LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV-Vis

Fundamentos de la espectroscopía UV-visible moderna Conceptos básicos

Tony Owen

 Copyright Agilent Technologies 2000 Todos los derechos reservados. Esta prohibida la reproducción, adaptación o traducción, sin el permiso previo y por escrito, excepto aquello permitido por la ley de Derechos de Autor. Impreso en Alemania 06/00 Número de publicación 5980-1397ES

Prólogo

Prólogo

En 1988 publicamos un libro titulado “The Diode-Array Advantage in UV/Visible Spectroscopy”. En ese momento, aunque los detectores de diodos estaban en el mercado desde 1979, sus características y sus ventajas comparados con los espectrómetros convencionales de barrido, no eran demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar aquella situación. El libro fue bien recibido y se distribuyeron varios miles de copias. Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos que este es un momento adecuado para otra publicación. Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluación de datos; las Buenas Prácticas de Laboratorio tienen ahora gran importancia; y la nueva generación de espectrofotómetros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento. Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los aspectos de importancia de la espectroscopía UV-visible, para la obtención de resultados. El control por microprocesador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes de instrumentos, nos gustaría creer que los equipos son ahora más fáciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el conocimiento de los fundamentos de la espectroscopía UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los peligros del tratamiento y la química de muestras, sigue siendo esencial para obtener buenos resultados. Además, quisieramos demostrar que la idea de “una medida a una sola longitud de onda” es insuficiente para obtener resultados óptimos. Múltiples medidas a múltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan lugar a la mejor exactitud y precisión de resultados y proporciona la información necesaria para detectar errores. Me gustaría aprovechar esta oportunidad para agradecer a mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre espectroscopía UV-visible, durante años.

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Contenidos capítulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible Principios básicos................................................................................................ 2 El espectro electromagnético.................................................................... 2 Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3 Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3 Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6 Derivadas de espectros .............................................................................. 6 Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8 Aplicaciones ........................................................................................ 9 Señal/ruido .......................................................................................... 9 Consideraciones instrumentales .................................................... 10 Análisis cualitativo ............................................................................................ 10 Identificación: espectros y estructura .............................................................................. 10 Confirmación de la identidad .................................................................. 11 Color ........................................................................................................... 13 Otra información cualitativa.................................................................... 14 Temperatura de fusión de las proteínas y los ácidos nucléicos . 14 Actividad enzimática ........................................................................ 15 Consideraciones instrumentales ............................................................. 16 Análisis cuantitativo.......................................................................................... 16 Ley de Beer ................................................................................................ 16 Requisitos de la muestra.................................................................. 20 Análisis multicomponente ....................................................................... 21 Principio de aditividad ..................................................................... 21 Método de ecuaciones simultáneas simples ................................. 21 Método de mínimos cuadrados....................................................... 24 Otros métodos................................................................................... 26 Requisitos de la muestra.................................................................. 27 Requisitos instrumentales........................................................................ 27 Cuantificación indirecta ................................................................................... 28 Derivatización química............................................................................. 28 Valoraciones espectrofotométricas ........................................................ 28 Ensayos cinéticos enzimáticos................................................................ 28

capítulo 2 Instrumentación Diseño instrumental .......................................................................................... 32 Componentes............................................................................................. 32 Fuentes .............................................................................................. 33

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Contenidos

Dispositivos de dispersión .............................................................. 34 Detectores ......................................................................................... 35 Optica ................................................................................................. 38 El espectrofotómetro convencional ....................................................... 38 El espectrofotómetro de diodos.............................................................. 39 Configuración ............................................................................................ 41 Diseño de haz simple ....................................................................... 41 Diseño de doble haz ......................................................................... 42 Diseño con división de haz.............................................................. 44 Diseño de doble longitud de onda ............................................................................... 45 Medida de un espectro ............................................................................. 45 Parámetros instrumentales clave .................................................................... 46 Resolución espectral ............................................................................... 46 Exactitud y precisión de longitud de onda ............................................ 50 Exactitud y precisión fotométrica .......................................................... 51 Luz dispersa....................................................................................... 51 Ruido .................................................................................................. 52 Rango dinámico lineal .............................................................................. 53 Deriva ......................................................................................................... 55

capítulo 3 Tratamiento y medida de muestra Muestras líquidas ............................................................................................... 58 Cubetas....................................................................................................... 58 Material .............................................................................................. 58 Tipos de cubeta................................................................................. 59 Fuentes de error ............................................................................... 60 Cuidado de las cubetas .................................................................... 61 Elección de disolvente ............................................................................. 61 Efecto del disolvente, concentración, pH y temperatura .................... 62 Muestras sólidas ................................................................................................ 64 Sin referencia............................................................................................. 64 Indice de refracción.................................................................................. 65 Geometría de la muestra .......................................................................... 65 Absorbancia débil.............................................................................................. 66 Cambiar la anchura de rendija.................................................................................................... 66 Promedio de tiempo ................................................................................. 67 Promedio de longitud de onda ................................................................ 67 Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68 Interferencia....................................................................................................... 69 Tipos de interferencia............................................................................... 69 Otros compuestos absorbentes ...................................................... 70 Dispersión.......................................................................................... 70 Técnicas de corrección ............................................................................ 71

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Contenidos

Isoabsorbancia.................................................................................. 72 Análisis multicomponente............................................................... 72 Modelar el fondo............................................................................... 73 Referencia interna ............................................................................ 74 Corrección de tres puntos ............................................................... 74 Espectroscopía derivada ................................................................. 75 Problemas fotoquímicos ................................................................................... 79 Fluorescencia ............................................................................................ 79 Descomposición de la muestra........................................................................ 80

capítulo 4 Desarrollo y validación del método Desarrollo del método ...................................................................................... 82 Linealidad................................................................................................... 83 Exactitud.................................................................................................... 87 Precisión..................................................................................................... 88 Sensibilidad................................................................................................ 89 Rango.......................................................................................................... 91 Selectividad................................................................................................ 91 Robustez..................................................................................................... 93 Requisitos instrumentales........................................................................ 94 Validación del método....................................................................................... 94

capítulo 5 Operación de rutina Verificación del rendimiento del instrumento ............................................... 96 Parámetros de test .................................................................................... 96 Exactitud y precisión de longitud de onda.................................... 97 Exactitud y precisión fotométrica.................................................. 98 Luz dispersa....................................................................................... 98 Resolución......................................................................................... 99 Ruido .................................................................................................. 99 LLanura de la línea de base ........................................................... 100 Estabilidad....................................................................................... 100 Linealidad ........................................................................................ 100 Patrones ................................................................................................... 101 Patrones de emisión ....................................................................... 101 Patrones sólidos de absorción...................................................... 101 Patrones líquidos de absorción..................................................... 102 Requisitos de las normas........................................................................ 104 GLP/GMP ......................................................................................... 104 Farmacopea europea ..................................................................... 104 Farmacopea de Estados Unidos ............................................................................... 106 Métodos americanos de test estándar ......................................... 107

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Contenidos

Recomendaciones ................................................................................... 109 Autotest del instrumento ................................................................................ 114 Idoneidad del sistema ..................................................................................... 115 Operación apropiada....................................................................................... 115 Almacén electrónico............................................................................... 116 Procedimientos estándar de operación................................................ 116 Datos colaterales ............................................................................................. 116 Longitudes de onda de confirmación ................................................... 117 Espectros completos .............................................................................. 117 Estadísticas .............................................................................................. 119

apéndice A Exactitud y precisión Definición de los términos ............................................................................. 122

apéndice B Características de los espectrofotómetros de diodos Ventajas de la espectroscopía de diodos ...................................................... 124 Rápida adquisición espectral................................................................. 124 Medida multilongitud de onda simultánea........................................... 125 Reselección de longitud de onda ..................................................................................................... 126 Sensibilidad.............................................................................................. 127 Estadísticas de las medidas ................................................................... 127 Robustez y fiabilidad................................................................................................... 127 Area abierta de muestra ......................................................................... 128 Desventajas de la espectroscopía de diodos................................................ 128 Resolución ............................................................................................... 128 Luz dispersa ............................................................................................. 129 Descomposición de la muestra................................................................................................. 129 Complejidad............................................................................................. 130 Errores en la medida de muestras fluorescentes................................ 130

apéndice C Referencias indice

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capítulo 1

capítulo 1

Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible

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Este capítulo presenta la teoría básica y los principios de la espectroscopía UV-visible, proporcionando una valiosa visión de los usos y limitaciones de esta técnica para el análisis químico. También se revisan, brevemente, las aplicaciones principales de la espectroscopía UV-visible.

Principios básicos El espectro La radiación ultravioleta (UV) y visible comprende sólo una electromagnético pequeña parte del espectro electromagnético, que incluye otras formas de radiación como radio, infrarrojo (IR), cósmica y rayos X (Figura 1). Frecuencia [Hz]

Longitud de onda [m] Figura 1 El espectro electromagnético

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Radio

NMR

Televisión

Rádar

Microondas

Infrarrojo

Infrarrojo

Visible

Ultravioleta visible

Rayos X

Rayos gamma

Rayos cósmicos

Ultravioleta


La energía asociada con la radiación electromagnética se define por la siguiente ecuación:

E = hν donde E es la energía (en julios), h es la constante de Planck (6.62 × 10-34 Js) y ν es la frecuencia (en segundos).

Longitud de onda y La radiación electromagnética puede considerarse una frecuencia combinación de campos eléctricos y magnéticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiación actúa como una onda, puede clasificarse según la longitud de ésta o la frecuencia, relacionadas por:

ν = c⁄λ donde ν es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 × 108 ms-1) y λ es la longitud de onda (en metros). En espectroscopía UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m). De las ecuaciones anteriores se deduce que radiación con longitud de onda más corta tiene mayor energía. En espectroscopía UV-visible, la luz UV de longitud de onda más pequeña tiene la energía más alta. En algunos casos, esta energía es suficiente para causar reacciones fotoquímicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).

Origen de los espectros Cuando la radiación interacciona con la materia, pueden UV-visible ocurrir varios procesos como reflexión, dispersión, absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorción y reemisión) y una reacción fotoquímica (absorbancia y rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, sólo es deseable que ocurra absorbancia. Como la luz es una forma de energía, la absorción de la luz por la materia causa que aumente el contenido de energía de las moléculas (o átomos). La energía potencial total de

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una molécula, generalmente se representa como la suma de sus energías electrónica, vibracional y rotacional:

E total = E electronica + E vibracional + E rotacional La cantidad de energía que una molécula posee en cada forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados discretos. La diferencias de energía entre los diferentes estados siguen el orden:

E electronica > E vibracional > E rotacional En algunas moléculas y átomos, los fotones de luz UV y visible tienen suficiente energía para causar transiciones entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz absorbida es aquella que tiene la energía requerida para mover un electrón desde un nivel de energía inferior a uno superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones electrónicas en el formaldehído y las longitudes de onda de la luz que las causan.

transición transición

Figura 2 Transiciones electrónicas en el formaldehído

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Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia muy estrechas, a longitudes de onda características de la diferencia entre los niveles de energía de las especies absorbentes. Esto es cierto para los átomos, como se muestra en la Figura 3.

Figura 3 Transiciones electrónicas y espectros de los átomos

Sin embargo en las moléculas, los niveles de energía vibracional y rotacional están superpuestos sobre los niveles de energía electrónica. Como pueden ocurrir muchas transiciones con diferentes energías, las bandas se ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor en las disoluciones, debido a las interacciones disolvente-soluto.

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niveles de energía electrónica niveles de energía vibracional niveles de energía rotacional transición electrónica

Figura 4 Transiciones electrónicas y espectros UV-visible en moléculas

Transmitancia y Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la absorbancia cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiación incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en términos de una fracción de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuación:

T = I ⁄ I o o % T = ( I ⁄ I o ) × 100 La absorbancia se define:

A = – log T Para la mayoría de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya que la relación entre ésta y tanto la concentración como el paso óptico es, normalmente, lineal.

Derivadas de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una función de longitud de onda (λ), las derivadas son:

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Orden cero:

A = f(λ )

Primer orden:

dA ------- = f ′( λ ) dλ

Segundo orden:

Ad-------= f ″( λ ) 2 dλ

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La Figura 5 de la página siguiente muestra los efectos de la derivación en una banda gaussiana simple. Las derivadas de los espectros son siempre más complejos que el espectro de orden cero. La primera derivada es la velocidad de cambio de la absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que la λmax de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una banda positiva y una negativa con un máximo y un mínimo a las mismas longitudes de onda que las de los puntos de inflexión de la banda de absorbancia. Este función bipolar es característica de todas las derivadas de orden impar. La característica más significativa de la derivada de segundo orden es una banda negativa con un mínimo a la misma longitud de onda que la del máximo de la banda de orden cero. Esta derivada también muestra dos bandas satélite positivas, a cada lado de la banda principal. La cuarta derivada muestra una banda positiva con un máximo a la misma longitud de onda que el máximo de la banda de orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda negativa o positiva, con mínimos o máximos a la misma longitud de onda que la λmax de la banda de absorbancia.

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Absorbancia

Absorbancia

1ª derivada

2ª derivada

3ª derivada

4ª derivada

Figura 5 Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia

Obtener las derivadas de los espectros

Pueden utilizarse métodos ópticos, electrónicos y matemáticos, para generar las derivadas de los espectros. Aunque las técnicas ópticas y electrónicas fueron la base de la primitiva espectroscopía UV-visible, han sido muy superadas por los métodos matemáticos. Para calcular la derivada a una longitud de onda determinada (λ), se selecciona una ventana de ± n puntos y se ajusta un polinomio por el método de mínimos

Aλ = a 0 + a 1 λ + … + a l λ

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l


cuadrados. Los coeficientes a0 … al a cada longitud de onda son los valores derivados, donde a1 es la primera derivada, a2 es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un método muy eficaz para realizar los cálculos, que son la base del algoritmo de derivación en la mayoría de los instrumentos comerciales. Este método también suaviza los datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el número de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por mínimos cuadrados da lugar a una aproximación suavizada a los puntos originales de los datos. Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil más complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no aumenta la información intrínseca contenida. De hecho, disminuye debido a la pérdida de datos, como los factores de desplazamiento (offset) constantes. Aplicaciones

Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas solapadas para el análisis cualitativo (vea “Confirmación de la identidad” en la página 11) y, más importante, reducir los efectos de interferencias debidas a dispersión, matriz u otros compuestos absorbentes para el análisis cuantitativo (vea “Espectroscopía derivada” en la página 75).

Señal/ruido

Un efecto no deseado de la derivación es la disminución de la relación S/N en las derivadas de orden superior. Esta disminución se debe a la discriminación (“Espectroscopía derivada” en la página 75) y al hecho de que el ruido siempre muestra las señales más agudas del espectro. Por tanto, si los datos espectrales utilizados en el cálculo de derivadas tienen intervalos de 2 nm, el ruido tiene una anchura de banda de 2 nm. Si la banda del analito tiene una anchura de 20 nm, la S/N de la primera derivada será 10 veces peor que en el espectro de orden cero. Puede utilizarse la técnica polinómica de suavizado de Savitzky-Golay para mitigar la disminución de S/N, pero

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debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de suavizado distorsiona el espectro derivado. Consideraciones instrumentales

Para que la resolución de las derivadas aumente, es necesario un incremento de la reproducibilidad de longitud de onda del espectrofotómetro. Pequeños errores de λ pueden resultar en errores de señal mucho mayores en el modo derivada que en el modo de absorbancia. El efecto negativo de la derivación sobre S/N también demanda un aumento de las características de bajo ruido del espectrofotómetro. Si éste puede barrer y promediar múltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la derivación.

Análisis cualitativo Identificación: Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas espectros y estructura bandas anchas. Comparada con técnicas como infrarrojo, que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopía UV-visible proporciona información cualitativa limitada. La mayor parte de la absorción de los compuestos orgánicos resulta de la presencia de enlaces π (es decir, insaturados). Un cromóforo es un grupo molecular que, normalmente, contiene un enlace π. Cuando se inserta en un hidrocarburo saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia UV-visible), se forma un compuesto con una absorción entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromóforos y las longitudes de onda de sus máximos de absorbancia.

Tabla 1

Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia Cromóforo

Fórmula

Ejemplo

λmax (nm)

Carbonilo (cetona)

RR’C=O

Acetona

271

Acetaldehído

293

Carbonilo (aldehído) RHC=O

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Tabla 1

Cromóforos seleccionados y sus máximos de absorbancia Carboxilo

RCOOH

Acido acético

204

Amida

RCONH2

Acetamida

208

Etileno

RCH=CHR

Etileno

193

Acetileno

RC=CR

Acetileno

173

Nitrilo

RC=N

Acetonitrilo

< 160

Nitro

RNO2

Nitrometano

271

La presencia de una banda de absorbancia a una determinada longitud de onda es una buena indicación de la presencia de un cromóforo. Sin embargo, la posición del máximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno molecular del cromóforo y del disolvente en el que pueda disolverse la muestra. Otros parámetros, como pH y temperatura, también pueden causar cambios tanto en la intensidad como en la longitud de onda de los máximos de absorbancia. Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces, aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las bandas de absorción. Para algunos sistemas moleculares, como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relación entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada sistemáticamente. Los iones de los metales de trasición también tienen niveles de energía electrónica que causan absorción de 400–700 nm en la región visible.

Confirmación de la Aunque los espectros UV-visible no permiten una identidad identificación absoluta, se usan frecuentemente para confirmar la identidad de una sustancia mediante la comparación del espectro medido con uno de referencia. Cuando los espectros son muy similares, pueden utilizarse espectros derivados. Como se muestra en la Figura 6, el

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número de bandas aumenta con el orden de derivada. Este aumento de complejidad de los espectros derivados puede ser útil en el análisis cualitativo, para caracterizar materiales o para identificación. Por ejemplo, el espectro del esteroide testosterona muestra una única banda ancha, sin estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la segunda derivada muestra seis picos distintos. El efecto de mejora de resolución puede utilizarse también en la identificación. La Figura 6 muestra una simulación por ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por 30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una banda con un máximo entre los dos componentes, es decir, no están resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas son claramente visibles, con máximos centrados cerca de la λmax de las bandas de los componentes. Absorbancia

4ª derivada

Figura 6 Mejora de la resolución

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Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El color de la materia está relacionado con su absortividad o reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.

Figura 7 Transmisión y color

Long. de onda [nm]

Color absorbido rojo naranja

amarillo-verde verde verde azulado azul verdoso azul violeta

Color complementario verde azulado azul verdoso púrpura rojo-púrpura rojo naranja amarillo amarillo-verde

Figura 8 Absorbancia y colores complementarios

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En la práctica, tanto la generación como la sensación de color son muy complejas y dependen de muchos factores, como el espectro del iluminante y, en el caso de sólidos, de la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentación para medida de color. Cuando están equipados con el software apropiado, la mayoría de los espectrofotómetros pueden utilizarse para medir el color. Una discusión a fondo sobre este tema está fuera del objetivo de este libro. Varias publicaciones2,3 discuten en detalle el color y su medida, muy correctamente.

Otra información La espectroscopía UV-visible puede utilizarse para determicualitativa nar muchas características físico-químicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar información como la identidad. A continuación se presentan dos ejemplos. Temperatura de fusión de las proteínas y los ácidos nucléicos

Los espectros de absorbancia de las proteínas resultan principalmente de la presencia de los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. Una proteína a temperatura ambiente tiene una estructura o conformación terciaria específica que crea un entorno electrónico determinado para los aminoácidos aromáticos. Si se calienta la proteína, a una cierta temperatura, se desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el entorno electrónico de los aminoácidos aromáticos cambia, lo que resulta en cambios o variaciones espectrales. Puede utilizarse análisis multicomponente (vea “Análisis multicomponente” en la página 21) para determinar la cantidad de cada aminoácido aromático que está presente en una proteína intacta.4 El ácido desoxirribonucléico (DNA) en su estado nativo, consta de dos cadenas de moléculas de desoxirribosa enlazadas helicoidalmente. Las cadenas están unidas por enlaces de hidrógeno entre las bases purina y pirimidina (la adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina (G-C)). Estas bases son las principales responsables de la

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absorbancia UV del DNA, con un máximo a 260 nm. Como en un sistema multicomponente, la absorción observada de una molécula de DNA debe ser igual a la suma de las absorbancias individuales:

A DNA = A adenina + A guanina + A cito sin a + Atimina Sin embargo, la absorbancia observada es siempre significativamente menor que la esperada debido a que el enlace de hidrógeno entre las bases cambia su entorno electrónico. Cuando se calienta una molécula, el enlace de hidrógeno se rompe, la doble hélice se desenrosca y la absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de desnaturalización también se conoce como fusión. En un experimento de fusión de DNA, se aumenta paso a paso la temperatura de una disolución de DNA y se mide la absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representándose como una curva de fusión. El punto medio del rango de temperatura sobre el que ocurre la fusión, es el valor Tm. El Tm de una muestra particular de DNA depende principalmente del porcentaje de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales contiene tres enlaces de hidrógeno (en contraste, cada pareja A-T contiene dos enlaces de hidrógeno). Cuanto mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor es el Tm observado. Actividad enzimática

La actividad de una enzima es una medida de su eficacia como catalizador. La concentración de enzima en una preparación impura puede expresarse en términos de unidades por mililitro y la actividad específica de la preparación, puede expresarse en unidades por miligramo de proteína. Al purificarse la enzima, la actividad específica aumenta hasta un límite (el de la enzima pura). Como la velocidad de reacción varía con factores tales como concentración del sustrato, pH, fuerza iónica y

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temperatura, las condiciones bajo las que se determina la actividad deben estar definidas con precisión. Estas condiciones son, normalmente, las óptimas de ensayo a una temperatura fija (25, 30 o 37 °C), con todos los sustratos presentes en condiciones de saturación. Para determinar la actividad, se prepara un sistema con concentraciones conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se añade un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad de reacción. Las medidas de actividad se realizan principalmente en el campo de la investigación donde se aislan y purifican enzimas, así como para la fabricación de kits de ensayos enzimáticos, en los que la actividad de la enzima debe ser igual en todos los lotes.

Consideraciones La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud instrumentales fotométrica absoluta son muy importantes para el análisis cualitativo, particularmente para la identificación y confirmación de compuestos desconocidos. A menudo, se comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden haber sido medidos a una resolución instrumental definida.

Análisis cuantitativo Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y sólo 50 salen por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos 50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idéntica, sólo saldrán 25, etc. La Figura 9 muestra la representación de la transmitancia frente a la concentración.

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Transmisión


Paso óptico Figura 9 Transmitancia y concentración: la ley de Bouguer-Lambert

Generalmente se piensa que Lambert (1760) formuló la primera ecuación matemática sobre este efecto, aunque ahora parece que se le adelantó Bouguer en 1729. La expresión matemática es:

T = I ⁄ Io = e

– kb

donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso óptico (normalmente en centímetros). La ley de Beer es idéntica a la ley de Bouguer, excepto porque está expresada en términos de la concentración. La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10 muestra una representación de la transmitancia frente al paso óptico.

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Transmisión


Paso óptico Figura 10 Transmitancia y paso óptico: ley de Beer

Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:

T = I ⁄ Io = e

– kbc

donde c es la concentración de las especies absorbentes (normalmente expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuación puede transformarse en una expresión lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se expresa en la forma decádica:

A = – log T = – log ( I ⁄ I o ) = log ( I o ⁄ I ) = εbc donde ε es la absorción molar o coeficiente de extinción. Esta expresión se conoce como ley de Beer. La Figura 11 muestra una representación de la absorbancia frente a la concentración.

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Absorbancia [UA]


Concentración Figura 11 La ley de Beer–Bouguer-Lambert

El coeficiente de extinción (ε) es característico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, disolvente y temperatura. En la práctica, el coeficiente de extinción medido también depende de las características del instrumento utilizado. Por esta razón, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extinción para análisis cuantitativo. En su lugar, se construye una curva de calibración o curva de trabajo para la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones patrón con concentraciones conocidas del analito. Para transiciones electrónicas, la diferencia de energía entre los estados fundamental y excitados, es relativamente grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable que todas las moléculas estén en estado electrónico fundamental. La absorción y vuelta al estado fundamental, son procesos rápidos y el equilibrio se alcanza muy rápidamente. Por consiguiente, la absorción de luz UV-visible es cuantitativamente muy exacta. La simple relación lineal entre la absorbancia y la concentración y la relativa facilidad de medida de la luz UV-visible, ha hecho

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de la espectroscopía UV-visible la base de miles de métodos analíticos cuantitativos. Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de Beer, existe una relación lineal similar entre la concentración y la amplitud, para todos los órdenes de espectros derivados: Orden cero:

A = εbc

Primera derivada:

dε dA ------- = ------ bc dλ dλ

n derivada:

d ε Ad-------= -------- bc dλ′ dλ′

n

n

a λ, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, b es el paso óptico y c la concentración. Para cuantificar un solo componente, la selección de longitudes de onda es más difícil con espectros derivados que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par tienen un máximo o un mínimo a la misma λmax que el espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden impar esta longitud de onda es un punto de corte con el cero. Tomando la diferencia entre el máximo más alto y el mínimo más bajo se obtiene la mejor S/N pero puede resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias de otros componentes. Requisitos de la muestra

Para resultados exactos, la muestra a analizar debe contener sólo el componente absorbente para el que se ha realizado la calibración. Si la muestra es una disolución, debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que sea posible corregir una interferencia con una segunda longitud de onda.

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Análisis Se han realizado casi tantos análisis multicomponente con multicomponente espectros UV-visible como de un solo componente, pero debido a que las técnicas usadas en análisis multicomponente a menudo producían resultados incorrectos (como se detalla a continuación), no eran muy aplicados. Sin embargo, los instrumentos modernos producen datos más precisos y las modernas técnicas de ajuste de curvas dan lugar a resultados más exactos y, quizás más importante, indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas razones, los análisis multicomponente UV-visible se han hecho más populares. Principio de aditividad

Según la ley de Beer (“Ley de Beer” en la página 16), la absorbancia es proporcional al número de moléculas que absorben radiación a la λ especificada. Este principio es cierto si hay presente más de una especie absorbente. Todos los métodos cuantitativos multicomponente están basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa λ.

Método de ecuaciones simultáneas simples

El método simple de análisis multicomponente se basa en medidas a un número de longitudes de onda igual al número de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda elegidas normalmente son aquellas del máximo de absorbancia de cada componente. Para la calibración, se mide la absorbancia de patrones puros de concentración conocida, para determinar el coeficiente de extinción de cada componente a cada longitud de onda seleccionada. La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de extinción y de la concentración de cada componente. Así, para dos componentes x e y, las ecuaciones son:

A′ ( x + y ) = A′ x + A′ y = e′ x bc x + e′ y bc y y

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A″ ( x + y ) = A″ x + A″ y = e″ x bc x + e″ y bc y donde A′ es la absorbancia a longitud de onda ′, A′′ es la absorbancia a longitud de onda ′′, e′ es la absortividad molar a longitud de onda ′, e′′ es la absortividad molar a longitud de onda ′′, c es concentración y b es el paso óptico.

Absorbancia [UA]

Estas ecuaciones se resuelven fácilmente para determinar la concentración de cada componente. Si las medidas siempre fueran perfectas, podrían obtenerse resultados exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros están muy solapados. La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los máximos.

Longitud de onda [nm] Figura 12 Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral

En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de dos componentes con un solapamiento significativo de los espectros, en los máximos de absorbancia.

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Absorbancia [UA]


Longitud de onda [nm] Figura 13 Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral significativo

Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberían ser: Con poco solapamiento espectral

Con solapamiento espectral

A’(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1

A’(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1

A’’(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9

A’’(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9

Si ocurre un error del 10 % en la medida de A′(x + y) y A′′(x + y), es decir, A′(x + y) = 0.99 (- 10 %) y A′′(x + y) = 0.99

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(+ 10 %), el cálculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2:

Tabla 2

Comparación de los resultados de análisis multicomponente para ejemplos con poco y sustancial solapamiento espectral Poco solapamiento

Método de mínimos cuadrados

Mucho solapamiento

Componente

Concentración Concentración nominal calculada % error

Concentración calculada % error

x

1

0.9

- 10 %

0

- 100 %

y

1

1.1

+ 10 %

1.98

+ 98 %

Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el uso de información espectral adicional, es decir puede utilizarse una serie de datos para cuantificación, en lugar de sólo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un ajuste por mínimos cuadrados de los espectros patrón al espectro de la muestra medida, da lugar a resultados cuantitativos.5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.

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Medido

Absorbancia [UA]

Real

Longitud de onda [nm] Figura 14 Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada longitud de onda

Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200–240 nm), los resultados cuantitativos del método de mínimos cuadrados tienen un error < 1 % comparados con un error de aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3

Comparación de los resultados de análisis multicomponente de los métodos de ecuaciones simultáneas simples y mínimos cuadrados Usando sólo 210 y 230 nm

Usando 200–240 nm

Componente

Concentración Concentración nominal calculada % error

Concentración calculada % error

x

1

0.0

- 10 %

1.003

+ 0.3 %

y

1

1.98

+ 10 %

0.995

- 0.5 %

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Este método permite el análisis de las mezclas más complejas y de mezclas simples de componentes con espectros similares. El residual del cálculo de mínimos cuadrados es un buen indicador de lo bien que los espectros patrón ajustan en los espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador de la probable exactitud de los resultados.

Absorbancia [UA]

Un ejemplo de análisis multicomponente es la cuantificación de cinco hemoglobinas en sangre, con mínima preparación de la muestra.7 La Figura 15 muestra los espectros de absorción de los derivados de hemoglobina. Este análisis se realizaba anteriormente utilizando varias técnicas analíticas, incluyendo espectroscopía y valoraciones.

Sulfhemoglobina Oxihemoglobina Carboxihemoglobina Hemoglobina (pH 7.0–7.4) Desoxihemoglobina

Longitud de onda [nm] Figura 15 Espectros de absorción de derivados de hemoglobina

Otros métodos

Otros métodos estadísticos de análisis multicomponente incluyen mínimos cuadrados parcial (PLS), regresión del componente principal (PCR) y mínimos cuadrados múltiple (MLS). En teoría, estos métodos ofrecen algunas ventajas

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sobre los descritos anteriormente, pero en la práctica el proceso de calibración es mucho más complejo. Requisitos de la muestra

Los métodos de ecuaciones simultáneas simples y mínimos cuadrados dan lugar a resultados exactos sólo si se realiza calibración utilizando patrones puros o mezclas de patrones, para cada componente de la muestra que contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe tener ninguna capacidad adicional de absorción.

Requisitos La cuantificación de un componente normalmente se realiinstrumentales za midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de patrones y a continuación, el desconocido. Esta calibración debería eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la exactitud de longitud de onda y fotométrica absolutas, fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la reproducibilidad fotométrica es esencial para resultados precisos. Si se mide sólo en el máximo de absorbancia, la reproducibilidad de λ es también de poca importancia debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con λ es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del lateral de la banda, la reproducibilidad será muy importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es crítico, ya que la calibración supone una relación lineal. Un análisis multicomponente exacto requiere una S/N excelente, especialmente si se utiliza el método de ecuaciones simultáneas simples. En mínimos cuadrados, los datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incorporan al cálculo, haciendo que la reproducibilidad de λ sea también esencial. Además, como se necesitan más datos, es necesario un barrido rápido para buena productividad.

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Cuantificación indirecta Derivatización química Debido a que muchos compuestos exhiben débil o ninguna absorbancia en las regiones UV o visible, se han desarrollado varios métodos con derivatización química. Tales métodos, normalmente implican el añadir un reactivo orgánico, que forma un complejo con fuerte absortividad. La etapa final de medida es prácticamente igual que la de los métodos directos. Con esta técnica, la elección apropiada del reactivo puede mejorar significativamente tanto la sensibilidad como la selectividad.

Valoraciones En análisis volumétricos, el cambio de color que señala el espectrofotométricas final de una valoración normalmente se detecta visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y puede ser una fuente de error. El uso de un espectrofotómetro para detectar el final, introduce la objetividad y la automatización en el análisis.

Ensayos cinéticos El análisis UV-visible directo de un componente en matrices enzimáticos biológicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difícil. Las interferencias de otros componentes a menudo imposibilitan la medida directa de una propiedad específica, como la absorbancia. La separación del compuesto de interés puede ser costosa y pesada y por tanto, impracticable en el análisis de rutina. Pueden utilizarse ensayos enzimáticos en el análisis indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en una matriz compleja. Si se selecciona la enzima cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior a la adición de la enzima, será el resultado sólo de la reacción del compuesto o compuestos específicos. Esta selectividad es la base de los ensayos enzimáticos.

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Los ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos tipos: ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen temperatura, pH, actividad enzimática, concentración de la enzima y concentración del sustrato. Sin embargo, si todos los parámetros están controlados a un nivel constante, la velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato. Con los ensayos de punto final, se seleccionan las condiciones de manera que la conversión del sustrato a producto se complete dentro de un periodo razonable de tiempo (5–20 min). La diferencia entre la absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la cantidad de sustrato.

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30

capítulo 2

capítulo 2

Instrumentación

31

Instrumentación

Idealmente, los instrumentos analíticos siempre dan lugar a medidas correctas de un parámetro químico o físico-químico, pero en la práctica todos los equipos están sujetos a error. En este capítulo se revisan los componentes básicos de un espectrofotómetro y las distintas configuraciones instrumentales posibles. Se discuten también los parámetros instrumentales clave y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.

Diseño instrumental Componentes Un espectrofotómetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en función de la longitud de onda de la radiación electromagnética. Los componentes clave de un espectrofotómetro, son:8 • una fuente que genera una banda ancha de radiación electromagnética • un dispositivo de dispersión que selecciona una longitud de onda particular (o más correctamente, una banda de ondas) de la radiación de la fuente • un área de muestra • uno o más detectores para medir la intensidad de la radiación

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Instrumentación

Otros componentes ópticos, como lentes o espejos, transmiten la luz a través del instrumento.

Irradiación espectral

Fuentes

Longitud de onda [nm] Figura 16a Espectro intensidad de la lámpara de arco de deuterio

La fuente ideal de luz sería aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Dos son las fuentes utilizadas, comúnmente, en los espectrofotómetros UV-visible. La primera fuente, la lámpara de arco de deuterio, produce un buen continuo de intensidad en la región UV y ofrece una intensidad útil en la región visible (Figura 16). Aunque las modernas lámparas de arco de deuterio tienen bajo ruido, éste, a menudo, es un factor limitante en el ruido general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz de una lámpara de arco de deuterio disminuye de modo homogéneo. Estas lámparas tienen una vida media (el tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.


La segunda fuente, la lámpara halógena de wolframio (Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lámpara tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, típicamente, una vida útil de 10000 h.

Longitud de onda [nm] Figura 17 Espectro intensidad de la lámpara halógena de wolframio

La mayoría de los espectrofotómetros utilizados para medir el rango UV-visible contienen ambos tipos de lámparas. En estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para cambiar de lámpara según corresponda, o se mezcla la luz procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola banda ancha.

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Instrumentación


Una fuente alternativa de luz es la lámpara de xenon (Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido de las lámparas actuales de xenon es significativamente peor que el de las lámparas de deuterio o wolframio, las lámparas de xenon se utilizan sólo para aplicaciones como medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal en una intensidad elevada. Longitud de onda [nm] Figura 18 Espectro intensidad de la lámpara de xenon

Dispositivos de dispersión (a)

(b)

Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda de luz sean dispersadas con ángulos distintos. Cuando se combinan con una rendija adecuada de salida, pueden utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, más exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una fuente continua. Comúnmente, se utilizan dos dispositivos de dispersión, prismas y redes holográficas de difracción, en los espectrofotómetros UV-visible.

Prisma

Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotómetros. Los prismas son simples y baratos, pero la dispersión resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Además, el ángulo de dispersión depende de la temperatura.

Red de difracción

1er orden

2º orden

Figura 19 Dispositivos de dispersión

Por esto, la mayoría de los espectrofotómetros modernos contienen redes holográficas en lugar de prismas. Estos dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecánicamente, pero actualmente se utiliza un proceso óptico holográfico. Las dimensiones de las hendiduras son del mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va

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Instrumentación

dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que incide sobre la red se refleja con diferentes ángulos, dependiendo de λ. Las redes holográficas producen una dispersión angular lineal con la longitud de onda y son insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de diferentes órdenes, que se solapan (Figura 19b). Como resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que sólo la luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cóncava dispersa y enfoca la luz, simultáneamente. Un monocromador consta de una rendija de entrada, un dispositivo de dispersión y una rendija de salida. Idealmente, lo que sale es luz monocromática. En la práctica, sin embargo, es una banda, óptimamente, simétrica. La anchura de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda instrumental (IBW). Detectores

Cátodo

Anodo

Figura 20 Detector tubo fotomultiplicador

Un detector convierte una señal de luz en una señal eléctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad. Normalmente, los espectrofotómetros contienen un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector. El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conversión de la señal con varias etapas de amplificación, dentro del cuerpo del tubo. El material del cátodo determina la sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo. Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles de luz. Sin embargo, en aplicaciones analíticas espectroscópicas, una alta sensibilidad está asociada con bajas concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para detectar con exactitud pequeñas diferencias entre las medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo ruido a altos niveles de intensidad.

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Instrumentación

Cada vez más, los fotodiodos se utilizan como detectores en espectrofotómetros (Figura 21). Tienen un rango dinámico más ancho y son más robustos que los fotomultiplicadores. En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material semiconductor permite que los electrones fluyan a su través, reduciendo la carga en un condensador conectado a él. La carga necesaria para recargar el condensador, a intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la luz. Los primeros fotodiodos tenían baja sensibilidad en el rango UV, pero este problema se ha corregido en los detectores modernos. Los límites de detección son, aproximadamente, 170–1100 nm para detectores de silicio.

Contacto metálico

capa p capa n

Fotón

Región intrínseca Bloque de oro

Figura 21 El detector de fotodiodos

Algunos espectrofotómetros modernos contienen una matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodiodos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada diodo tiene un condensador dedicado y está conectado, por un interruptor, a una línea común de salida. Los interruptores se controlan por un registro de cambio (Figura 22). Inicialmente, los condensadores están cargados. Cuando los fotones penetran el silicio, se generan portadores de

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Instrumentación

carga eléctrica libres que descargan los condensadores. Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el periodo de medida para cada ciclo de barrido. Luz

Fotodiodo Condensador Registro de cambio Interruptor transistor Línea de vídeo Ciclo de lectura Figura 22 Diagrama esquemático de una matriz de fotodiodos

La cantidad de carga necesaria para recargar los condensadores es proporcional al número de fotones detectados por cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la variación de intensidad de luz sobre el rango completo de longitud de onda. La matriz, típicamente, comprende entre 200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la aplicación. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofotómetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el área fotosensible mide, aproximadamente 25 × 0.5 mm. El ciclo de lectura, que corresponde al tiempo de iluminación, es 100 ms. La tecnología de matriz de fotodiodos es similar a la del microprocesador. Las matrices son dispositivos complejos pero, debido a su estado sólido, tienen mayor fiabilidad.

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Instrumentación

Optica

Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se utilizan lentes o espejos cóncavos. Las lentes son baratas pero sufren de aberración cromática, es decir, luz de diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseño cuidadoso, la aberración cromática de las lentes individuales de un sistema óptico, puede utilizarse para cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema óptico eficaz con estos componentes simples y baratos. Las lentes acromáticas combinan múltiples lentes de diferentes cristales con distintos índices de refracción, en una lente bastante libre de aberración cromática. Estas lentes se utilizan en las cámaras. Ofrecen un buen rendimiento, pero a un coste relativamente alto. Los espejos cóncavos son menos costosos de fabricar que las lentes acromáticas, completamente libres de aberración. Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fácilmente, resultando en una pérdida de eficacia. En cada superficie óptica, incluyendo las interfases entre los componentes de una lente acromática, el 5–10 % de la luz se pierde por absorbancia o reflexión. Por lo tanto, idealmente, los espectrofotómetros deberían estar diseñados con un mínimo número de superficies ópticas.

El espectrofotómetro La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotómetro convencional convencional de haz simple. La luz policromática de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador, que transmite selectivamente una estrecha banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el área de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco) y comparándola con la intensidad de la luz que alcanza el detector después de atravesar la muestra. Como se indica anteriormente, la mayoría de los espectrofotómetros contienen dos lámparas, de deuterio y de wolframio y

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Instrumentación

utilizan tubos fotomultiplicadores o, más recientemente, fotodiodos, como detectores.

Muestra Monocromador Detector

Rendija de salida

Fuente

Rendija de entrada

Dispositivo de dispersión

Figura 23 Esquema de un espectrofotómetro convencional

Este diseño es el adecuado para medir la absorbancia en un solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo, para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar estas tareas con un espectrofotómetro convencional, deben rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el problema de irreproducibilidad mecánica en las medidas. Además, la adquisición de datos en serie es un proceso inherentemente lento.

El espectrofotómetro La Figura 24 muestra un diagrama esquemático de un de diodos espectrofotómetro de diodos. La luz policromática de una fuente atraviesa el área de muestra y es enfocada en la rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz detectada por un diodo está relacionada con el tamaño de la

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Instrumentación

rendija de entrada del policromador y con el tamaño del diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma función que la rendija de salida de un monocromador.

Matriz de diodos

Policromador

Muestra

Fuente

Dispositivo de dispersión Rendija de entrada

Figura 24 Esquema de un espectrofotómetro de diodos

El policromador (rendija de entrada más dispositivo de dispersión) y la matriz de diodos están contenidos en una unidad conocida como espectrógrafo. Como las posiciones relativas de la muestra y el elemento dispersivo están invertidas respecto a un instrumento convencional, esta configuración, a menudo, se denomina óptica inversa. Para minimizar posibles reacciones fotoquímicas, se utiliza un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el obturador se abre automáticamente y la luz pasa a través de la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y sin muestra, según se describe en “El espectrofotómetro convencional” en la página 38. Un espectrofotómetro de diodos es, inherentemente, muy rápido debido a su capacidad de adquisición paralela de datos y de barrido

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Instrumentación

electrónico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de onda y es de elevada fiabilidad.

Configuración Comercialmente, existen varias configuraciones de espectrofotómetros. Cada una de ellas tiene ventajas y desventajas. Diseño de haz simple

Tanto los espectrofotómetros convencionales como los de diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple son de bajo coste y el sencillo sistema óptico ofrece alto rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los espectrofotómetros de referencia utilizados por instituciones como el National Institute of Standards and Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz simple. Los espectrofotómetros de matriz de diodos son particularmente adecuados para la configuración de haz simple, ya que se adquieren espectros muy rápidamente y porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y muestra es mínimo. Además, pueden utilizarse referencias internas para reducir aún más los efectos de deriva de la lámpara (consulte “Referencia interna” en la página 74). La Figura 25 muestra el sistema óptico de un moderno espectrofotómetro de diodos, el Agilent 8453. Esta configuración de haz simple tiene un número mínimo de componentes ópticos, obteniéndose la eficacia más elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolución.

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Instrumentación

Obturador Lente Muestra

Lámpara de wolframio Lámpara de deuterio

Lente Rendija Red Matriz de 1024 diodos

Figura 25 Diagrama óptico del espectrofotómetro de diodos Agilent 8453

Diseño de doble haz

En un espectrofotómetro convencional de haz simple, el blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un intervalo de varios segundos para una medida a una longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida de un espectro completo. Las variaciones de la lámpara pueden dar lugar a errores significativos en intervalos largos de tiempo. El espectrofotómetro de doble haz fue desarrollado para compensar los cambios de intensidad de la lámpara entre las medidas de blanco y muestra. En esta configuración, se coloca un chópper en el paso óptico, cercano a la fuente. El chópper hace que al detector llegue intermitentemente la luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad de la lámpara (deriva). La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotómetro de doble haz. Comparado con los diseños de haz simple, los

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Instrumentación

instrumentos de doble haz contienen más componentes ópticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos de medida. Además, el diseño mecánico más complejo del espectrofotómetro de doble haz, puede resultar en una menor fiabilidad.

Monocromador Rendija de salida

Referencia

Dispositivo de dispersión Fuente

Rendija de entrada

Chópper

Detector

Muestra

Figura 26 Sistema óptico de un espectrofotómetro de doble haz

Tradicionalmente, la mayor estabilidad de los instrumentos de doble haz, ha sido fundamental en el diseño de los espectrofotómetros de alto rendimiento. Sin embargo, recientes avances en el diseño de lámparas y de la electrónica han mejorado la estabilidad de los espectrofotómetros de haz simple y han llevado a un resurgimiento de esta configuración. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensibilidad y más facilidad de uso, con derivas sólo un factor de dos, peores que las de los instrumentos de doble haz. El primer espectrofotómetro de diodos comercial, el HP 8450A, era un diseño multihaz (Figura 27). El director de haz se usaba para alternar el paso de luz por la posición de referencia y hasta por cuatro posiciones de muestra (en la figura sólo se muestra una de ellas).

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Instrumentación

Lámpara visible

Espejos de esquina de la cubeta

Celda de referencia

Lámpara UV Elipse de la fuente

Espejo de la fuente

UV

Elipse del espectrógrafo

Espejo superior director del haz Celda de muestra

Visible Red holográfica

Rendija del espectrógrafo y matrices del detector

Espejo inferior director del haz

Espejos esquina de cubeta

Figura 27 Sistema óptico del espectrofotómetro de diodos HP 8450A

Diseño con división de haz

El espectrofotómetro con división de haz (Figura 28) simula el espectrofotómetro de doble haz pero utiliza un divisor en lugar de un chópper para dirigir la luz por los pasos de blanco y muestra, simultáneamente, hasta dos detectores idénticos pero separados. Esta configuración permite medir el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseño de división de haz es mecánicamente más simple que el instrumento real de doble haz y requiere menos elementos ópticos, el uso de dos detectores independientes introduce otra posible fuente de deriva.

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Instrumentación

Monocromador Rendija de salida Dispositivo de dispersión Fuente

Referencia

Detector

Muestra

Detector

Rendija de entrada

Figura 28 Sistema óptico de un espectrofotómetro con división de haz

Este diseño proporciona alta estabilidad, aunque no tan elevada como el instrumento de doble haz ya que dos detectores pueden variar independientemente y, bajo ruido, aunque no tan bueno como el del instrumento de haz simple, ya que la luz se divide de manera que menos del 100 % atraviesa la muestra. Diseño de doble longitud de onda

Con un espectrofotómetro de doble longitud de onda, puede medirse simultáneamente a dos λ en aplicaciones especiales, como el estudio de dos reacciones concurrentes en una muestra. El monocromador contiene dos dispositivos de dispersión (transformándolo en un duocromador), con la salida combinada en un haz simple. Estos instrumentos complejos, normalmente, son significativamente más costosos que los convencionales y han sido sustituidos por espectrofotómetros de diodos, que son instrumentos multilongitud de onda.

Medida de un espectro El grado de interacción de la muestra con la radiación (transmitancia o absorbancia) se determina midiendo la intensidad de la radiación incidente (sin la muestra) y la

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Instrumentación

intensidad transmitida (con la muestra). Estas intensidades se denominan Io y I, respectivamente, en las ecuaciones de “Transmitancia y absorbancia” en la página 6. Como la mayoría de las muestras medidas en espectroscopía UV-visible están en disolución, debe medirse el blanco en una cubeta que contenga el disolvente puro utilizado para preparar la muestra. Este proceso elimina de la medida de la muestra, cualquier absorbancia debida al disolvente. Con un instrumento de haz simple, la cubeta con el disolvente se coloca en el espectrofotómetro y se mide el blanco. Entonces, se mide la disolución de muestra en la misma cubeta. Todos los instrumentos modernos almacenan automáticamente los valores de referencia Io, que se usan para calcular los valores de absorbancia de la muestra. Con un instrumento de doble o haz dividido, se necesitan dos cubetas. Ambas se llenan incialmente con disolvente puro y se realiza la denominada medida de balance. Esta medida refleja la diferencia de absorbancia entre los dos pasos ópticos utilizados. Entonces, se llena una cubeta con disolución de muestra y se miden Io e I, de modo prácticamente simultáneo. El espectro resultante se corrige restando el espectro de balance.

Parámetros instrumentales clave

En esta sección se discuten algunos parámetros instrumentales que pueden afectar a la exactitud y la precisión de los valores de absorbancia (vea en el Apéndice A la definición de los términos exactitud y precisión). En el capítulo 3 “Tratamiento y medida de muestra” se describen fuentes de error relacionadas con el tratamiento de muestra.

Resolución espectral La resolución espectral es una medida de la capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda adyacentes. Dos λ se consideran resueltas, normalmente, si el mínimo entre los dos picos de la señal de salida del detector es menor que el 80 % del máximo. Esto se

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Instrumentación

conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 29 muestra esquemáticamente un caso para dos líneas de emisión adyacentes (la entrada al instrumento) y la señal actual que es la salida del detector. Señal de salida del detector

Intensidad

Longitud de onda

Longitud de onda

Figura 29 Definición de resolución

La resolución está muy relacionada con la anchura de banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a la mitad de su intensidad máxima, de la banda de luz que sale del monocromador (ver la Figura 30).

Absorbancia I

0.5 I

Longitud de onda Figura 30 Anchura de banda espectral instrumental SBW

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Instrumentación

La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de la relación de la SBW a la anchura de banda natural (NBW) de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorción de la muestra a la mitad de su máximo de absorción (Figura 31).

Absorbancia

NBW

Longitud de onda

Figura 31 Anchura de banda espectral natural

Absorbancia

Una relación SBW/NBW de 0.1 o menos, dará lugar a una medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor.8,9 A una relación SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona progresivamente, como se muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden resolverse correctamente y ocurrirán errores significativos en los valores de absorbancia, a la mayoría de las longitudes de onda. SBW es principalmente una función de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de la dispersión generada por la red de difracción. No son inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la relación S/N.10 Longitud de onda Figura 32 Efecto de variar la SBW sobre la forma de la banda medida

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Absorbancia

Instrumentación

Espectro original

Absorbancia

Proceso de muestreo Espectro digitalizado

Longitud de onda Figura 33 Efecto del muestreo digital

En los espectrofotómetros modernos, el intervalo de muestreo utilizado para digitalizar el espectro para su evaluación y almacenamiento, también afecta a la resolución (en un espectrofotómetro de diodos, la digitalización ocurre en la propia matriz). La Figura 33 muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande relativamente a la SBW, la resolución del instrumento se degradará. Un intervalo de muestreo más pequeño mejora la resolución pero resulta en ficheros espectrales mucho más grandes, que pueden ser difíciles de manejar. En la práctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor igual o más pequeño que la SBW. Cuando se consideran requisitos instrumentales, es importante determinar cuál es la resolución necesaria. Como se trató en el capítulo 1 “Principios y aplicaciones de espectroscopía UV-visible”, las bandas de absorción en la región UV-visible son más bien anchas, particularmente para muestras en disolución. Para aproximadamente el 99 % de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es más que adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de bandas con una NBW de 20 nm o mayor. Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para medir muestras con una NBW más estrecha de 20 nm (por ejemplo, benceno), resultará en un error en las medidas de absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW más estrecha. Sin embargo, la mayoría de las medidas UV-visible se utilizan para cuantificación, lo que normalmente requiere sólo medidas relativas (por ejemplo, la absorbancia de una concentración desconocida relativa a la absorbancia de un patrón). Una calibración realizada utilizando patrones, que encierran la concentración de la muestra desconocida, dará lugar a resultados cuantitativos exactos incluso para bandas muy estrechas.

49

Instrumentación

Exactitud y precisión de La diferencia entre exactitud y precisión de longitud de longitud de onda onda, normalmente, no se entiende demasiado bien (vea en el Apéndice A una explicación de la diferencia entre ellas). La exactitud de longitud de onda es importante para comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos. Sin embargo, en la mayoría de los análisis UV-visible las medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente a un patrón y, la precisón de longitud de onda (es decir, la repetitividad) es más importante. La Figura 34 muestra el efecto de una pobre repetitividad de longitud de onda. Si se selecciona una λ en el máximo de absorción para medidas cuantitativas, los pequeños errores que ocurran al reprogramar el espectrofotómetro a esa longitud de onda, tendrán un mínimo efecto sobre la absorbancia medida. Este método da lugar a los resultados cuantitativos más reproducibles. Por otro lado, elegir una longitud de onda en un lateral de la banda de absorción, con el mismo error al reprogramar λ, resultará en errores significativos en la absorbancia medida. En este caso, no serán fiables los resultados cuantitativos.

Absorbancia [UA]

Error = 0.0 UA

Error = 0.1 UA (10 %)

Longitud de onda [nm] Figura 34 Efecto de una pobre repetitividad de la longitud de onda

50

Instrumentación

Todos los textos estándar sobre espectroscopía UV-visible señalan que, para una cuantificación exacta, la longitud de onda analítica debe estar en el máximo de absorción, incluso aunque otras longitudes de onda puedan dar lugar a una mejor selectividad. Sin embargo, estos textos están basados en técnicas de barrido mecánico convencional y no se aplican a los instrumentos de diodos, que tienen una repetitividad de longitud de onda prácticamente absoluta.

Exactitud y precisión Suponiendo un buen diseño óptico y electrónico, sólo dos fotométrica factores influyen en la exactitud y precisión fotométrica: la luz dispersa y el ruido. Luz dispersa

La luz dispersa se define como aquella luz detectada de cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de banda de la longitud de onda seleccionada. La ecuación utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, la absorbancia, es:

T = ( I + Is ) ⁄ ( Io + Is ) donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la intensidad de la luz dispersa. La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende de la luz transmitida. Si Is es prácticamente constante, se convierte en el término dominante a bajos niveles de I. A elevada absorción, la luz dispersa causa un hábito negativo en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la concentración que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve comprometida la exactitud fotométrica del instrumento. La Figura 35 muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa sobre la absorbancia medida, comparada con la absorbancia actual.

51

Absorbancia medida [UA]

Instrumentación

0.00 % Luz dispersa 0.01 % Luz dispersa 0.10 % Luz dispersa 1.00 % Luz dispersa

Absorbancia real [UA] Figura 35 Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra

Ruido

Un espectrofotómetro, típicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotónico o Schott) resulta de la distribución estadística de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de la intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentración con bajas absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequeña diferencia entre dos niveles de luz. El segundo factor es inherente a la electrónica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analógico-digital, etc.) y es independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de absorbancia, donde la señal de muestra es muy pequeña. Puede minimizarse mediante un buen diseño. El ruido afecta negativamente a la precisión de las medidas y, para una medida sola, puede introducir también errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida (vea “Promedio de tiempo” en la página 67).

52

Instrumentación

Rango dinámico lineal Una especificación citada con frecuencia y, a menudo, mal entendida, es el rango del instrumento. En la mayoría de los casos, éste es simplemente el rango numérico que un instrumento puede mostrar. Una especificación más útil es el rango dinámico lineal que especifica para una desviación aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia), los valores mínimo y máximo de absorbancia. Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido. Por tanto, el error debido a la luz dispersa (%) es igual a

( A t – Am )100 ⁄ At donde At es la absorbancia real y Am es la absorbancia medida.

At = – log ( I ⁄ I o ) Am = – log [ ( I + I s ) ⁄ ( I o + I s ) ] donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La Figura 35 muestra el error debido sólo a la luz dispersa. Además, la absorbancia medida puede ser errónea debido al ruido del instrumento. Por consiguiente, el error debido al ruido (%) es igual a

( A t – A m ) ⁄ ( A t × 100 ) donde

A t = – log ( l ⁄ l o )

y

A m = A t + T ⁄ 100 × A pn + A en

o

Am =

T ⁄ 100 × A pn – A en

53

Instrumentación

donde Apn es el ruido fotónico en UA, Aen es el ruido electrónico en UA y T es la transmitancia como porcentaje.

% Error

El error total a cualquier absorbancia es la suma de los errores debidos a la luz dispersa y el ruido. La Figura 36 representa el error total para un ejemplo con ruido fotónico de ± 0.0004 UA y ruido electrónico de ± 0.0001 UA. El gráfico muestra que las medidas de absorbancia hechas desde, aproximadamente, 0.3 a 1.0 UA tienen la exactitud y precisión más elevadas. El rango dinámico instrumental puede determinarse a partir del error de medida aceptable.

Curva de error de luz dispersa Curva de error de luz dispersa + ruido Curva de error de luz dispersa - ruido

Absorbancia [UA] Figura 36 Error de absorbancia teórica frente a absorbancia

54

Instrumentación

Deriva Otra causa potencial de error fotométrico es la deriva. Esta normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la lámpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la electrónica del instrumento también pueden causar deriva. Un buen diseño instrumental puede minimizar la deriva, pero este efecto puede reducir la exactitud de los resultados, especialmente en un periodo prolongado de tiempo (Figura 37). Con datos a múltiple longitud de onda, el problema de la deriva puede minimizarse utilizando técnicas como la de referencia interna (vea “Referencia interna” en la página 74).

Absorbancia [UA]

Error

Longitud de onda [nm] Figura 37 Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida

55

Instrumentación

56

capítulo 3

capítulo 3

Tratamiento y medida de muestra

57


Conocidas las limitaciones instrumentales y si el espectrofotómetro opera correctamente, las mayores fuentes de error en espectroscopía UV-visible están relacionadas con el tratamiento y la química de la muestra. En este capítulo se discuten las potenciales fuentes de error y los pasos para evitarlas.

Muestras líquidas Cubetas La espectroscopía UV-visible se utiliza principalmente, para medir líquidos o disoluciones. Esto es más simple y permite un análisis cuantitativo más exacto que realizar medidas de reflectancia en sólidos. En esta técnica, una cubeta debe contener el líquido o disolución en el área de muestra. Material

Idealmente, las cubetas deberían ser completamente transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinámico lineal efectivo para la muestra. Por ejemplo, si el límite superior del rango dinámico lineal es 2.5 UA pero la cubeta absorbe 1 UA, el rango restante utilizable para la muestra estará entre 1 y 2.5 UA, que es sólo 1.5 UA. Las cubetas más baratas son de plástico, normalmente acrílico. Estas cubetas no son resistentes a todos los disolventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm, haciéndolas inadecuadas para medir en esta región. La

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consistencia (absorbancia y paso óptico) puede variar entre cubetas, dependiendo del fabricante. Las cubetas de vidrio son ligeramente más caras que las de plástico pero son más duraderas y, con el cuidado apropiado, pueden durar años. El vidrio absorbe por debajo de 320 nm y por tanto, no es adecuado para medir en este área. Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm. Las mejores cubetas son de sílice fundida sintética de alta pureza, siendo razonablemente transparentes por debajo de 190 nm. La Figura 38 muestra la absorción de los diferentes materiales. Observe que todos exhiben al menos el 10 % de pérdida por transmisión a todas las longitudes de onda.

Transmitancia [%]

Sílice fundida Cuarzo fundido

Plástico acrílico

Vidrio

Vidrio óptico Longitud de onda [nm] Figura 38 Características de transmisión óptica de los materiales de cubetas

Tipos de cubeta

Existe una amplia gama de cubetas pero aquí sólo se describen las más importantes. La cubeta más utilizada es la rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden tener pasos ópticos de 1 a 100 mm, pero el más popular es 10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una

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anchura exterior de 12.5 mm. Cuando el volumen de muestra es limitado, a menudo se utilizan cubetas con apertura (Figura 39b). Si el volumen de muestra es muy limitado, pueden utilizarse microcubetas que reducen la apertura del área de muestra a una sección muy pequeña (2 × 2.5 mm), Figura 40a. Sólo se requieren aproximadamente 60 µl de muestra para medir. Con ultramicrocubetas especiales, pueden medirse volúmenes por debajo de 5 µl. Para aplicaciones automatizadas, se utilizan cubetas de flujo (Figura 40b). Las cubetas modernas se conectan a un tubo de transferencia de muestra. Puede disponerse de cubetas de flujo de varios tamaños de apertura y geometrías, con amplio rango de paso óptico. Figura 39 Cubetas estándar (a) y con apertura (b)

En las cubetas con apertura y microcubetas, se bloquea parte del haz de luz, se reduce el rendimiento y se compromete de algún modo, la sensibilidad. La pérdida de sensibilidad depende del grado de apertura y de la geometría óptica.

Fuentes de error Si las cubetas están apropiadamente diseñadas y utilizadas, su contribución a los errores de absorbancia debe ser mínima. Sin embargo, el analista debe estar al tanto de varias fuentes potenciales de error. Como la absorbancia medida depende del paso óptico, la precisión de éste es importante en las medidas absolutas. La tolerancia de paso óptico para cubetas de alta calidad es ± 0.01 mm para pasos entre 0.5 y 100 nm.11 Para una exactitud cuantitativa máxima, debe utilizarse la misma cubeta para las medidas de patrón y muestra. Figura 40 Cubetas micro (a) y de flujo (b)

Cuando se coloca en el haz, una cubeta se transforma en un componente óptico activo. Superficies ópticas no planas o no paralelas pueden desviar el haz y causar errores de absorbancia (vea “Geometría de la muestra” en la página

60


65). Las mejores cubetas tienen superficies ópticas muy planas y paralelas que minimizan su influencia como componente óptico. La cubeta siempre debe colocarse en la misma dirección en el soporte para asegurar que los efectos ópticos son idénticos en las medidas de blanco y muestra. En cubetas con apertura, las partes que no contienen la muestra deben estar apropiadamente cubiertas (como en las figuras) para evitar transmisiones y reflexiones no deseadas a través de las paredes. Si se utilizan cubetas sin cubrir, las medidas serán erróneas. El grado de error depende de la geometría óptica del área de muestra. Si el haz óptico se enfoca de manera que gran proporción de luz atraviesa una apertura muy pequeña de la cubeta, los resultados con cubetas sin cubrir serán razonablemente exactos, ya que la óptica hará el efecto de auto-cubierta. En cambio, si el haz óptico es ancho y colimado (paralelo), pasará mucha luz a través de las paredes de la cubeta en lugar de atravesar la muestra y las medidas serán inexactas. Cuidado de las cubetas

Las cubetas deben manejarse cuidadosamente para evitar arañarlas. Debe evitarse tocar las superficies ópticas con los dedos, ya que la grasa de las huellas dactilares puede absorber significativamente. Si las superficies ópticas de la cubeta están ligeramente sucias, pueden limpiarse con un pañuelo de papel fotográfico. Si la cubeta está muy contaminada, puede limpiarse con un detergente sulfónico suave o con un líquido especial de limpieza. En casos extremos, puede utilizarse un tratamiento con ácido clorhídrico o nítrico.

Elección de disolvente El disolvente ideal para la preparación de muestras sería aquel que disolviera todos los tipos de compuestos, sería no inflamable y no tóxico, además de completamente transparente a todas las longitudes de onda. El agua destilada se acerca al ideal pero no es adecuado para muchos compuestos orgánicos no polares. La Tabla 1 lista algunos de los disolventes más utilizados. Con la excepción del agua, todos ellos exhiben una longitud de onda de corte

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en el rango UV, por debajo del cual absorben demasiado para realizar medidas de muestra.

Tabla 4

Propiedades de algunos disolventes comunes Longitud de onda Disolvente

Polaridad*

de corte (nm)**

Riesgos***

Agua destilada

78.5

< 195

ninguno

Hexano

1.9

199

F

Etanol (absoluto)

24.3

207

F

Metanol

32.6

210

F

Ciclohexano

2.0

211

F

Cloroformo

4.8

246

F/T

Dimetilsulfóxido

ninguna

270

H

Acetona

20.7

331

F

*

Constante dieléctrica a temperatura ambiente Longitud de onda a la que la transmitancia a paso óptico de 10 mm es < 25 % *** F = inflamable; T = tóxico; H = riesgo para la salud **

Con disolventes orgánicos volátiles, como acetona o cloruro de metileno, es aconsejable utilizar una cubeta cerrada para eliminar la evaporación, que podría dar lugar a cambios rápidos de concentración.

Efecto del disolvente, Varios factores, que incluyen el disolvente utilizado, junto concentración, pH y con la concentración, pH y temperatura de la muestra, temperatura pueden afectar a la posición e intensidad de las bandas de absorción de las moléculas. Estos parámetros deben controlarse para asegurar máxima precisión y para poder comparar espectros medidos bajo diferentes condiciones. La polaridad de un disolvente puede modificar el entorno electrónico de un cromóforo absorbente. En general, la magnitud de la variación puede correlacionarse con la

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polaridad del disolvente. Por tanto, por ejemplo, el máximo de absorción de la acetona puede variar de 259 a 279 nm, dependiendo del disolvente. Para análisis comparativo, debe utilizarse un solo disolvente para todas las medidas. La concentración, normalmente, sólo afecta a la intensidad de las bandas. A concentraciones más altas, sin embargo, las interacciones moleculares (por ejemplo, dimerización) pueden causar cambios en la forma y posición de la banda de absorbancia. En último término, estos cambios afectan a la linealidad de la concentración frente a la relación de absorbancia y puede llevar a resultados cuantitativos inexactos. Los efectos del pH sobre los espectros de absorbancia pueden ser muy grandes y resultar, principalmente, de las variaciones del equilibrio entre dos formas diferentes. Por ejemplo, los indicadores de pH cambian de color a diferentes valores. Si el espectro de la muestra se afecta por el pH, debe utilizarse un regulador para controlar este parámetro. Observe, sin embargo, que la mayoría de los reguladores exhiben una absorbancia significativa, lo que puede afectar al rango de longitud de onda sobre el que pueden realizarse las medidas. La temperatura también puede afectar a las medidas UV-visible. Una simple expansión, especialmente en algunos disolventes orgánicos, puede ser suficiente para cambiar la absorbancia aparente y, por lo tanto, la exactitud de los resultados cuantitativos. Además, la temperatura puede afectar a los equilibrios, químicos o físicos. Un buen ejemplo de equilibrio físico es la desnaturalización de los ácidos nucléicos al aumentar la temperatura, lo que cambia la absortividad. Finalmente, sobre todo en disolventes orgánicos, pueden ser significativos los cambios del índice de refracción con la temperatura. Si las corrientes de convección causan que haya diferencias de temperatura en distintas partes de la cubeta, el efecto Schlieren resultante puede cambiar la absorbancia aparente. Si se observa que la temperatura tiene efecto considerable sobre las medidas,

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debe controlarse este parámetro utilizando un soporte termostatizado. Este puede ser un simple soporte envuelto por agua, utilizado junto a un baño de agua circulante, o un controlador Peltier de temperatura, más sofisticado. Con disolventes orgánicos, es aconsejable utilizar una cubeta cerrada para minimizar el efecto Schlieren.

Muestras sólidas

Varios factores pueden interferir con la medida exacta y precisa de muestras sólidas transparentes, como vidrios o cristales.

Sin referencia A menudo se miden muestras sólidas para determinar el espectro o cuantificar un componente de la matriz. Sin embargo, una muestra de la matriz que no contenga el analito, no siempre puede conseguirse. En este caso, puede realizarse la medida del blanco con aire, ya que no es posible obtener un blanco real (matriz sin analito). Este proceso, en el mejor de los casos, resultará en un desplazamiento constante a todas las longitudes de onda y, en el peor, en un espectro medido que será una mezcla del analito y la matriz. Es posible el análisis cuantitativo exacto si se dispone de dos o más patrones y si se utiliza una curva de calibración que no esté forzada a pasar por cero. La intersección con el eje Y representa, entonces, la absorbancia debida a la matriz. Si no se dispone de múltiples patrones, la referencia interna utilizando una longitud de onda de referencia a la que no haya absorbancia del analito, es a menudo, una alternativa viable.

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Indice de refracción Haz colimado

Muestra

Detector

Haz enfocado

Luz no detectada

La carencia de una muestra de referencia también causa un cambio significativo del índice de refracción entre el blanco (aire) y la muestra sólida. Si el haz óptico se colima perpendicularmente a la muestra, este efecto no es importante. Sin embargo, si el haz se enfoca, la muestra sólida se convierte en un componente activo óptico y altera la longitud del paso. Este cambio del paso óptico puede, en último caso, causar una modificación significativa del grado de iluminación del detector entre el blanco y la muestra (Figura 41), resultando en un error de la absorbancia aparente. Este problema es muy difícil de detectar y, si el instrumento es de diseño de enfoque de haz, no tiene fácil solución. Sin embargo, este efecto puede minimizarse colocando la muestra tan cerca del detector como sea posible.

Figura 41 Efecto del índice de refracción

Geometría de la A menudo las muestras sólidas pueden ser de vidrio, filtros muestra de plástico moldeados o lentes (por ejemplo, lentes de cristales solares). Estas muestras son componentes ópticos activos del sistema y desvían o cambian la longitud focal del haz de luz. Como resultado, el detector falla al detectar parte de la luz (Figura 42), que se mide, entonces, como absorbancia aparente. Este efecto puede probarse rotando o invirtiendo la muestra en su soporte y puede minimizarse colocando la muestra tan cerca del detector como sea posible.

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Area fotosensible Detector

Muestra plana

Detector

Muestra “con bordes”

Figura 42 Efecto de una geometría no plana de la muestra

Absorbancia débil

Un problema en química analítica es la baja sensibilidad, que puede ser debida a una baja concentración de la muestra o a una absortividad muy débil del analito. A bajas absorbancias, el ruido en las medidas resulta en una pérdida de precisión de manera que cualquier medida simple puede ser inexacta. Reducir directamente el nivel de ruido mejora la precisión de los resultados. La especificación de ruido debe ser un parámetro clave en la selección del espectrofotómetro, pero observe que variar los parámetros de medida reducirá el nivel de ruido.

Cambiar la anchura Si el espectrofotómetro tiene una anchura variable de de rendija rendija, el nivel de ruido puede reducirse aumentando esta anchura para que más luz atraviese los componentes ópticos. Este aumento de la rendija da lugar a una mejor relación S/N pero reduce la resolución del instrumento.

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Promedio de tiempo

Absorbancia [UA]

S/N = 5.5

Absorbancia [UA]

0.1 seg

S/N = 18

Tomar la media de los datos reduce el ruido por la raiz cuadrada del número de puntos promediados. La Figura 43 muestra la mejora de la relación S/N con el aumento del tiempo de integración, para un colorante a muy baja concentración. Las medidas se realizaron utilizando un espectrofotómetro de diodos con tiempos de integración de 0.1 y 1.6 s. La mejora actual es cercana al valor teórico esperado de cuatro. Observe que ampliar el tiempo de integración mejorará la sensibilidad sólo hasta que otros efectos, como la deriva, sean dominantes.

1.6 seg

Longitud de onda [nm] Figura 43 Efecto del t de integración en S/N

Promedio de longitud Otra técnica es promediar la longitud de onda. La Figura 44 de onda muestra una banda ancha de absorción. Las medidas cuantitativas convencionales se realizan en el máximo de absorción. Si se dispone de los datos a todas las longitudes de onda, pueden incluirse en la media valores adicionales a ambos lados del máximo. La reducción del ruido es equivalente a la raiz cuadrada del número de puntos. Sin embargo, cuantos más datos se añaden, la absorbancia media se reduce, lo que tiene un efecto negativo sobre la señal. Para una particular anchura de banda de absorción, un número determinado de puntos dará lugar a la S/N óptima (Figura 44).

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S/N Señal Ruido

Absorbancia

Absorbancia


Longitud de onda NBW

# de puntos Rango óptimo

Figura 44 Efecto del promedio de longitud de onda sobre S/N

La deriva también afecta a la exactitud de las medidas de absorbancia. Puede utilizarse una referencia interna (“Referencia interna” en la página 74) para mejorar la precisión y la exactitud a bajos niveles de absorbancia.

Absorbancia fuerte

Cuando las muestras absorben fuertemente, puede excederse el rango dinámico lineal del instrumento, siendo la relación entre absorbancia y concentración, no lineal (“Rango dinámico lineal” en la página 53). La solución más fácil a este problema es diluir la muestra a un nivel de absorbancia dentro del rango dinámico lineal. Con muestras sólidas esto no es posible. Además, cualquier etapa de tratamiento de muestra, incluso la dilución, introduce errores y debe, por lo tanto, ser evitada. Una alternativa es seleccionar una o más longitudes de onda en el lateral de la banda de absorbancia, donde la absortividad es menor (Figura 45). Cuando se utiliza para calibración la longitud de onda del máximo (241 nm), puede medirse una concentración máxima de aproximadamente 0.26 mg/ml, con una exactitud razonable. Sin embargo, utilizar la

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Absorbancia [UA]

0.1428 mg/ml espironoloactona

Absorbancia medida [UA]

absorbancia en el lateral de la banda (266 nm) permite medir concentraciones de hasta 5 mg/ml con igual exactitud. Un prerrequisito para esta técnica es una excelente reproducibilidad de longitud de onda (“Exactitud y precisión de longitud de onda” en la página 50).

Longitud de onda [nm]

Concentración [mg/ml]

Figura 45 Cambio de longitud de onda para aumentar el rango dinámico

Interferencia Tipos de interferencia Idealmente, la absorbancia que ocurre durante las medidas UV-visible tiene que deberse sólo al analito de interés. Sin embargo, en la práctica, a menudo aparecen absorbancias que interfieren con las medidas, por razones químicas o físicas.

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Otros compuestos absorbentes

La presencia de cualquier compuesto que absorba en la misma región que el de interés, resultará en un error en la medida de absorbancia. A veces, sólo está presente un único compuesto absorbente conocido, por ejemplo un subproducto de la síntesis de un compuesto farmacéutico. En otros casos, múltiples especies absorbentes, muchas de ellas conocidas (por ejemplo, muestras biológicas como sangre), pueden causar una ancha absorción matriz.

Dispersión

Un problema de los análisis farmacéuticos y biológicos es la dispersión, scattering, causada por las partículas suspendidas en disolución. En análisis farmacéuticos, estas partículas suelen ser los excipientes o rellenos utilizados en las formulaciones de las tabletas o cápsulas. La dispersión de radiación resulta en una absorbancia aparente de fondo que interfiere con las medidas de absorbancia. Filtrar las muestras antes de las medidas elimina la dispersión pero no siempre es practicable y, a menudo, el analista trabaja con espectros que incluyen este problema.

Detector

Muestra transparente

Detector

Muestra con dispersión

La dispersión causa una absorbancia aparente debida a que la luz, en lugar de pasar a través de la disolución hasta el detector, se dispersa con cierto ángulo. Por lo tanto, incluso si no hay absorción, menos luz alcanza el detector, como se muestra en la Figura 46. En la parte UV-visible del espectro, pueden observarse dos tipos de dispersión. La dispersión Rayleigh ocurre cuando las partículas son pequeñas relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional a la cuarta potencia de λ. La dispersión Tyndall ocurre cuando las partículas son grandes relativamente a la longitud de onda de la luz y es inversamente proporcional al cuadrado de λ. En sistemas químicos, el exponente de la longitud de onda puede variar de - 4 a - 2, dependiendo de la distribución de tamaños de las partículas:

Figura 46 Dispersión (Scattering)

A scatter ∝ 1 ⁄ λ

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n


Absorbancia [UA]

donde A es la absorbancia debida a la dispersión, λ es la longitud de onda y n es el orden de dispersión, scattering. Esta relación causa que el error debido a la dispersión aumente al disminuir la longitud de onda, Figura 47.

dispersión Tyndall dispersión Rayleigh

Longitud de onda [nm] Figura 47 Espectros de dispersión

La magnitud del efecto de dispersión puede reducirse colocando la muestra lo más cerca posible del detector. Sin embargo, con una dispersión significativa, se pierde luz y la sensibilidad y la exactitud del análisis cuantitativo se ven seriamente comprometidas.

Técnicas de corrección Pueden utilizarse varias técnicas para eliminar o reducir los errores de interferencia. En general, si el origen del error es conocido y reproducible entre muestras, puede eliminarse. Por el contrario, si el origen es desconocido y varía de muestra a muestra, el error puede reducirse pero no eliminarse. Las técnicas de corrección siempre requieren datos de al menos dos longitudes de onda. Las técnicas más sofisticadas requieren datos multilongitud de onda o espectrales.

71


Cuando está presente un componente interferente de espectro conocido, puede eliminarse el error introducido por este compuesto a la longitud de onda analítica, seleccionando una longitud de onda de referencia a la que la interferencia exhiba la misma absorbancia que a la longitud de onda analítica. La absorbancia a esta longitud de onda de referencia se resta de la abosrbancia a la longitud de onda analítica, Figura 48. La absorbancia residual es la absorbancia real del analito.

Absorbancia [UA]

Isoabsorbancia

Espectro del analito Espectro interferente Espectro medido

Longitud de onda [nm] Figura 48 Corrección de isoabsorbancia

Esta técnica es menos fiable cuando los espectros del analito y de la interferencia son muy similares. Además, permite corregir sólo una interferencia. Análisis multicomponente

Una extensión de la isoabsorbancia es el análisis multicomponente, descrito en “Análisis multicomponente” en la página 21. Aquí, deben medirse como patrones los espectros de las interferencias. Esta técnica puede aplicarse con éxito cuando los espectros se solapan de manera considerable y cuando hay presente más de un compuesto interferente.

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Modelar el fondo es apropiado cuando la interferencia se debe a un proceso físico (frecuentemente, dispersión) en la que la interferencia a la longitud de onda analítica puede estimarse por extrapolación a partir del modelo en otro rango de λ. Se selecciona una parte del espectro donde la absorbancia aparente se debe sólo a la interferencia. Entonces, se ajusta un polinomio a esta parte del espectro utilizando un ajuste por mínimos cuadrados al logaritmo de la absorbancia:

A = aλ

n

log ( A ) = log ( a ) + n log ( λ ) donde A es absorbancia, λ es longitud de onda, n es el orden de la relación entre absorbancia y longitud de onda y a es una constante. La absorbancia de fondo al resto de las longitudes de onda puede estimarse utilizando los coeficientes determinados por el ajuste. Estos valores se restan de los valores medidos, para obtener las absorbancias debidas al analito, Figura 49.

Espectro medido Absorbancia [UA]

Modelar el fondo

Espectro extrapolado de dispersión

Longitud de onda [nm] Figura 49 Modelo de fondo

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Referencia interna

Una de las técnicas más simples de corrección es la referencia interna, que utiliza una sola longitud de onda de referencia. Este método se suele utilizar cuando aparece deriva de la línea de base entre medidas En general, es mejor elegir una longitud de onda de referencia lo más cerca posible de la longitud de onda analítica, pero sin absorbancia significativa del analito. La absorbancia a la longitud de onda de referencia se resta de la de la longitud de onda analítica. Se corrige cualquier interferencia constante a todas las longitudes de onda, Figura 50. Aunque en la práctica las interferencias no suelen ser constantes a todas las longitudes de onda, esta simple técnica a menudo da lugar a sorprendentes mejoras en la exactitud.

Absorbancia [UA]

Espectro a Espectro b

Longitud de onda [nm] Figura 50 Referencia interna

Corrección de tres puntos

La corrección de tres puntos, o Morton-Stubbs, utiliza dos longitudes de onda de referencia, normalmente aquellas a los lados de la longitud de onda analítica. Se estima entonces la absorbancia interferente de fondo a la longitud de onda analítica, usando interpolación lineal (Figura 51). Este método representa una mejora sobre la técnica de referencia a una λ, porque corrije cualquier absorbancia de

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fondo que exhiba una relación lineal con la longitud de onda. En muchos casos, si el rango de longitud de onda es estrecho, será una corrección razonable para absorbancias de fondo no lineales, como la resultante de la dispersión o de una matriz comleja.

Absorbancia [UA]

Espectro medido

Longitud de onda [nm] Figura 51 Corrección de tres puntos (Morton-Stubbs)

Espectroscopía derivada

Debido a dos de sus propiedades, la espectroscopía derivada puede utilizarse para reducir o eliminar la interferencia de fondo de varios orígenes. Primero, cualquier interferencia con una relación directamente proporcional a diferentes órdenes de λ, de forma general 1

A = a0 + a1 λ + … + an λ

n

se elimina por el uso de derivadas de orden cada vez mayor. Así, un desplazamiento constante de la línea de base (a0) se elimina por la primera derivada, una absorbancia de fondo que aumenta linealmente con λ, se elimina por la segunda derivada, etc. Desafortunadamente, sólo el desplazamiento constante de la línea de base es común en espectroscopía UV-visible.

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Segundo, y quizás más importante que la primera propiedad, las derivadas discriminan bandas anchas de absorbancia relativamente a bandas estrechas de absorbancia. Esta discriminación resulta del hecho de que la amplitud (Dn) de una banda gaussiana en la enésima derivada, es inversamente proporcional a la anchura de banda original (W) elevada al grado n:

1 n D ∝ -------n . W Por lo tanto, para dos bandas coincidentes de igual intensidad pero diferente anchura en el orden cero, la amplitud de la derivada n de la banda más aguda (X) es mayor que la de la banda más ancha (Y), en un factor que depende de la anchura de banda relativa y del orden de la derivada: n

n

WY DX --------- = --------n n DY DX La Figura 52 muestra el efecto de tomar las derivadas de dos bandas con NBW de 160 y 40 nm, respectivamente. En modo absorbancia, estas bandas tienen igual amplitud. En la primera derivada, la banda más estrecha tiene 4 veces mayor amplitud y, en la segunda derivada tiene 16 veces mayor amplitud. Esta propiedad mejora la exactitud de la cuantificacion de cualquier componente de banda ancha. Este último puede ser un componente intereferente, como se muestra en la Figura 52.

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Absorbancia

Primera derivada

Segunda derivada

Longitud de onda [nm] Figura 52 Discriminación de bandas anchas en espectroscopía derivada

El espectro resultante de dispersión es también de banda ancha y el uso de derivadas puede reducir también su contribución. Por ejemplo, la Figura 53 muestra una banda de absorbancia con una NBW de 40 nm y la misma banda en la presencia de fondo de dispersión. Sin ninguna corrección, la amplitud a 500 nm es 1.0920 A en lugar de 1.0 A, debido a la contribución de la dispersión. La cuantificación a esta longitud de onda resulta en un error del + 9.2 %. Tomar la primera derivada reduce la contribución del componente de dispersión, de manera que utilizando del máximo al mínimo del pico, la señal en la presencia de dispersión es 0.02992 A en lugar de 0.03024 (un error de cuantificación de sólo - 1.1 %).

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Absorbancia Espectro medido Espectro actual

Primera derivada

Longitud de onda [nm] Figura 53 Corrección de la dispersión por espectroscopía derivada

Normalmente, sin embargo, el problema analítico no puede definirse de modo tan simple como dispersión, variación de línea de base o componentes de absorción ancha no deseados. Lo normal es que una combinación de dos o más de estos efectos resulte en una matriz de fondo de absorción ancha. La espectroscopía derivada es una herramienta excelente para reducir o eliminar estas fuentes de error difíciles de caracterizar.

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Problemas fotoquímicos Fluorescencia Algunas muestras fluorescen, es decir, emiten luz de un rango de longitud de onda cuando se irradian con luz de una longitud de onda más corta (de más energía). Esta luz emitida resulta en un error en la medida de absorbancia. La magnitud y posición del error depende de si el instrumento tiene una óptica convencional o una óptica inversa. En un instrumento de óptica convencional, la muestra se ilumina con luz de longitud de onda, variable con el tiempo. Al barrer el rango de longitud de onda de excitación, ocurre absorción y se inicia el proceso de fluorescencia que emite luz a longitudes de onda más largas. Como el detector no puede diferenciar entre las longitudes de onda individuales, la absorbancia medida a la longitud de onda de excitación es muy baja (Figura 54). Al barrer el rango de longitud de onda de emisión, no aparece fluorescencia y las medidas de absorción son, por lo tanto, exactas.

Absorbancia [UA]

Longitud de onda de excitación

Espectro medido con óptica convencional Espectro medido con óptica inversa

Longitud de onda de emisión

Longitud de onda [nm] Figura 54 Efecto de la fluorescencia sobre el espectro medido de absorbancia

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En un instrumento de óptica inversa, la muestra se ilumina con todas las longitudes de onda simultáneamente, incluyendo luz de la longitud de onda de excitación. Por tanto, la muestra fluoresce y emite luz pero, como la selección de longitud de onda ocurre después de que la luz haya pasado a través de la muestra, la luz emitida es dirigida a la longitud de onda correcta. La absorbancia medida a la longitud de onda de emisión es, por lo tanto, muy baja (Figura 54), pero la absorbancia medida a la longitud de onda de excitación es correcta.

Optica convencional Detector

Optica inversa Rendija detector

Figura 55 Angulos de aceptación y magnitud del error de fluorescencia

Descomposición de la muestra

Un factor adicional que afecta a la magnitud del error es el denominado ángulo de aceptación del detector, Figura 55. La luz fluorescente se emite en todas direcciones. Si el ángulo de aceptación es ancho, una parte significativa de la luz fluorescente alcanzará al detector. Por el contrario, si el ángulo de aceptación del detector es estrecho, sólo una pequeña cantidad de luz fluorescente alcanzará el detector y el error de absorbancia será también pequeño. Los instrumentos de óptica inversa tienen un ángulo estrecho de aceptación del detector y por lo tanto son menos susceptibles al error de fluorescencia. Colocando un filtro en el haz de luz, puede eliminarse el error debido a la fluorescencia. En un instrumento convencional, el filtro se sitúa entre la muestra y el detector para filtrar las longitudes de onda de emisión, mientras que en un instrumento de óptica inversa, el filtro de coloca entre la fuente y la muestra para eliminar las longitudes de onda de excitación.

Algunas muestras son sensibles a la reacción fotoquímica, especialmente cuando se exponen a luz UV de baja longitud de onda. En casos extremos, puede ser necesario un filtro para eliminar esta luz.

80

capítulo 4

capítulo 4

Desarrollo y validación del método

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Conocer los errores que pueden deberse al instrumento, al tratamiento de muestra y a la propia muestra, permite desarrollar métodos analíticos que minimicen sus efectos sobre los resultados. En este capítulo se revisan los criterios para definir un buen método y las estrategias para localizar los parámetros óptimos.

Desarrollo del método

Debido a que la mayoría de las aplicaciones UV-visible son la cuantificación de un solo componente, este capítulo está dirigido a la optimización de tales métodos. El desarrollo del método implica la selección de una o varias longitudes de onda que den lugar a los mejores resultados para un determinado análisis o instrumento. En éste, deben definirse parámetros como exactitud, precisión, sensibilidad, linealidad, rango, selectividad y robustez. Como estos parámetros no pueden ser optimizados al mismo tiempo, debe determinarse antes del análisis aquellos que se desea optimizar, así como los requisitos. Hasta hace poco, la instrumentación limitaba la elección de longitud de onda (debido principalmente a problemas de reproducibilidad de λ) y/o no se disponía de las herramientas adecuadas para comparar las opciones. Estas limitaciones ya no existen en los instrumentos modernos. NOTA: El desarrollo del método implica el uso de varias herramientas estadísticas. Los detalles de estas herramientas y sus ventajas, están fuera del objetivo de este libro, pero existen varias publicaciones excelentes.12–15

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Linealidad Linealidad es la capacidad del método para producir resultados proporcionales, directamente o mediante una transformación matemática, a la concentración del analito en las muestras, dentro de un determinado rango.16 En las medidas UV-visible, la relación lineal más usual es la ley de Beer, que indica que la absorbancia de un soluto es directamente proporcional a su concentración (vea “Ley de Beer” en la página 16). Una curva de calibración lineal que relacione la absorbancia con la concentración, debe tener la forma:

A = kc donde A es la absorbancia, c es la concentración y k es el factor de calibración (la pendiente de la curva de calibración). Por lo tanto, al comprobar la linealidad se prueba cómo las medidas actuales se ajustan al modelo teórico (ley de Beer). Teóricamente sólo se requiere la medida de absorbancia de un patrón de concentración conocida, como calibrado para la cuantificación. El valor medido de absorbancia dividido por la concentración, es la pendiente. Varios parámetros instrumentales y de la muestra (vea el capítulo 2 “Instrumentación” y el capítulo 3 “Tratamiento y medida de muestra”) pueden causar desviaciones de la ley de Beer y pueden resultar errores cuantitativos significativos si la curva de calibración no está caracterizada con exactitud (Figura 56). Sin embargo, como estas desviaciones dependen de la longitud de onda, la selección del valor apropiado de ésta puede minimizar su influencia sobre los resultados.

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Absorbancia [UA]


Absorbancia medida del patrón

C

ad urv

ció br a ali c e

n

r t eó

ica

Concentración conocida del patrón Concentración

Posibles curvas de calibración reales Absorbancia medida de la muestra

d rva Cu

ec

t ión rac b i l a

ic eór

a

Posibles resultados de cuantificación

Concentración

Absorbancia [UA]

Figura 56 Errores potenciales resultantes de una calibración inadecuada

Absorbancia [UA]

Concentración

Concentración Figura 57 Grupos de datos de calibración

Para construir una curva de calibración, deben medirse los espectros de un grupo de, al menos, tres disoluciones patrón del analito. Las concentraciones de los patrones deben “encerrar” el rango de concentración esperado de las muestras de análisis. Idealmente, todos los valores patrón medidos deben estar sobre una línea recta, pero en la práctica, los valores siempre presentan cierta dispersión (Figura 57). Debe aplicarse un método estadístico para encontrar el mejor ajuste de los datos a la curva de calibración y, en una segunda etapa, para determinar qué tipo de curva de calibración da lugar al mejor ajuste. El método estadístico más frecuente es la regresión lineal, que también se conoce como el método de mínimos cuadrados. Para comparar dos curvas de calibración, se requiere medir la bondad del ajuste de los patrones. Varios valores estadísticos, como el coeficiente de correlación, el error estándar de regresión y la incertidumbre, pueden usarse para esta medida. De estos, el coeficiente de correlación es el más popular. Este valor siempre está entre + 1 y - 1. Un valor + 1 indica una relación lineal perfecta entre absorbancia y concentración, siendo A creciente. Un valor - 1 también

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indica una relación lineal perfecta, con A decreciente (lo que puede ocurrir si se usan derivadas). El valor 0 indica que no hay correlación entre absorbancia y concentración. Para determinar el mejor valor o combinación de longitudes de onda, se miden los espectros de un grupo de patrones puros con un amplio rango de concentraciones. Se aplica una curva de calibración lineal a cada longitud de onda y se calculan las estadísticas elegidas para valorar la linealidad. Para una evaluación más rápida, es útil una representación gráfica de las estadísticas frente a la longitud de onda.

Coeficiente correlación

Absorbancia [UA]

La Figura 58 muestra los espectros de cuatro patrones de colorantes amarillos y el correspondiente coeficiente de correlación para una curva de calibración lineal simple. La mejor calibración en términos de la linealidad se realiza en el punto en el que el coeficiente de correlación se aproxima a la unidad. En este ejemplo, la longitud de onda del máximo (414 nm) no es idéntica a aquella (402 nm) que dá lugar a la mejor linealidad. Típicamente, pueden esperarse valores del coeficiente de correlación mejores de 0.999.

Rango óptimo

Longitud de onda [nm] Figura 58 Selección de las longitudes de onda para la mejor linealidad

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Si una longitud de onda individual no proporciona el grado requerido de linealidad, puede utilizarse una combinación de λ. Por ejemplo, el uso de una longitud de onda de referencia interna para eliminar los errores de variación de línea de base en las medidas, mejorará los resultados. Si no puede obtenerse el grado de linealidad deseado con una curva de calibración lineal simple, puede aplicarse un tipo diferente de curva para minimizar la influencia de la no idealidad de los resultados. Típicamente se utilizan ecuaciones de la forma:

A = a + kc A = kc + k′c

2

y

A = a + kc + k′c

2

De nuevo, debe utilizarse el coeficiente de correlación u otra herramienta estadística para valorar la calidad relativa de las curvas de calibración. Observe que cuando se utilizan tipos de curva de calibración con mayor grado de libertad, se requieren más patrones para caracterizar adecuadamente la curva. Para análisis multicomponente, también se supone que se cumple la ley de Beer. Sin embargo, en este caso, el modelo de cálculo incluye la ley de aditividad para explicar la absorbancia total a cada longitud de onda. No puede usarse el test simple de linealidad descrito anteriormente. En su lugar, puede utilizarse la desviación estándar del residual para probar el ajuste de los patrones al espectro medido. Este valor es la suma de los cuadrados de las diferencias a cada longitud de onda, entre el espectro medido y el calculado. Puede suponerse que si el residual es cero, es decir si los patrones pueden ajustarse perfectamente al espectro medido, la ley de Beer y la ley de aditividad se

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cumplen en el sistema en estudio. Si la desviación estándar del residual no es cero, el modelo teórico no refleja el sistema en estudio ya que una de las leyes no se obedece o porque está presente un componente para el que no hay patrón de calibración. En la práctica, sin embargo, el residual nunca es cero y debe determinarse empíricamente el valor aceptable para un análisis, utilizando resultados analíticos que cumplan los requisitos de exactitud y precisión.

Exactitud La exactitud de un método es el grado de acuerdo entre el resultado de un test individual generado por el método y el valor verdadero.16 (Vea en el Apéndice A una explicación de la diferencia entre exactitud y precisión). Para determinar qué valor o valores de longitud de onda dan lugar a la mejor exactitud, se miden los espectros de un grupo de patrones y se construyen curvas de calibración a todas las longitudes de onda, como se describió anteriormente. Se requiere, entonces, una muestra de concentración conocida. Esta muestra es, idealmente, una en la que se haya determinado la concentración del analito utilizando una técnica diferente. Sin embargo, si no se dispone de esta muestra, puede prepararse una sintética que contenga un peso conocido. Se mide el espectro de la muestra, se realiza la cuantificación y se compara con el valor conocido. Una representación gráfica de los resultados cuantitativos frente a la longitud de onda, permite una rápida evaluación. La Figura 59 muestra los resultados de un colorante amarillo. Aunque tendría que haberse fijado la longitud de onda analítica a 414 nm utilizando métodos tradicionales, aquellos valores que dan lugar a la mejor exactitud están en la región de los 400 nm.

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Concentración

Absorbancia [UA]


Concentración medida Concentración real

Rango óptimo

Longitud de onda [nm] Figura 59 Selección de las longitudes de onda para la mejor exactitud

Como el ruido puede influir en la exactitud de una medida, es preferible realizar una serie de medidas sobre la muestra y calcular la media. Este método reduce la contribución del ruido a errores en la exactitud. Sin embargo, en análisis multicomponente con rangos espectrales, no puede deducirse el rango óptimo de longitud de onda utilizando una técnica tan simple. En su lugar, debe determinarse el mejor rango a través de un proceso de tanteo del rango de longitud de onda y comparando los resultados calculados con los valores actuales.

Precisión La precisión de un método es el grado de acuerdo entre los resultados de los tests individuales cuando el procedimiento se aplica repetidamente a múltiples muestreos.16 (Vea en el Apéndice A una explicación de la diferencia entre exactitud y precisión). Para determinar la precisión se requiere un valor estadístico. La desviación estándar, el porcentaje de desviación

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estándar relativa (obtenido dividiendo la desviación estándar por la media y multiplicando por 100) y el intervalo de confianza, son las funciones más populares para valorar la precisión o repetitividad de un grupo de medidas.

Valor [mg/l]

Para determinar la precisión de un método, se preparan un grupo de unas 10–20 muestras con la misma concentración. Entonces, se miden estas muestras y se calcula la cantidad de analito. La desviación estándar de los resultados es una medida de la precisión. La Figura 60 muestra un ejemplo de la dispersión de los resultados y de la desviación estándar que pueden esperarse de un buen análisis.

Media = 31.41 mg/l Desviación estándar = 0.022 mg/l

Número de medidas Figura 60 Determinación de la precisión de un análisis

Si no se obtiene el nivel deseado de precisión, deben utilizarse técnicas de reducción de ruido como promedio de longitud de onda, promedio de tiempo y referencia interna, para mejorar los valores. Pueden aplicarse las mismas técnicas en análisis multicomponente.

Sensibilidad Sensibilidad se refiere a la respuesta obtenida para una determinada cantidad de analito y, a menudo, se indica mediante dos factores analíticos: el límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ).16

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El LOD es la concentración más baja del analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada, en matrices de muestra. En general, el LOD es el punto al que la señal del analito es igual a tres veces el ruido de la medida. Los resultados de las medidas de algunos espectrofotómetros listan las desviaciones estándar basadas en el ruido de la medida. El LOD es, aproximadamente, tres veces la desviación estándar. El LOQ es la concentración más baja del analito que puede determinarse con una precisión y exactitud aceptables, en matrices de muestra. Para calcular el LOQ, deben definirse los límites aceptables de precisión y exactitud (que dependen de los objetivos del análisis). Entonces, pueden utilizarse las herramientas descritas anteriormente, para determinar los límites aceptables. A menudo se supone que la longitud de onda con la máxima absorbancia da lugar a la mejor sensibilidad. Sin embargo, como el ruido instrumental puede variar significativamente con la longitud de onda, esto no siempre es necesariamente cierto. Un método mejor de determinar el valor o valores de longitud de onda de sensibilidad óptima, es medir el espectro de una muestra de baja concentración, varias veces. Se calculan, entonces, la media y el porcentaje de desviación estándar relativa de los valores medidos a cada longitud de onda. El valor de λ con el porcentaje de desviación estándar relativa más bajo, probablemente dará lugar a la mejor sensibilidad. La Figura 61 ilustra esta técnica para un colorante amarillo. Aunque las longitudes de onda entre 400 y 450 nm ofrecen una sensibilidad excelente, la mejor se obtiene a 220 nm.

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% RSD

Absorbancia [UA]


Rango óptimo

Longitud de onda [nm] Figura 61 Selección de las longitudes de onda de mejor sensibilidad

En análisis multicomponente, puede utilizarse esta técnica para identificar los valores óptimos de longitud de onda para cada componente. Estas λ pueden aplicarse directamente en el método de ecuaciones simultáneas simples o como una guía del rango óptimo de longitud de onda, en el método de mínimos cuadrados.

Rango Rango es el intervalo entre (e incluidos) los niveles superior e inferior del analito, que han sido calculados con la precisión, exactitud y linealidad requeridos.16 El rango se determina analizando primero, muestras que contengan distintas concentraciones del analito y, a continuación, utilizando las herramientas descritas anteriormente para calcular la linealidad, precisión y exactitud de los resultados.

Selectividad Selectividad es la capacidad de un método para cuantificar con exactitud y especificamente al analito o analitos, en presencia de otros compuestos.16

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La presencia de cualquier otro compuesto que absorba a la longitud de onda utilizada para cuantificar el analito, resultará en un error cuantitativo. Estos otros compuestos pueden ser precursores de la síntesis, impurezas conocidas, excipientes o productos de degradación de la matriz. Si el tipo de interferencia es conocido, la persona que desarrolla el método puede examinar los espectros del analito y de la interferencia, para seleccionar una longitud de onda a la que el analito tenga una absorbancia significativa pero a la que sea pequeña la de la interferencia. Si la elección de λ no evita lo suficiente el efecto de la interferencia, puede aplicarse una técnica de corrección apropiada, como el uso de una longitud de onda de isoabsorbancia (vea “Isoabsorbancia” en la página 72). Si la identidad y/o los espectros de las posibles interferencias son desconocidos, puede utilizarse un método empírico casi idéntico al descrito anteriormente, para determinar qué longitud o longitudes de onda darán lugar a la mejor exactitud. En este caso, las muestras de test deben contener la interferencia. Si se conoce la concentración del analito en la muestra, la longitud de onda que dé el resultado más cercano al valor conocido, será la correspondiente a la mejor selectividad (las impurezas siempre añaden absorbancia, causando resultados erróneamente elevados). En el ejemplo de la Figura 62, la muestra de colorante amarillo ha sido contaminada con un colorante rojo. La representación de la concentración frente a la longitud de onda muestra que las λ entre 390 y 420 nm dan lugar a la mejor selectividad. Observe que, debido al contaminante, el rango del error de exactitud es mucho más amplio que para el colorante amarillo puro (Figura 59).

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Concentración [mg/l]

Absorbancia [UA]


Concentración medida Concentración real

Rango óptimo

Longitud de onda [nm] Figura 62 Selección de la longitud de onda para la mejor selectividad

Robustez Robustez es el grado de reproducibilidad de los resultados de test, obtenidos analizando las mismas muestras bajo varias condiciones normales de test.16 El método no debe afectarse por cambios de tiempo o lugar. La reproducibilidad del método debe establecerse en varias condiciones, por ejemplo con diferentes lotes de reactivos, a diferentes temperaturas y con diferentes tiempos de prueba. La robustez de un método analítico se determina analizando submuestras de una muestra homogénea, en diferentes laboratorios y con equipos distintos. Estos tests deben realizarlos diferentes analistas bajo condiciones operacionales y medioambientales que pueden variar, pero que estarán dentro de los parámetros especificados para el método. El grado de reproducibilidad de los resultados se calcula, entonces, como una función de las variables del ensayo. Este valor puede compararse con la precisión del método en condiciones normales para obtener una medida de su robustez.

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Requisitos En el desarrollo de un método analítico, son valiosos los instrumentales datos espectrales completos, aunque no esenciales, para la evaluación de todas las opciones posibles. La reproducibilidad de longitud de onda del instrumento también debe ser excelente para no restringir la elección de la longitud o longitudes de onda. Un espectrofotómetro que mide automáticamente espectros múltiples y calcula los valores medio y de desviación estándar para cada absorbancia, puede mejorar la productividad en gran medida. Finalmente, el software instrumental debe ser capaz de procesar una gran cantidad de datos y utilizar las herramientas estadísticas apropiadas. Los cálculos manuales o la transferencia de los datos desde el espectrofotómetro a otras aplicaciones para su evaluación, limitan seriamente la productividad.

Validación del método

Cualquier método analítico diseñado para ser utilizado en un entorno que cumpla las normativas, como un laboratorio de control de calidad farmacéutico, debe ser validado. La validación del método es el proceso para determinar si las características de rendimiento son adecuadas para el propósito que se pretende. La Farmacopea de Estados Unidos (USP) contiene guías para la validación del método.17 Esta validación es similar al desarrollo del método que incluye estudios sobre especificidad, linealidad, exactitud o recuperación, sensibilidad y precisión o reproducibilidad. Sin embargo, la validación debe realizarse separadamente del desarrollo y la validación del método.16 Mientras que el desarrollo del método implica la selección de parámetros y condiciones específicos, la validación se utiliza para confirmar que las características de rendimiento del método están de acuerdo con la aplicación pretendida de los estudios del laboratorio.

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capítulo 5

capítulo 5

Operación de rutina

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La espectroscopía UV-visible se considera una técnica de rutina y ampliamente utilizada en QA/QC y laboratorios similares. Sin embargo, ni las consideraciones tratadas en los capítulos previos ni el mejor desarrollo de método, garantiza buenos resultados. Este capítulo revisa las etapas para asegurar resultados exactos y precisos regularmente y, quizás más importante, para detectar resultados erróneos.

Verificación del rendimiento del instrumento

En los últimos años, las normas de calidad indicadas por la ISO 9000 (BS 5750), las Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP), las Buenas Practicas de Fabricación (GMP) y el United Kingdom National Measurement Accreditation Service (NAMAS) han cobrado una gran importancia. Como consecuencia, en la industria farmacéutica, las recomendaciones contenidas en las farmacopeas también han alcanzado mayor influencia. La verificación del rendimiento continuo y apropiado de los espectrofotómetros UV-visible, es un elemento clave de estos requisitos de calidad.

Parámetros de test Aunque no hay una definición clara sobre qué parámetros deben probarse para verificar el rendimiento del instrumento, los fabricantes y usuarios, generalmente, están de acuerdo en que deben incluirse los criterios descritos a continuación.

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La exactitud de longitud de onda es el criterio de rendimiento más importante para diferenciar espectros, cuando se miden en instrumentos distintos. También es importante en el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extinción o factores. Debido a que estos factores dependen de la longitud de onda, las medidas deben realizarse a exactamente la misma λ a la que los factores se determinaron originalmente. Cuando se comparan espectros o valores de absorbancia medidos en el mismo instrumento (como en la mayoría de los análisis cuantitativos en los que se mide un patrón), sin embargo, la precisión de longitud de onda es el parámetro crítico (vea “Exactitud y precisión de longitud de onda” en la página 50). Para medir la exactitud y precisión de longitud de onda, se requiere un patrón de referencia. Idealmente, este patrón debería tener picos bien definidos y muy estrechos, a una serie de longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible, como se muestra en la Figura 63. Este patrón ideal no existe, aunque algunos se aproximan. Para los patrones actuales de exactitud de longitud de onda, como los picos no son idealmente simétricos, los cambios en la anchura de la rendija del instrumento afectarán ligeramente a la posición medida de los picos.

Patrón de absorbancia Absorbancia [UA]

Exactitud y precisión de longitud de onda

Patrón de longitud de onda

Longitud de onda [nm] Figura 63 Espectros ideales de patrones de absorbancia y longitud de onda

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Exactitud y precisión fotométrica

La exactitud fotométrica es el criterio más importante para el análisis cuantitativo cuando se utilizan coeficientes de extinción o factores. Sin embargo, para medidas comparativas (como las anteriores), la precisión fotométrica es el parámetro crítico (vea “Exactitud y precisión fotométrica” en la página 51). Es necesario un patrón de referencia para medir la exactitud y la precisión fotométrica. Idealmente, este patrón tendría absorbancia constante a todas las longitudes de onda a lo largo de los rangos UV y visible (Figura 63), de manera que un error de exactitud de longitud de onda no afecta a los resultados. En la práctica, no existe tal patrón, aunque los cristales de densidad neutra se aproximan al ideal en el rango de longitud de onda visible. Los patrones utilizados, típicamente, tienen picos anchos y valles.

Luz dispersa

La luz dispersa es el factor que más afecta a la relación lineal entre la absorbancia y la concentración a absorbancias elevadas. Introduce una predisposición sistemática a menores absorbancias en concentraciones crecientes. La luz dispersa es también la influencia principal en el límite superior del rango dinámico lineal para un análisis (vea “Luz dispersa” en la página 51). Para medir la luz dispersa, es necesario un filtro. Idealmente, este filtro absorbería toda la luz de la longitud de onda a la que que se va a realizar la medida y transmitiría las longitudes de onda superiores o inferiores (los orígenes de la luz dispersa, como se muestra en la Figura 64). En la práctica, sin embargo, este filtro no existe. En su lugar se utilizan filtros de corte que transmiten toda la luz por encima o por debajo de una determinada longitud de onda y que bloquean toda la luz en un rango particular de λ.

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Transmitancia [%]


Longitud de onda [nm] Figura 64 Espectro ideal de un filtro de luz dispersa

Resolución

La resolución es un factor crítico en la determinación de la forma de los picos. En general, la resolución instrumental debe ser aproximadamente 10 veces mejor que la anchura de banda del pico medido. Si la resolución instrumental no es suficiente, la absorbancia medida en el máximo de longitud de onda será demasiado baja. Por consiguiente, la exactitud fotométrica tiene una predisposición sistemática. Esta predisposición juega un papel clave si es esencial la exactitud absoluta pero, como se trata en “Resolución espectral” en la página 46, es menos importante para medidas relativas como las de cuantificación. Medir la resolución es difícil y, a menudo, se utilizan métodos empíricos como la medida de alturas relativas de picos y valles, para una muestra con una banda estrecha (vea “Resolución” en la página 110).

Ruido

El ruido es el factor principal que afecta a la precisión de las medidas de absorbancia. Es especialmente significativo a bajas absorbancias, a las que suele determinarse el límite de detección (vea “Ruido” en la página 52). El ruido se mide, normalmente, a absorbancia cero, es decir, sin muestra en el paso de luz.

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LLanura de la línea de base

Medir el ruido a todas las longitudes de onda, normalmente, no es practicable. Sin embargo, la llanura de la línea de base indica el ruido relativo a todas las longitudes de onda y revela aquellas con problemas instrumentales resultantes del cambio de filtro o fuente, por ejemplo. La llanura de línea de base se mide, normalmente, a absorbancia cero.

Estabilidad

La estabilidad afecta a la exactitud de las medidas de absorbancia en función del tiempo. La deriva de las medidas de absorbancia introduce errores sistemáticos en la exactitud fotométrica (vea “Deriva” en la página 55). La estabilidad se mide, normalmente, a absorbancia cero.

Linealidad

La linealidad a menudo se considera importante para verificar el rendimiento. Pero debido a que depende mucho de la muestra, creemos que se mide mejor durante un test de idoneidad del sistema, como se describe posteriormente. El problema principal en la verificación del rendimiento es que todos los parámetros listados anteriormente dependen de la longitud de onda y, en el caso de la luz dispersa, de la muestra. Como no es práctico realizar todos los tests a todas las λ, deben seleccionarse algunas representativas para el propósito pretendido. Los resultados de estos tests deben compararse con las especificaciones absolutas de rendimiento para los métodos en uso. La verificación demostrará, entonces, eficazmente, si las características de rendimiento han cambiado de manera que pudiera afectar a la bondad de los resultados analíticos. Cumplir los criterios anteriores (determinados utilizando patrones de referencia) no garantiza, sin embargo, que un deteminado análisis pueda realizarse con la exactitud y linealidad requeridas. Debido a que muchos parámetros dependen de la muestra, la exactitud y linealidad deseadas sólo pueden lograrse con un test apropiado de idoneidad del sistema, realizado sobre la propia muestra.

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Patrones Una discusión detallada sobre todos los patrones y sus ventajas y desventajas relativas, está fuera del objetivo de este libro. Existen varias publicaciones excelentes que cubren estos temas en profundidad.18,19 A continuación encontrará algunos comentarios generales sobre los méritos relativos de los tres tipos principales de patrones. Patrones de emisión

Ciertas fuentes de emisión, como las lámparas de mercurio y deuterio, exhiben líneas agudas a longitudes de onda específicas que son ideales para los test de exactitud y precisión de longitud de onda. De hecho, en muchos espectrofotómetros modernos, se utilizan las líneas de deuterio a 486.0 y 656.1 nm de la fuente incorporada, para comprobar y recalibrar la exactitud de longitud de onda. Sin embargo, las fuentes de emisión requieren alimentación eléctrica y, si el instrumento ha sido auto-calibrado utilizando su lámpara de deuterio, debe utilizarse otro patrón para verificación. Además, debido a que las fuentes de emisión no son muestras típicas, no prueban el sistema completo.

Patrones sólidos de absorción

Los patrones sólidos no requieren ninguna preparación, son fáciles de usar y mantener, son relativamente insensibles a la temperatura y tienen una buena estabilidad con el tiempo. Sin embargo, con patrones sólidos no puede asegurarse la homogeneidad de un patrón a otro o entre lotes. Por lo tanto, debe calibrarse cada patrón individualmente en un espectrofotómetro de referencia. Debido a que este proceso implica cierto tiempo, los patrones sólidos tienden a ser caros. Además, como los patrones sólidos no son absolutamente estables, deben devolverse para ser recalibrados, con regularidad. Por último, estas muestras deben mantenerse escrupulosamente limpias y no pueden utilizarse para probar sistemas de flujo.

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La Tabla 5 resume algunos de los patrones sólidos más conocidos, sus usos, sus ventajas y desventajas.

Tabla 5

Algunos patrones sólidos

Patrón

Uso

Ventajas

Desventajas

Cristal de óxido de holmio


Picos a muchas longitudes de onda de 280 a 2000 nm

La posición de los picos varía de lote a lote

Cristal de óxido de didimio



La posición de los picos varía de lote a lote No hay picos por debajo de 400 nm

Granate de neodimio ytrio aluminio



No hay picos por debajo de 350 nm

Cristal de densidad neutra

Patrón fotométrico

Perfil de absorbancia muy llano en el rango visible de longitud de onda

No es adecuado para el rango UV No es absolutamente estable; debe recalibrarse regularmente

Metal sobre cuarzo


Perfil de absorbancia muy llano en los rangos UV y visible de longitud de onda

Problemas frecuentes por error de interreflexión Sensible a la temperatura No es muy estable; debe recalibrarse regularmente

Patrones líquidos de absorción

Estos normalmente son patrones físicos absolutos. En otras palabras, si se preparan patrones líquidos utilizando materiales puros apropiadamente, poseerán de modo inherente las propiedades de absortividad, máximos de picos, etc. requeridos para comprobar la exactitud. Debido a que la calibración de las disoluciones no es necesaria, los patrones líquidos pueden ser relativamente baratos. Estos patrones pueden utilizarse también para comprobar sistemas de flujo. Además, el proceso de utilizar una disolución como patrón, es muy similar al de una muestra normal. La desventaja principal de los patrones líquidos es que, en general, deben haberse preparado recientemente. Esto implica tiempo y requiere una razonable habilidad del operador. Algunos proveedores han intentado solventar este problema suministrando patrones sellados en cubetas. Sin embargo, debido a que la propia cubeta contribuye con

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algo de absorbancia, estos patrones deben calibrarse y recalibrarse individualmente, lo que incrementa los costes. Más aún, como los patrones líquidos son menos estables que los sólidos, deben recalibrarse más a menudo. Ahora puede disponerse de disoluciones preparadas selladas en ampollas, para utilizar en cubetas normales, fáciles de utilizar y de coste adecuado.20 La Tabla 6 resume algunos de los patrones líquidos más conocidos, sus usos, sus ventajas y sus desventajas.

Tabla 6

Algunos patrones líquidos

Patrón

Uso

Ventajas

Desventajas

Oxido de holmio en ácido perclórico



No hay picos utilizables por encima de 650 nm

Oxido de samario en ácido perclórico



No hay picos utilizables por encima de 500 nm

Benceno (vapor)


Picos muy estrechos de 230 a 260 nm Rango muy limitado de longitud de onda

Dicromato potásico en ácido perclórico o sulfúrico


Picos anchos a 257 y 350 nm y valles No absorbancia en el rango visible anchos a 235 y 313 nm Muy sensible al pH y, como agente oxidante potente, puede ser inestable

Mezcla de sales de cobalto y níquel


Picos a 302, 395, 512 y 678 nm que cubren las regiones UV y visible

Bandas más bien estrechas, la exactitud de λ puede afectar a los resultados

Disolución de nitrito sódico (50 g/l) Luz dispersa

Cortes a 390 nm Usado para medir luz dispersa a 340 nm o inferior

Ninguna

Disolución de ioduro potásico o sódico (10 g/l)


Tendencia a descomponerse

Luz dispersa

103


Tabla 6

Algunos patrones líquidos

Patrón

Uso

Ventajas

Desventajas

Disolución de cloruro potásico (12 g/l)

Luz dispersa


Como la medida se realiza en el lateral de la pendiente de corte, los errores de exactitud de λ pueden afectar a la medida de luz dispersa

Tolueno en hexano

Resolución

Fácil método empírico usando pico (269 nm) y valle (266 nm) del espectro del tolueno

Sólo puede usarse para determinar la resolución en un punto del espectro. Puede variar con λ

Requisitos de las En la sección siguiente se revisan algunos de los requisitos normas más importantes de las normativas que regulan el uso de los espectrofotómetros UV-visible. GLP/GMP

Los requisitos de las GLP y GMP para la validación de instrumentos, puede resumirse como sigue: Verificación documentada de que el sistema o subsistema funciona como se pretende en rangos operativos representativos o anticipados.21 Para espectroscopía, se indica la siguente recomendación: Donde sea apropiado, deben llevarse a cabo controles periódicos del rendimiento (por ejemplo, ... la resolución, alineamiento y exactitud de longitud de onda de los espectrofotómetros, etc.).22

Farmacopea europea

Los requisitos que regulan los espectrofotómetros UV-visible utilizados para análisis farmacéutico en Europa, están contenidos en la Farmacopea Europea (EP).23 Estos requisitos se basan y prácticamente son idénticos a aquellos listados en las farmacopeas nacionales como la Británica (BP) y la Alemana (DAB): Control de longitudes de onda—Verificar la escala de λ utilizando los máximos de absorción de una disolución de perclorato de holmio, la línea de una lámpara de descarga

104


de hidrógeno o deuterio o las de arco de vapor de mercurio, mostradas a continuación. La tolerancia permitida es ± 1 nm para el ultravioleta y ± 3 nm para el visible. 241.15 nm (Ho)

404.66 nm (Hg)

253.70 nm (Hg)

435.83 nm (Hg)

287.15 nm (Ho)

486.00 nm (Dβ)

302.25 nm (Hg)

486.10 nm (Hβ)

313.16 nm (Hg)

536.30 nm (Ho)

334.15 nm (Hg)

546.07 nm (Hg)

361.50 nm (Ho)

576.96 nm (Hg)

365.48 nm (Hg)

579.07 nm (Hg)

Control de absorbancia—Comprobar la absorbancia utilizando disolución de dicromato potásico R a las longitudes de onda indicadas en la siguiente tabla, que muestra para cada longitud de onda el valor exacto de A (1 por ciento, 1 cm) y los límites permitidos. Longitud de onda (nm)

A (1 por ciento, 1 cm) Tolerancia máxima

235

124.5

122.9 a 126.2

257

144.0

142.4 a 145.7

313

48.6

47.0 a 50.3

350

106.6

104.9 a 108.2

Límite de luz dispersa—La luz dispersa puede detectarse a una longitud de onda dada, con filtros o disoluciones adecuados: por ejemplo la absorbancia de una disolución de cloruro potásico R del 1.2 por ciento m/V en una cubeta de 1 cm, debe ser mayor de 2 a 200 nm al compararla con agua como líquido de compensación. Poder de resolución—Cuando se indique en una monografía, mida la resolución del aparato como sigue:

105


registrar el espectro de una disolución de tolueno R al 0.02 % V/V en hexano R. La relación mínima de la absorbancia en el máximo a 269 nm, a aquella en el mínimo a 266 nm, se indica en la monografía. NOTA: La BP indica que la relación debe “... no ser inferior a 1.5 a no ser que se indique lo contrario en la monografía.” Farmacopea de Estados Unidos

En los Estados Unidos, los requisitos para los espectrofotómetros UV-visible no están tan claramente definidos como en Europa. La Farmacopea24 de Estados Unidos (USP) XII, Sección 831 (“Espectrofotometría y dispersión de luz”) dice: Comprobar la exactitud de la calibración del instrumento. ... La escala de longitud de onda puede calibrarse también por medio de filtros adecuados de cristal, con bandas de absorción útiles en las regiones visible y ultravioleta. Han sido ampliamente utilizados cristales patrón con didimio (una mezcla de praseodimio y neodimio). El cristal con contenido de holmio se considera superior. Para comprobar una escala fotométrica, puede disponerse de varios filtros patrón de cristal inorgánico, así como disoluciones patrón de transmitancia conocida, como cromato o dicromato potásico. Este último contiene una referencia cruzada: Para más detalles relativos a los controles de las escalas de longitud de onda y fotométricas de un espectrofotómetro, pueden consultarse las siguientes publicaciones del National Institute of Standards and Technology ... El National Institute of Standards and Technology (NIST) indica varios patrones sólidos y líquidos para determinar la

106


exactitud de longitud de onda, exactitud fotométrica y luz dispersa.25 La Tabla 7 resume los más importantes.

Tabla 7

Patrones NIST

SRM #

Tipo

Descripción NIST

930

Filtros de cristal de densidad neutra

Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de transmitancia y absorbancia de espectrofotómetros de absorción visible.

931

Disolución de cobalto y níquel en Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de absorbancia de espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible con pasos de banda estrechos. mezcla de ácido nítrico y perclórico

935

Dicromato potásico sólido para preparar la disolución de test

Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de absorbancia de espectrofotómetros de absorción ultravioleta.

2031

Metal sobre cuarzo

Este SRM es para la verificación y calibración de las escalas de transmitancia y absorbancia de espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible.

2034

Disolución de óxido de holmio en Este SRM es para utilizar en la verificación y calibración de la escala de longitud de onda de ácido perclórico espectrofotómetros de absorción ultravioleta y visible con anchuras de banda espectral nominal que no exceden 3 nm.

2032

Ioduro potásico sólido para preparar la disolución de test

Este SRM se utiliza en la valoración de la energía radiante dispersa heterocrómica (luz dispersa) en espectrofotómetros de absorción ultravioleta.

Métodos americanos de test estándar

La American Standard Testing Methods (ASTM)26 publica métodos de test para medir las características clave del rendimiento, de los espectrofotómetros UV-visible: Exactitud y precisión de longitud de onda: determinada utilizando una lámpara de descarga de vapor de mercurio (región UV), una lámpara de arco de deuterio o hidrógeno (región visible), vapor de benceno (región UV), o cristal de óxido de holmio o disolución de perclorato de holmio (regiones UV y visible). La ASTM recomienda que las longitudes de onda de calibración utilizadas, “encierren” a la longitud de onda analítica. Linealidad: determinada preparando una curva de trabajo analítica con el analito de interés (vea “Idoneidad del sistema” en la página 115).

107


Exactitud fotométrica: determinada utilizando patrones NIST 930, 2031 o 935. Precisión fotométrica: determinada utilizando una pantalla metálica o un filtro adecuado de cristal. La importancia de la anchura de la rendija y la resolución se menciona en la documentación ASTM, pero no se indica ningún método práctico para medir estos parámetros. Una publicación ASTM adicional27 describe los patrones y procedimientos para medir la luz dispersa. La Tabla 8 resume los requisitos y recomendaciones de varios estamentos reguladores.

Tabla 8

Parámetros de test y patrones usados por las principales agencias reguladoras

Tipo de test

Patrón

Exactitud de Solución de perclorato de holmio longitud de onda Cristal de óxido de holmio

Exactitud fotométrica y linealidad

Luz dispersa

Resolución

EP ASTM

—

2034

S

X

X

—

—

X

Lámpara de arco de deuterio

X

—

S

X

Lámpara de arco de mercurio

X

—

S

X

Vapor de benceno

—

—

—

X

Disolución de dicromato potásico

X

935

S

X

Cristal de densidad neutra

—

930

—

X

Solución sales de cobalto y níquel

—

931

—

X

Metal sobre cuarzo

—

2031

—

X

Disolución de cloruro potásico

—

—

S

X

Disolución de ioduro potásico

—

2032

Disolución de ioduro sódico

—

—

—

X

Disolución de nitrito sódico

—

—

—

X

Tolueno en disolución de hexano

—

—

S

—

USP: Sólo método de test

108

NIST USP SRM

— —


NIST SRM: Material patrón y método de test EP: Método de test y especificación de rendimiento mínimo ASTM: Sólo método de test

La elección de patrones depende de los análisis a realizar en el instrumento. Está condición está señalada en los requisitos GLP, de manera que la verificación debe realizarse para los rangos de operación pretendido y anticipado; en las recomendaciones ASTM, de manera que las longitudes de onda utilizadas para calibración encierren la longitud de onda analítica; y en las normas NIST. Así por ejemplo, si el propósito es medir la absorbancia en la región UV (como en la mayoría de los análisis farmacéuticos), la exactitud fotométrica debe verificarse no en el rango visible sino en el UV, preferiblemente a varias longitudes de onda. De modo similar, no es apropiado verificar la exactitud de longitud de onda sólo en la línea del deuterio 656.1 nm, ya que éste no es un indicador fiable de la exactitud de longitud de onda en la región UV.

Recomendaciones Aunque no hay un grupo definitivo de patrones para verificar el rendimiento de un espectrofotómetro, se recomiendan los siguientes tests para aquellos usuarios que analizan, principalmente, muestras líquidas y que necesitan cumplir con los requisitos generales de las normas. Exactitud de longitud de onda: disolución de perclorato de holmio (40 g/l óxido de holmio en ácido perclórico al 10 % v/v). La Figura 65 muestra el espectro de esta disolución, medido en un espectrofotómetro Agilent 8453.

109

Absorbancia [UA]


Longitud de onda [nm] Figura 65 Espectro de disolución de perclorato de holmio

La Tabla 9 muestra los valores especificados por el NIST para los picos de referencia utilizables para tres anchuras de banda espectral instrumental (SBWs) diferentes. Estos valores son preferibles a los EP ya que éstos no especifican

110


la SBW ni la temperatura utilizada y porque los valores EP y NIST exhiben una discrepancia significativa.

Tabla 9

Valores NIST para picos de disolución de perclorato de holmio28 SBW 0.5 nm

1.0 nm

2.0 nm

241.01

241.08

240.90

249.79

249.87

249.98

278.13

278.10

278.03

287.01

287.18

287.47

333.43

333.44

333.40

345.52

345.47

345.49

361.33

361.31

361.16

385.50

385.66

385.86

416.09

416.28

416.62

—

451.30

451.30

467.80

467.83

467.94

485.27

485.29

485.33

536.54

536.64

536.97

640.49

640.52

640.48

Exactitud fotométrica: disolución de dicromato potásico (aproximadamente 60 mg/l en ácido sulfúrico 0.01N). La Figura 66 muestra el espectro del dicromato potásico. Los valores EP para este patrón, se presentan en la página 104.

111

Absorbancia [UA]


Longitud de onda [nm] Figura 66 Espectro del dicromato potásico

Si las medidas van a realizarse en la región visible, se aconseja realizar test adicionales con filtros de cristal de densidad neutra, como el NIST SRM 930. Luz dispersa: disoluciones de nitrito sódico (50 g/l), ioduro sódico (10 g/l) y cloruro potásico (12 g/l) en agua. Estas tres disoluciones permiten la medida de luz dispersa a tres longitudes de onda diferentes. La Figura 67 muestra los espectros de estas disoluciones. En general, se recomiendan nitrito sódico e ioduro sódico o potásico, pero para aquellos usuarios que necesiten cumplir con los requisitos de la EP, también puede ser necesario cloruro potásico.

112

Transmitancia [%]


Longitud de onda [nm] Figura 67 Espectros de disoluciones patrón de luz dispersa

Absorbancia [UA]

Resolución: disolución de tolueno en hexano (0.02 % v/v), según se especifica en la EP. La Figura 68 representa el espectro de esta disolución.

Longitud de onda [nm] Figura 68 Espectro de tolueno en hexano

La resolución se estima tomando la relación de la absorbancia en el máximo cercano a 269 nm, a aquella en el mínimo próximo a 266 nm. Esta relación está empíri-

113


camente relacionada con la SBW, como se muestra en la Tabla 10.29

Tabla 10

SBW y relación 269/266 nm (tolueno)

SBW (nm)

Relación de la absorbancia a 269 nm a la absorbancia a 266 nm

0.25

2.30

0.50

2.20

1.00

2.00

2.00

1.40

3.00

1.10

4.00

1.00

También deben medirse con el área de muestra limpia, el ruido, llanura de la línea base y deriva. No se requieren patrones.

Autotest del instrumento

La verificación completa del rendimiento de un espectrofotómetro, necesita tiempo y por consiguiente, normalmente sólo se realiza a intervalos periódicos. Estos intervalos se determinan de acuerdo con la estabilidad del instrumento. Para asegurar que se detecta cualquier desviación del rendimiento que ocurra entre verificaciones regulares, el instrumento debe estar equipado con rutinas auto-test que puedan ejecutarse diariamente. Estas rutinas deben incluir un control de la operación electrónica y óptica del espectrofotómetro, así como controles de exactitud de longitud de onda con una o ambas líneas de la lámpara de deuterio.

114


Idoneidad del sistema

La idoneidad del sistema está diseñada para evaluar los componentes del sistema analítico, para verificar que el rendimiento del sistema cumple los estándares requeridos por el método. La idoneidad del sistema no debe confundirse con la validación del método. Mientras la validación se realiza una vez al finalizar el desarrollo del método, los tests de idoneidad del sistema se ejecutan periódicamente para determinar si todo es adecuado y/o su eficacia. Los requisitos de idoneidad del sistema están bien definidos para los sistemas cromatográficos pero no para los sistemas de espectroscopía UV-visible. En la práctica, los analistas han desarrollado sus propias estrategias para realizar los test de idoneidad del sistema en instrumentos UV-visible. Dos ejemplos son: A. Medir y calibrar utilizando un patrón de concentración igual al 100 % de la concentración del componente esperado. Entonces, medir y cuantificar el patrón diluido por un factor de dos. Los resultados de ambas muestras deben caer dentro de un porcentaje especificado de la concentración conocida. Volver a medir el patrón confirma la exactitud de la medida inicial. B. Primero medir el patrón y a continuación, una serie de diluciones del mismo y calcular el coeficiente de extinción (absorbancia dividida por concentración) para cada concentración. Los valores de los coeficientes de extinción no deben variar más de un porcentaje especificado.

Operación apropiada

Sin embargo, buenas medidas del control de calidad, como test de verificación del rendimiento del instrumento y validación del método, así como resultados exactos y precisos, dependen en gran medida del factor humano. Aunque este factor no puede eliminarse nunca, pueden tomarse ciertas medidas para reducir el error humano.

115


Almacén electrónico Los espectrofotómetros modernos están casi todos controlados por microprocesador u ordenador y ofrecen un almacenaje electrónico de los parámetros de métodos. Idealmente, todos los parámetros importantes deben almacenarse en un solo fichero de método, con un nombre único. Cuando el operador introduce el nombre del método, todos los parámetros deben fijarse automáticamente, eliminando errores potenciales. En particular los entornos regulados, se beneficiarán de un sistema que evita que los operadores cambien parámetros de los métodos o que mantienen un seguimiento e informan de cualquier cambio.

Procedimientos Aunque los espectrofotómetros pueden almacenar y, autoestándar de operación máticamente, fijar parámetros, algunos procesos (como vaciar, enjuagar y llenar cubetas) debe realizarlas el operador, pudiendo introducir errores. Los operadores deben estar entrenados en estos procesos y todos los pasos deben estar documentados con las instrucciones de trabajo. En un entorno regulado, estos pasos se conocen como procedimientos estándar de operación (SOP).

Datos colaterales

Pueden obtenerse errores o resultados incorrectos, a pesar de usar la mejor instrumentación, del desarrollo y validación del método y del entrenamiento del operador. Por ejemplo, la muestra puede estar contaminada. Mientras un resultado incorrecto no es necesariamente problemático, puede tener serias consecuencias el no darse cuenta. La mayoría de los resultados analíticos obtenidos por UV-visible se basan en una medida a una longitud de onda. Con un punto, prácticamente no hay modo de detectar si un resultado es sospechoso, a menos que sea un resultado típico y que el actual se desvíe significativamente del valor conocido. Datos colaterales y medidas múltiples a una λ o (preferiblemente) a múltiples, puede ayudar a asegurar que un resultado es correcto. Los datos también pueden utilizarse para investigar la razón del error.

116


Longitudes de onda de Un modo sencillo de verificar resultados analíticos confirmación cuantitativos es a través del análisis de confirmación. En este, se mide la absorbancia a una o más longitudes de onda, además de a la λ analítica, tanto de patrones como de muestras. Se realiza la cuantificación a todas las longitudes de onda analíticas. Si la muestra es pura, los resultados a la λ analítica y a la longitud o longitudes de onda de confirmación, será idéntica. Si la muestra está contaminada, es muy probable que el contaminante contribuya de modo diferente a la absorbancia a las longitudes de onda analítica y de confirmación, difiriendo los resultados. En la Figura 69 se muestra un ejemplo. El análisis de confirmación también puede utilizarse para detectar si se ha medido la muestra correcta y si las medidas están fuera del rango dinámico lineal del instrumento.

Absorbancia [UA]

Cafeína

Acido salicílico

Longitud de onda [nm] Figura 69 Análisis de confirmación

Espectros completos Para resultados óptimos, deben adquirirse los espectros completos de la muestra. Estos espectros pueden superponerse con los del patrón para comprobar las

117


diferencias, o pueden utilizarse métodos matemáticos para obtener un factor de coincidencia, que indicará la similitud entre muestras y patrones. El factor de coincidencia se obtiene representando los valores de absorbancia a cada longitud de onda de la muestra, frente a los del patrón. Si los espectros son idénticos, los puntos representados estarán sobre una línea recta. La pendiente de esta línea es la relación de la concentración de la muestra a la del patrón. Si los espectros no son idénticos, los puntos no estarán en una línea recta, sino que mostrarán cierta dispersión. La Figura 70 muestra gráficos de ambos casos. En los dos, puede utilizarse regresión lineal para ajustar la mejor línea y puede calcularse el coeficiente de correlación. Este coeficiente es una medida de la similitud de los espectros de muestra y patrón. Si son exactamente iguales, el coeficiente de correlación será 1, mientras que si son completamente distintos, será próximo a 0.

Normalizado

Correlación = 0.999

Patrón

Desconocido Longitud de onda [nm]

Desconocido [mUA]

Normalizado

Desconocido Correlación = 0.056 Patrón

Longitud de onda [nm]

Desconocido [UA]

Figura 70 Gráficos comparativos de espectros similares y distintos

118


Si se utilizan espectros completos, se dispondrá de toda la información analítica para reevaluar los resultados y para determinar por qué un resultado es incorrecto.

Estadísticas Una sola medida no tiene un alto grado de validez. Todas las medidas incluyen cierta predisposición y variación aleatoria debidas al ruido. Aunque esta predisposición puede detectarse utilizando técnicas como las descritas anteriormente, el ruido también puede dar lugar a errores significativos. Siempre debe estimarse la precisión de los resultados realizando múltiples medidas y calculando la media y la desviación estándar de ésta. La desviación estándar es un indicador de la validez de una medida. Controlar los cambios de la desviación estándar con el tiempo, puede ser útil para diagnosticar muchos problemas de medida.

119


120

apéndice A

apéndice A

Exactitud y precisión

121

Exactitud y precisión

Definición de los términos

Los términos exactitud y precisión se utilizan a lo largo de esta publicación, pero no pueden ser intercambiados. Por lo tanto, es importante comprender perfectamente la diferencia entre ellos. Como analogía, la Figura 71 muestra el resultado de varios disparos de un rifle sobre una diana.

Figura 71 Ejemplo de precisión y exactitud

En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b), son precisos pero inexactos; el tirador dispara bien, pero es evidente una desviación constante. En (c), los disparos son exactos pero imprecisos: la media de los disparos estaría justo en el centro de la diana, pero cada uno de los tiros se desvía significativamente. En (d), los disparos son exactos y precisos.

122

apéndice B

apéndice B

Características de los espectrofotómetros de diodos

123


Ventajas de la espectroscopía de diodos

Como fabricante líder de espectrofotómetros de diodos, sabemos que esta tecnología ofrece considerables ventajas sobre los instrumentos convencionales de barrido. En las secciones siguientes se revisan las ventajas de la tecnología de diodos y se comentan algunas de las desventajas.

Rápida adquisición La rápida adquisición espectral hace de los espectrofotómeespectral tros de diodos la mejor opción para la medida de sistemas

Absorbancia [UA]

dinámicos, como detectores en el análisis por inyección en flujo, en control de procesos y medidas cinéticas. Por ejemplo, la Figura 72 muestra los espectros medidos a intervalos de 1 s durante una hidrólisis de sultona. Con estos datos, puede monitorizarse simultáneamente la desaparición de reactivo y la aparición de producto.

Longitud de onda [nm] Figura 72 Espectros de la hidrólisis de sultona

Para la mayoría de los usuarios de espectrofotómetros UV-visible que no trabajan con sistemas dinámicos, la rápida adquisición espectral ofrece también ventajas. Debido a su rapidez, este método permite la adquisición de espectros completos incluso cuando el análisis requiere sólo una longitud de onda. Los datos espectrales completos

124


pueden utilizarse para corregir errores (“Modelar el fondo”, página 73 y “Espectroscopía derivada”, página 75) y como información colateral para confirmar la calidad de los datos (“Espectros completos”, página 117). Finalmente, pueden obtenerse espectros completos con alta productividad para el desarrollo de métodos (vea “Desarrollo del método”, página 82) y para análisis multicomponente (vea “Análisis multicomponente”, página 21).

Medida multilongitud La mayoría de los equipos convencionales pueden realizar de onda simultánea medidas multilongitud de onda, pero deben moverse físicamente de un punto a otro del espectro, lo que necesita tiempo. Con un espectrofotómetro de diodos, todos los puntos del espectro pueden medirse simultáneamente. Por consiguiente, las medidas multilongitud de onda se realizan en el tiempo que un instrumento convencional requiere para medir a una única λ. Esto facilita el uso de varias técnicas para eliminar errores (vea “Isoabsorbancia”, página 72, “Referencia interna”, página 74 y “Corrección de tres puntos”, página 74). Además, proporciona información colateral para confirmar la calidad de datos (“Longitudes de onda de confirmación”, página 117) y mejorar la productividad del método de ecuaciones simultáneas simples (“Análisis multicomponente”, página 21). En medidas multilongitud de onda, es necesario almacenar menos datos que en medidas espectrales completas. Sin embargo, las técnicas de eliminación de errores son algo menos eficaces que las que pueden utilizarse con espectros completos. Utilizando longitudes de onda alternativas para rangos de concentración alta y baja, puede maximizarse el rango dinámico con espectrofotómetros de diodos. Los máximos de absorción pueden utilizarse para medidas de alta sensibilidad y una longitud de onda con menor absorción, en el lateral de la banda de absorción, previene de los errores debidos a la luz dispersa. Finalmente, un espectrofotómetro de diodos puede utilizarse en muchas aplicaciones en las que antes se

125


requerían los costosos equipos de doble λ (“Diseño de doble longitud de onda”, página 45).

Reselección de longitud Los equipos convencionales de barrido mecánico tienen un de onda error inherente de reselección de λ (“Exactitud y precisión de longitud de onda”, página 50) que aumenta con el tiempo según se desgastan las uniones. También son susceptibles de deriva de longitud de onda en largos periodos de tiempo. Como en los instrumentos de diodos no se mueve ninguna pieza en el cambio de λ o en el barrido, no ocurren errores mecánicos significativos, con el tiempo. Datos de todas las zonas del espectro, no afectados por errores de reselección de λ, son una ventaja para el analista. Permiten seleccionar la longitud de onda óptima para el mejor rango dinámico, sensibilidad y selectividad en el desarrollo del método (“Desarrollo del método”, página 82). Además, es esencial en técnicas de mejora de sensibilidad que utilizan promedio de λ (“Promedio de longitud de onda”, página 67), para disminuir la sensibilidad de compuestos muy absorbentes (“Absorbancia fuerte”, página 68) y para verificar la calidad de datos con λ de confirmación (“Longitudes de onda de confirmación”, página 117). Otras técnicas que utilizan datos espectrales completos son análisis multicomponente (“Análisis multicomponente”, página 72), desarrollo de métodos (“Desarrollo del método”, página 82), confirmación de calidad de datos (“Longitudes de onda de confirmación”, página 117) y espectroscopía derivada (“Derivadas de espectros”, página 6 y “Espectroscopía derivada”, página 75). Una excelente reselección de longitud de onda también asegura que las diferencias entre medidas se deben a la muestra y no a errores del instrumento. Por tanto, es posible la identificación incluso cuando los espectros son prácticamente idénticos pero exhiben una pequeña variación de λ. Además, pueden medirse espectros de patrones, almacenarlos en disco y recuperarlos días, semanas o incluso

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meses más tarde, para usarlos en análisis cuantitativo sin tener que volver a medirlos. Esto mejora la productividad, especialmente es el caso de compuestos caros, difíciles de obtener o inestables, que no pueden usarse rutinariamente.

Sensibilidad El rango dinámico de un espectrofotómetro de diodos puede ampliarse a bajos niveles de absorción. Estos instrumentos son menos complejos y tienen menos superficies ópticas que los convencionales. Por ello, la salida de luz es mayor y los niveles de ruido son inferiores. La capacidad de adquirir espectros completos rápidamente también ayuda a mejorar la sensibilidad espectral utilizando técnicas de promedio de tiempo (“Promedio de tiempo”, página 67) y promedio de λ (ver “Promedio de longitud de onda”, página 67).

Estadísticas de las Los espectrofotómetros de diodos barren tan rápidamente medidas que normalmente se realizan múltiples medidas y se promedian a la vez. Se calcula la media y la desviación estándar para cada dato. La desviación estándar es una medida de la fiabilidad de los datos y se obtiene para cada valor de absorbancia del espectro. Se suele decir que una sola medida no tiene significado estadístico.12 Sin embargo, con espectrofotómetros convencionales, obtener múltiples medidas requiere mucho tiempo. Los datos estadísticos son una valiosa herramienta para evaluar la calidad de los resultados analíticos (“Estadísticas”, página 119) y pueden también utilizarse en el desarrollo de métodos (el software de los espectrofotómetros Agilent Technologies utiliza automáticamente estos datos).

Robustez y Los espectrofotómetros de diodos son mecánicamente fiabilidad simples y no tienen, prácticamente, partes móviles. Como se desgastan o rompen pocas piezas, estos instrumentos son muy fiables. El usuario se beneficia del mínimo tiempo sin utilizar. Además, el coste de mantenimiento es menor

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que en los instrumentos convencionales, ya que los espectrofotómetros de diodos no requieren mantenimiento ni recalibración regular. Se estima que los instrumentos modernos tienen sólo un fallo cada 10 años (excluyendo cambios de lámpara).

Area abierta de muestra Debido al diseño de óptica inversa (“El espectrofotómetro de diodos”, página 39) el área de muestra de un espectrofotómetro de diodos no necesita estar cubierta, ya que el instrumento no es susceptible de interferencias de la luz ambiental. Además, este diseño aumenta la productividad facilitando el cambio de muestra y permite medir un amplio rango de tipos de muestra, ya que son menores las restricciones de tamaño. También es más fácil cambiar o añadir accesorios especiales de muestreo.

Desventajas de la espectroscopía de diodos

Como los espectrofotómetros de diodos difieren de los convencionales de barrido, han surgido muchas objeciones relativas a su rendimiento. En esta sección, se comentan.

Resolución En un espectrofotómetro convencional, la resolución puede cambiarse fácilmente variando la anchura de rendija. Sin embargo, en un espectrofotómetro de diodos, depende de un factor adicional: el intervalo de muestreo de la matriz de diodos. De hecho, este intervalo depende del número de diodos en la matriz y del rango de longitud de onda medido. Hasta hace poco, los equipos de diodos tenían algunas limitaciones al compararlos con instrumentos de 2 nm de resolución. Este problema se ha corregido en las matrices modernas, como la del Agilent 8453 (“Diseño de doble haz”, página 42), que contiene más elementos. Aunque los instrumentos de diodos no pueden alcanzar resoluciones de 0.5 nm o menos, como los convencionales, en muchos análisis puede no ser necesaria tanta resolución (“Resolución espectral”, página 46). Además, con una

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resolución tan elevada, menos luz alcanza al detector y la sensibilidad es menor. Por ejemplo, si un espectro se barre con una resolución de 0.1 nm, puede llevar mucho más de una hora obtener un espectro con buen S/N.

Luz dispersa En un instrumento de barrido secuencial, se reduce la luz dispersa colocando filtros en el paso de luz, delante del monocromador (vea “Luz dispersa”, página 51). Estos filtros deben cambiarse según la longitud de onda incidente. En un espectrofotómetro de diodos, utilizar filtros de esta manera, normalmente, límita el rango de longitudes de onda que pueden medirse simultáneamente. Por ello, los filtros se colocan sobre la propia matriz para reducir la luz dispersa. Sin embargo, como todas las λ de luz están siempre en el área del detector, la luz dispersa es más problemática que en los equipos convencionales. Hasta hace poco, los espectrofotómetros de diodos exhibían niveles más altos de luz dispersa que los convencionales. Sin embargo, el Agilent 8453 está basado en un proceso patentado que usa la capacidad de barrido rápido completo de la tecnología de diodos, para reducir significativamente la luz dispersa. Primero, se barre el espectro completo. A continuación, se coloca en el paso de luz un filtro que bloquea toda la luz por debajo de 430 nm, y se mide el espectro en la región por encima de 430 nm. La única luz detectada es la dispersa, que se resta de la primera medida, obteniéndose un espectro con la luz dispersa corregida. El proceso completo sólo dura 1.5 s (con dos medidas de 0.5 s) y reduce la luz dispersa a niveles equivalentes o mejores a aquellos obtenidos con instrumentos de barrido convencional, con un monocromador.

Descomposición de Debido a que los espectrofotómetros de diodos irradian la la muestra muestra con luz de todas las longitudes de onda, se ha argumentado que la muestra se degradará. Sin embargo, las intensidades de luz utilizadas en un instrumento de diodos

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no son mayores que las de uno convencional. Por ello, cuando se barre un espectro completo, secuencialmente, con un espectrofotómetro convencional, la cantidad total de luz (la suma de la luz a todas las longitudes de onda) a la que se somete a la muestra, es la misma que en un instrumento de diodos. Si la muestra es fotosensible, ambos instrumentos la descompondrán en la misma extensión. Alguna evidencia circunstancial indica que, en algunos casos, un instrumento de diodos puede adquirir espectros de compuestos de mayor fotosensibilidad, que no pueden obtenerse en espectrofotómetros convencionales. Cuando se mide a una longitud de onda, un instrumento convencional debería tener clara ventaja sobre un espectrofotómetro de diodos, ya que somete a la muestra a mucha menos irradiación. Sin embargo, en la práctica, los problemas de fotodegradación son extramadamente raros. En el momento de la publicación de este libro, no se conocía ningún caso documentado.

Complejidad Algunos usuarios están intimidados por los instrumentos de diodos porque creen que son muy complicados. Pero aunque el proceso interno de datos asociado con los espectrofotómetros de diodos es, por supuesto, mucho más complejo que en los instrumentos convencionales, el usuario nunca es consciente de esta diferencia. Y, mientras los espectrofotómetros de diodos generan muchos más datos que los convencionales, estos datos se manejan fácilmente con los modernos softwares. Además, los datos adicionales tienen numerosas ventajas, como se ha tratado a lo largo de este libro.

Errores en la medida de Aunque los espectrofotómetros de diodos pueden producir muestras fluorescentes resultados incorrectos cuando se miden muestras fluorescentes, los instrumentos convencionales de barrido también están sujetos a error (en “Fluorescencia”, página 79 se ofrece una explicación).

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apéndice C

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Referencias

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A

C

aberración cromática, 38 absorbancia, 3, 6, 21, 83, 105 bandas, 7, 11, 76, 77 errores de medida en, 53–54, 60– 61, 79 interferencias, 69, 70, 74 medida de errores en, 65 y color, 13 absorbancia débil, 66–68 absorbancia fuerte, 68–69, 126 ácido nítrico, 107 ácido perclórico, 103, 107, 109 ácido sulfúrico, 103 actividad enzimática, 15–16, 29 aditividad, 21, 86 Agilent 8453 espectrofotómetro, 41, 42, 109, 129 aminoácidos, 14 análisis cualitativo, 10–16 análisis cuantitativo, 16–27, 58, 64, 97, 98, 127 análisis multicomponente, 14, 21– 26, 125, 126 e isoabsorbancia, 72 anchura de banda espectral instrumental (SBW), 47–49, 110, 111, 114 anchura de banda espectral natural (NBW), 48–49 anchura de rendija, 66, 128 ángulo de aceptación, 80 arco de deuterio lámpara, 101, 107, 108 arco de mercurio lámpara, 101, 108 ASTM (American Standard Testing Methods), 107–109 autotest, 114

cloruro potásico, 104, 108, 112 coeficiente de correlación, 84, 85, 86, 118 coeficiente de extinción, 18–19, 21, 97, 98, 115 color, 13–14 confirmación longitud de onda, 117 controlador de temperatura Peltier, 64 convencional óptica, 79 corrección de tres puntos, 74 corrección Morton-Stubbs. Ver corrección de tres puntos cristal óxido de holmio, 108 cristal de densidad neutra, 98, 102, 108 filtros, 107, 112 cristal de óxido de didimio, 102 cromóforo, 10–11, 62 cuantificación de un solo componente, 20 Cubetas, 58 cubetas, 58–61 cuidado de, 61 material, 58–59 cubetas con apertura, 60, 61 cubetas de flujo, 60 cubetas rectangulares abiertas, 59 cubetas sin cubrir, 61 curva de calibración, 19, 83–85 curva de trabajo. Ver curva de calibración

D B benceno (vapor), 103, 107, 108 blanco, 38, 41, 42, 44, 46, 64, 65 británica farmacopea, 104, 106

datos colaterales, 116–119, 125 débil absorbancia, 66–68 deriva, 42, 44, 55, 68, 100, 114, 126 derivatización química, 28 desarrollo de métodos, 125 desarrollo del método, 82–94 descarga de vapor de mercurio lámpara, 107

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descomposición de la muestra, 80, 129–130 desviación estándar, 86–87, 88, 89, 90, 119, 127 detector fotodiodo, 35–36 matriz de diodos, 36–37 tubo fotomultiplicador, 35 detector de matriz de diodos, 36–37 detector fotodiodo, 35–36 detector tubo fotomultiplicador, 35 dicromato potásico, 107, 108 en ácido perclórico, 103 en ácido sulfúrico, 103 diodos espectrofotómetro, 39–40 disolución de perclorato de holmio, 107, 108, 109, 111 disolvente efecto del, 62–64 elección de, 61–62 dispersión, 84, 89, 118 dispersión Rayleigh, 70 dispersión Tyndall, 70 dispersión (scattering), 3, 9, 70–71 dispersión Rayleigh, 70 dispersión Tyndall, 70 dispositivos de dispersión, 34–35 división de haz espectrofotómetro, 44 DNA (ácido desoxirribonucléico), 14–15 doble haz espectrofotómetro, 42–43 doble longitud de onda espectrofotómetro, 45

E efecto Schlieren, 63, 64 electromagnética radiación, 3, 32 electromagnético espectro, 2 electrónica energía, 4 energía electrónica, 4 energía rotacional, 4 energía vibracional, 4

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ensayos cinéticos enzimáticos, 28 error estándar de regresión, 84 espectral resolución, 46–49 espectrofotómetro convencional, 38–39 espectrofotómetro Agilent 8453, 41, 42, 109, 129 espectrofotómetro con división de haz, 44 espectrofotómetro convencional, 38–39 espectrofotómetro de diodos, 39–40 espectrofotómetro de doble haz, 42–43 espectrofotómetro de doble longitud de onda, 45 espectrofotómetro de haz simple, 41 espectrofotómetro HP 8450A, 43, 44 espectros derivados, ??–10, 11–12, 20 espectroscopía derivada, 75–78 espejos cóncavos, 38 estabilidad, 33, 43, 45, 100 estadísticas, 119, 127 Estados Unidos farmacopea, 94, 106–107, 108 europea farmacopea, 104–106, 108, 110, 113 exactitud, 87–88, 100 longitud de onda, 50–51, 97, 101, 103, 107, 108 exactitud fotométrica, 51–54, 98, 99, 100, 108, 111 exatitud fotométrica, 108

fosforescencia, 3 fotométrica exactitud, 51–54, 98, 99, 100, 108, 111 precisión, 51–54, 98, 108 fotoquímica reacción, 3, 80 frecuencia, 3 fuentes de luz, 33–34 fuerte absorbancia, 68–69, 126

G geometría de la muestra, 65 GLP (Buenas prácticas de laboratorio), 96, 104, 109 GMP (Buenas prácticas de fabricación), 96, 104 Golay. Ver Técnica polinómica Savitzky-Golay granate de neodimio ytrio aluminio, 102

H haz simple espectrofotómetro, 41 HP 8450A espectrofotómetro, 43, 44

I F Farmacopea Alemana (DAB), 104 Farmacopea Británica (BP), 104, 106 Farmacopea de Estados Unidos (USP), 94, 106–107, 108 Farmacopea Europea (EP), 104– 106, 108, 110, 113 filtros, 35, 80, 98 cristal de densidad neutra, 107, 112 fluorescencia, 3, 79–80

identificación, 10–11, 12, 16 idoneidad del sistema, 115 incertidumbre, 84 índice de refracción, 65 interferencia, 9, 20, 28 tipos de, 69–78 intervalo de confianza, 89 inversa óptica, 40, 79, 80, 128 ioduro potásico, 103, 107, 108, 112 ioduro sódico, 103, 108, 112 ISO 9000, 96 isoabsorbancia, 72, 92

y análisis multicomponente, 72

L Lambert. Ver ley de Bouger-Lambert lámpara arco de deuterio, 33 halógena de wolframio, 33 xenon, 34 lámpara de arco de deuterio, 33, 101, 107, 108 lámpara de arco de mercurio, 101, 108 lámpara de descarga de vapor de mercurio, 107 lámpara de xenon, 34 lámpara halógena de wolframio, 33 lentes, 38 ley de Beer, 16–20, 21, 83 ley de Beer–Bouguer-Lambert, 18– 19 ley de Bouguer-Lambert, 17 límite de cuantificación (LOQ), 89– 90 límite de detección (LOD), 89–90 linealidad, 83–87, 100, 100, 107, 108 llanura de línea de base, 100, 114 longitud de onda confirmación, 126 exactitud, 50–51, 97, 101, 103, 107, 108 precisión, 50–51, 97, 101, 107 promedio, 67, 89, 126, 127 referencia, 64, 72, 74, 86 repetitividad, 50, 51 reproducibilidad, 10, 41, 51, 69, 94 reselección, 126–127 longitud de onda de confirmación, 117, 126 luz dispersa, 51–52, 98–99, 103, 105, 108, 112–113, 129

M matriz, 9, 64, 70, 78 medida de balance, 46 metal sobre cuarzo, 102, 107, 108

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método de ecuaciones simultáneas simples, 21–24, 25, 27, 91 método de mínimos cuadrados, 8, 24–25, 27, 84, 91 método de mínimos cuadrados múltiples (MLS), 26 método de mínimos cuadrados parciales (PLS), 26 métodos estadísticos, 26, 84 coeficiente de correlación, 84, 85, 86, 118 ecuaciones simultáneas simples, 21–24, 25, 27, 91 error estándar de regresión, 84 incertidumbre, 84 mínimos cuadrados, 8, 24–25, 27, 84, 91 mínimos cuadrados múltiples (MLS), 26 mínimos cuadrados parciales (PLS), 26 regresión del componente principal (PCR), 26 microcubetas, 60 monocromador, 35

N NAMAS (Servicio Nacional de Acreditación de Medidas), 96 NIST (National Institute of Standards and Technology), 41, 106–107, 108, 110, 111 nitrito sódico, 103, 112 NPL (National Physical Laboratory), 41

P patrones de emisión, 101 patrones sólidos de absorción, 101 pH, 11, 15, 29, 62–63 policromador, 39 precisión, 60, 66, 88–89, 94, 119 longitud de onda, 50–51, 97, 101, 107 precisión fotométrica, 51–54, 98, 108 prismas, 34 promedio de tiempo, 67, 89, 127 proteínas, 14

R rango, 91 rango dinámico lineal, 53–54, 58, 68, 125, 126 reacción de hidrólisis de sultona, 124 reacción fotoquímica, 3, 80 redes holográficas, 34–35 referencia longitud de onda, 64, 72, 74, 86 patrón, 97, 98 valores, 46 referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89 reflexión, 3 regresión del componente principal (PCR), 26 resolución, 105, 108, 128–129 resolución espectral, 46–49 robustez, 93, 127–128 rotacional energía, 4 ruido, 52, 66, 88, 99, 114, 119 ruido Schott, 52

O óptica, 38, 61 óptica convencional, 79 óptica inversa, 40, 79, 80, 128 óxido de holmio, 109 cristal, 102, 107 en ácido perclórico, 103, 107 óxido de samario en ácido perclórico, 103

S sales de cobalto, 103, 108 en ácido nítrico/perclórico, 107 sales de níquel, 103, 108 en ácido nítrico/perclórico, 107 selectividad, 28, 91–93, 126 señal-ruido (S/N), 9–10, 27, 67

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sensibilidad, 28, 60, 71, 89–91, 126, 127 sultona, 124

T técnica polinómica Savitzky-Golay, 9 técnicas de corrección, 78, 92, 125 análisis multicomponente, 14, 21– 26, 72, 125, 126 corrección de tres puntos, 74 espectroscopía derivada, 75–78 isoabsorbancia, 72, 92 referencia interna, 41, 55, 64, 74, 89 temperatura, 11, 14–15, 19, 29, 62– 64 tipos de cubetas, 58–60 con apertura, 60, 61 de flujo, 60 microcubetas, 60 rectangulares abiertas, 59 sin cubrir, 61 ultramicrocubetas, 60 tolueno en hexano, 104, 108, 113 transmitancia, 6, 18, 51

U ultramicrocubetas, 60

V validación del método, 94 valoraciones espectrofotométricas, 28 vibracional energía, 4

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LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV-Vis

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