Universidad Mayor de San Simón Facultad de Ciencias y Tecnología Departamento de Química
GUIA DE LABORATORIO DE INTRODUCCIÓN A LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA
. Doc.: Lic. Orlando Mercado D.
Aux.: Univ. Wilder Quispe R.
Cochabamba - Bolivia
LABORATORIO DE INTRODUCCIÓN A LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA El experimento permite desarrollar procesos y habilidades como, la observación, la manipulación, indagación, la clasificación, predicción, asimilación, la reflexión, y el cuestionamiento alrededor de los problemas que la cotidianidad co tidianidad nos presenta. Estas habilidades se desarrollan y se hacen parte importante del experimentador solo cuando se convierten en un acto vivencial para él y el experimento es la herramienta más adecuada para conseguir este prop ósito. La biotecnología aplicada es una alternativa muy significativa para la diversificación de los procesos y la generación de nuevos productos. Es conocido que los procesos biotecnológicos tienen gran difusión y aceptación en la mayoría de los países desarrollados, sin embargo no ocurre lo mismo en nuestro país, en el que apenas se incursiona tímidamente. Por este motivo, se considera necesario fundamentar y acelerar la investigación en biotecnologías con aplicación en procesos industriales y en este sentido y con este fin se desarrollo la materia de LABORATORIO DE INTRODUCCIÓN A LA INGENIERIA
BIOQUÍMICA. Cronograma de Actividades
Actividad
Microscopia y Observación de Microorganismos
Aislamiento y Cultivo de Microorganismos Poder Fermentativo er
1 Parcial
Fermentación Alcohólica Elaboración de la Cerveza Fermentación Láctica
Biomasa
2do Parcial
a a a a a a a a a n n n n n n n n n a a a a a a a a a m m m m m m m m m e e e e e e e e e S S S S S S S S S ª ª ª ª ª ª ª ª ª 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a n a m e S ª 0 1
a n a m e S ª 1 1
a n a m e S ª 2 1
a n a m e S ª 3 1
a n a m e S ª 4 1
LABORATORIO DE INTRODUCCIÓN A LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA El experimento permite desarrollar procesos y habilidades como, la observación, la manipulación, indagación, la clasificación, predicción, asimilación, la reflexión, y el cuestionamiento alrededor de los problemas que la cotidianidad co tidianidad nos presenta. Estas habilidades se desarrollan y se hacen parte importante del experimentador solo cuando se convierten en un acto vivencial para él y el experimento es la herramienta más adecuada para conseguir este prop ósito. La biotecnología aplicada es una alternativa muy significativa para la diversificación de los procesos y la generación de nuevos productos. Es conocido que los procesos biotecnológicos tienen gran difusión y aceptación en la mayoría de los países desarrollados, sin embargo no ocurre lo mismo en nuestro país, en el que apenas se incursiona tímidamente. Por este motivo, se considera necesario fundamentar y acelerar la investigación en biotecnologías con aplicación en procesos industriales y en este sentido y con este fin se desarrollo la materia de LABORATORIO DE INTRODUCCIÓN A LA INGENIERIA
BIOQUÍMICA. Cronograma de Actividades
Actividad
Microscopia y Observación de Microorganismos
Aislamiento y Cultivo de Microorganismos Poder Fermentativo er
1 Parcial
Fermentación Alcohólica Elaboración de la Cerveza Fermentación Láctica
Biomasa
2do Parcial
a a a a a a a a a n n n n n n n n n a a a a a a a a a m m m m m m m m m e e e e e e e e e S S S S S S S S S ª ª ª ª ª ª ª ª ª 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a n a m e S ª 0 1
a n a m e S ª 1 1
a n a m e S ª 2 1
a n a m e S ª 3 1
a n a m e S ª 4 1
NORMAS Y CUIDADOS PARA EL TRABAJO EN EL LABORATORIO Cuando se trabaja en el laboratorio es necesario, ser cuidadoso, buen observador, obrar con cautela, todo en bien de realizar un trabajo más eficiente y evitar accidentes. Con este fin se proponen las siguientes normas: El experimentador debe leerlas cuidadosamente, preguntar, si no son claras y luego interiorizarlas
de tal forma que las tenga en cuenta de manera automática y voluntaria durante las prácticas de laboratorio. Use guardapolvo de laboratorio (bata), guantes desechables y lentes de seguridad cuando trabaje
con sustancias peligrosas, trasiegos, pelado de materia prima y cuando realice las prácticas. Coloque ropa, mochilas y demás cosas en el lugar dispuesto en el laboratorio. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia, al
terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Limpie o desinfecte la superficie del mesón al inicio y fin de la práctica; ya que se trabajara con
microorganismos y fermentos. Tenga cuidado con el uso del mechero, reconocer la posición de cerrado o abierto. Antes de utilizar un compuesto fíjese en la etiqueta para asegurarse de que es el que se necesita y
de los posibles riesgos de su manipulación. Consulte previamente con el docente ó auxiliar. d evuelva nunca nu nca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar No devuelva con el docente o el auxiliar. No toque con las manos y menos con la boca los productos químicos. No pipetee nunca con la boca. Se debe utilizar la bomba de goma. Abra las cajas de Petrie, tubos de ensayo u otros recipientes que contengan medio o cultivos el
menor tiempo posible y cerca del mechero para evitar contaminación. Identifique y marque los recipientes con medios de cultivo en uso con fecha, abreviatura del
medio de cultivo, número o nombre del grupo. Maneje técnicamente el microscopio si no sabe hacerlo pida a su docente o auxiliar las
instrucciones pertinentes. Informe al docente, en caso de accidente, para tomar las medidas necesarias.
Entregue al auxiliar de laboratorio los materiales empleados durante la práctica. Deje el salón en perfecto orden y aseo. Disponga en el sitio de desecho el material contaminado
para ser inactivado antes de ser lavado, y el resto de material orgánico sobrante llévelo al lugar indicado por el docente. No coma, ni beba ningún tipo de alimento dentro del laboratorio. No guarde materiales o reactivos dentro de los bolsillos del guardapolvo.
FORMATO DE PRESENTACIÓN DEL INFORME
Todo informe es individual, se presentara a la siguiente clase de haber terminado la práctica, muy bien puede ser realizado a mano ó en computadora y se evaluara sobre cien puntos según el siguiente criterio de ponderación:
TITULO DE LA PRÁCTICA 1. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………………... 5 pts. 2. OBJETIVOS……………………………………………………………………............. 5 pts. 2.1. Objetivo General 2.2. Objetivos Específicos 3. MARCO TEÓRICO………………………………………………………………….... 10 pts. 4. MATERIALES Y REACTIVOS.................................................................................... 10 pts. 4.1. Materiales 4.2. Reactivos 4.3. Equipos 5. METODOLOGÍA……………………………………………………………………....
10 pts.
6. RESULTADOS…………………………………………………………………………
15 pts.
7. OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES………………………………………….... 15 pts. 7.1. Observaciones 7.2. Conclusiones 8. CUESTIONARIO…………………………………………………………………….... 30 pts. TOTAL 100 pts. “El docente ó auxiliar explicara detalladamente cada punto del informe, para una mejor compresión y realización del informe por parte del estudiante”
Practica #1
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica MICROSCOPIA Y OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS
Introducción: La invención de los aparatos de óptica, el telescopio y el microscopio a finales del siglo XVI y principios del XVII, han contribuido a modificar la concepción que el hombre tenía de mundo. Con el primero se comenzó a sondear la profundidad del cosmos y con el segundo, el mundo de lo infinitamente pequeño. El microscopio permite observar objetos no visibles para nuestros ojos y es el instrumento de mayor uso en el laboratorio. Mediante un sistema de lentes e iluminación, se puede aumentar el tamaño de la imagen de 40 a 1000 veces. Y por ende se puede observar microorganismos a diferentes aumentos. Un microorganismo, también llamado microbio, es un ser vivo que sólo puede visualizarse con el microscopio, aunque la mayoría son microorganismos inofensivos, los hay también “infecciosos”. Éstos se pueden multiplicar en el cuerpo y causar enfermedades o dolencias.
Marco Teórico:
Definición de Microscopia Tipos de Microscopios Partes de un Microscopio Sistema mecánico Sistema óptico Sistema de iluminación
Definición de microbiología Clasificación de Microorganismos Microbiología Industrial Beneficios de los microorganismos Perjuicios de los microorganismos Usos industriales de microorganismos
Metodología: 1) Reconocimi ento de un M icroscopio Óptico Identifique las partes del microscopio con la ayuda del docente ó del auxiliar.
2) Pr eparaci ón de las M uestr as Se preparara en los portaobjetos muestras de yogurt, fermentos y mohos de pan. Su finalidad es conocer los tres tipos de microorganismos que utilizaremos en las practicas (bacteria, levaduras y mohos). Previo a preparar las muestras, se debe tener prendido el mechero de alcohol, los portaobjetos y cubreobjetos limpios encima de una franela; y tener al alcance el asa y la punta. Se esteriliza al fuego del mechero el asa, agitamos un poco para que enfrié, introducimos al recipiente que contiene la muestra, ya sea el yogurt o fermento, sin tocar las paredes. Extraemos el asa y colocamos una gotita al medio del portaobjetos, lo recomendable es colocar unas gotas de agua estéril inicialmente, para que la muestra no se encuentra muy concentrada y se pueda observar el microorganismo, en este caso el asa con la muestra se homogeniza en el agua Seguidamente colocar el cubreobjetos a una altura no mayor de 1 cm. (Siempre se debe agarrar el cubreobjetos de los extremos y nunca de las esquinas) Para preparar una muestra solida, en este caso moho de pan. Esterilizamos el asa, donde haya mayor presencia de moho, se frota suavemente sin presionar hasta tener una buena cantidad de hongo en el asa. Una vez que el hongo este en el asa, lo apoyamos en el portaobjetos y con un gotero, goteamos agua estéril (que penetra por capilaridad en caso que se haya cubierto con el cubre) y el moho se quedara ahí y procedemos a homogenizar. Inmediatamente cubrimos con el cubreobjetos teniendo el cuidado de no formas burbujas de aire. Todos estos pasos se deben realizar entre el mechero y el operario, evitando en lo posible de contaminar la muestra..
3) Obser vación de las muestr as en el M icroscopio Coloque el objetivo al de menor aumento (4x) en posición de empleo y baje la platina completamente, coloque una de las preparaciones sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. Comenzar la observación con el objetivo de 4x o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
Para realizar el enfoque: Acerque al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo
micrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparación con el micrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el micrométrico hasta obtener un enfoque fino. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operación. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de inmersión. Desde el paso cinco se debe hacer para cada uno de los montajes, realizar la descripción y los dibujos de cada muestra de forma detallada.
Resultados: a) Dibuj ar y descri bir las levadur as, en un f ermento espontan eo, notar l as dif erentes formas que se van sucediendo en todo el proceso f ermentati vo, al pr in cipi o un as cé lu las en forma de li món (apícul adas) a medida que el procesos avanza apar ecen otras en for ma gl obosa, a veces alar gadas y otr as en for ma elíptica.
4x10 Descripción:
40x10 Descripción:
100x10 Descripción:
b) Di bujar y descri bir las bacterias en una muestr a de yogur t, obser var l as dos for mas, las de forma de bacil os y los cocos
4x10 Descripción:
40x10 Descripción:
100x10 Descripción:
c) Dibuj ar y describi r a los hongos, como se dij o en mu estr a de pan, se debe tener mucho cui dado con este ti po de mi croorganismo, r ecué rdese son pr oductor es de muchas enf ermedades de la piel.
4x10 Descripción:
40x10 Descripción:
100x10 Descripción:
Practica #2
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Introducción: Los microorganismos están presentes en todos lados, y no es excepción alguna que estas estén involucradas en la formación de productos fermentados como la cerveza, vinos, quesos, yogurt, etc. Como así también causantes de muchas enfermedades y desperdicios provocada por los microorganismos. Nosotros trabajaremos con microorganismos industriales, está practica aislaremos levaduras, claro que en la caja petri crecerán varios otros tipos de microorganismos, para un ojo de experiencia, puede distinguir por las colonias que tipo de microorganismo es. Es por ello la necesidad de aislar y desarrollar microorganismos específicos, ya sea para fermentación de cerveza, vinos, productos lácteos, como así también para el área de salud como la penicilina, entre otras más.
Marco Teórico:
Crecimiento Microbiano Cultivo de de microorganismos Medios de cultivo Métodos de Aislamiento Concepto de Cultivo Puro Factores físicos y químicos que influyen en el crecimiento
Métodos de conteo Métodos de conservación Microorganismos aeróbicos Microorganismos anaeróbicos Características de las Levaduras Características de las colonias de las levaduras
Metodología: 1) Preparación del M osto Seleccionar una fruta (durazno, uva, frutilla, otros). Preferentemente que la fruta este sana y fresca. Estrujar la fruta en su totalidad, es decir junto con su cascara y sus semillas, y colocar en un frasco de vidrio limpio. Tapar con algodón la boca del frasco y dejar fermentar por 72 horas mínimamente.
2) Preparación de M edios de Cul tivo en Caj as Petr ie “El agar malta se trata de un medio cuya fuente de carbono es el extracto de malta, recomendado para el aislamiento de levaduras y hongos, sirve para la identificación selectiva de algunas cepas de levaduras.”
Preparar el agar según la cantidad requerida previo a los cálculos realizados en las cajas petrie y tubos de ensayo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
Cada caja petrie recibe un promedio de 20 ml ó 0,5 cm de espesor, y cada tubo de ensayo recibe 9ml del agar. Previo a ello esterilizar en autoclave todo el material de vidrio que se usara: cajas petries, tubos de ensayo, pipetas y otros materiales a usar envueltas en papel madera preferentemente.
Fig. 1 Una vez preparada la solución de agar que se utilizara, se esteriliza en autoclave previo al preparado de los medios. (Fig.1) El mismo paso se prosigue en los tubos, echándole 6 ml y tapándolo con algodón, una vez esterilizado se lo inclina para su solidificación. (Fig.2)
Fig. 2
3) Sembrado Previo al sembrado en las placas se prepara diluciones del mosto virgen, en 5 tubos de ensayo que contienen 9 ml de Suero Ringer. (Fig. 3)
10
-1
-2
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-3
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-4
10 Fig. 3
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-2
Con una pipeta graduada se extrae 1ml del mosto virgen (10 ) y se trasvasa al tubo 10 , se -3 mezcla homogéneamente y se extrae 1ml para después trasvasar al 10 y así sucesivamente. Para hacer un sembrado por extensión, en una caja petrie ya con el agar solidificado y esterilizado se coloca 1ml de la dilución cualesquiera, seguidamente con el Asa Drigalsky expandir por toda la placa. (Fig. 4a) Para hacer un sembrado por versación, en una caja petrie limpia y esterilizada se coloca 1ml de la dilución, seguidamente encima se pone el agar malta, se la tapa y se gira suavemente para solidificar. (Fig. 4b) Una vez terminado el proceso de siembra, se lleva a la mufla a temperatura de 27ºC. a
b
Fig. 4
4) Cr ecimiento y Selección de L evadur as Pasada 48 horas después del sembrado en las cajas petries, seleccionamos e identificamos las posibles colonias definidas de levaduras, seleccionamos máximo 4 colonias por caja petrie. Observar el crecimiento, la morfología, la coloración, características, etc y diferenciarlas de un hongo u otro agente externo o contaminante. A las 72 horas del sembrado, colocar las cajas petrie, en la congeladora para evitar la confrontación y contaminación de las colonias. Realizar todas las observaciones por un máximo de cinco días y realizar el conteo y determinar las Unidades Formadoras de Colonias. [UFc]
5) Ai slami ento de Levaduras Una vez seleccionada las cuatro colonias definidas posibles levaduras, se procede a aislar en tubos de ensayo que contienen el agar solidificado en forma de pico de flauta. Con un asa de aguja picamos la colonia y sembramos por estría en el tubo ya con el agar solidificado e inclinado y lo tapamos con algodón previamente esterilizado al fuego. (Fig 5)
Fig. 5
6) Conf ir mación de levaduras por mi croscopia Se selecciona dos tubos según la coloración de indicador del medio que se utilizo. Se procede de la misma manera de la Práctica #1 los incisos 2 y 3. Es decir mediante microscopia
identificar las posibles levaduras.
Resultados: a) Realizar los cálcu los para el pr eparado del agar para l os medios en las cajas petr ie y tubos de ensayo. b) Realizar l os cálcul os para el pr eparado del suero Ri nger al 2% para las diluci ones en l os tubos. c) Calcul ar las UF c presentes en l as cajas petr ies. UFc g de muestra
N de colonias º
Factor de Dilución
d) Di bujar, descri bir y detall ar todo lo que observo por el m icr oscopio.
Practica #3
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica PODER FERMENTATIVO
Introducción: Se entiende por poder fermentativo o poder alcoholígeno la capacidad que tienen las levaduras para producir alcohol , por tanto, corresponde al máximo porcentaje de etanol que una levadura es capaz de producir al fermentar un mosto estéril con exceso de azúcares, graduación Brix igual o superior a 24 ºBrix. El poder fermentativo es la medida del porcentaje (v/v) de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir y paralelamente estudiar la cinética fermentativa. Los grados Brix (símbolo °Bx) miden el cociente total de sacarosa disuelta en un líquido. Por ejemplo una solución de 25 °Bx tiene 25g sacarosa por 100 g de la solución.
Marco Teórico:
Definición de levadura Fisiología de levaduras Criterios de selección de una levadura Ciclo de crecimiento de poblaciones de levadura Estudios de Müller-Thurgau
Flora Blastomicética Fermentación espontanea Poder Fermentativo Cinética fermentativa Biotecnología de las fermentaciones alcohólicas
Metodologia: 1) Preparacion del mosto de uva Obtener uvas enteras, maduras, sanas y limpias y sobre todo que estén frescas, aproximadamente ½ Kg. de uva luego procedemos a estrujarlas de forma suave, importante saber que las semillas deben de quedar enteras. Con una tela filtrante limpia y planchada, filtrar 250 ml de la uva estrujada a un recipiente limpio y seco. Medir los grados Brix iniciales del mosto obtenido con u n refractómetro. [C1] Hacer los cálculo necesarios para agregar la cantidad de azucar para el mosto, con tal de tener una concentración entre 23 - 25 ºBx. [C2] Pasar a un matraz Erlenmeyer de 200 ml exactamente 100 ml del mosto. Se tapa con algodón limpio y se lo esteriliza en autoclave a 121ºC y 1,2 atm por 15 minutos.
2) Siembra de una levadura en el mosto esteril ( Metodo Gravimetrico del Microvinificador ) OJO: previo a esta parte de la practica, se debe tener seleccionada una levadura joven, obtenida en la
practica #2. Con una asa de aguja esterilizada se pica la levadura y se procede a la inoculacion dentro el matraz esterilizado una vez que se enfrio el mosto. Trabajar alrededor de la flama del mechero. Tras la inoculacion, se sustituye el tapon de algodón por una valvula Müller que contiene acido sulfurico concentrado que evita la entrada de oxigeno y permite la salida de CO2. Previamente la valvula debemos esterilizar a vapor de agua. Pesar el matraz [M0] una vez asegurada la valvula Müller y pesar cada 24 horas a 30ºC, es decir a la misma hora cada dia, hasta que se alcance un peso constante [M f ] usando la misma balanza.
Resultados: OJO: Una vez terminada la prueba, es decir, que el microvinificador dejo de liberar CO 2 y el peso sea constante, se procede a realizar varias determinaciones.
a) Anotar la concentracion inicial del mosto [C1] y realizar los calculos necesarios para obtener un mosto aproximado de 24ºBx aproximadamente [C1]. b) Determinación del pH . Determinar el pH0, es decir el pH del mosto antes del autoclavado. Determinar el pH f , es decir el pH del mosto inoculado una vez que dejo de liberar CO2 Con ambos datos corroboramos que en el proceso fermentativo se producen acidos.
c) Determinación del poder fermentati vo Para poder fermentativo se debe tener la masa inicial y la masa final del matraz con su valvula Müller. PF M f M 0 2,5
Donde:
PF Poder Fermentativo expresado en % [v/v] de Etanol M 0 Peso inicial del matraz junto con la valvula de Müller en [g] M f Peso final del matraz junto con la valvula de Müller en [g] 2,5 Factor que sale de la estequiometria de la reaccion
d) Determinación de alcohol (metodo picnometrico) Se toma 50 ml del fermento en un matraz aforado de 50 ml. Se tranfiere el contenido del matraz aforado al balon de destilacion, se enjuaga el matraz aforado
con dos porciones de 5 ml de agua destilada, incorporandola al balon de destilacion. Se efectua la destilacion, recogiendo 35 ml del destilado. Seguidamente se la enrasa a 50 ml con
agua destilada. Determinar la densidad relativa del alcohol mediante el metodo del picnometro: º C
relativa
M Picnometro Alcoho l M Picnometro
M Picnometro Agua M Picnometro
Una vez obtenido la densidad relativa del alcohol y la temperatura ambiente, se determina el
% [v/v] de etanol mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura, Tablas Windsord.
e) Determinacion de azucar residual (azucar reductores) El residuo de la destilacion, aproximadamente 15 ml, lo enrasamos con agua destilada en un matras aforado de 50 ml. Y con el refractometro medimos los grados Brix, con este dato determinamos azucar residual del mosto.
a) Determinacion de Acidez Total (la acidez valorable se utiliza durante las operaciones de elaboración y acabadopara normalizar los vinos y para descubrir alteraciones indeseables debidas a bacterias, fermentos, etc.) Primeramente colocamos 200 ml de agua recientemente hervida en un matraz Erlenmeyer, neutralizamso está agua, colocando unas gotas de fenoftaleina y valorando con NaOH 0,1 N seguidamente colocamos 5 ml del fermentado y homogenizamos. Procedemos a titular con NaOH 0,1N hasta que se de el cambio de color ligeramente rosado. Calculamos el %Acidez Total:
Rango permitido = 0,5 g/100ml en Ac. Acético.
% Ac.Total
V NaOH C NaOH 60 100 1000 V M
Donde:
% Ac.Total en g/100ml Acido Acético
V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ] C NaOH Concentracion del NaOH[ N ] V M Volumen de la muestra[ml ]
b) Determinacion de Acidez Volatil (se debe a los acidos grasos presentes, como formico, acetico, butirico,etc. Una acidez alta indica presencia de microorganismos daniños)
Se utiliza el equipo de destilacion diseñado para el efecto, es decir por arrastre de vapor. Se coloca 10 ml del fermento en el tubo Sellier, y el agua del balon debe hervir. Una vez que hierva dicha agua, se cierra la valvula de escape y se forza a que el vapor entra en el tubo de Sellier. Se debe obtener 60 ml aproximadamente del destilado y pasar a un matraz Erlenmeyer y agregar 4 gotas de indicador fenoltaleina. Se procede a titular con NaOH 0,1N hasta que vire de color ligeramente rosado.
% Ac. Acetico
V NaOH C NaOH 60 100 V M 1000
Rango permitido = 0,12 g/100ml Ac. Acético
f) Cal cul o de la Ciné ti ca Fermentati va (graficar en papel milimetrado) Para determinar cinetica fermentativa se debe pesar el matraz cada 24 horas hasta que el peso sea constante a 30ºC, lo cual nos indica que ya no esta liberando CO2 y completamos la siguiente tabla. Peso [g]
Tiempo [horas] ] g [ o s e p e d a d i d r é P
Tiempo [hrs]
Curvas de cinetica fermentativa de las cepas para su comparacion y analisis cualitativo de resultados:
a. b. c. d.
Correcta Rapida Con problemas de acabado Con problemas de arranque
Practica #4
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Es algo límpido y no es agua, Es algo fluido y no es aire, Es una luz sin fuego Y un espíritu sin cuerpo “
”
Introducción: En la fermentación alcohólica, los azúcares, fructosa, glucosa y sacarosa, son transformados, por levaduras fermentativas del género Saccharomyces, en un gran número de componentes bioquímicos, entre los que destaca el etanol y el gas carbónico como productos mayoritarios. Según gay Lussac se tiene: C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 En condiciones anaerobias las levaduras realizan la fermentación; es decir degradan los azúcares de forma incompleta generando etanol, CO2 y energía. En estas condiciones el rendimiento en biomasa es de tan solo 1 g de levadura por cada 100 g de azúcares consumidos. Las levaduras han sido utilizadas para la producción de etanol. Saccharomyces Cerevisiae es la levadura más comúnmente utilizada. El etanol es inhibitorio a altas concentraciones y la tolerancia al alcohol de las levaduras es crítica para obtener rendimientos altos.
Marco Teórico:
Fermentación alcohólica Bioquímica de la fermentación Factores que influyen en la fermentación Productos secundarios de la fermentación Fermentación Maloláctica Procesos metabólicos anaeróbicos
Procesos metabólicos aeróbicos Procesos de fermentación y asimilación Definición de Enología Microbiología de fermentaciones vínicas Fermentación espontanea Sustratos: Sulfatización
Metodología: NOTA : No es recomendable utilizar para la práctica frutas tales como: mango, papaya, guanábana, guayaba, etc; ya que estas tienen mucho mucílago y son muy espesantes al trabajar con ellas, complicando la fermentación. Se sugiere utilizar frutas tales como: mora, uva, piña, maracuyá, naranja, manzana, frutilla, durazno entre otras. Caso contrario consultar con el docente o el auxiliar, como manejar esas frutas, recuérdese todo es posible.
El aboración de Sidr a ó Vi no
1) Pr eparado del Pie de Cuba Sin importar que fruta sea la que escogió, se procede a: lavar, pelar y trozar en cubitos. En caso que la fruta tuviera semillas se los separa de la pulpa. El trozado de la fruta se coloca en una licuadora, en está operación se aumenta agua para su molienda y se corrige con azúcar el contenido final de ºbrix, hasta que se tenga un jugo aproximadamente de 3 litros. Se filtra el jugo de la fruta a un recipiente y se mide la cantidad de azúcar que contiene el mosto, si es necesario una corrección le agregamos azúcar hasta obtener entre 21ºBrix o un poco más para vino y 16ºBrix o un poco más para sidras. Se coloca entre 20 y 30 ppm de SO2 como inhibidor de enzimas y posibles contaminaciones. Una vez obtenido el mosto de la fruta y con los ºBx corregidos, trasvasamos los 3,5 litros al botellón de vidrio. (Botellón verde de vino seco) Procedemos a inocular con la levadura ya seleccionada de la tercera práctica, caso contrario una levadura comercial, teniendo en cuenta el procedimiento que se debe hacer para evitar la contaminación. Una vez terminada la inoculación de la levadura, tapamos el botellón con algodón limpio y estéril.
2) Trasiegos Pasada los primeros 3 días de fermentación del pie de cuba, se procede al primer trasiego. Usando una manguera de goma y una varilla de vidrio, se la introduce con cuidado por la boca del botellón hasta ¾ partes del contenido teniendo el cuidado de no levantar el precipitado (borras de fermentación) que se formo en la base. Del otro extremo de la manguera aspiramos hasta que fluya el fermento, a otro botellón limpio y seco. Una vez extraído todo el líquido límpido y sin burbujeos al botellón, extraemos 10 ml del fermento a un vaso de precipitado y lo llevamos a ebullición del 50% del volumen total del mosto. Una vez que ebullo aproximadamente el 50% del volumen extraído, lo enrasamos con agua destilada a 10ml y procedemos a leer los grados Brix con el refractómetro. Consultando con el docente ó el auxiliar, se agregara los siguientes reactivos, según la concentración de ºBx del pie de cuba:
Sulfitos
Urea
Fosfatos
[ppm]
% [p/v]
% [p/v]
>6
100
0,15
0,1
<5
150
0,10
--
ºBrix
Pasado los 3 días siguientes, se procede con el segundo trasiego, y se procede con los mismos pasos mencionados anteriormente. Una vez que el pie de cuba nos de menor a 5 ºBx, se pasara a la siguiente etapa del proceso. Se coloca una dosis de 150 ppm de SO2 con el objeto de estabilizar tempranamente el fermento.
3) Clarificado Una vez terminada el ultimo trasiego y nos de menor a 5 ºBx, se le agregara bentonita 0,7g/L. La bentonita se preparara con 24 horas de anticipación, se calcula la cantidad requerida para el fermento, y se la mezcla con agua potable en una relación de 1:10 de su peso agregándole agua. Pasada las 24 horas del preparado de la bentonita, se notara que la bentonita se hincho, se le agrega al pie de cuba después de haber realizado el ultimo trasiego. Se deja actuar a la bentonita por 24 horas y después se procede a filtrar el mosto clarificado, y se agrega nuevamente SO2 100ppm. Después se procede a verificar su estabilidad, realizando controles de calidad. Recuérdese que en está etapa se distingue un vino de una sidra, los vinos deben tener más de 11º de alcohol y las sidras menores a 8º GL. Se debe tener cuidado con la estabilidad de las sidras, es conveniente que se pasteurice o de lo contrario se sulfite convenientemente.
Resultados: (Ya sea para la sidra ó para el vino, son los mismos cálculos realizados en la Practica #3) a) Determin ación de Acidez Total y Aci dez Volátil.
% Ac.Total
V NaOH C NaOH 60 100 V M 1000
Donde:
% Ac. Acetico
g/100 mlde Acido Acetico
V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ] C NaOH Concentración del NaOH[ N ] V M Volumen de la muestra[ml ] Rango permitido = 0,5 g/100ml Acidez total
Rango permitido = 0,12 g/100ml Acidez volátil
b) Determinación del Gr ado Al cohóli co (Método del Picnómetro) Una vez obtenido la densidad del alcohol y la temperatura del ambiente, se determina el Grado
Alcoholico [ºGL] mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura. (Tablas de Windsord)
º T Amb
M Picnometro Alcoho l M Picnometro
M Picnometro Agua M Picnometro
c) Determinación de Sul fito Total (se usa este antiséptico que está como bisulfito HSO 3 o sulfito -2 SO 3 o mejor SO2 , que reacciona con el acetaldehído, glucosa, fenoles a este SO2 se lo llama sulfito total y al resto sulfito libre)
Para su determinación es necesario hidrolizar con un álcali fuerte y después acidulando y
valorando directamente, es el procedimiento de Ripper. Se toma 20 ml del fermento y 25 ml de NaOH 1 N, se vierten en matraz Erlenmeyer de 250 ml,
se mezclan se tapa el matraz y se deja 10 min, para lograr la hidrólisis. Luego se le agrega 5 ml de almidón y 10 ml de Ac. Sulfúrico 1:3, se valora rápidamente con
disolución de yodo 0,02N hasta coloración azulada.
SO2 Total
V I 2 C I 2 32 1000 V Muestra
SO2 Total mg / L ppm V I 2 Volumen de la titulacion gastada [ml ] C I 2 Concentracion de I2 N V Muestra Volumen de la muestra [ml ]
Rango permitido=300-350ppm
d) Determinación de Sul fi tos L ibr es Primero se acidula para reducir la oxidación de los polifenoles por el yodo y después se valora con
el yodo, hasta el punto final, con almidón como indicador.
Se toma 50 ml de la muestra del fermento y se introduce a un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Se adiciona 5 ml de almidón como indicador, 5 ml de Ac. Sulfúrico 1:3 , rápidamente se valora el
acido sulfuroso libre con yodo 0,02 N. El punto final es el primer oscurecimiento azulado persistente durante la valoración.
SO2 Total
V I 2 C I 2 32 1000 V Muestra
SO2 Libre mg / L ppm V I 2 Volumen de la titulacion gastada [ml ] C I 2 Concentrac ion de I2 N V Muestra Volumen de la muestra [ml ]
Rango permitido=20-30ppm
e) Determin ación de Azúcar Residual . El residuo de la destilacion, aproximadamente 15 ml, lo enrasamos con agua destilada en un
matras aforado de 50 ml. Y con el refractometro medimos los grados Brix, con este dato determinamos azucar residual del
mosto.
f) Pr opi edades or ganolé pti cas. Desde el momento que se prepara el pie de cuba, se debe degustar el mosto y anotar los cambios que suceden en cada trasiego hasta el producto final:
Propiedades Or ganol é pticas Olor Sabor Textura Color Brillo Aspecto Aroma Grados Brix
Pie de Cuba
er 1 Tr asiego
do 2 Tr asiego
er 3 Tr asiego
Producto F in al
Practica #5
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica ELABORACIÓN DE LA CERVEZA
Introducción: La cerveza es una bebida alcohólica, no destilada, de sabor amargo que se fabrica con granos de cebada u otros cereales cuyo almidón, una vez modificado, es fermentado en agua y frecuentemente aromatizado con lúpulo. De ella se conocen múltiples variantes con una amplia gama de matices debidos a las diferentes formas de elaboración y a los ingredientes utilizados. Generalmente presenta un color ambarino con tonos que van del amarillo oro al negro pasando los marrones rojizos. Se la considera "gaseosa" (contiene CO2 disuelto en saturación que se manifiesta en forma de burbujas a la presión ambiente) y suele estar coronada de una espuma más o menos persistente. Su aspecto puede ser cristalino o turbio.
Marco Teórico:
La malta La cebada Bioquímica de la Germinación de la Cebada
El lúpulo El agua, su papel principal Tipos de Cerveza Calidad de la cerveza
Metodología: a) Germinación Selección del grano: este proceso es delicado ya que debe observarse con sumo cuidado que los
granos tengan una textura homogénea, cualquier defecto afecta a la estabilidad del producto final. Remojado del grano: se pone a remojar el cereal en diferentes ciclos de remojo llegando a
reblandecer e hinchar el grano por la absorción del agua.
Lavar la cebada de 3 aguas para eliminar partículas de tierra presentes en la misma.
Remojar la cebada (24 horas), colocar el agua al nivel de la cebada en un recipiente de plástico, vidrio ó acero inoxidable.
Colocar NaOH al 0.1% durante 6 horas, luego cambiar el agua por otra hasta completar las 24 horas.
La cebada tiene que tener aproximadamente 50% de humedad en donde el embrión se pone activo para la posterior germinación.
La cebada se coloca en un embase de plástico, vidrio ó acero inoxidable en una forma rectangular una altura de 15cm cada día, rociar con agua y remover para mantener la humedad y facilitar la germinación.
En los siguientes días se realiza la misma operación disminuyendo la altura 5cm, hasta tener una altura máxima de 5cm donde comenzara la germinación.
Germinado: en este momento de los granos sale un diminuto brote verde (plúmula y la radícula)
de unos centímetros de longitud, en este momento (previo a la aparición de la raíz), la planta emite un enzima que convierte el almidón en azúcar para alimentarse, en este justo instante se interrumpe el germinado (secado). El proceso se hace siempre removiendo para que la germinación sea homogénea en todos los granos, esta fase suele durar unos días. El grano empieza a germinar el ¾ a 1 el tamaño de las raicillas y 3 veces el tamaño del grano, ahí se para la germinación. Secado del grano: se seca el grano con el objeto detener la germinación, se lo puede realizar en
un horno a una temperatura de 80ºC ó al sol. Posteriormente se realiza la trituración del grano germinado con unos rodillos concéntricos (batan) sin de shacer la cascarilla.
b) Cocimiento L ista de adjun tos para un volumen aproxi mado de 1,9 L Malta (se usa de tres tipos) Lúpulo (dos tipos) tenemos pelles inicio Lúpulo antes de hervir Yeso Acido fosforito Sal Arrocillo Azúcar
250g 0.11g 0.32g 0.11g 0.3 ml 0.06g 43g 19g
La sacarificación (conversión del almidón en maltosa y dextrinas) se llevara a cabo según el
siguiente temple de cocimiento. 10 min
15 min
20 min
15 min
15 min
45ºC
50ºC
62ºC
70ºC
75ºC
Se debe tener el agua limpia y pura a 45ºC, en ese momento se coloca la malta, se agita y se va
colocando los adjuntos, el lúpulo se divide en dos, en todo momento a medida que se va cumpliendo los tiempos y temperaturas se debe ir agitando (la subida de una temperatura a otra es de 0,5 a 1 ºC/min. A la temperatura de 62ºC se hace la prueba del almidón (conversión) terminado el tiempo
señalado (debe ser café claro, en caso de ser oscuro o azul, indicativo que tiene almidón sin conversión) o en caso se deja unos 10 min más.
Cuando se finaliza se debe controlar los grados Brix, lo deseable es de 10 a 12 (recuerde que
usted decide su grado alcohólico que va tener su cerveza), aquí se puede añadir de azúcar más, o en caso empezar con un poco más de malta (una cantidad más elevada le dará un mejor
“cuerpo”, todo lo señalado aquí es aproximado, la practica hace al maestro. La segunda parte del lúpulo se coloca a los 75ºC (la industria tiene olla de presión donde se
produce una extracción alta de los ácidos alfa). Cuando se termina
el proceso se filtra, con ayuda de un cedazo se forma la capa filtrante formada por la cascarilla, lo aconsejable es que los primeros filtrados retornen nuevamente a la filtración.
c) F er mentación del M osto Terminado este proceso se enfría hasta 30 a 35ºC, se airea y se coloca la levadura, la proporción
es de una cucharilla para todo este volumen. Se tapa el recipiente con algodón y se deja fermentar según el tiempo indicado por el docente o auxiliar.
Resultados: a) Determinación de Acidez Total
% Ac.Total Donde:
% Ac. Acetico
V NaOH C NaOH 60 100 V M 1000
g / 100ml de Acido Acetico
V NaOH Volumen de la titulacion gastada [ml ] C NaOH Concentración del NaOH[ N ] V M Volumen de la muestra[ml ] 60 Factor del equivalent e del acido mayoritario
b) Determin ación del gr ado alcohólico ºGL Una vez obtenido la densidad del alcohol y la temperatura del ambiente, se determina el Grado
Alcoholico [ºGL] mediante tablas de equivalencia de densidad-temperatura. (Tablas de Windsord)
º T Amb
M Picnometro Alcoho l M Picnometro
M Picnometro Agua M Picnometro
Practica #6
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica FERMENTACIÓN LÁCTICA
Introducción: La fermentación láctica es aquella que se lleva a cabo por las bacterias ácido láctica cuya actividad se desarrolla en ausencia de oxígeno (anaerobiosis), y se manifiesta en la transformación de los azúcares presentes en el vegetal, en ácido láctico, etanol y dióxido de carbono. Este proceso lo realizan muchas bacterias (llamadas bacterias lácticas), hongos, algunos protozoos y en los tejidos animales; en efecto, la fermentación láctica también se verifica en el tejido muscular cuando, a causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportación adecuada de oxígeno que permita el desarrollo de la respiración aeróbica. El acido láctico es un compuesto incoloro compuestos de formula CH3CHOHCOOH. Se da bajo formas óptimamente activas, dextrógira y levógira, frecuentemente denominados acido D-Láctico y acido L-Láctico. En su estado natural es una mezcla óptimamente inactiva compuesta por agentes iguales de ambas formas D y L, conocida como mezcla racemica.
Marco Teórico:
Fermentación Láctica Ventajas y desventajas de la F. Láctica Fermentación Homoláctica Fermentación Heteroláctica Rutas metabólicas
Proceso de fermentación acido láctica Factores que influyen en la F. Láctica Glucolisis Productos que se obtienen de la F. Láctica
Metodología: El aboración de Yogurt Sabori zado
1) Recepción Para el efecto, se requerirá 3 litros de leche recién ordeñada y fresca. Previo a la elaboración se debe analizar su estado organoléptico y fisicoquímico, teniendo en cuenta primordialmente que la leche tenga un grado de acidez bajo y formación de coagulo.
Estabilidad frente al agregado de alcohol - Test del alcohol Colocar 1 ml de leche en un tubo de ensayos y agregar igual volumen de etanol 70%. Agitar
y observar si coagula.
Acidez en la Leche Medir exactamente 20 ml de muestra y colocar en un Erlenmeyer de 250 ml. Diluir con aproximadamente 2 veces su volumen con agua destilada.
Agregar 6 gotas de fenolftaleína al 1%, y titular con NaOH 0,1N hasta color rosa débil pero
persistente durante 30seg. Expresar los resultados en % en ácido láctico [p/p]
2) Filtración Una vez que la leche haya pasado satisfactoriamente los análisis de estado de conservación, se prepara una tela blanca, lavada, enjuagada con abun dante agua, preferentemente planchada. Se filtra toda la leche a un recipiente limpio y seco, la cual retendrá todos los residuos contaminantes provenientes del ordeño de la vaca. Es indispensable realizar esta operación ya que las partículas como pelos, bosta, mosquitos, residuos vegetales entre otros residuos pueden deteriorar nuestro producto. Después del filtrado se debe agregar azúcar blanca refinada (no es azúcar en polvo) en una relación de 90 g/L.
3) Pasteurizado Utilizando una olla de acero inoxidable o aluminio, la leche filtrada se calienta hasta una temperatura de 85 °C durante 10 minutos. Es recomendable que la leche se mantenga a esta temperatura en forma constante, porque a temperaturas mayores, se desnaturalizan las proteínas y bajan la calidad del producto terminado y temperaturas menores no eliminan la carga bacteriana y el producto se deteriora por contaminación microbiana.
4) Enfriamiento Una vez concluida el pasteurizado, 10 min. a temperatura constante, se procede a realizar el choque térmico a través de un baño María. Llevamos la olla a otro recipiente más grande, que contiene agua fría, y bajamos la temperatura de la leche a 45 ºC. Esto con el fin de hacer un descenso rápido de la temperatura y evitar que se desarrollen de nuevo las bacterias que sobrevivieron finalmente después de la pasteurización.
5) Inoculación La leche esta a una temperatura ambiente de 40 a 45 °C que es la temperatura en que se desarrollan óptimamente las enzimas del cultivo de yogurt. Adicionamos a la leche la cantidad de cultivo necesario para que esta se fermente dando como resultado las características de aroma, sabor y textura propias del yogurt. Para adicionarlo correctamente debes diluirlo en un poquito de leche hasta deshacerlo completamente y luego homogenizar en la totalidad de la leche.
6) Incubación Esta operación consiste en mantener la mezcla anterior a una temperatura promedio de 40 a 45 °C. Durante 3 a 4 horas. Transcurrido este tiempo se observa la coagulación del producto adquiriendo la consistencia de flan.
7) Adi ción de aditivos Transcurrido el tiempo, se corta suavemente el proceso de incubación. Agregar el saborizante del agrado que desee moviendo suavemente, teniendo en cuenta la relación que indique el envase, caso contrario consultar con el docente ó auxiliar.
Resultados: a) Pr opi edades or ganolé pti cas de la leche Degustar la leche antes del proceso de elaboración y el yogurt en si, llenar el siguiente cuadro:
Pr opiedades Or ganolé pti cas
L eche Cr uda
Olor Sabor Textura Color Aspecto Aroma Presencia de sedimento
b) Estabil idad f rente al agr egado de alcohol - Test del alcohol Verificar si el coagulado sale negativo o positivo Estabilidad de la Leche =
c) Aci dez en l a L eche % Ac. Láctico
V NaOH C NaOH 9
Rango permitido= 0,16% Ac. Láctico
V Muestra
Yogurt
Practica #7
Lab. Introducción a la Ing. Bioquímica PRODUCCION DE BIOMASA
Introducción: Las proteínas, grasas, carbohidratos, minerales y vitaminas son una fuente de materia y energía, asimilables por el hombre y los animales a través del consumo de alimentos. Las proteínas son polímeros biológicos de alto peso molecular conformados por 20 residuos de aminoácidos y dos amidas de aminoácidos di carboxílicos (asparagina y glutamina).. su importancia está en las funciones que desempeña en el organismo vivo. Estas proteínas contenidas en la ración alimentaria suministran el nitrógeno y los aminoácidos esenciales necesarios al organismo para la síntesis de las sustancias proteicas y otros compuestos nitrogenados. Entre los aminoácidos fisiológicamente importantes, 8 en el adulto y 9 en el niño deben hallarse contenidos en los alimentos, pues el ser humano es incapaz de sintetizarlos. En la actualidad se están desarrollando varios métodos de obtención de las llamadas proteínas unicelulares (biomasa), utilizando varios tipos de microorganismos y medios de cultivos diferentes o usos de derivados residuos de origen agrícola o industrial. Con el manejo adecuado de la biomasa, industrias grandes vieron por conveniente comercializar este producto (recuérdese que estos microorganismos tiene un determinado ciclo de vida) para uso en animales, por el alto contenido de aminoácidos.
Marco Teórico:
Definiciones Usos de la biomasa Producción de levaduras y bacterias forrajeras
Preparación del sustrato Condiciones de Asimilación Separación de biomasa
Metodología: Los requerimientos de la célula son grandes, respecto a materia y energía se pueden utilizar varios medios, como melazas, hidrolizados de almidón o excedentes frutícolas. El medio de cultivo para nuestro estudio será el plátano.
1) Preparación Se tomara unos 50 g de plátano en 400 ml de agua, se licuara y se filtrara, se dosificara con sulfato de amonio en un rango de 1,5 % y se autoclavara, en caso que el mosto no sea limpio, se filtrara nuevamente las gomas producidas y se esterilizara.
2) Inoculación Se utilizara, una levadura comercial, lo ideal sería usar la especia Candida (alto rendimiento en biomasa), el uso está por los 2 g/L, el control del pH es importante debe estar entre 4 y 5, se corrige con Ac. Cítrico 1 N y NaOH 1 N.
