Makalah Mikrobiologi Ames Test

A. DESK DESKRI RIPS PSII Mutagen Mutagen adalah suatu zat atau senyawa yang dapat meningkatkan laju perubahan di dalam gen. Mutasi perubahan! dapat mempengaruhi repr"duksi sel# bahkan terkadang  bisa menyebabkan kerusakan sel atau pertumbuhan sel yang tidak terkendali. $eberapa %"nt"h mutagen# antara lain senyawa kimia mustard# etil metal sul&"nat# sinar sinar u'# u'# radiasi radiasi sinar sinar (# dan lain)la lain)lain. in. Mutage Mutagenis nisitas itas adalah adalah pr"ses pr"ses pemben pembentuk tukan an mutasi. Perbedaan mutagen dan karsin"genik  Karsin"gen * menyebabkan kanker. • Mutagen * menyebabkan mutasi# tidak selalu s elalu menyebabkan kanker. • Ames test Ames test adalah uji untuk menemukan apakah suatu senyawa adalah mutagen.  +ama test ini diambil dari penemunya yaitu $ru%e Ames. $ru%e Ames Ames dkk pada tahun ,-/an ,-/an menemu menemukan kan suatu suatu met"de met"de uji dengan dengan mengg mengguna unakan kan bakteri bakteri khusus khusus yang yang sang sangat at sensit sensiti' i'ee terh terhad adap ap seny senyawa)se awa)seny nyawa awa mutag mutagen en.. Peng Penggu guna naan an ames ames test test  berdasarkan asumsi bahwa senyawa yang bersi&at mutageni% terhadap bakteri yang digunakan# dapat berubah menjadi karsin"gen yang dapat menyebabkan kanker. 0ji senyawa karsin"gen a. 0ji 0ji jangk jangkaa pend pendek ek sh"r sh"rt)t t)term erm test! test! * dike dikemb mban angk gkan an untu untuk k meng mengid iden enti& ti&ik ikas asii senyawa karsin"genik yang berp"tensi atas dasar kapasitasnya untuk menginduksi mutasi pada D+A di dalam sel se%ara in)'itr" atau in)'i'". 1"nt"h test * Pada ames test# digunakan mikr"ba Salm"nella typhimuriu. Selain uji mutasi bakteri# ada ada pula pula uji uji muta mutasi si sel sel mama mamali liaa se%a se%ara ra in)' in)'it itr" r"## uji muta mutasi si gen gen in)' in)'i' i'" " menggunakan men%it# uji kerusakan D+A se%ara in)'itr".  b. 0ji jangka menengah * uji kr"nis , tahun tahun * uji menggunakan 2/ ek"r ek"r tikus. %. 0ji jangka jangka panjan panjang g * uji kr"nis kr"nis 3 tahun tahun * multi multi stage stage m"dels m"dels pada perkemb perkembang angan an ne"plasti. 4he &""d and drug administrati"n 5DA! 0SA saat ini menggunakan met"de yang dikembangkan Ames untuk menapis senyawa)senyawa kimia se%ara %epat dan mura murah. h.

6alaup laupun un

demi demiki kian an##

pada pada

keny kenyat ataa aann nny ya#

bebe bebera rapa pa

seny senyaw awaa

yang yang

menyebabkan kanker pada hewan per%"baan misalnya di"ksin! tidak menunjukkan  p"siti& pada Ames 4est 4est atau kebalikannya!. Mikr"ba uji yang digunakan dalam ames a mes test test adal adalah ah Salmonella typhimurium  typhimurium   galur M04A+4. Mengapa menggunakan galur 

mutant7 $iakan induk 6ild)type! dari Salmonella typhimurium dapat tumbuh dalam media tanpa penambahan asam amin". 8al ini dimungkinkan karena membuat asam amin" mereka sendiri dengan jalur bi"sintesis yang berbeda)beda. Pada mutan Salmonella typhimurium# tidak dapat tumbuh tanpa asam amin" histidin karena mutasi ditujukan pada gen. $. 19+498 DA+ PE+:A$ARA+ Salah satu %"nt"h met"de ames test terdapat pada jurnal E&ek Mutagenik  Ekstrak Metan"l Ampas $iji :arak  Jatropha Curcas ;.! Sisa Peng"lahan $ahan $akar   +abati  Biofuel !. $ahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ampas biji jarak  Jatropha curcas ;! yang merupakan sisa atau limbah peng"lahan minyak biji jarak yang diper"leh pada bulan Mei 3//- dari Puspiptek Pusat Penelitian Ilmu Pengetahuan dan 4ekn"l"gi! Serp"ng.

Selain itu bahan lain yang digunakan adalah metan"l#

dimetilsul&"ksida# natrium azida +a+
Uji butuh histidin Pada pelat agar# dibuat g"resan biakan semalam S.typhimurium# pelat uji mengandung histidin# sedangkan pelat k"ntr"l tidak ditambahkan histidin. Pelat diinkubasi pada suhu <=1 selama ,>)3? jam. Diamati ada tidaknya pertumbuhan

• 

k"l"ni. Uji mutasi rfa Pada pelat agar dituangkan %ampuran 3 m; t"p agar dengan /#, ml biakan semalam bakteri uji. Setelah t"p agar memadat# %akram kertas steril diletakkan di tengah t"p agar# kemudian pada pusat %akram diteteskan larutan Kristal 'i"let ,

mg@m; sebanyak /#/, m;. Pelat diinkubasi pada suhu <=1 selama 3? jam. • 

Diamati diameter z"na hambat di sekeliling %akram. Uji mutasi uvrB $iakan semalam bakteri uji dig"reskan pada pelat agar. Setelah itu tutup %awan  petri dibuka# setengah bagian ditutup dengan kertas kart"n# bagian yang tidak  ditutup disinari lampu ultra'i"let pada jarak << %m selama > detik. 1awan petri ditutup kembali dan diinkubasi pada suhu <=1 selama ,3)3? jam. Setelah itu#

• 

diamati ada tidaknya pertumbuhan k"l"ni bakteri pada bagian yang disinari. Uji reversi spontan Sebanyak /#3 m; biakan semalam bakteri uji ditambahkan pada 3 m; t"p agar  yang telah ditambah dengan larutan histidin kemudian di%ampur dan dituangkan  pada pelat gluk"sa minimal. Pelat diinkubasi pada suhu <=1 selama 3?)?> jam# kemudian dihitung jumlah k"l"ni yang tumbuh.

Dalam Pengujian mutagenik digunakan dua lapis agar# yaitu lapisan dasar  bottom agar ! yang merupakan pelat gluk"sa minimal dan lapisan atas t"p agar! yaitu agar yang diperkaya dengan histidin dengan perbandingan ,/*,!. Sampel uji dibuat dalam bentuk larutan dengan tiga seri k"nsentrasi ,/# ,//# ,/// ppm!. Sebanyak /#, m; larutan uji di%ampur dengan 3 m; t"p agar dan /#, m; biakan bakteri S. typhimurium usia satu malam overnight !. 1ampuran dih"m"genkan dan segera dituang di atas lapisan dasar bottom agar !. Pada pengujian dengan menggunakan h"m"genat hati S-!# ditambahkan /#2 m; %ampuran h"m"genate hati pada t"p agar. Setelah pelat t"p agar membeku kemudian diinkubasi dalam keadaan gelap pada suhu < =1 selama ?> jam.

Kel"mp"k k"ntr"l dibuat dengan %ara yang sama. Pelarut

sampel uji yaitu dimetil sul&"ksida digunakan sebagai k"ntr"l negati&. +atrium azida +a+ jam# jumlah k"l"ni  bakteri S. typhimurium dihitung dan dibandingkan dengan k"ntr"l. P"tensi mutagenik  sampel uji ditetap dengan membandingkan jumlah k"l"ni re'ertan pada lempeng k"ntr"l negati&. 8asil uji dinyatakan p"siti& jika jumlah k"l"ni pada pelat uji minimal dua 3! kali jumlah k"l"ni pada pelat k"ntr"l negati& serta adanya hubungan d"sis) resp"n.

HASIL DAN PEMBAHASAN

0ji mutagenik dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak metan"l ampas biji  jarak bersi&at mutagen atau tidak. 8al ini dilakukan untuk memastikan bahwa ampas biji  jarak sisa peng"lahan bahan bakar nabati aman dan dapat dikembangkan dalam  peman&aatan ampas ini sebagai "bat bahan alam. Mutagen adalah zat atau senyawa yang dapat meningkatkan laju perubahan di dalam gen. 0ji ini menggunakan bakteri S. typhimurium galur 4A,2<2. alur 4A ,2<2 memiliki substitusi basa yang menyebabkan missense mutation di dalam gen yang mengk"de enzim pertama dalam sintesis histidin. Enzim yang dimiliki mutan mengandung pr"lin# sementara biakan induk mengandung leusin. 8al ini menyebabkan S. typhimurium mutan tidak dapat mempr"duksi histidin sendiri# sehingga bakteri ini tidak dapat hidup pada media yang tidak mengandung histidin.

Mutan ini disebut mutan auxotroph atau mutan histidin dependent . Mutan auxotroph yang berinteraksi dengan senyawa mutagen akan berubah menjadi mutan pr"t"tr"ph yang dapat tumbuh pada media tanpa histidin. 4erbentuknya k"l"ni re'ertan menunjukkan bahwa bakteri S. typhimurium mutan telah termutasi balik "leh senyawa

uji. Senyawa yang dapat menyebabkan terjadinya mutasi balik tersebut dikatakan sebagai mutagen. $akteri S. typhimurium yang digunakan untuk uji mutagenik harus memiliki s i&at gen"tip yang dipersyaratkan. K"n&irmasi gen"tip yang dilakukan adalah uji butuh histidin# mutasi r&a# mutasi u'r$# dan re'ersi sp"ntan. $akteri uji yang digunakan adalah galur mutan yang tidak mampu mensintesis histidin sehingga bakteri memerlukan media yang mengandung histidin. Mutasi r&a menyebabkan hilangnya sebagian barier

lip"p"lisakarida yang melapisi permukaan sel  bakteri# sehingga

mengakibatkan naiknya  permeabilitas terhadap m"lekul besar seperti  benz"BaCpyren yang tidak dapat berpenetrasi pada sel n"rmal. Mutasi u'r$ terjadi karena pengurangan k"de genetik pada sistem perbaikan kembali jika ada penyimpangan D+A  DN excision repair system!. 8asil uji k"n&irmasi gen"tip 4abelI! menunjukkan bahwa S. typhimurium 4A ,2<2 dapat digunakan untuk uji mutagenik. Penambahan enzim mikr"s"mal hati S)- pada uji dimaksudkan untuk  mengetahui apakah metab"lit dari senyawa uji menyebabkan e&ek mutagenik atau tidak. Pelarut sampel uji yaitu dimetilsul&"ksida digunakan sebagai %"ntr"l negati&. +atrium azida +a+
KESIMPULAN

Ekstrak metan"l ampas biji jarak tidak bersi&at mutagenik terhadap S. typhimurium 4A 1535.

DA54AR P0S4AKA Sadi# M.5.# dan 9wais# 6.M. 3///! * Mutageni%ity "& +atrium azidaand Its Metab"lite Azid"alanine in Drosophila melanogaster! "utation #esearch# ?-# 32