i TUGAS MAKALAH ANALISIS INSTRUMENT MICROPLATE READER ATAU ELISA PLATE READER
DISUSUN OLEH: PUTRI INDAH RINI NIM:1500070 DOSEN PEMBIMBING: HAIYUL FADHLI M.Farm.Apt
PROGRAM STUDI DIII-FARMASI SEKOLAH TINGGI ILMU FARMASI RIAU 2017
ii KATA PENGANTAR Dengan memanjatkan puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas rahmat dan karunia-Nyalah, maka Makalah ini dapat diselesaikan sesuai kemampuan dan tanpa mengalami suatu hambatan yang berarti. Adapun tujuan dari pembuatan Makalah ini adalah untuk memenuhi tugas dari mata kuliah Analisis instrumen. Makalah ini dapat terselesaikan dengan bantuan beberapa literature yg didapatkan oleh penyusun sehingga penulisan Makalah ini dapat terselesaikan. Penyusun menyadari bahwa Makalah ini jauh dari sempurna. Oleh sebab itu, kritik dan saran yang sifatnya membangun, penyusun sangat harapkan demi sempurnanya penulisan Makalah ke depannya
Pekanbaru,03 april 2017
iii DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL.................................................................................................i KATA PENGANTAR.............................................................................................ii DAFTAR ISI...........................................................................................................iii BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang....................................................................................1 1.2Rumusan Masalah...............................................................................2 1.3Tujuan…………….............................................................................2 BAB II ISI 2.1 Definisi microplate reader……………………………………….......3 2.1.1 prinsip microplate reader…………………………………………....4 2.1.2 kelebihan microplate reader……………………………………………………...4 2.1.3 kekurangan microplate reader…………………………………………………….5 2.1.4 macam-macam teknik elisa plate reader…………………………………….5-8 2.1.5 langkah kerja teknik elisa plate reader……………………………………….9 BAB III PENUTUP A. Kesimpulan.......................................................................................10 DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………………11
1 BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 LATAR BELAKANG Teknik ELISA pertama kali diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall. Mereka menggunakan teknik ELISA ini dalam bidang imunologi (ELISA konvensional) untuk menganalisis interaksi antara antigen dan antibodi di dalam suatu sampel, dimana interaksi tersebut ditandai dengan menggunakan suatu enzim yang berfungsi sebagai pelapor/ reporter/ signal. Prinsip dasar dari teknik ELISA ini secara simpel dapat dijabarkan sebagai berikut:EnzymeLinked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri. Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu permukaan solid(biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik (melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA). Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel.
2 Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat kromogenik, meskipun metode metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang jauh lebih sensitive. Dalam perkembangan selanjutnya, selain digunakan sebagai uji kualitatif untuk mengetahui keberadaan suatu antibodi atau antigen dengan menggunakan antibodi atau antigen spesifik, teknik ELISA juga dapat diaplikasikan dalam uji kuantitatif untuk mengukur kadar antibodi atau antigen yang diuji dengan menggunakan alat bantu berupa spektrofotometer atau dengan cara menentukan jumlah penambahan atau kadar antibodi atau antigen, sehingga dapat dibuat suatu kurva standar dan kadar antigen atau antibodi yang tidak diketahui dapat ditentukan. ELISA tradisional secara khusus memiliki reporter dan substrat yang menghasilkan beberapa bentuk perubahan warna yang dapat diamati untuk mengetahui kehadiran antigen atau analyte. Bentuk teknik ELISA terbaru seperti teknik flurogenic,electro chemiluminescent , dan real-time PCR dibuat untuk mengetahui sinyal kuantitatif. Metode ini dapat memberikan berbagai keuntungan diantaranya sensitifitas yang tinggi dan bersifat multiplexing.
1.2 RUMUSAN MASALAH 1.apa itu elisa microplate reader? 2.apa prinsip dari elisa microplate reader? 3.apa saja kelebihan dan kekurang dalam elisa microplate reader? 4.bagaimana teknik dalam pengerjaan elisa microplate reader? 5.apa saja metode-metode dalam elisa plate reader? 1.3 TUJUAN Untuk mengetahui dan memahami metode dari penggunaan elisa microplate reader serta memahami teknik-teknik pengerjaannya
3 BAB 2
PEMBAHASAN 2.1 DEFINISI MICROPLATE READER ELISA adalah salah satu metode yang sensitif untuk mendeteksi antibodi, antigen, hormon maupun bahan toksik. Metode ini merupakan pengembangan dari sistem deteksi dengan imunofluorescence atau radioaktif. Dalam teknik ini beberapa enzim dapat dikonjugasi pada antigen dan antibodi. Dalam praktiknya, enzim yang dipilih menunjukkan kinetika sederhana, dan dapat diuji dengan prosedur sederhana. Pertimbangan lain dalam penggunaan teknik ini adalah murah, ketersediaan dan kestabilan substrat. Microplate reader merupakan alat untuk melakukan analisis senyawa aktif atau mikrobacepat berdasarkan kekeruhan (OD). Fungsi microplate raider sama dengan spektrofotometerakan tetapi, pada mikroplate raider ukurannya lebih kecil dibandingkan spektrofotometer.
Cara kerja alat : a.Hubungkan dengan arus listrik. b.Tekan tombol ON. c.Hubungkan dengan printer d.Warm up selama ± 15 menit. 4 e.Letakkan mikro plate yang berisi sampel pada tempat yang telah ada
f.Pembacaan sampel mikro plate. g.Tunggu hasilnya secara langsung akan di print (dicetak)
2.1.1 PRINSIP ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan menggunakan enzim sebagai indikator. Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibody atau antigen yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna. Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader . 2.1.2KELEBIHAN ELISA MICROPLATE READER Teknik ELISA ini memiliki beberapa kelebihan, antara lain : 1. Teknik pengerjaan relatif sederhana 2. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi) 3. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi. 4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen yang bersifat sangat spesifik) 5. Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian.
5
2.1.3
KEKURANGAN ELISA MICROPLATE READER Sedangkan kekurangan dari teknik ELISA antara lain :
1. Jenis antibodi yang dapat digunakan pada uji dengan teknik ELISA ini hanya jenis antibodi monoklonal (antibodi yang hanya mengenali satu antigen) 2. Harga antibodi monoklonal relatif lebih mahal daripada antibodi poliklonal, sehingga pengujian teknik ELISA ini membutuhkan biaya yang relatif mahal. 3. Pada beberapa macam teknik ELISA, dapat terjadi kesalahan pengujian akibat kontrol negatif yang menunjukkan respons positif yang disebabkan inefektivitas dari larutan blocking sehingga antibodi sekunder atau antigen asing dapat berinteraksi dengan antibodi bertaut enzim signal dan menimbulkan signal. 4. Reaksi antara enzim signal dan substrat berlangsung relatif cepat, sehingga pembacaan harus dilakukan dengan cepat (pada perkembangannya, hal ini dapat diatasi dengan memberikan larutan untuk menghentikan reaksi).
2.1.4
MACAM-MACAM TEKNIK ELISA
Secara umum, teknik ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu teknik ELISA kompetitif yang menggunakan konjugat antigen-enzim atau konjugat antibodi-enzim, dan teknik ELISA nonkompetitif yang menggunakan dua antibodi (primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua (sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal. Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA sandwich.
A. Indirect ELISA Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum adalah: 1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik 6 dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang akan diuji.
2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking, karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate. 3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi nonspesifik, maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar. 4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang, bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking. 5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim. 6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat. 7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/ fluorogenik/ elektrokimia. 8. Hasil dikuantifikasi dengan Elisa Reader / spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/ elektrokimia lainnya. Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.
7
B. Sandwich ELISA Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut: 1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’ 2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir 3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate 4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat 5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen 6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan antibodi primer 7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi‐enzim yang tidak terikat dapat dibuang 8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/ berfluoresensi/ elektrokimia 9. Diukur absorbansinya untuk menetukan kehadiran dan kuantitas dari antigen Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:
8
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain:
Banyak molekul antibodi penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang microtiter
Afinitas dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen
Sebenarnya, teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA terdahulu, yaitu ELISA direct. Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan, yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
9
2.1.5
LANGKAH KERJA TEKNIK ELISA MICROPLATE READER
Secara singkat tahapan kerja dalam metode elisa dapat digambarkan sebagai berikut :
10
BAB III KESIMPULAN 1. Metode ELISA dibedakan menjadi direct ELISA, indirect ELISA, sandwich ELISA, capture ELISA, dan sel ELISA. 2. ELISA diaplikasikan untuk deteksi virus, deteksi infeksi bakteri, deteksi infeksi parasit, diagnostik hormon, dan aplikasi klinik. 3. Beberapa macam model ELISA dikembangkan melalui produk PCR dan selanjutnya direaksikan dengan probe (antibody anti DNA/RNA) dan akhirnya divisualisasikan dengan penambahan substrat.
11
DAFTAR PUSTAKA Modul Training Elisa Microplate Reader Lab.Biologi FMIPA UNNES Semarang, 11 Nopember 2012 Burgess, G.W. 1995. Prinsip dasar ELISA dan variasi konfigurasinya, Teknologi ELISA dalam diagnosis dan penelitian. G.W. Burgess (Ed.) Wayan T. Ariana (terjemahan). Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. hlm. 506 Brooks, G.F., dkk., 2005, Mikrobiologi Kedokteran, Salemba Medika; Jakarta Rantam, F.A., 2003, Metode Imunologi, Airlangga University Press; Surabaya Sofro, A.S.M, 1994, Imuno Kimia, Penerbit Andi Offset; Yogyakarta
