erTO-5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 65
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en baño maría a 37°C y hacer lecturas en los tiempos señalados, anotando en el siguiente cuadro el grado de coloración, con cruces (de una a tres). a) Resultados
2
1
3
4
5
6
0 10 20 30 b) ¿En cuál de las fracciones de hígado deben encontrarse las mitocondrias y por qué? c) Describa cómo actúa el malonato de sodio en esta reacción. d) Explique sus resultados en base al análisis del contenido de cada tubo.
LOCALIZACION Y DEMOSTRACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE CITOCROMO-OXIDASA. La citocromo-oxidasa es la última enzima de la cadena respiratoria y es la responsable de la "activación del oxígeno" para oxidar a los citocromos. Tanto los citocromos como la citocromo-oxidasa son metalo proteínas (porfirinas). La citocromo-oxidasa se caracteriza por su elevada sensibilidad al cianuro (CN) y al monóxido de carbono (CO). En el año de I885 Ehrlich reportó la reacción del indofenol. Observó que inyectando alfa naftol y dimetil-para -fenilendiamina en animales se formaba en los tejidos una sustancia azul, llamada azul de indofenol. La enzima se denominó indofenol-oxidasa, pero posteriormente se ha podido comprobar que esta enzima sólo oxida al citocromo c, el que a su vez oxida al indofenol; por lo que ahora se le conoce como citocromo- oxidasa. EXPERIMENTO 5 Prepare una serie de tubos de ensaye y numérelos. Añada a cada uno los reactivos de acuerdo a las instrucciones de la tabla siguiente:
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1 Sol.alfa-naftol 0.15%enetanolal 10% Sol. dimetil- para fenilen-diamina 0.15% H2O Sol. *KCN 0.01% 0.5ml = 10 gotas Sobrenadante de hígado Suspensión de hígado * No pipetear.
2
0.5
3
4
5
6
7
0.5 0.5 0.5 0.5
0.5 0.5
8
9
10
0.5 0.5 0.5
0.5 0.5 0.5 0.5
0.5 0.5
1.0 1.5 1.5 2.0 0.5 1.0 1.5 1.5 2.0 0.5
1.0 1.0 1.0
0.5
—
1.0
—
0.5
1.0 1.0 1.0
1.0
Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparición del azul de ¡ndofenol y anote sus resultados en la siguiente tabla. a)Resultados: TUBO No-> TIEMPO (m¡n)¿
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 10 20 30 b) Escriba la reacción de formación del azul de indofenol. c) ¿Explique por qué no se usó vaselina en este experimento? d) Explique sus resultados en base al análisis del contenido de cada tubo.
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ÁCIDOS NUCLEICOS Una de las principales características de un ser vivo es la forma tan ordenada como realiza sus funciones. El control de todos los procesos vitales que realiza una célula, como son la transformación de energía en sus diferentes formas, la síntesis de moléculas propias, la degradación de los metabolitos, el transporte de diferentes materiales a través de sus membranas, la formación de nuevas células, la diferenciación celular, la creación de nuevos seres, etc., se puede explicar debido a la existencia de proteínas específicas, fundamentalmente las enzimas, sin embargo, es indispensable saber cómo se producen las enzimas y cómo se controla su producción y su actividad. Se han descrito unas meléculas presentes en todos los seres vivos, que son las que poseen la información necesaria para controlar la biosíntesis de proteínas y, por lo tanto, controlar todos los procesos vitales. -Más aún, rompiendo la máxima bioquímica de que "todas las enzimas son proteínas", se descubrió (1982-1983) que algunos RNA pueden funcionar como enzimas.- Estas moléculas son los llamados ácidos nucleicos.es decir, el ácido desoxirribonucleico (DNA) y el ácido ribonucleico (RNA). Los ácidos nucleicos reciben este nombre debido a que el año de 1871, el químico suizo, Friedrich Miescher, logró aislar del núcleo celular una sustancia que llamó nucleína, la cual debido a su carácter ácido se denominó posteriormente "ácido nucleico". Sin embargo, existen otros tipos de ácidos nucleicos. El ácido desoxirribonucleico se encuentra fundamentalmente en el núcleo y es el que posee la información genética, trasmite esta información al citoplasma y por ser capaz de replicarse puede trasmitir la información de padres a hijos. En la célula normalmente existen 3 tipos de ácidos ribonucleicos, que son: el ácido ribonucleico ribosomal (RNAr), el ácido ribonucleico mensajero (RNAm) y el ácido ribonucleico soluble o de trasferencia (RNAt). El RNAr se encuentra en los ribosomas y su P.M es de 2 000 000. El RNAm tiene un P.M de 300 000, se forma en el núcleo y lleva la información al citoplasma. El RNAt tiene un P.M de 25 000 a 30 000 y se encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomoléculas más grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular va 1.000.000 a 1000.000.000. Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con proteínas fuertemente básicas (histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoproteínas. La estructura química es similar en todos los ácidos nucleicos, todos están constituidos por bases púricas, bases pirimídicas, un azúcar y un ácido fosfórico. El DNA tiene como bases púricas adenina y guanina, como bases pirimídicas citosina y timina, como azúcar la 2-desoxirribosa y ácido fosfórico
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Los ácidos ribonucleicos tienen como bases púricas la adenina y guanina, como bases pirimídicas uracilo y citosina, como azúcar D-ribosa y ácido fosfórico. Los ácidos nucleicos son macrornoléculas formadas por la unión de varios nucleótidos. Un nucleótido se puede considerar como un éster fosfórico de un nucleósido, que es la unión de una base púrica o pirimídica con un azúcar. Los mononucleótidos se unen entre sí por medio de un enlace fosfodiéster 3'- 5', formando los polinucleótidos. En esta práctica se aislará DNA de bazo y se estudiarán algunas de las principales propiedades tanto del DNA como del RNA.
PARTE EXPERIMENTAL OBTENCION DE DNA DE BAZO. Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las células o tejidos que se van a utilizar como materia prima. En el caso de DNA esta selección es en especial importante porque el contenido del DNA es pequeño en la mayor parte de las células. La célula ideal es aquella que tenga una relación núcleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y células del tumor ascítico de Ehrlich. Sin embargo, no es fácil obtener este tipo de células, por lo que, frecuentemente se usan órganos típicamente linfoides, como el timo y el bazo. El primer paso en la extracción de DNA es la homogeneización del te jido. Este paso puede degradar en parte, la molécula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, aunque en este experimento la degradación no es importante. La solución reguladora es de citrato 0.01 M y NaCI 0.14M, el pH 7.2 - 7.4; la fuerza iónica de esta solución hace insoluble a la desoxirribonucleoproteína. Si se centrifuga este homogeneizado, en el sedimento quedarán los residuos celulares y las desoxirribonucleoproteínas insolubles. En el sobrenadante se escontrarán todos los compuestos solubles, entre ellas la mayor parte de los ácidos ribonucleicos. Al homogenizar el tejido se liberan varias enzimas de los lisozomas, entre ellas la DNAasa, la cual es capaz de destruir por despolimerización el DNA. Se sabe que el Mg++ es indispensable para la actividad de esta enzima:si en la solución existe citrato, éste se une al Mg ++ e impide la acción de la DNAasa. Otra forma de evitar la acción hidrolítica de la enzima es trabajar a temperaturas bajas (0 a 2°C). El siguiente paso en la purificación está basado en que las desoxirribonucleoproteínas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas, mientras que la mayor parte de las proteínas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solución cte NaCI 2.6M y se centrifuga, el residuo insoluble estará formado fundamentalmente por proteínas, mien69
tras que el DNA permanecerá en solución. Este DNA se puede precipitar selectivamente por la adición de 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% formándose un precipitado blanco fibroso, el cual se puede recoger por rotación de un agitador de vidrio con pequeñas salientes. EXPERIMENTO 1. Se utilizará en este experimento bazo, el cual debe recolectarse inmediatamente después de la muerte del animal y colocarse en una solución reguladora de citrato 0.01 M - NaCI 0.14M pH 7.2 heleda. Después de 30 minutos se corta en pedazos de aproximadamente 3 cm., se congela a -20°C y se mantiene en esas condiciones hasta el momento de iniciar la extracción. Nota: Antes de iniciar la homogeneización compruebe que las soluciones de citratos - y NaCI estén frías y consérvelas en baño de hielo a temperatura de 2QC durante el experimento. Tome una muestra del bazo congelado y anote su peso exacto (10-15 g). Coloque aproximadamente 150 mi de la solución reguladora de citrato 0.01 M NaCI 0.14M, pH 7.2 fría, en una licuadora cuyo vaso haya sido previamente enfriado. Haga funcionar la licuadora a baja velocidad y vaya añadiendo los trozos de bazo congelado uno a uno, esperando a que se macere completamente el primero antes de añadir el segundo y asi sucesivamente. Una vez terminada la adición continúe homogeneizando por 30-60 segundos más. Se coloca el homogeneizado en tubos de centrifuga apropiados teniendo cuidado de tarar perfectamente los tubos opuestos (consulte a su maestro),.se centrífuga por 15 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante se desecha. El residuo soluble se lava con 50ml de citrato 0.01 M-NaCI 0.14M, pH 7.2, agitando con ayuda de una varilla de vidrio hasta volver a homegeneizar. Se vuelve a centrifugar a 5000 rpm por 5 minutos. El sobrenadante se desecha. Al sedimento insoluble que contiene el DNA y residuos celulares se le añaden 50 mi de NaCI 2.6M frío y se homogeneiza por agitación o con ayuda de la licuadora a baja velocidad, por 1 minuto. El ácido desoxirribonucleico es soluble en esta solución mientras que la mayor parte de las proteínas son insolubles, centrifugar a 1000 rpm durante 20 minutos. El líquido sobrenadante contiene el DNA en solución y el sedimento,que contiene restos celulares y proteínas insolubles, se desecha. La solución salina sobrenadante se coloca en un vaso de precipitados y se añaden lentamente 2 volúmenes de alcohol etílico al 95% , procurando que la fase alcohólica quede en la parte superior. Se deberá observar la formación de un precipitado blanco, denso.en la ínterfase. Utilizando un agitador con pequeñas salientes agite esta mezcla lentamente procurando enrollar sobre el agitador las fibras del DNA precipitadas. En esta forma recolecte todo el DNA que pueda y transfiéralo a un frasco que contenga 100 mi de agua. El DNA debe disolverse. Conserve esta solución para los otros experimentos.
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a) Explique por qué se utilizó bazo como materia prima y no otro órgano cualquiera b) ¿Sería conveniente utilizar solución reguladora de fosfatos para la extracción del DNA, por qué ? c) ¿Por qué es conveniente trabajar durante toda la extracción a baja temperatura?
CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL DNA. Existen varios métodos para identificar y cuantificar a los ácidos nucleicos. El método más utilizado es el espectrofotométrico, el cual está basado en que tanto el DNA como el RNA absorben a 260 nm. La absorbancia es proporcional a la concentración del ácido, por lo tanto, el medir la absorbancia es un método cuantitativo muy sensible y sencillo, pero no distingue entre DNA y RNA. Es de gran utilidad cuando las muestras están puras. Una reacción muy utilizada para identificar y cuantificar DNA es la llamada reacción de Dische, la cual está basada en que el reactivo de difenilamina, reacciona específicamente con el DNA dando una coloración azul cuya intensidad es proporcional a la concentración del DNA. En realidad, la especificidad de esta reacción no es absoluta, ya que la difenilamina es un reactivo específico para las 2-desoxipentosas en general, pero en condiciones normales la cantidad de azúcares capaces de interferir son despreciables. EXPERIMENTO 2. Prepare una serie de 6 tubos de ensaye numérelos del 1 al 6. Mida con una pipeta cuidadosamente 2 mi de solución patrón. Esta solución tiene una concentración de DNA de 1mg/ml colóquela en el tubo No.1. Añada a los tubos No. 2, 3, 4 y 5; 2ml de agua destilada. Agregue al tubo No. 2, 2ml de la solución patrón; mezcle perfectamente y transfiera 2 mi de esta mezcla al tubo No.3;se mezcla el contenido y se transfieren 2 mi al tubo No.4. De este tubo se toman 2 mi yse desechan. El tubo No.5 será el blanco y en el tubo No.6 se colocan 2ml de la solución de DNA problema. Añada a todos los tubos 4 mi del reactivo de Dische y agite vigorosamente y coloque los tubos en baño maría a ebullición por 10 minutos. Inmediatamente después coloque los tubos en un baño de hielo-agua durante 5 minutos con objeto de enfriar su contenido rápidamente. Los tubos con DNA desarrollan una coloración azul característica con un máximo de absorción a 600 nm. La intensidad de la coloración se puede 71
determinar cuantitativamente en el espectrofotómetro. Determine la absorbancia a de todos los tubos utilizando el tubo No.5 como blanco. a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla: TUBO 1 2 3 4 5 6
CONCENTRACIÓN DE DNA 1 mg / mi 0.5mg / mi 0.25 mg / mi 0.125 mg/ml 0 Problema
ABSORBANCIA A 600 nm.
b) Con los datos de la tabla anterior construya la curva tipo, absorbancia contra mg de DNA ). c) Interpolando la absorbancia del tubo No.6 encuentre la concentración de DNA (mg/ml) y calcule la cantidad total de DNA en su problema
CARACTERIZACIÓN Y ANÁLISIS CUANTITATIVO DEL RNA. El RNA puede ser cuantificado por espectrofotometría, como ya se explicó. Sin embargo, la reacción más utilizada para identificar y cuantificar el RNA es la reacción del orcinol, la cual se caracteriza por dar una coloración verde en presencia de cualquier RNA. La reacción del orcinol es una modificación de la reacción de Bial para pentosas y es, por lo tanto, poco específica. Sin embargo, cuando se trata de muestras con cierto grado de pureza, esta reacción puede ser utilizada para análisis cuantitativos. EXPERIMENTO 3. Prepare una serie de 6 tubos de ensaye y numérelos del 1 al 6. Añada a los tubos, 2,3,4 y 5; 3 mi de agua destilada; al tubo No.1, 3 mi de la solución patrón de RNA que contendrá 0.300 mg de RNA/ml. Añada 3 mi de la misma solución patrón al tubo No.2, mezcle bien el contenido y transfiera 3 mi de esta solución al tubo No.3;mezcle el contenido del tubo No.3 y añada 3 mi de esta solución al tubo No.4, mezcle bien el contenido y tome 3 mi de esta solución y deséchelos. El tubo No.5 será considerado como blanco y al tubo No.6 se le añade 3 mi de solución problema. Añada a todos los tubos 6 mi del reactivo de orcinol ácido y 0.4 mi del reactivo del orcinol-alcohol. Se mezcla el contenido y se colocan en baño maría a ebullición por 20 minutos. Una vez fríos se determina la absorbancia de cada tubo a 660 nm.
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a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla: tubo No. 1 2 3 4 5
6
Concentración de RNA mg/ml 0.300 0.150 0.075 0.0375 0 Problema
Absorbancia a 660 nm
__ u
b) Con los datos de la tabla anterior trace la curva tipo, absorbancia contra mg de RNA c) Interpole los valores de absorbancia de su problema y determine la concentración real en mg/ml.
DETERMINACIÓN DEL FOSFATO TOTAL. Los fosfatos son uno de los constituyentes tanto del DNA como del RNA, ya que a éstos se unen una base nitrogenada y azúcar para dar los nucleótidos correspondientes esterficándose los (OH) del fosfato con los (OH) del azúcar en posición 3' o 5'. EXPERIMENTO 4. Para efectuar la determinación colorimetrica con el molibdato de amonio se empleará una muestra que ha sido previamente digerida.
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Preparar una
Acetato 0.1 M Buffer acetato 0.1MapH4.0 Reactivo molibdato (2.5%) Agua destilada Sol. Vit. C 1 % Reciente Sol.tipo
1nM/ml Sol. tipo 2.5nM / mi
Sol. tipo 5^M / mi Problema DNA Problema RNA
serie de 6 tubos como se indica en la siguiente tabla: 1
2
3
4
5
6
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5ml
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
2 mi
-
-
-
-
-
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
-
2 mi
-
-
-
-
-
-
2 mi
-
-
-
-
-
-
2 mi
-
-
-
-
-
-
2 mi -
2 mi
Dejar los tubos en reposo a temperatura ambiente durante 30 min y leer la absorbancia a 660 nm, tomando como blanco el tubo No.1 a) Con los datos obtenidos con las soluciones tipo, construya la curva tipo para fosfato.( D:O contra concentración en umol / mi). b) Interpolando la densidad óptica contra los pobiemas de RNA y DNA calcule la cantidad total de fosfatos en sus muestras. c) ¿Cómo afecta el medio ácido al enlace 3'- 5' -diéster fosfato? d) ¿Cómo afecta el medio alcalino al enlace 3'- 5'-diéster fosfato?
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GLUCIDOS Los glúcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehídicos o cetónicos reales o en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su molécula uno o más carbonos asimétricos. Estos compuestos se encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeñando importantes funciones estructurales y energéticas. Debe recordarse que todas las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales, o sea, grupo alcohólico, y grupo carbonilo (aldehídico o cetónico). Los glúcidos se clasifican, según el número de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos: monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Los monosacáridos son aquellos que por hidrólisis no se pueden desdoblar en compuestos más sencillos, a su vez se subdivíden,según el número de carbonos que contengan, en: triosas, tetrosas, pentosas, hexosas, etc. Los oligosacáridos son aquellos glúcidos que por hidrólisis dan pocas moléculas de monosacáridos. En la naturaleza existen varios disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa, etc.), unos cuantos trisacáridos, tetrasacáridos y pentasacáridos libres. Se pueden obtener por síntesis química en el laboratorio o por degradación hidrolítica de polisacáridos. Los oligosacáridos poseen propiedades físicas similares a las de los monosacáridos. Los polisacáridos son aquellos que por hidrólisis dan muchas moléculas de monosacáridos. Desde el punto de vista fisiológico se dividen en dos grupos; polisacáridos estructurales y polisacáridos nutrientes o de reserva. Entre los primeros tenemos en vegetales, la celulosa, ácidos pécticos, y hemicelulosas. En los animales los más importantes son los llamados mucopolisacáridos, tales como el ácido hialurónico, condroitin sulfato, abundantes en varios tejidos y líquidos como el cuerpo vitreo del ojo, cordón umbilical, líquido sinovial, tendones, cartílagos, etc. Entre los polisacáridos nutrientes o de reserva los más importantes son, en los vegetales, almidones e inulina y en los animales, glucógeno.
OBTENCIÓN DE GLUCIDOS DE FUENTES NATURALES. Por regla general las propiedades físicas y químicas de los polisacáridos son lo suficientemente diferentes de las otras sustancias presentes en los organismos lo cual permite una rápida y fácil separación. La mayor parte de los otros componentes como proteínas y ácidos nucleicos en presencia de ácido tricloroacético precipitan, mientras que los polisacáridos permanecen en solución; esta propiedad y la de ser poco solubles en alcohol se utilizan para separarlos de otras sustancias hidrosolubles. 75
PARTE EXPERIMENTAL OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO HEPÁTICO DE RATA. EXPERIMENTO 1. Se matan dos ratones por descerebración ,uno excitándolo previamente durante 10 minutos y otro sin excitación .En ambos casos se diseca el hígado y se coloca sobre hielo molido. Una vez frío, se pesa lo más exacto posible y se anota el peso. Se corta en pequeños pedazos y se coloca en un mortero previamente enfriado que contenga 1 mi. de ácido tricloroacético al 10% por cada gramo de tejido. Se muele, con precaución, hasta obtener una pasta homogénea. Este homogeneizado se coloca en un tubo de centrífuga teniendo cuidado de vaciar completamente el contenido. Se centrífuga a 4000-5000 r.p.m. durante 5 minutos (recuerde la necesidad de tarar con el tubo opuesto). El líquido sobrenadante se decanta en otro tubo, el residuo se desecha. Añada lentamente 2 volúmenes de alcohol etílico al extracto del ácido tricloroacético, agitando constantemente. Deje reposar la mezcla hasta que observe un precipitado. (Si no hay precipitado añada un poco de cloruro de sodio en cristales y caliente ligeramente el recipiente).Pese un tubo de centrífuga vacío y reciba el precipitado formado, centrifugue por 5 minutos a 5000 r.p.m. Elimine el liquido sobrenadante y lave su precipitado con 3 mi. de alcohol etílico al 95%, (agitando enérgicamente) vuelva a centrifugar y elimine el sobrenadante, repita el lavado con 3 mi. de alcohol etílico absoluto y centrifugue finalmente con 3 mi. de éter etílico. Deje secar el precipitado al aire. Una vez seco, pese el tubo nuevamente y por diferencia determine el peso del glucógeno obtenido, anote sus resultados en la tabla siguiente. (Guarde el glucógeno obtenido para la prueba de lugol). (Experimento 12) DATOS Peso del hígado Peso del glucógeno seco % de glucógeno
RATÓN NO EXCITADO
RATÓN EXCITADO
a) ¿Por qué es necesario enfriar el hígado y los reactiv os en las prime ras etapas de la purificación? b) Compare y discuta los resu ltados obtenidos. c) ¿Por qué cree usted que escogimos como material hígado y no otro órgano?
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PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS GLÚCIDOS. Los glúcidos reciben este nombre debido a que la mayor parte de ellos se caracterizan por tener sabor dulce. Sin embargo, esta propiedad la presentan solamente los monosacáridos y los oligosacaridos, ya que los polisacáridos generalmente son insípidos. Otras propiedades que nos permiten diferenciar glúcidos de bajo peso molecular (monosacáridos y oligosacaridos) de los de elevado peso molecular (polisacáridos), es su solubilidad en agua y su capacidad para cristalizar.
SABOR EXPERIMENTO 2. Determinar cuidadosamente el sabor de los siguientes glúcidos: glucosa, maltosa, almidón y celulosa. a) ¿Qué glúcidos tienen sabor dulce? b) ¿Cuales son insípidos? c) ¿Cómo explica esta diferencia?
SOLUBILIDAD EXPERIMENTO 3. Determine la solubilidad a temperatura ambiente y en caliente (en baño maría a ebullición) de glucosa, sacarosa, almidón y celulosa en los siguientes solventes: agua, alcohol etílico y benceno. Anote sus resultados en la siguiente tabla: AGUA T.Amb.
ALCOHOL
GLUCOSA SACAROSA ALMIDÓN CELULOSA
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BENCENO
ESTRUCTURA CRISTALINA. EXPERIMENTO 4 Examine al microscopio los siguientes glúcidos: glucosa, sacarosa, almidón y celulosa y haga los esquemas correspondientes: a) ¿Cuáles de estos glúcidos tienen estructura cristalina, por qué?
PROPIEDADES QUÍMICAS DE LOS GLÚCIDOS. Las propiedades químicas de los glúcidos dependen de sus grupos funcionales. Todos los glúcidos poseen en su molécula grupos alcoholes y grupos carbonilos, ya sean, aldehídico o cetónico. Sin embargo, en algunos glúcidos estos grupos pueden estar bloqueados y, por lo tanto, su reactividad química estará ausente. Una característica química de los aldehidos y cetonas es su carácter reductor, todos los monosacáridos , oligosacáridos y polisacáridos que tengan libre el grupo aldehídico o cetónico serán reductores,mientras que los oligosacáridos y polisacáridos que tengan bloqueados estos grupos serán no reductores. Todos los glúcidos formados por varios monosacáridos (oligo o polisacáridos), se pueden hidrolizar por acción enzimática o de ácidos, dando como producto final los monosacáridos y liberando los grupos reductores bloqueados. Existen varias reacciones químicas que se utilizan para la identificación de los glúcidos, algunas son generales y otras son específicas para determinado tipo o incluso específicas para cada azúcar. Entre las más utilizadas tenemos:
REACCIÓN DE MOLISCH-UDRANSKY. Es una reacción general para todos los glúcidos, debido a que el ácido sulfúrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y deshidrata a los azúcares obteniéndose furfural o hidroximetilfurfural como producto final y estas sustancias son capaces de reaccionar con el oc-naftol formando un compuesto color violeta en la interfase. Esta prueba es una de las mas sensibles, la dan positiva soluciones de glucosa al 0.001 % y soluciones de sacarosa al 0.0001%. Sin embargo, la reacción no es específica, ya que la dan positiva los aldehidos, las cetonas y algunos ácidos orgánicos tales como fórmico, oxálico, láctico, cítrico, etc. EXPERIMENTO 5. Colocar en una gradilla 6 tubos de ensaye, poner en cada uno 3 mi. de una de las siguientes soluciones: 78
Tubo No. 1 2 3 4 5 6
Solución formaldehído glucosa fructosa arabinosa sacarosa almidón
Clasificación
Resultado
Añadir a todos los tubos, 3 gotas del reactivo de Molisch (solución de cc-naftol al 0.5% en alcohol). Mezclar bien. Posteriormente añadir a todos los tubos lentamente 1 mi. de ácido sulfúrico concentrado, estratificando (inclinando el tubo y dejando resbalar el ácido por las paredes). La reacción es positiva si aparece en la interfase un anillo de color violeta. a) Diga cuál de estas soluciones da positiva la reacción. b) ¿Se puede considerar como una reacción útil para diferenciar un glúcido de otro? ¿Por qué? c) ¿Qué utilidad puede tener la reacción de Molisch-Udransky? d) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DE FEHLING La mayor parte de las pruebas para el análisis cualitativo y cuantitativo de azúcares se basa en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no sea específica de ellos.Se sabe que los azúcares reductores son capaces de reducir diversos iones metálicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc., cuando se encuentran éstos en solución alcalina. Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son sensibles y puede usarse la misma reacción para un análisis cualitativo o cuantitativo. EXPERIMENTO 6. En 5 tubos de ensaye se colocan 2 mi. de la solución A y 2 mi. de la solución B del reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de los siguientes azúcares: Tubo No. 1 2 3 4 5
Solución glucosa fructosa arabinosa sacarosa almidón
Clasificación
79
Resultado
Se colocan en baño maría los tubos a ebullición y se mantienen por 3 minutos, al cabo de los cuales se dejan enfriar (no deben enfriarse con agua fría) y se observan. El mecanismo de la reacción se lleva a cabo debido a que algunos compuestos orgánicos que contienen uno o más grupos alcohol en su molécula, en este caso el tartrato de sodio, reaccionan en solución alcalina con los hidróxidos metálicos, formando un ion complejo soluble, el cual se disocia muy poco, pero los iones que deja en libertad son suficientes para que se produzcan las reacciones de coloración. La formación de este complejo es esencial para que se produzca un precipitado con la mayor parte de los metales pesados. a) ¿Qué azúcares dan positiva la reacción de Fehling? b) Explique por qué algunos azúcares dan negativa la reacción? c) Mencione 3 sustancias que usted considere puedan dar positiva la reacción de Fehling y no sean azúcares: d) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DEL ACIDO PICRAMICO. Esta reacción también la dan positiva todos los azúcares reductores y tiene como base la reducción del ácido pícrico, de color amarillo intenso, a ácido picrámico, de color rojo caoba. EXPERIMENTO 7. PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIÓN DE GLUCOSA EN ORINA. Colocar 1 mi. de orina normal en un tubo de ensaye. En otro tubo 1 mi. de orina de diabético. Añadir a los 2 tubos 1 mi. de solución de ácido pícrico y 0.5 mi. de NaOH al 5%. A continuación se añaden 5 gotas de acetona al 50% y se colocan los tubos en baño maría a ebullición por 12 minutos y se observa la coloración en los tubos. Se puede hacer la determinación cuantitativa del azúcar comparando la intensidad de la coloración con patrones previamente controlados. a) ¿Cómo explica la diferencia de coloración en las muestras de orina utilizadas? b) ¿Es específica esta reacción para glucosa? c) Escriba la reacción que se efectúa
d) ¿Qué otras sustancias presentes en orina son reductoras?
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REACCIÓN DE BARFOED. El reactivo de Barfoed es una solución de acetato cúprico en ácido acético, y, una vez más, se determina la. capacidad de los azúcares para reducir el ¡ón cúprico a cuproso (Cu 20). Esta reacción sirve para diferenciar un monosacárido de un disacárido, ya que los primeros a los 3 minutos reducen el reactivo y los disacáridos necesitan mas tiempo para que se lleve a cabo la reacción de reducción, mas o menos unos 15 minutos. EXPERIMENTO 8. Se colocan 4 tubos de ensaye y a cada uno se le agregan 3 mi. del reactivo de Barfoed y 1 mi. de una de las siguientes soluciones de glucidos: Tubo No. 1 2 3 4
Sustancia Glucosa Arabinosa Lactosa Maltosa
Clasificación
Resultado
Se colocan en baño maría observando y anotando el tiempo que tarda en aparecer el precipitado de óxido cuproso rojo. a) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DE BIAL Esta reacción sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo consiste en una solución de orcinol en HCI concentrado con una pequeñísima cantidad de FeCI3. El fundamento de esta reacción, igual que la reacción de Molisch, la de Seliwanoff y otras, se basa en la producción de furfural o hidroximetil furfural cuando se calienta con ácidos concentrados y la condensación de éstos con otras sustancias dando productos coloridos, en este caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o café. EXPERIMENTO 9. En tubos de ensaye se colocan 3 mi. del reactivo de Bial. ¡PRECAUCIÓN!. Añádale 0.2 mi. de las siguientes soluciones: Tubo No. 1 2 3
Sustancia Glucosa Arabinosa Agua
Clasificación
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Resultado
Caliente los tubos ligeramente sobre la flama del mechero, hasta que se inicie la ebullición, retire de la flama, diluya cada tubo con 10 mi. de agua y agregue 2 mi. de butanol. Agite los tubos, deje reposar y haga su observación. a) Explique las diferencias observadas
REACCIÓN DE SELIWANOFF Esta reacción sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas reaccionan rápidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El reactivo es una solución de resorcinol al 0.05% en HCI l:3 recién preparado. Este compuesto es el que se condensa con el furfural o sus derivados dando productos coloridos. EXPERIMENTO 10. En 3 tubos de ensaye se coloca 1 mi. de los azúcares que se mencionan abajo y agregue a cada tubo 0.5 mi. del reactivo y caliente en baño a ebullición exactamente 60 segundos. Anote sus resultados y continúe calentando y observando el cambio de color a intervalos de 1 minuto durante 5 minutos. Tubo No. 1 2 3
Sustancia Glucosa Fructosa Agua
Clasificación
Resultado
Las cetosas dan una coloración rojo fuego y las aldosas la dan muy débil y muy lentamente. a) ¿Observó alguna diferencia en las soluciones? b) Escriba la reacción que se efectúa:
FORMACIÓN DE OSAZONAS. Esta reacción es una de las de mayor utilidad para la identificación de azúcares por ser específica para cada azúcar. La dan positiva tanto los monosacáridos como los disacáridos reductores, sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en frío y los puntos de fusión
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EXPERIMENTO 11. Se colocan en un tubo de ensaye 0.1 g. de un carbohidrato, 0.2 g. de clorhidrato de fenilhidracina, 0.3 g. de acetato sódico anhidro y 2 mi. de agua, se agita, se tapa el tubo con un tapón de papel procurando que no quede muy cerrado, se coloca en baño maría a ebullición, agite ocasionalmente, observe el tiempo que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en frío o en caliente. La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa y la lactosa en frío por lo que después de 20 minutos de calentamiento se deben retirar del fuego. a) Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por usted y las preparadas por sus compañeros de grupo. b) Haga un esquema de los cristales.
c) ¿Por qué la glucosa, la mañosa y la fructosa dan la misma osazona? d) Escriba la reacción que se efectúa:
REACCIÓN DE LUGOL El reactivo de lugol es una solución de yodo en yoduro de potasio. Este reactivo reacciona con algunos polisacáridos como los almidones, glucógeno y ciertas dextrinas formando un complejo de inclusión termolábil que se caracteriza por ser colorido, dando color diferente según las ramificaciones que presenta la molécula. EXPERIMENTO 12 En un tubo de ensaye se colocan 2 mi. de solución de almidón, en otro se colocan 2 mi. del glucógeno que obtuvo en el experimento 1, disolviendo 20 mg. en 2 mi. de agua calentando ligeramente, añada una gota de lugol y anote el color producido en cada uno de los tubos. El tubo que contiene el almidón se calienta a ebullición y se deja enfriar nuevamente observando lo que ocurre con la coloración. a) ¿Por qué el complejo almidón-yodo es termo|ábil? b) ¿Se puede considerar la reacción del lugol característica para cual quier polisacárido? 83
HIDRÓLISIS ACIDA DE POLISACARIDOS. La celulosa es un polisacárido muy abundante en los vegetales, se encuentra principalmente en la pared celular. La celulosa es una glucosana formada por cadenas de glucosa unidas en posición p (1 -4), debido a lo cual no pueden ser utilizadas por el hombre como alimento, ya que carece de enzimas capaces de hidrolizarla. Algunos microorganismos que constituyen la flora bacteriana de herbívoros poseen una enzima denominada celulasa capaz de hidrolizarla hasta glucosa. La celulosa también puede ser hidrolizada por ácidos y álcalis bajo condiciones enérgicas. EXPERIMENTO 13. Coloque en un vaso de precipitados de 250 mi. de capacidad unos trozos de papel filtro y añada 5ml de H 2SO4 concentrado (¡PRECAUCIÓN!) agite cuidadosamente hasta que el papel se haya disuelto. Se añaden lentamente 50 mi. de agua destilada ¡ PRECAUCIÓN !. La reacción es fuertemente exotérmica. . Se toman 2 mi. de esta solución y se colocan en un tubo de ensaye, se neutraliza con NaOH al 10% usando papel indicador para comprobarlo. Se añade un mililitro de la solución "A" y un mililitro de la solución "B" del reactivo de Fehling y se calienta en baño maría a ebullición hasta que se forme el precipitado rojo de Cu2O. a) Escriba la reacción que se efectúa:
b) Mencione otros métodos por los cuales se puede hidrolizar un, polisacárido.
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FENÓMENOS DE INTERFASE Y SISTEMAS DISPERSOS INTERFASE Se conoce como interfase a la superficie de contacto entre dos fases, las moléculas que forman la interfase son suficientemente diferentes de las del seno o cuerpo de cada fase, de manera que forman una'"zona interfasial". Existen varios tipos de interíases dependiendo del estado físico en que se encuentran las dos fases ad yacentes. Cada partícula o conjunto de partículas de materia, sea una célula o un organismo superior, posee una interfase en el límite de sus alrededores, por lo que los fenómenos interfasiales son tema de importancia evidente y factor significativo en: penetración de moléculas a través de membranas biológicas, dispersión de partículas insolubles en el medio extracelular, adsorción de fármacos, intercambio gaseoso, etc. Por conveniencia estas combinaciones se pueden dividir en dos grupos: las llamadas interfases líquidas (líquido-gas o bien líquido-líquido) y las interfases sólidas (sólido-gas y sólido-líquido).
INTERFASES LIQUIDAS TENSIÓN SUPERFICIAL Y TENSIÓN INTERFASIAL. En la superficie de contacto entre un líquido y un gas se han observado, experimentalmente, fenómenos similares a los que se presentan donde existe una membrana tensa. La explicación de ésto la tenemos suponiendo que podemos ver las moléculas del líquido y analizamos una que se encuentre en el seno del mismo; ésta se halla interactuando con las demás moléculas que la rodean y el resultado es que no hay fuerza vectorial que la desplace hacia ningún lado. En cambio, una molécula situada en la superficie, sólo interactúa con las que están situadas a los lados y debajo de la misma, arriba, las moléculas de gas o vapor ejercen poca interacción. El resultado es que cada una de las moléculas de la superficie sufre atracciones abajo y a los lados constituyendo una resistencia o tensión. Esta fuerza se denomina tensión superficial, (T.S,). Debido a esta tensión, que es una manifestación de la energía de superficie, las gotas de un líquido o las burbujas de un gas tienden a contraerse y ocupar el menor espacio posible, la forma esférica es la que tiene el mínimo de superficie para un volumen dado. 85
Por otro lado la tensión interfasial es la fuerza por unidad de longitud existente en la interíase entre dos líquidos inmiscibles. Invariablemente las tensiones interfasiales son menores que las tensiones superficiales debido a que las fuerzas de adhesión en la interíase líquido-líquido, son mayores que en la interfase líquido-gas.
ACUMULACIÓN DE MOLÉCULAS EN INTERFASES LIQUIDAS El agua posee, después del mercurio, el valor más alto de tensión superficial de todos los líquidos pero cuando disolvemos en ella diferentes sustancias, este valor (72.8 dinas/ cm) se modifica. Ciertas moléculas insolubles como los ácidos grasos, los ácidos sulfónicos, y las sales alcalinas de ácidos grasos (jabones), cuando se dispersan en el agua, aún a concentraciones bajas, se mueven hacia la interfase; su concentración es mayor en la superficie que en el seno del líquido, por lo que el valor de la tensión superficial del agua disminuye. A los iones o moléculas que se concentran en la interfase, debido a su naturaleza antipática, se les denomina agentes tensoactivos negativos. Otras sustancias como los electrolitos fuertes, alcaloides (cafeína, nicotina, etc) y la sacarosa, al ser disueltos en el agua, se concentran en el seno de ésta, aumentando la tensión superficial (aunque no de manera importante). A estas sustancias se les denomina agentes tensoactivos positivos.
PARTE EXPERIMENTAL OBSERVACIÓN DE LA TENSIÓN SUPERFICIAL EFECTO DE SUSTANCIAS TENSO ACTIVO NEGATIVAS. EXPERIMENTO 1 a) Tome un vaso de precipitados de 250 mi. y llénelo con agua. En la superficie de ésta deposite, por una de sus caras, una navaja de afeitar lim pia y seca. Observe primero la depresión que ocasiona sobre la superficie del líquido y luego, con un es tilete, trate de hundir la navaja. ¿ Qué observa al tratar de hundir la navaja ? b) Repita a continuación el experimento sólo que, antes de colocar la navaja, disuelva en el agua 100 mg de detergente en polvo, procurando que no se formen burbujas. Si se formaran, destruyalas con un pedazo de pa pel filtro. Coloque entonces con suavidad la misma navaja limpia y seca. Observe lo que ocurre. c) Repita el experimento agregando previamente al agua solución de bilis al 1 %. 86
1) ¿Qué efecto tienen la bilis y el detergente sobre la tensión superficial? 2) ¿Qué agente tensoactivo negativo tiene mayor efecto?
FUERZAS DE ADHESI ÓN Y FUERZAS DE COHESI ÓN Para una mejor compresión de las fuerzas moleculares que determinan la T.S. es conveniente observar, prácticamente, dos factores que determinan la tendencia de los líquidos a presentar el área mínima en un determinado volumen: las fuerzas de adhesión (fuerzas de atracción entre moléculas de diferente naturaleza) y las fuerzas de cohesión (fuerzas de atracción entre moléculas de la misma naturaleza). FUERZAS DE ADHESIÓN.
EXPERIMENTO 2 Sumerja en agua, un tubo de vidrio limpio y otro cubierto con parafina y observe en cuál se adhiere el líquido, es decir, cuál se moja. a) ¿En qué tubo se eleva el agua en contra de la gravedad? b) ¿Existe alguna relación entre adhesión y T.S.? FUERZAS DE COHESIÓN EXPERIMENTO 3 Coloque una gota de agua entre dos portaobjetos y trate de separarlos. c) ¿Qué observa? Repita el experimento anterior utilizando una gota de los siguientes solventes: alcohol etílico, éter etílico, cloroformo y benceno. d) ¿Qué concluye de sus observaciones?
MEDIDA DE LA TENSIÓN SUPERFICIAL La tensión superficial es la fuerza por unidad de longitud que debe ser aplicada paralelamente a la superficie para contrarrestar la atracción de las moléculas hacia dentro del líquido y se expresa en dinas/ cm. Termodinámicamente la tensión superficial puede considerarse como la tendencia de un líquido a disminuir su superficie hasta que su energía de superficie potencial sea mínima.
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Como se refirió anteriormente, la tensión superficial es una de las propiedades fisicoquímicas que tiene coeficiente térmico negativo, es decir, que al aumentar la temperatura, el valor de la tensión superficial disminuye. Existen varios métodos para conocer la tensión superficial como son: del tensiómetro, del capilar, del anillo de Du Nouy y el estalagmométrico.
MÉTODO ESTALAGMOMÉTRICO El método estalagmométrico ( medida de las gotas ) consiste en hacer fluir un líquido por un tubo de diámetro estrecho. Algunos líquidos dan gotas muy pequeñas que fluyen rápidamente, otros en cambio dan gotas grandes. La gota que aparece por el extremo del tubo (pipeta) se detiene por la membrana tensa que resiste la acción de la gravedad . Si la gota aumenta de tamaño, llega un momento en que su peso vence a la tensión superficial, se rompe la membrana y la gota cae. Así, contando el número de gotas que hay en determinado volumen se puede calcular su tensión superficial, comparando con un líquido de tensión superficial conocida, generalmente el agua (72.8 dinas/cm, a 20°C), según la siguiente fórmula:
donde: T.S.H2o = Tensión superficial del agua. T.S prob. = Tensión superficial del problema. V, y D, = Volumen y densidad del agua. V 2 y D2 = Volumen y densidad del problema. Para calcular el volumen de la gota, se divide el volumen total que se utiliza entre el número de gotas, que se obtienen. Si se emplea 1 mi el volumen de la gota será:
Así tenemos:
despejando T.S.prob, nos queda:
EXPERIMENTO 4 Para medir la tensión superficial por este método debe emplearse la misma pipeta en todas las determinaciones, lavándola cuidadosamente al terminar cáela valoración. Mida exactamente 1 mi de las sustancias a determinar, en el orden indicado en la siguiente tabla, cuente el número de gotas que se forman al vaciar la pipeta. ¡ No desperdicie el solvente, vacíe las gotas al frasco ! TENSIÓN SUPERFICIAL (dinas/ cm)
DENSIDAD g errv3 Agua 1.000 Alcohol etílico (95°) 0.816 Éter etílico 0.719 Cloroformo 1.484 Benceno 0.878 LIQUIDO
ADSORCIÓN Toda superficie contiene una cierta cantidad de energía que puede ser fácilmente transformada en trabajo. Ese trabajo puede manifestarse cuando se concentran en las interfases iones o moléculas en solución, o sea, cuando aparece el fenómeno de adsorción. En este fenómeno intervienen las fuerzas de cohesión intermoleculares, las valencias residuales y la carga eléctrica. La adsorción tiene numerosas aplicaciones, tanto en la industria como en los laboratorios de investigación, siendo una de estas aplicaciones la cromatografía en sus diversas formas como son: en papel, en capa fina, de intercambio iónico, de líquidos de alta resolución etc.; técnicas de gran utilidad en métodos de separación, purificación y análisis cualitativo y cuantitativo. La adsorción cromatográfica permite la separación de los componentes de una mezcla, dependiendo del grado en que los solutos adsorbidos son intercambiados entre la solución original (fase móvil) y una segunda fase sólida o líquida (fase estacionaria). El grado de separación dependerá de las propiedades polares, afinidad, estéricas (conformación espacial), etc. de los solutos en relación al adsorbente. La relación entre cantidades de gas adsorbido por un sólido y la presión o concentración, a temperatura constante se denomina isoterma de adsorción. ADSORCIÓN EN IIMTERFASE SOLIDA. La adsorción de materiales sólidos o gaseosos sobre la superficie de sólidos es semejante en muchos aspectos a la adsorción en interfases lí89
quidas. Este tipo de adsorción puede ser considerada como la tendencia a reducir la energía libre de superficie del sólido. INTERFASE SOLIDO - GAS. El grado en que un gas es adsorbido por un sólido depende de la naturaleza química del adsorbente (sustancia usada para adsorber el gas ) y del adsorbato (sustancia a ser adsorbida), el área del adsorbente , la temperatura y la presión parcial del gas adsorbido. La adsorción puede ser de tipo físico, asociada a fuerzas de Van der Waals, reversible o bien de tipo químico en la que establecen enlaces químicos fuertes y por lo tanto irreversibles; en general la adsorción química es más específica que la adsorción física. ADSORCIÓN EN FUNCIÓN DE LA CONCENTRACIÓN. La relación entre la concentración de una sustancia adsorbida (x) por un sólido y la concentración de la sustancia puesta en contacto (c) con el adsorbente (m), a temperatura constante, se le denomina isoterma de adsorción de Freündlich. Cuando se desee medir la adsorción o poder adsorbente de una sustancia se puede emplear, la isoterma de Freündlich: donde:
x/m = KC1/n x = miligramos de sustancia adsorbida, m = miligramos de sustancia adsorbente. C = concentración molar del soluto o sustancia que se va a adsorber. K = constante de adsorción específica para cada sustancia, n = constante arbitraria, generalmente igual a 0.5.
Al graficar esta ecuación obtendríamos una parábola, indicándonos que la velocidad de adsorción aumenta al aumentar la concentración. Sin embargo, llega un momento en que por más que se aumente la concentración, no aumenta la sustancia adsorbida y esto ocurre en la saturación. Si se desea obtener una gráfica lineal, es necesario transformar la ecuación de Freündlich a su forma logarítmica. log x/m = 1/n log C + log K Esta ecuación se parece a la forma general de la ecuación de la recta: y = ax + b y nos indica que el logaritmo de la concentración en la superficie x/m es función lineal de la concentración de soluto (C) en la solución. Las superficies sólidas pueden también adsorber sustancias en solución, esta adsorción sigue por lo general, los mismos lineamientos que en el caso de los gases y es afectado por los mismos factores; incluso la ecuación de Freündlich parece trabajar mejor que en el de los gases.
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EXPERIMENTO 5 Tome cuatro matraces Erlenmeyerde 125 mi y numérelos. En cada uno de ellos deposite 0.5 gr de carbón activado en polvo. En seguida agregue a cada matraz, solución de ácido oxálico.en las siguientes concentraciones: matraz 1 solución 0.05 N; matraz 2 solución 0.2 N; matraz 3 solución 0.4N matraz 4 solución 0.8 N; un volumen igual a 50 mi en cada matraz. Agite fuertemente durante 3 minutos todos los matraces y luego déjelos en reposo por 10 minutos. A continuación filtre. Tome 10 mi de cada filtrado y adicione 2 gotas de solución de fenoftaleína. Titule por separado cada alícuota con NaOH 0.2 N y anote la diferencia entre la cantidad de NaOH 0.2N que debió gastarse y la que realmente gastó. Esta diferencia será la cantidad de ácido oxálico que quedó adsorbida al carbón. Calcule la cantidad de ácido oxálico adsorbido en miligramos en cada caso. Utilizando la ecuación de Freündlich, construya la gráfica correspondiente colocando en las ordenadas los valores de x/m y en las abscisas los valores de C. a) ¿Qué tipo de curva se obtiene? b) ¿Cuáles son los valores de K y n obtenidos en la gráfica? c) ¿Qué características debe tener el adsorbente (carbón) utilizado en este experimento?
ADSORCIÓN PREFERENTE O SELECTIVA En ocasiones las superficies sólidas se recubren de capas sólidas, líquidas o gaseosas, representando un problema la eliminación de estas sustancias, para lo cual se emplean frecuentemente agentes tensoactivos que por adsorción preferente logran desplazarlas. EXPERIMENTO 6 Coloque en un tubo de ensaye, 5 mi de solución de azul de metileno diluida y agregue 0.5 gramos de carbón en polvo. Agite la mezcla y filtre. Coloque en otro tubo de ensaye, 2 mi. de una solución concentrada de fenol, 5 mi. de agua y 0.5 mi. de vaselina, de manera que formen 3 capas separadas. A continuación tome con un agitador un poco de carbón retenido en el papel que utilizó para filtrar y hágalo descender por el tubo que contiene las capas de fenol-agua- vaselina. a) ¿Qué aspecto tiene el filtrado? b) ¿Qué ocurre cuando las partículas de carbón atraviesan la capa acuosa? c) ¿Qué sucede al entrar en contacto las partículas de carbón con la capa fenólica?
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d) Explique el fenómeno de adsorción en base a las características observadas en el filtrado.
ADSORCIÓN ELÉCTRICA Se ha denominado así al fenómeno mediante el cual la acumulación de las sustancias en la superficie depende de su carga eléctrica y no de la energía de superficie. Este fenómeno se diferencia de la adsorción propiamente dicha, en que es un fenómeno irreversible y en que no es afectado por la temperatura. Se puede demostrar en el laboratorio estudiando el comportamiento de superficies de carga eléctrica negativa, como el papel filtro, frente a colorantes. Un colorante electropositivo, es adsorbido fuertemente y no puede ser lavado. En cambio, un colorante electronegativo, por tener la misma carga que el papel no es fijado, se extiende en una mayor superficie y puede ser fácilmente separado por lavado con agua.
ADSORCIÓN DE COLORANTES DETERMINACIÓN DE LA CARGA ELÉCTRICA Los colorantes son sales disociables que se clasifican según la carga eléctrica de sus iones cromóforos. Los que tienen carga positiva se denominan colorantes básicos y los que tienen carga negativa se denominan colorantes ácidos.
EXPERIMENTO 7. Para determinar la carga eléctrica de un colorante, utilice cuadros de papel filtro de 3 x 3 cm y deposite en el centro una gota de colorante problema. Observe la extensión de la mancha y luego lávelos en un recipiente con agua de la llave. Para tener un patrón de comparación, observe el comportamiento de dos colorantes, uno positivo y otro negativo. Como colorante básico (positivo) utilice solución diluida de azul de metileno y como colorante ácido (negativo) use fucsina acida. a) Relacione el grado de extensión de la mancha y su comportamiento al lavado, con la carga eléctrica, en ambos colorantes. Tomando como base este comportamiento, determine la carga eléctrica de los colorantes rojo neutro y safranina.
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b) Carga eléctrica del rojo neutro, e) Carga eléctrica de la safranina.
SISTEMAS DISPERSOS, CARACTERÍSTICAS Y PROPIEDADES. Los sistemas dispersos están formados por partículas de materia que constituyen la fase dispersa, distribuidas en un medio continuo o fase de dispersión. De acuerdo al diámetro de las partículas del material disperso, dichos sistemas se clasifican en: dispersiones moleculares (ej. soluciones de glucosa, de sales, éter); sistemas coloidales (ej. polímeros naturales y sintéticos, soluciones de proteínas); y, suspensiones groseras.
PREPARACIÓN DE UN SISTEMA COLOIDAL Y OBSEVACION DEL FENÓMENO DE TYNDALL-FARADAY EXPERIMENTO 8 En un tubo de ensaye coloque 10 mi. de agua destilada y añada 2 o 3 gotas de una solución de brea en alcohol al 3 %. Agite vigorosamente la mezcla; describa su apariencia y observe el fenómeno de Tyndall-Faraday, comparándolo con una solución verdadera (por ejemplo, de NaCIO.IN). a) Enuncie diferentes métodos de preparación de coloides. b) ¿Cuál de estos métodos empleó en la preparación del coloide de brea en agua? c) Explique brevemente a qué se debe el fenómeno de Tyndall-Faraday. d) ¿Es posible observar el fenómeno de Tyndall-Faraday en las solu ciones verdaderas?
CARACTERÍSTICAS DE LOS SISTEMAS COLOIDALES Tamaño de las partículas. El tamaño de las partículas coloidales varía entre 0.1 - 0.0001 |i Cuando el tamaño de la micela se aproxima a 0.1 JJ. de diámetro las propiedades del sistema son similares a las de las suspensiones groseras y cuando son de 0.0001 n son comparables a las soluciones verdaderas. El tamaño de la partícula es responsable de las principales propiedades de los sistemas coloidales, tales como la estabilidad, propiedades catalíticas y propiedades ópticas. Stokes ha demostrado que la velocidad de sedimentación es proporcional al cuadrado del radio de la partícula, por lo tanto, entre más pequeño
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sea el radio de la partícula, menor será su velocidad de sedimentación y mayor su estabilidad. Las propiedades catalíticas de algunos sistemas coloidales dependen también de la superficie que presentan las partículas dispersas, la cual es mayor entre menor sea el tamaño de las partículas. A simple vista, algunos sistemas coloidales presentan cierta turbidez y una ligera coloración azul o violeta; ésto se debe a que los rayos de luz se refractan y se dispersan al chocar con las partículas. Debido a ésto, es posible observar en ciertos sistemas coloidales el paso del rayo de luz en forma de cono. Este fenómeno se conoce como fenómeno de Tyndall Faraday. Carga eléctrica. Todas las partículas coloidales poseen carga eléctrica, la cual puede estar dada en algunos sistemas coloidales por grupos químicos ionizables presentes en la propia molécula, como en las proteínas. O bien, pueden adquirir la carga por adsorción de iones que existan en la solución, como en los coloides liofóbicos. La estabilidad de las soluciones coloidales depende en gran parte de la carga eléctrica de las partículas. Capa de hidratación o de solvatacion. Los sistemas coloidales se pueden dividir en liófilos o hidrófilos y liófobos o hidrófobos. Los sistemas liófilos (entre los que se encuentran las proteínas y algunos polisacáridos) son mas estables que los liófobbs y para precipitar necesitan cantidades mayores de electrolitos. La estabilidad de los sistemas liófilos depende de la carga eléctrica de sus partículas y además de su capa de solvatacion, mientras que los coloides liófobos carecen de esta capa y su estabilidad está dada sólo por la carga eléctrica de sus partículas. Si la carga se neutraliza totalmente o se reduce por debajo de cierto valor crítico, las partículas se agru pan y precipitan.
ACCIÓN PROTECTORA DE LOS SISTEMAS COLOIDALES LIOFILICOS. El hecho de que los sistemas liof ílicos posean además de la carga eléctrica una capa de solvatacion les confiere mayor estabilidad, a tal grado que se utilizan en la industria alimenticia, en la industria químico-farmacéutica, etc., para proteger o estabilizar un sistema coloidal liofóbico o una emulsión. El poder protector de un sistema coloidal liofílico se puede cuantificar mediante el llamado número de oro, que se define como "la cantidad, en miligramos, de un sistema liofílico seco necesario para impedir que 10 mi. de coloide de oro se alteren cuando se agrega 1 mi. de solución de NaCl al 10%."
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EXPERIMENTO 9 En un tubo de ensaye coloque 2 mi. de solución de gelatina al 3% y añada 2 mi. de solución de nitrato de plomo (Pb(NO 3)2) 0.1 M. En otro tubo de ensaye coloque 2 mi. de solución de almidón al 3% y agregúele 2 mi de la misma solución de Pb(NO3)2 0.1 M. En un portaobjetos coloque una gota de cada una de las mezclas anteriores y una gota de solución de Pb(NO 3)2 0.1 M. Deposite en el borde de cada una de las tres gotas anteriores, con ayuda de un gotero, una gota de solución de dicromato de potasio (K 2Cr 207) 0.2M. Observe la magnitud y velocidad de precipitación en cada caso.
a) De las sustancias empleadas identifique los coloides liofílicos protectores y explique su acción sobre el dícromato de plomo obtenido.
EMULSIONES Una emulsión es un sistema termodinámicamente inestable formado por dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales está disperso en forma de gotas en el otro líquido. El tamaño de las partículas dispersas puede o no corresponder al tamaño de las micelas coloidales pero, generalmente, el estudio de las emulsiones está asociado al de dichos sistema, puesto que la estabilidad de las emulsiones depende de la presencia de un agente emulsificante de naturaleza coloidal. El que dos líquidos inmiscibles permanezcan mezclados se explica por el hecho de que las fuerzas de cohesión entre las moléculas de cada líquido individual o separado, son mayores que las fuerzas de adhesión entre los dos líquidos. Cuando un líquido es disgregado en pequeñas gotitas, el área interfasíal de los glóbulos constituye una superficie enormemente mayor que la superficie original del líquido, por lo tanto la energía libre de superficie también se incrementa.
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Tipos de emulsiones. Invariablemente uno de los líquidos que participan en la emulsión es de naturaleza polar (por ej. agua) y el otro es relativamente no polar (por ej. aceite). Cuando el aceite es dispersado en forma de glóbulos en una fase acuosa continua, el sistema es considerado como una emulsión aceite en agua. Cuando la fase oleosa es la fase continua, la emulsión es de agua en aceite. Muchas emulsiones de uso medicinal para administración oral son emulsiones del tipo aceite en agua que requiere de un agente emulsificante como gelatina, goma de acacia, goma de tragacanto, etc. Sin embargo, algunas emulsiones de consumo común como la mantequilla y salsas para ensaladas son emulsiones del tipo de agua en aceite. El tipo de emulsión dependerá de varios factores tales como concentración de cada fase, tipo de emulsificador, tensión superficial de cada líquido, etc. Los agentes emulsificantes más eficaces para todo sistema que contenga agua, son los que más activamente disminuyen la tensión superficial de ella. Bancroft demostró que si se emulsiona aceite y agua en presencia de un jabón de sodio, las emulsiones resultantes son de tipo aceite en agua, pero cuando se emplean jabones de calcio, las emulsiones son de agua en aceite. Esto se debe según Bancroft, a que el jabón de sodio es más soluble en agua y disminuye su tensión superficial en grado suficiente para permitir emulsionar grasa. Además de los jabones de sodio, otras sustancias como monoacilglicéridos, sales biliares, etc, favorecen la emulsión de grasa, y en estas condiciones, son más fácilmente atacadas por las lipasas cuando se encuentran en el intestino para ser hidrolizadas. Así también las vacunas son más efectivas en la producción de anticuerpos cuando se encuentran emulsionadas, ya que son englobadas mejor las partículas antigénicas por los macrofagos (primera fase en la formación de anticuerpos).
PREPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE EMULSIONES DE ACEITE EN AGUA
IDENTIFICACIÓN DEL TIPO DE EMULSIÓN Son varios los métodos empleados para determinar el tipo de emulsión, entre los que podemos mencionar: 1.- Método de Briggs. Se coloca una gota de emulsión en un portaobjetos y se agrega una gota de agua; si se observa una mayor dispersión, la emulsión será de aceite en agua, pero si se observa una aglutinación la emulsión es de agua en aceite. 2.-Método de Robertson. Se coloca una gota de la emulsión en un portaobjetos y se agrega Sudán III en polvo, colorante de grasas. Con ayu-
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da de un agitador de punta delgada se mezcla bien la emulsión hasta que la coloración sea uniforme. Si se observan sólo puntos de color rojo en fondo sin colorear, la emulsión es de aceite en agua; s¡ la emulsión toma una coloración roja y sólo permanecen pequeños puntos sin teñir, la emulsión es de agua en aceite. EXPERIMENTO 10 a) Emulsión de aceite en agua. En un tubo de ensaye con 9 mi. de agua destilada, disuelva poco a poco 1 g de goma arábiga y 1 mi de aceite de algodón. Homogeneice esta mezcla (es necesario agitar enérgicamente para que la emulsión de aceite en agua que se ha preparado sea estable). Conservarla para su identificación. b) Emulsión de agua en aceite. En un tubo de ensaye coloque 1.0 g de goma arábiga, 1.0 mi de agua destilada y 9.0 mi de aceite de algodón. Agite perfectamente esta mezcla hasta conseguir que la emulsión sea estable. Consérvela para su identificación. c) Identifique el tipo de emulsión por los métodos de Briqgs y Robertson. 1.- Observe la diferencia existente en ambos sistemas por los métodos utilizados. 2.- Haga un juicio crítico a los métodos y diga cuál considera usted el más efectivo.
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LIPIDOS Este grupo de compuestos esenciales para los organismos y que también se encuentran en los productos naturales, son un conjunto heterogéneo de moléculas orgánicas de cuyas propiedades, lo que mejor las relaciona entre sí, es su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares como el benceno, cloroformo, éter, etc. Por lo que este grupo incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser moléculas de número relativamente alto de átomos de carbono e hidrógeno y bajo en átomos de oxígeno; ciertos lípidos también poseen átomos de fósforo, nitrógeno, y azufre en su molécula. Cualquier clasificación presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede producir falsas interpretaciones ya que idéntica terminología ha sido empleada por diferentes autores para denominar a distintos grupos de lípidos. De los lípidos más recientemente estudiados son por ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc, ya que este tipo de sustancias hasta hace poco se consideraban muy complejas y de poco interés. Las funciones de los lípidos son muy variadas y las más aceptadas actualmente son las siguientes: 1. Función estructural, principalmente en las membranas celulares. 2. Actúan como material de energético y de reserva. 3. Intervienen en ei transporte de algunos compuestos energéticamente activos y, como precursores de otros. , 4. Algunos lípidos actúan como componentes protectores de la pared celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados. 5. Dentro de los lípidos se encuentran sustancias de gran actividad bio lógica como vitaminas y hormonas. Las cuales se consideran como verdaderos reguladores metabólicos. 6. La capa de tejido subcutáneo, abundante en lípidos, sirve como aislante térmico y como protección alrededor de determinados órganos.
PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS LIPIDOS ESTADO FÍSICO. Los acilgliceroles se pueden encontrar en la naturaleza en forma sólida (grasas) o en forma líquida (aceites). Esto depende fundamentalmente del tipo de ácidos grasos, los aceites generalmente contienen ácidos grasos de bajo peso molecular o ácidos insaturados; las grasas, por el contrario, poseen principalmente ácidos grasos de elevado peso molecular y saturados. 98
PARTE EXPERIMENTAL EXPERIMENTO 1. Describa el estado físico de los siguientes lípidos: LIPIDO: Aceite de algodón. Grasa de algodón. Mantequilla Acido esteárico.
ESTADO FÍSICO:
a) ¿Cuáles son los ácidos grasos más abundantes en el aceite de algodón? b) ¿En qué difieren el aceite y la grasa de algodón?
SOLUBILIDAD Los grupos principales de los lípidos, tienen características de solubilidad diferentes y esta propiedad se utiliza en la extracción y purificación de los mismos a partir de materiales biológicos.
EXPERIMENTO 2 Determinar la solubilidad en frío, a temperatura ambiente y en caliente (en baño maría a ebullición) de los lípidos utilizados en el experimento anterior con los solventes indicados: SOLVENTE ->
AGUA
LIPIDO-i
ALCOHOL
CLOROFORMO
temp. a caliente temp. a caliente temp. a
BENCENO
caliente temp.a caliente
Aceit e de algod ón Mantequilla Grasa de algodón Acid o est eári co
EMULSIFICACION DE LAS GRASAS La mayoría de los lípidos son solubles en etanol 95% v/v pero forman una emulsión de gotas pequeñas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspensión una apariencia lechosa característica y constituye una prueba muy sensible para grasas. 99
Las grasas y los aceites de los alimentos no son solubles en agua, por lo tanto, para que puedan ser absorbidos tienen que ser hidrolizados o finamente emulsificados. Las sales biliares desempeñan una función muy importante ya que por ser tensoactivas negativas favorecen la formación de emulsiones.
PREPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE EMULSIONES EXPERIMENTO 3. En un tubo de ensaye coloque 1 mi. de aceite de algodón y 5 mi. de agua. Agite fuertemente hasta formar una emulsión. En otro tubo de ensaye coloque 1 mi. del mismo aceite, 5 mi. de agua y 1 mi. de solución de bilis al 1%. Agite fuertemete y observe. a) ¿Qué diferencia observa en los dos tipos de emulsión?
TINCIÓN DE LAS GRASAS El sudan III es un colorante específico de grasas, por lo que se usa genereralmente para su análisis cualitativo. Esta prueba es de gran utilidad en el análisis de heces y gracias a ella se pueden descubrir trastornos de la digestión. EXPERIMENTO 4 Coloque en un portaobjetos una pequeña gota de emulsión estable del esperimento anterior, añada unos cuantos cristalitos de Sudan III y observe al microscopio. a) ¿Qué tipo de emulsión identificó en cada caso? b) Haga su esquema
MANCHA TRANSLÚCIDA. Formación de la mancha translúcida en papel. Los lípidos, en general, tienen la propiedad de manchar el papel dejando una mancha translúcida característica y duradera.
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EXPERIMENTO 5 Coloque una gota de aceite de algodón sobre un papel filtro, y observe el tipo de mancha que se produce. Repita el experimento utilizando indistintamente cualquier compuesto no lípido, por ejemplo: agua, alcohol etílico, éter, acetona, etc. a) Explicar si observa alguna diferencia entre los compuestos no lípidos y los lípidos. b) ¿Qué utilidad cree que pueda tener esta propiedad de ios lípidos?
OBTENCIÓN DE LÍPIDOS DE PRODUCTOS NATURALES La separación de los diferentes lípidos que se encuentran constituyendo un tejido, es aparentemente una operación sencilla basada en el uso de solventes selectivos. Sin embargo, es necesario tomar en cuenta varios factores que pueden complicar la purificación: 1. La mayor parte de los lípidos que se encuentran en los organismos no se encuentran libres, sino formando complejos con proteínas y polisacáridos. Estos complejos se pueden romper para liberar los lípidos, pero generalmente son menos estables. 2. Muchos lípidos presentan gran afinidad para combinarse con mate rial no lípido y ésto dificulta la purificación. 3. Los lípidos que contienen ácidos grasos insaturados pueden presen tar el fenómeno de auto-oxidación y esto modifica sus propiedades y por !o tanto dificulta su separación. 4. Los solventes de grasas tienden a formar emulsiones co n el agua de los tejidos. En ocasiones se recomienda secar antes de la extracción, pero los rendimientos disminuyen c onsiderablemente. 5. Por regla general en los tejidos existen enzimas capaces de hidrolizar los lípidos, y es posible que se degrade un lípido durante su purificación si no se inactivan previamente. 6. Los solventes que se utilizan para la extracción poseen diferentes afinidades según el tipo de lípido. Por esto se recomienda utilizar varios solventes o mezclas de ellos si se desea una extracción completa. Un solvente muy útil para la extracción de lípidos es la acetona, debido a que produce una rápida deshidratación de los tejidos y extrae las grasas, esteres de esteróles y otros lípidos simples. Los lípidos complejos, son relativamente insolubles en acetona. El éter y hexano, extraen casi totalmente los fosfolípidos (glicerofosfátidos), el alcohol caliente extrae los esfingolípidos, etc. 101
EXTRACCIÓN DE LIPIDOS DE CEREBRO. EXPERIMENTOS Pese 5 g de cerebro y tritúrelos perfectamente en un mortero con 30 mi de una mezcla (200:100:1) de cloroformo metanol-ac. clorhídrico por 10 minutos. Una vez obtenido el homogenizado agregue 3 mi de HCI 1N., mezcle y centrifugue a 2000 rpm por 10 minutos. Separe el paquete celular, la fase clorofórmica y la metanólica. Se obtienen dos fases: a) Clorofórmica, que se usará para la identificación de colesterol, la separación cromatográfica de fosfolípidos y la formación de membranas. b) Metanólica que servirá para la identificación de cerebrósidos.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE LIPIDOS IDENTIFICACIÓN DE CEREBRÓSIDOS EXPERIMENTO 7 Utilizando 1 mi del extracto metanólico obtenido en la extracción de lípidos de cerebro, trate de demostrar la presencia de cerebrósidos utilizando la reacción de Molisch-Udransky cuya técnica y fundamento ya han sido descritos anteriormente.
IDENTIFICACIÓN DE ACILGLICEROLES REACCIÓN DE LA ACROLEINA Una de las reacciones más usadas para la identificación de acilglicéridos, es la formación de la acrolefna o aldehido acrílico, el cual se puede obtener por deshidratación del glicerol o de cualquier glicérido y se reconoce fácilmente por su fuerte olor acre característico. EXPERIMENTO 8 Coloque en dos tubos de ensaye secos, un poco de bisulfato de potasio y añada 3 o 5 gotas de glicerina en uno de los tubos y en el otro 5 gotas de
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aceite de algodón, cártamo o girasol. Caliente cuidadosamente y huela los vapores ¡PRECAUCIÓN! a) ¿Se puede considerar esta reacción general para cualquier lípido? ¿Porqué? b) Escriba la reacción que se ha efectuado.
REACCIÓN DE HANUS El grado de insaturación de los ácidos grasos que forman parte de un lípido es uno de los factores determinantes en sus propiedades físicas, químicas y fisiológicas. Se ha observado que aparecen más dobles enlaces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lípidosestructurales cuando la temperatura ambiente disminuye, los dobles enlaces disminuyen el punto de fusión por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo para impedir la cristalización de los lípidos en los tejidos. El reactivo de Hanus es una solución de yodo y bromo que nos permite determinar el grado de insaturación de un lípido, midiendo la capacidad que tiene para fijar halógenos en su molécula. EXPERIMENTO 9 Coloque en 3 tubos de ensaye limpios y secos 6 mi. de soluciones clorofórmicas al 10%,de aceite de algodón, aceite de cártamo y monoestearilglicerol. Añada a cada tubo 5 gotas del reactivo de Hanus y agite vigorosamente. Anote cada 30 min. el grado de decoloración de cada tubo protegiéndolos de la luz. a) Anote sus resultados en la siguiente tabla: 30 min.
60 min.
Aceite de Algodón Aceite de Cártamo Monoestearilglicerol
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90 min.
120 min.
REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DEL COLESTEROL REACCIÓN DE SALKOWSKY Cuando una solución clorofórmica de colesterol se mezcla con H 2SO4 conc, se produce una serie de colores característicos. Hasta la fecha se desconoce el mecanismo de la reacción y la naturaleza química del producto o de ios productos coloridos que se forman. Sin embargo es probable que el color se deba a la formación de dobles enlaces conjugados en el núcleo del colesterol, o bien, a la conjugación de dos moléculas de colesterol, para formar bi-esteroides. EXPERIMENTO 10 Prepare una serie de 3 tubos de ensaye. Añada al tubo No. 1, 3 mi. de cloroformo (servirá como testigo); al tubo No. 2,3 mi. de solución clorofórmica de colesterol puro, y al tubo No. 3,3 mi. de extracto clorofórmico de colesterol obtenido en la extracción de lípidos de cerebro (exp. 6). Agregue a cada tubo 1 mi. de H2SO4 conc, resbalándolo lentamente por las paredes del tubo. a) Observe y describa los cambios de coloración que se producen
REACCIÓN DE LIEBERMANN-BURCHARDS El anhídrido acético se puede condensar con los grupos -OH, en posición 3 de esteróles como el colesterol y dar los correspondientes esteres. Si el esterol tiene un doble enlace en posición 5, se produce además una epimerización y una deshidratación en presencia de H 2SO4 conc, dando como resultado una serie de compuestos de estructura desconocida que se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde. Esta reacción es específica, por lo tanto, paro todos los esteróles que tengan un grupo -OH en posición 3 y un doble enlace en posición 5. EXPERIMENTO 11 Prepare 2 tubos de ensaye. En el tubo No. 1 coloque 3 mi. de solución clorofórmica de colesterol puro y en el tubo no. 2, 3 mi. de solución clorofórmica de colesterol obtenido en la extracción de lípidos de cerebro (exp. 6). Añada a los 2 tubos, 1 mi. de anhídrido acético y mezcle bien, añada lentamente, resbalándolo por las paredes del tubo, 1 mi de H 2SO4 concentrado. a) Observe y describa los cambios de coloración que se producen. 104
IDENTIFICACIÓN DE FOSFOLIPIDOS DE CEREBRO POR CROMATOGRAFÍA EN PLACA FINA Como una aplicación del fenómeno de adsorción, que se estudia en la práctica de fenómenos de interfase, se desarrollará la técnica de cromatografía en placa fina, para separar los diferentes fosfolfpidos extraídos del cerebro. EXPERIMENTO 12 Diluya 1:1 con cloroformo, un volumen pequeño (0.5 a 1ml.) del extracto clorofórmico obtenido en el experimento No. 6. Utilizando una pipeta Pasteur, aplique 1 gota de esta dilución en 3 puntos equidistantes, en una cromatoplaca previamente preparada, aproximadamente a 2 cm de altura de la base. Permita que el cloroformo se evapore y entonces introduzca la placa en una cubeta de vidrio que contenga como solvente de elución, una mezcla de cloroformo-metanol-ác. acético-agua (65:25:8:4). Deje desarrollar el cromatograma hasta el frente del solvente ya marcado; saque la placa de la cubeta y déjela secar. En esta forma se tendrán 3 cromatogramas idénticos en la misma placa, los cuales se van a revelar con diferentes reactivos. Esto se puede hacer cubriendo con una placa de vidrio los cromatogramas que no se deseen revelar. Se revelará un cromatograma con el reactivo de molibdato, este reactivo revela todos los fosfolípidos. Otro cromatograma se revelará con el reactivo de bismuto, éste es específico para fosfolípidos que contengan colina. Otro cromatograma se revelará con ninhidrina y pondrá de manifiesto a los fosfoaminolípidos. Las dos primeras reacciones ocurren a temperatura ambiente y la tercera debe calentarse a 100 eC. por 10 minutos.
PERMEABILIDAD DE LA BICAPA LIPIDICA En este capítulo de lípidos no podemos dejar de mencionar a las membranas ya que hacen posible la existencia de organismos complejos, por que separan las células en el interior de los tejidos y los organelos celulares dentro de las células, formando compartimentos con propiedades físico-químicas diferentes, lo que permite una diferente organización; y cada compartimento se vuelve una parte individual de un conjunto más comple jo. Se ha comprobado que las membranas son complejos lipoproteicos que contienen 60% - 75% de proteína y 25% - 40% de lípidos. En este experimento usaremos monocapas lipídicas como modelos de membrana. Al estratificar butanol sobre agua y adicionar un lípido, éste se situará en la interfase, orientándose la parte polar lipídica a la fase acuosa, y la parte hidrofóbica a la fase orgánica. Si ahora se coloca un colorante se puede observar la difusión pasiva a través de la membrana.
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EXPERIMENTO 13 Preparar 4 tubos de ensaye como se indica en la siguiente tabla colocando las soluciones con mucho cuidado resbalando por las paredes del tubo para estratificar. 1—
1
2
3
4
Agua Azul de metileno en butanol más monoesterato de glicerilo Azul de metileno en butanol más fosfolípidos* Azul de metileno en butanol más colesterol Azul de metileno en butanol
5 2
5
5 —
5 —
—
■
;
—
2
—
—
—
—
2
—
—
—
—
2
:
* 2.0 mí de! extracto clorofórm'ico obtenido en el experimento 6 se evapora a sequedad (cuidando que no se queme), el residuo se redisuelve con 2.0 mi de azul de metileno en butanol y agregue este contenido al tubo No. 2 de la serie. Dejar los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y hacer observaciones a las 2, 4 y 24 horas. a) ¿Observó el paso del colorante en todos los tubos? b) Explique a qué se debe la diferencia.
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DIGESTIÓN Los seres vivos para subsistir requeren un suministro continuo de energía libre, por tres razones principales; 1) Para la síntesis de moléculas y macromóleculas de importancia bio lógica, a partir de compuestos más simples. 2) Para mantener la distribución iónica y el transporte activo de iones y moléculas a través de las menbranas de las células que las constituyen. 3) Para realizar trabajo mecánico, tal como el desarrollado en el movi miento de los organismos unicelulares y la actividad muscular de los animales superiores. Esta energía la obtienen los seres vivos, invariablemente de oxidación o de combustión de los alimentos, que son generalmente compuestos químicos procedentes de otros animales o de vegetales, tales como; proteínas, lípidos y glúcidos los cuales se caracterizan por ser de elevado peso molecular y de estructura muy compleja; por lo que la mayor parte de ellos no pueden ser absorbidos directamente. Para que puedan ser asimilados por el organismo deben ser degradados a sus componentes más sencillos es decir: las proteínas a aminoácidos, los oligo y polisacáridos a monosacáridos y los lípidos a alcoholes y ácidos grasos. Todo el conjunto de procesos hidrolíticos y mecánicos que sufren los alimentos para que puedan ser asimilados se denomina "Digestión" ésta puede ser extra o intracelular. En la mayor parte de los organismos inferiores la digestión es intracelular ,no así en los organismos superiores en los que es extracelular y se realiza en un tubo digestivo. Todos los cambios químicos que ocurren durante el proceso de digestión se efectúan con ayuda de enzimas, las cuales se encuentran distribuidas en diferentes zonas del aparato digestivo. Uno de los factores que más afectan la actividad de las enzimas es el pH. Cada enzima presenta su máxima actividad a un determinado valor de pH (pH óptimo), valores más ácidos o más alcalinos disminuyen notablemente la actividad de la enzima; considerando que en el tubo digestivo existen zonas con pH muy diferentes, en esta práctica se efectuarán los diferentes experimentos necesarios para confirmarlo.
107
PARTE EXPERIMENTAL DETERMINACIÓN DE pH EN DIFERENTES REGIONES DEL APARATO DIGESTIVO EXPERIMENTO 1 Se utilizarán como animales de experimentación conejos adultos, los cuales se sacrificarán por descerebración. Se abrirá el abdomen y se expondrá el aparato digestivo "in sitú'. Con todo cuidado se hará una incisión en el esófago, en el estómago, en diferentes niveles del intestino delgado (duodeno, yeyuno e íleon), intestino grueso y recto. En caso necesario retire los restos de alimento presente en la región de estudio. Con ayuda de un gotero terminado en capilar se tomará una pequeña cantidad del líquido presente en cada zona y se depositará sobre un pedazo de papel pH, teniendo cuidado de lavar el gotero muy bien, antes de cada determinación. Se puede también hacer la determinación introduciendo un pequeño pedazo de papel pH, con ayuda de unas pinzas en cada parte mencionada anteriormente, teniendo cuidado de no tocar líquidos de otras zonas. a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla: CAVIDAD
pH
Boca Esófago Estómago Intestino delgado
duodeno yeyuno
ileon Intestino grueso Recto
DIGESTIÓN EN LA BOCA. La digestión en los organismos superiores, como el hombre, se inicia en la boca con la masticación de los alimentos transformándolos en una papilla íntimamente mezclada con saliva. La saliva desempeña una doble función, por una parte el agua y las mucinas lubrican el bolo alimenticio, por otra, las enzimas que contiene inician la digestión. Sin embargo, en condiciones normales, debido al poco tiempo que permanecen los alimentos en 108
la boca, el proceso hidrolítico no es completo y debe ser terminado en otras zonas del tubo digestivo. La saliva es un líquido viscoso que contiene un 99.5% de agua aunque este valor puede variar. El pH es 6.8 - 7.2 y posee varias enzimas entre otras está la amilasa, que hidroliza los almidones hasta maltosa, la fosfatasa alcalina que hidroliza algunas uniones de éster fosfórico, una lipasa que hidroliza ácidos grasos de bajo peso molecular en posición alfa y que trabaja a pH ligeramente ácido. EXPERIMENTO 2 Colecte aproximadamente 10ml de saliva y diluyala con 30 mi de agua destilada fría; si la solución está turbia filtre a través de un pedazo de gasa limpia. Con el filtrado, que se conservará en hielo para las determinaciones enzimáticas, efectúe los siguientes ensayos. a) Determinación del pH, puede hacerla con el potenciómetro o con pa pel pH. b) Determinación de cloruros, en un tubo de ensaye se colocan 3 mi de la dilución de saliva y se les añade 1 mi de solución de AgNO3 0.1 N. la apari ción de turbidez o un precipitado blanco nos indicará la presencia de cloruros. c) Determinación de proteínas, en un tubo de ensaye se colocan 3 mi de saliva diluida, se añade 1 mi de NaOH 10% y una gota de solución de sulfato de cobre 1%. La reacción será positiva si en no más de 20' aparece una coloración rosa o violeta.(reacción de biuret). d) Eliminación de cloruros por diálisis, tome 15 mi de la solución de sa liva diluyala con 28 mi de agua destilada , tome 10 mi y c olóquelos en un tubo de diálisis. Guarde el resto en hielo. Dialice contra agua destilada (este es un proceso lento, debe iniciar la práctica con este experimento y dejar lo), cambiando el agua del vaso cada 30 minutos para que pueda observar una diferencia significativa. El contenido del saco de diálisis se conserva en hielo para el experimento g. e) Inhibición de fosfatasa y amilasa por calentamiento, coloque en un tubo de ensaye 5 mi de la dilución salival y caliente a ebullición por 3 minu tos (con precaución para que no se derrame). f) Determinación de fosfatasa, prepare dos tubos de ensaye de la siguien te manera:
109
BLANCO
PROBLEMA
1 — 0.1
— 1 0.1
1
1
4
4
Saliva hervida (inciso e) Saliva recién emitida Sustrato para fosfatasa (Bioxon) Solución amortiguadora Colocar en baño maría a37°C15' Reactivo desabollador de color p/fosfatos Deje en reposo 10' compare sus resultados
g) determinación de amilasa, prepare una serie de ocho tubos de ensaye y numere, para estas determinaciones se usará la saliva que se diluyó en el experimento d (dializada y sin dializar), siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:
reguladora PO4;pH=3.0 reguladora PO4;pH=7.0 reguladora PO4;pH=10.0 sustrato de almidón al 1% dilución de saliva s/ dializar (d) dilución de saliva dializada (d) dilución de saliva hervida (e) solución de NaCI 1 %
1
2
3
4
5
6
7
8
— 5 — 5 — — — —
— 4 — 5 — — 1 —
— 4 — 5 — 1 — —
— 3 — 5 — 1 — 1
4 — — 5 1 — —
— 4 — 5 1 — — —
— — 4 5 1 — — —
— 3 — 5 1 — — 1
Mezcle el contenido y coloque los tubos en baño maría a 40°C. Cada 3 minutos tome una gota de cada tubo de ensaye y coloquela sobre un mosaico blanco; añada luego una gota de lugol y, de acuerdo a la coloración, determine el grado de hidrólisis. Suspenda el análisis en cualquier tubo que dé negativa la reacción de lugol (c olor amarillo paja). a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla, indicando con Una (+) la reacción positiva y con el signo (-) si es negativa (puede indicar el color que se obtiene en cada caso).
110
Reac Reacci ción ón de de lugo lugoll TUBO NO Tiempo en minutos i
'j
■■■
2
3
4
5
6
3 6 9 12 15 18
7
8
1
b) Indique en qué tubos hubo hidrólisis y explique en cada caso el r esultado.
DIGESTIÓN EN EL ESTOMAGO. Una vez que el bolo alimenticio ha sido preparado, como ya se mencionó en digestión en la boca, pasa al estómago a través del esófago, al llegar al estómago se mezcla con el jugo gástrico, esta mezcla se denomina quimo. El estómago sirve como almacén de alimentos, actúa como zona antiséptica, bactericida y además, desempeña un papel importante en la digestión. En él se encuentra el jugo gástrico, el cual en un organismo normal es secretado de 1 a 3 litros al día, aunque se reabsorbe una gran cantidad. La enzima original del jugo gástrico es una proteasa, la pepsina, que es secretada como una proenzima y para activarse sufre una proteólisis parcial. Esto constituye un mecanismo de control de la actividad, típico de las enzimas digestivas y de las que participan en la coagulación de la sangre. Esta proteasa por encontrarse en el estómago trabaja a pH muy ácido (1 a 3), en contraste con la amilasa y fosfatasa salivales que lo hacen a pH casi neutro.
111
HIDRÓLISIS DE LA LECHE POR LA PEPSINA. Para determinar la actividad de la pepsina se empleará un método simple.el método de Ball y Hoover (aglutinación de la leche) EXPERIMENTO 3 Prepare una serie de 4 tubos como se indica en el cuadro siguiente:
Sustrato (leche) Agua Preincubación a 40°C por 5 min. * Pepsina al 1 % en Buffer pH3 Incubación a 40° C
1
2
3
4
5 0.8
5 0.6
5 0.4
5 0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
* Después de agregar la pepsina agite muy bien para que se redisuelvan los pequeños grumos que se hayan formado ya que nos encontramos a un pH por debajo del punto isoeléctrico de la leche. Con ayuda de un cronómetro, mida el tiempo desde el momento en que se agregó la enzima al momento en que aparezcan grumos en la leche, lo que nos indicará la acción de la pepsina. Grafique la inversa del tiempo en las ordenadas contra la concentración de enzima en las abcisas e indique el orden de la reacción
DIGESTIÓN INTESTINAL. El tiempo que permanecen los alimentos en el estómago es variable, pasando luego al intestino donde son sometidos a la acción de 3 secreciones digestivas: el jugo intestinal, el jugo pancreático y la bilis. El jugo pancreático es un líquido transparente y viscoso de pH 7.5 a 8, contiene una gran cantidad de enzimas entre las que se encuentran:el tripsinógeno que pasa a su forma activa, tripsina, por acción de la enteroquinasa del jugo intestinal; quimotripsinógeno y precarboxilasa que pasan a quimotripsina y carboxilasa por efecto de la tripsina; amilasa y lipasa pancreática, ésta última actúa sobre las grasas siempre y cuando estas sean previamente emulsionadas por la secreción biliar. Existen además exopeptidasas, ribonucleasas, desoxirribonucleasas, colagenasa y colesterolesterasas, que se complementan con las enzimas que contiene el jugo intestinal. Este último además de la enteroquinasa contiene carboxipolipeptidasas, polipeptidasas, aminopolipeptidasas, dipeptidasas, sacarasa, maltasa, nucleosidasas y lecitinasas, entre otras. Para comprobar la digestión a nivel intestinal veremos únicamente la pancreatina. Antiguamente se creyó que era una sola enzima y ahora 112
se sabe que es una mezcla de enzimas, nosotros comprobaremos su actividad lipolítica y proteolítica.
HIDRÓLISIS DE LIPIDOS POR LIPASA. Debido a que las grasas no son solubles en agua, las enzimas deben actuar en la interfase lípido-agua, por lo que se requiere de agentes emulsificantes como las sales biliares que favorecen la acción hidrolítica, porque aumentan dicha interfase. EXPERIMENTO 4. a) En un matraz Erlenmeyer de 250 mi coloque 100 mi de alcohol; añá dales 4 a 5 gotas de fenoltaleina y titule con KOH 0.01 M hasta vire rosa. Esta solución se denominará alcohol neutro. b) Prepare una serie de 4 tubos de ensaye como se indica en la siguien te tabla:
Aceite vegetal pancreatina 1% Pancreatina 1% Hervida Bilis 6%
1
2
3
4
5
1
1 1.5
1 1.5
1
1
1
1
i
1.5 1
Se agitan bien para lograr una mezcla homogénea y se colocan en baño maría a 40°C durante 60 minutos agitando de vez en cuando. Pasado este tiempo se transfiere el contenido del tubo No.1 a un matraz Erlenmeyer de 250 mi enjuagando el tubo con 20 mi de alcohol neutro preparado previamente en el inciso (a) para favorecer la solubilidad. Agregue 2 a 3 gotas de fenolftaleína como indicador y titule el contenido del matraz con solución de KOH 0.01 M agitando enérgicamente después de cada adición del álcali hasta que vire. Repita el mismo procedimiento con los demás tubos de la serie. c) A los mililitros mililitr os de KOH gastados en los tubos 2, 3 y 4 résteles los mililitros gastados en el tubo 1 (testigo). d) ¿Hubo hidrólisis en los tubos con la enzima? e) ¿Observó diferencia en los tubos donde empleó la bilis?
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HIDRÓLISIS DE LA GELATINA POR LA PANCREATINA. Las enzimas proteolíticas, en general, catalizan la siguiente reacción.
Entre mayor sea el número de enlaces peptídicos hidrolizados, mayor será el número de grupos carboxilo y amino libres. Por lo tanto es posible determinar la magnitud de la hidrólisis de una proteína midiendo el incremento de grupos amino o carboxilo libres. Lo cual se puede cuantificar bloqueando los grupos amino con formol en exceso y titulando con una base los grupos amino con el pKa modificado, (titulación de Sórensen).
EXPERIMENTO 5 a) Coloque 150 mi de formol en un matraz Eriermeyer de 250 mi. Añada 5 gotas de fenolftaleína fenolftaleína y titule con KOH 0.01 M hasta vire rosa. Esta solución se denominará formol neutro. En dos matraces Eriermeyer de 125 mimi da exactamente 15 mi de es ta solución (matraz 1 y matraz 2).Coloque 100 mi de solución de gelatina al 3% (disuelta en una solu ción reguladora de carbonato sódico 0.1 M pH 7.5) en un matraz Eriermeyer de 250 mi y ponga el matraz en un baño a temperatura constante de 40°C. Una vez que la solución alcance esta temperatura añada 10 mi de solución de pancreatina al 2%, mezcle, inmediatamente tome 2 muestras de 10 mi y colóquelas en los matraces con formol neutro que quedaron listos en el inciso (a), agregue 3 a 4 gotas de fenolftaleína como indicador. Titule con KOH 0.01 M y anote sus resultados. b) Repita lo anterior cada 20 minutos tomando cada vez dos muestras de 10 mi de la mezla y titulando con KOH 0.01 M. c) Resuma sus resultados en la siguiente tabla: TIEMPO , minutos
Promedi Promedio Enlaces o de 1 y2 menos hidrolizados, Matraz 1 Matraz 2 mM/100ml tiempo cero
KOH 0.01 M mi
0 20 40 60 80 e) Calcule el número de milimoles de enlaces peptídicos hidrolizados en cada tiempo en la muestra total (mi gastados x 0.01 = mmoles para los 10 mi x 10 = mmoles/100 mi) de gelatina.
114
METABOLISMO Para que exista un funcionamiento armónico del organismo, es necesario que subsista buena interrelación y coordinación metabólica entre los diferentes órganos y tejidos. En la práctica médica diaria, se puede apreciar la importancia del conocimiento de los factores que participan en las interrelaciones metabólicas, que por lo general se reflejan en la composición de los líquidos corporales, como la sangre y la orina que a través de los cambios en su composición orientan a un diagnóstico oportuno para un tratamiento efectivo de la enfermedad. Uno de los órganos que juega un papel primordial en el metabolismo es el hígado; por lo que será el órgano a utilizar en nuestra práctica.
METABOLISMO HEPÁTICO Como ya mencionamos el hígado es uno de los órganos que juega un papel importante en el metabolismo y es interesante recalcar que se encuentra en una posición estratégica, donde recibe todos los nutrientes, además esta misma ubicación entre las circulaciones portal y general, no sólo permite que absorba, transforme y almacene los nutrientes resultantes de la digestión, sino que también protege al resto del cuerpo de los metabolitos tóxicos producidos en los intestinos, como el amoniaco (NH 3) o presentes en la dieta, al convertirlos en sustancias no tóxicas antes de que entren a la circulación general. Entre algunas de la funciones del hígado podemos encontrar las siguientes: a) metabólicas b) de destoxificación y protectora c) excretora d) de almacenamiento e) circulatorias Al observar esta lista de funciones del hígado nos damos idea de la gran cantidad de enzimas que contiene, algunas de las cuales son, en cierto modo, específicas de este tejido. Por lo que un incremento o disminución de sus niveles en el plasma constituye una evidencia de daño en las células hepáticas.
115
Las enzimas que más se consideran para este fin son las transaminasas: transaminasa glutámica oxalacética (TGO) y transaminasa glutámica pirúvica (TGP) aunque existen algunas otras. Nosotros estudiaremos una de las enzimas que se usan para la desintoxicación, la arginasa. Ya que a lo largo de nuestro curso hemos empleado el hígado como base para observar algunas otras funciones de él como la obtención de glucógeno hepático, reacciones de oxidoreducción biológicas, localización de citocromo-oxidasa y de la deshidrogenasa succínica.
PARTE EXPERIMENTAL DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ARGINASA Todos los organismos requieren como alimento sustancias nitrogenadas, generalmente aminoácidos, ya sea para la biosíntesis de proteínas o para la síntesis de otras sustancias nitrogenadas no proteínicas, indispensables en la regulación del metabolismo como algunas hormonas. Una parte de estos compuestos nitrogenados se metabolizan con objeto de utilizar la energía potencial que contienen y, en esta degradación se elimina el nitrógeno, el cual puede excretarse en diferentes formas. En forma de amoniaco (NH 3) por los animales que viven en el agua (amoniotélicos), en forma de ácido úrico por aves, reptiles etc. (urícotélicos). La mayor parte dé los animales terrestres eliminamos el nitrógeno en forma de urea, compuesto muy soluble y poco tóxico, estos animales se denominan ureotélicos. La urea se descubrió en la orina desde el año de 1773 por Robelle, en un principio él creyó que se formaba por la unión directa del bióxido de carbono (CO2) y del amoniaco, según la siguiente reacción:
Kossel y Dakin (1904), comprobaron que la urea se formaba a partir de un nitrógeno de la arginina, el cual es hidrolizado catalíticamente por acción de una enzima específica denominada arginasa.
116
La omitiría actúa como "aceptar de NH 3 y CO2" para transformarse en citrulina, este aminoácido reacciona con el ácido aspártico, el cual se transforma en fumárico y la citrulina en arginina. Es decir, la formación de urea es un proceso cíclico que se conoce como ciclo de la urea o de KrebsHensseleit, y se puede resumir de la s iguiente forma:
Enzimas: 1. Carbamilfosfato sintetasa 2. Ornitina transcarbamilasa 3. Argininosuccínico sintetasa
4. Argininosuccínico sintetasa 5. Arginasa
Determinación de arginasa
EXPERIMENTO 1. a) Preparación del homogeneizado de hígado de ratón. Se utilizará para este propósito un ratón blanco adulto, el cual se sacrificará por descerebración, se le extrae el hígado y se pesa lo más rápido posible, se añade la cantidad de agua helada necesaria para que la solución quede al 2%. Se homogeneiza y se centrifuga a 2000 rpm, por 20 minutos. El sobrenadante se utilizará como fuente de enzimas. El residuo se deshecha. Dicha fuente de enzimas deberá conservarse en hielo hasta el momento de usarse. b) Preparación de la serie enzimática.
117
Prepare una serie de 5 tubos de ensaye que contengan lo siguiente: 1
2
3
4
5
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25 0.25 Sol. reg. glicina 0.1 M pH9.5 0.2 0.2 Sol. reg. Larginina 0.5M pH9.5 Agua 0.2 0.2 9 Preincubar a 37 C durante 5 minutos
0.25
0.25
0.25
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
MnCI20.01M
Homogeneizado de hígado de ratón al 2% Incubar a 37fi C a los:
0.25
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
5'
10'
*&'
20'
25'
Concluido el tiempo indicado para cada tubo se les añade 3 mi de ácido perclórico (HCIO4) 0.5M para detener la reacción. c). Preparación de la serie colorimétrica. Para desarrollar el color se prepara una serie de 5 tubos que contengan lo siguiente:
Agua Mezcla enzimática del procedimiento anterior (conservando el orden) Mezcla acida Isonitroso propiof enona 1 %
1
2
3
4
5
5.5 0.5
5.5 0.5
5.5 0.5
5.5 0.5
5.5 0.5
2
2 0.4
2 0.4
2 0.4
2 0.4
0.4
Colocar en baño maría a ebullición durante 60 minutos Restablecer el volumen en cada tubo y leer a 540 nm (Anotar lectura) 118
d) Trace una gráfica que relacione la actividad de la enzima contra tiempo de incubación.
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE TRANSAMINASAS El tejido hepático es rico en una gran variedad de enzimas entre las que destacan arginasa, transaminasa glutámico pirúvica (TGP) y glutámico oxalacética (TGO). El tejido hepático contiene más TGP que TGO, por lo que una elevación es un indicador más específico del daño hepático. La TGO está ligeramente elevada en la necrosis cardiaca. La TGO y TGP están normalmente presentes en el plasma humano, bilis, líquido cefalorraquídeo y saliva, pero ninguna se encuentra en orina, a menos que el riñon presente una lesión. En hepatitis viral y otras enfermedades asociadas con necrosis hepática, las concentraciones de ambas enzimas se elevan; aún antes de que aparezcan los síntomas clínicos. En cáncer hepático, cirrosis, ingestión de alcohol, después de la administración de algunos medicamentos (opiáceos, salicilatos, ampicilina), varían las concentraciones de transaminasas según el proceso de que se trate. Este tipo de enzimas cataliza la transferencia de un grupo amino (-NH 2) de un a-aminoácido a un a-cetoácido, formándose un nuevo aminoácido y un nuevo cetoácido. Se han porpuesto nombres más lógicos para estas enzimas, por ejemplo: Para la transaminasa glutámico oxalacética (TGO o GOT) se ha propuesto el nombre de aminotransferasa de aspartato y para la transaminasa glutámico pirúvica (TGP o GTP) aminotransferasa de alanina; sin embargo los nombres antiguos son los más usados. La reacción que cataliza la TGO (E.C. 2.6.1.1.): L-aspartato; 2 oxoglutarato aminotransferasa, es la siguiente:
119
Determinación de TGO. Existen varios métodos para cuantificar estas transaminasas, por ejemplo: Karmen introdujo la cuantificación de la enzima con espectrofotómetro ultravioleta, la cual se considera hoy en día como el método de referencia general. No obstante, el procedimiento cinético se considera como el me jor, aún y cuando se han investigado métodos que permiten el empleo de fotómetros de filtro. En la técnica de Rietman y Frankel, método a utilizar en este experimento, se determina directamente el ácido oxalacético como dinitrofenilhidrazona. En la reacción que se efectúa, tanto el ácido a-cetoglutárico como el ácido oxalacético forman hidrazonas pero, la absorbancia de la hidrazona del segundo es muy superior a la del primero. Dado que consecutivamente a la acción enzimática se produce un incremento del ácido oxalacético, así como una disminución del ácido a-cetoglutárico, entonces, el incremento resultante en la absorbancia del color de la hidrazona es proporcional a la cantidad de ácido oxalacético formado.
Método fotocolorimétrico de Rietman y Frankel. EXPERIMENTO 2 a) Se extraen 5 mi de sangre del pliegue del brazo con una jeringa esté ril y se deposita en un tubo de ensaye para centrífuga. Se deja reposar para que se forme el coágulo, una vez formado se separa de las paredes cuida dosamente con un aplicador de madera, evitando la hemolisis. Se centrifuga a 3 000 rpm por 10 minutos, el suero obtenido se utilizará como fuente de enzimas. b) Determinación cuantitativa de TGO
120
En dos tubos de ensaye colocar: Problema
Blanco
0.5
0.5
02
-
0.5
0.5
-
0.2
5.0
5.0
Sustrato para TGO en sol. reg. (BIOXON) Preincubar durante 5 minutos en baño maría a 37a C Suero de reciente obtención Mezclar, incubar durante 60 minutos en baño maría a 37e C Reactivo desabollador de color 2,4-dinitrofenilhidracina Suero de reciente obtención Mezclar, dejar en reposo 20 minutos a temperatura ambiente NaOH 0.4N
Mezclar bien, dejar en reposo por 5 minutos, medir la absorbancia del problema contra el blanco e interpolar en la curva tipo para obtener U.l/ml c) preparación de la curva tipo para TGO Preparar una serie de 5 tubos de ensaye, siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:
Agua destilada Piruvato de sodio 2mM (patrón) Sustrato para TGO (Aspartato + ct-cetoglutarato Reactivo desarrollador de color (2,4-dinitrofenilhidracina 1.5 mM) Unidades de TGO Ul/ml
1
2
3
4
5
0.2 -
0.2 0.05
0.2 0.1
0.2 0.2
0.2 0.3
1.0
0.95
0.9
0.8
0.7
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
11
22
55
95
Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo agregar 5 mi. de NaOH 0.4N. Mezclar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con filtro verde. Trazar una gráfica en papel milimétrico con la lectura de densidad óptica (D.O.) contra las unidades internacionales anotadas en la tabla anterior.
121
Determinación de TGP La transaminasa glutámico pirúvica es similar a la TGO y es determinada por los mismos métodos excepto que el sustrato contiene L-alanina en vez de ácido aspártico y el producto intermedio es ácido pirúvico en lugar de ácido oxalacético.
Método colorimétrico de Rietman y Frankel.
EXPERIMENTO 3. a) Determinación cuantitativa de TGP El procedimiento es el mismo que para TGO excepto que se usa el sustrato para TGP y que el tiempo de incubación es de 30 minutos, en lugar de una hora. Prepare dos tubos de ensaye, siguiendo las mismas indicaciones que en el experimento anterior, cambiando los reactivos, en esta ocasión para TGP y modificando el tiempo de incubación. b) Preparación de la curva tipo.
Agua destilada Piruvato de sodio 2mM (solución patrón) Sustrato para TGP (alanina + a-cetoglutarato)(BIOXON) Reactivo desabollador de color (2,4dinitrofenilhi-dracina). Unidades de TGP Ul/ml
1
2
3
4
5
0.2 _
0.2 0.05
0.2 0.1
0.2 0.2
0.2 0.3
1.0
0.95
0.9
0.8
0.7
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
12.5
25
50
85
122
Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Después de este tiempo agregar 5 mi de NaOH 0.4N. Mezclar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con filtro verde. Trazar una gráfica en papel milimétrico con las lecturas de densidad óptica (D.O.) contra Ul/ml anotadas en la tabla anterior. Los resultados de la lectura del blanco y el problema se interpolan en la curva tipo para TGP.
123
Esta obra se terminó de imprimir en el mes de junio de 1996, en los talleres de Edicupes, S.A. de C.V., en México D.F.
125
