LAPORAN PRAKTIKUM FARMAKOGNOSI DAN FITOKIMIA II PENENTUAN POLA KROMATOGRAM DENGAN HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) / KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT) Laboratorium PNA, 23 April 2013
DISUSUN OLEH :
KELOMPOK IV FARMASI 4B
ANNISA NURUL AZ-ZAHRA
1111102000029 1111102000029
ATHIYAH
1111102000031
TIARA APRILIA
11111020000 11111020000
HARDI MOZER
1111102000049 1111102000049
ARINI EKA PRATIWI
1111102000051 1111102000051
HAPPY RAHMA YULIN
11111020000 11111020000
SONIA ULFAH
1111102000116 1111102000116
NURKHAYATI INDRIYANI P.
1111102000
PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA 2013
BAB I PENDAHULUAN
1.1. LATAR BELAKANG
Dalam analisis senyawa pada suatu tumbuhan, mahasiswa dapat melakukan berbagai pengujian dengan berbagai parameter, salah satunya dengan pengujian parameter pola kromatogram. Pola kromatogram dapat didapatkan setelah kita melakukan pemisahan dengan metode kromatografi, diantaranya: kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi sentrifugal, kromatografi kolom, dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Metode KCKT merupakan metode yang memberikan sensifitas dan spesifitas yang tinggi, dapat memberikan hasil kualitatif maupun kuantitatif, sehingga pada praktikum ini kami akan melakukan pengujian parameter pola kromatogram dengan menggunakan KCKT. Kromatografi kinerja tinggi adalah perkembangan teknologi dari metode-metode kromatografi yang telah ada sebelumnya. Memiliki prinsip pemisahan zat-zat terlarut terpisah berdasarkan perbedaan kecepatan elusi. Dibandingkan metode lainnya KCKT memiliki berbagai kelebihan, antara lain: mampun memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi/ kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detektor, kolom dapat digunakan kembali, dan mudah melakukan sampel recovery. Kegunaan umu KCKT adalah untuk pemisahan senyawa organik, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian, analisis senyawa yang tidak mudah menguap, penentuan molekul netral, ionik, maupun zwitter ion, isolasi pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak, dan dalam skla proses industri.
1.2. TUJUAN
Mahasiswa dapat melakukan pengujian parameter pola kromatogram dengan menggunakan KCKT
1.3. MANFAAT
Mahasiswa dapat melakukan pengujian menggunakan KCKT.
Mahasiswa mendapatkan pola kromatogram dari sampel yang digunakan.
BAB II LANDASAN TEORI
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan tipe kromatografi cair yang digunakan untuk pamisahan dan analisa kuantitatif suatu bahan yang terlarut dalam suatu larutan. HPLC digunakan untuk menentukan kada senyawa katif dan spesifik dalam suatu larutan. HPLC dan kromatografi cair lainnya menggunakan prinsip dimana larutan sampel akan berinteraksi dengan fase cair kedua atau fase padat, dan zat terlarut yang berbeda-beda dalam larutan sampel akan berinteraksi dengan fase diam. Perbedaan interaksi antara sampel dengan kolom akan membantu memisahkan komponen sampel yang berbeda beda satu sama lain. Prinsip dari kromatografi adalah : 1. Retensi Retensi suatu senyawa dengan fase gerak disebut sebagai waktu retensi (Rt) atau retensi volume. Volume retensi atau elusi adalah kuantitas fase gerak yang diperlukan untuk menarik sampel melalui kolom. Waktu retensi didefinisikan berapa lama sampel tersebut berada dalam kolom fase diam relative terhadap waktu dan fase geraknya. Retensi tersebut digambarkan sebagai perbandingan kapasitas kolom yang dapat mengevaluasi efisiensi kolom. Semakin lama sampel berada dalam kolom,maka akan semakin besar faktor kapasitasnya. 2. Resolusi Resolusi adalah kemampuan kolom dalam memisahkan sampel menjadi bentuk peak yang terukur pada kromatogram dalam bentuk puncak. 3. Sensitivitas Ukuran terkecil komponen yang dapat dipisahkan dengan metode kromatografi. Sistem yang digunakan dalam kromatografi sering dikelompokkan ke dalam salah satu dari empat jenis berdasarkan mekanisme kerja, adsorbsi, partisi, pertukaran ion dan ukuran eksklusi. Adsorbsi kromatografi muncul dari interaksia antara zat terlarut dengan permukaan fase diam. Kromatografi partisi melibatkan fase diam berbentuk cair yang bercampur dengan pelarut dan dilapisi oleh suatu bahan yang inert. Kromatografi pertukaran ion memiliki fase diam ionic yang berbeda dengan ion pada sampel. Teknik yang digunakan itu berdasarkan pada ionisasi sampel tersebut. Semakin kuat muatan sampel,akan semakin
kuat pula daya tarik pada fase diamnya sehingga akan memerlukan waktu lebih lama untuk mengelusi sampel tersebut dari kolom. Ukuran eksklusi adalah yang paling sederhana, seperti skrining sampel berdasarkan ukuran molekul. Fase diam terbuat dari bahan yang ukuran porinya sudah terkontrol dengan baik. Partikel yang berukuran kecil akan terperangkap dalam kolom dan waktu elusinya akan lebih lambat dibandingkan dengan perikel yang berukuran besar. Secara umum KCKT digunakan dalam kondisi-kondisi berikut:
Pemisahan berbagai senyawa organik maupun anorganik, ataupun spesimen biologis
Analisis ketidakmurnian (impurities)
Analisis senyawa-senyawa yang tak mudah menguap (non-volatil)
Penentuan molekul-molekul netral, ionik maupun zwitter ion
Isolasi dan pemurnian senyawa
Pemisahan senyawa-senyawa dengan struktur kimia yang mirip
Pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah kecil (trace elements)
Komponen KCKT
Komponen utama dalam KCKT adalah juga komponen dalam kromatografi lainnya yaitu wadah/kemasan fase gerak, fase gerak, pompa KCKT, kolom, fase diam, detektor, dan perangkat komponen pendukung lainnya.
Wadah Fase Gerak Wadah fase gerak dalam KCKT harus terbuat dari bahan yang bersih dan inert. Wadah ini
dapat menampung sekurang-kurangnya 1-2 liter fase gerak, dan terlebih dahulu harus dibebasgaskan. Kehadiran gas dalam wadah fase gerak ini akan menimbulkan gelembung gas pada pompa dan detektor yang akan sangat mengacaukan hasil analisis.
Fase Gerak Fase gerak dalam KCKT harus berupa pelarut, buffer, ataupun reagen dengan tingkat
kemurnian yang sangat tinggi, yaitu suatu cairan yang berderajat KCKT (HPLC grade). Adanya pengotor dalam fase gerak akan menyebabkan gangguan pada sistem kromatografi. Partikel-partikel kecil yang terdapat dalam fase gerak yang kurang murni dapat mengakibatkan kekosongan kolom KCKT.
Fase gerak atau dikenal juga dengan istilah eluen umumnya merupakan campuran pelarut yang berperan dalam daya elusi dan resolusi analisis. Daya elusi dan resolusi KCKT ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat-sifat komponen dalam sampel. Secara umum ada 2 tipe fase gerak: 1. Fase gerak/eluen isokratik, yaitu eluen dengan komposisi pelarut yang tidak berubah selama percobaan kromatografi 2. Fase gerak/eluen gradien, yaitu fase gerak dengan komposisi pelarut yang berubah selama masa kromatografi Ada begitu banyak pilihan fase gerak yang dapat kita gunakan (pelarut/larutan) serta kemungkinan gradiennya akan menghasilkan kesempatan untuk mengoptimalkan pemisahan pemisahan campuran kompleks dari segi resolusi maupun waktu. Secara normal elusi isokratik akan lebih mudah dikerjakan daripada elusi gradien. Seringkali campuran pelarut merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni, namun pekerjaan optimasi berbagai komposisi pelarut untuk fase gerak secara coba-coba tentu tidak mudah dilakukan.Berdasarkan kepolaran fase gerak dibandingkan fase diamnya, fase gerak dibedakan menjadi: 1. Fase normal, yaitu fase diam lebih polar dari fase gerak. Kemampuan elusinya akan meningkat seiring peningkatan polaritas fase gerak. 2. Fase terbalik, yaitu bila fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Kemampuan elusi akan menurun seiring peningkatan kepolaran fase geraknya. Dalam KCKT dengan fase terbalik, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran larutan buffer-metabol atau campuran air-asetonitril. Sedangkan dalam fase normal sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut terklorinasi atau menggunakan pelarut jenis-jenis alkohol.
Pompa Pompa KCKT harus terbuat dari bahan yag inert terhadap fase gerak. Bahan pompa dapat
terbuat dari: gelas, baja tahan karat, teflon maupun batu nilam.Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan hingga 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak
dengan kecepatan 3 ml/menit. Untuk keperluan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan hingga 20 ml/menit. Ada 2 tipe pompa: 1. Pompa dengan tekanan konstan 2. Pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Pompa tipe ini lebih umum digunakan.
Kolom Ada 2 jenis kolom pada KCKT, yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.
Fase Diam Kebanyakn fase diam berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tak
dimodifikasi atau polimer-polimer stiren dan divinil benzena.
Detektor Detektor KCKT dikelompokkan menjadi dua golongan yaitu detektor yang bersifat
universal, yaitu detektor yang dapat mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif. Contoh detektor yang bersifat universal adalah detektor indeks bias dan spektrometri massa. Dan jenis detektor lainnya adalah detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, fluoresensi dan elektrokimia. Detektor yang ideal akan mempunyai karakteristik berikut:
Mempunyai respon terhadap analit yang cepat dan reproduksible
Mempunyai sensitivitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi analit pada kadar yang sangat kecil
Stabil dalam pengoperasiannya
Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. Untuk kolom konvensional 8 ul atau lebih kecil dan 1 ul atau lebih kecil pada kolom mikrobar.
Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi analit pada kisaran yang luas
Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak
Detektor merupakan bagian integral dari peralatan analitik kromatografi cair ini. Ada beberapa jenis detektor yang digunakan, dengan pemilihan yang umumnya didasarkan pada persyaratan sensitivitas, jenis senyawa yang ada dalam sampel, dan faktor-faktor lain seperti biaya. Detektor yang paling umum didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni. Detektor ini mampu menginderai perbedaan tersebut dan menghasilkan sinyal-sinyal listrik yang proporsional yang kemudian diperkuat dan direkam untuk
menghasilkan
kromatogram.
Batasan
utamanya
adalah
sensitivitas;
batasan
pendeteksian akan bervariasi sesuai dengan keadaan, yang umumnya sekitar satu mikrogram zat terlarut. Detektor Spektr ofotometri
Deteksi spektrofotometri umumnya hanya dalam daerah ultraviolet. Idealnya, spektrofometri yang nyata dengan pemilihan panjang gelombang yang sempurna akan memberikan fleksibilitas yang maksimal untuk mendeteksi berbagai macam zat terlarut dengan sensitivitas yang sangat baik. Detektor f lu orometri
Merupakan detektor yang didasarkan atas fluoresens. Detektor elektroki mia
Lazimnya, larutan efluen dari dalam kolom memasuki sebuah sel dimana larutan tersebut mengalir diatas permukaan sebuah elektroda yang diberi potensial pada satu harga, dimana komponen-komponen sampel mengalami reaksi transfer elektron.
Perangkat Pendukung Lainnya Perangkat pendukung lain yang digunakan dalam KCKT dapat berupa komputer,
integrator dan rekorder.
BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1. TEMPAT DAN TANGGAL
Laboratorium PNA, 23 April 2013. 3.2. ALAT DAN BAHAN o
Seperangkat alat HPLC
o
Erlenmeyer
o
Vial
o
Pipet tetes
o
Beker Glass
o
Penyaring Membran
o
Alat suntik
o
Spatula
o
Ekstrak sereh
o
Methanol
3.3. CARA KERJA
1) Penentuan kondisi alat HPLC: kolom, fase gerak, laju alir, detector, volume penyuntikan. 2) Sedikit ekstrak dimasukan ke dalam erlenmeyer untuk pengenceran, tambahkan methanol ±25 ml, kocok hingga ekstrak larut dalam methanol. 3) Siapkan alat suntik yang telah dipasang penyaring membrane, masukan ekstrak yang telah diencerkan ke dalam vial yang sebelumnya sudah dibilas dengan cairan ekstrak tersebut. Tutup vial, beri tanda. 4) Tempatkan vial pada alat HPLC. Jalankan alat. 5) Analisis pola kromatogram senyawa sampel.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. HASIL
Dilampirkan. 4.2. PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kandunan ekstrak sereh dengan menggunakan metode HPLC (high performance liquid chromatography). Prinsip kerja HPLC sebenarnya sama dengan prinsip kerja kromatografi lainnya yaitu memisahkan suatu senyawa dari suatu campuran. Cara kerja HPLC : Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detector. Kemudian cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan
cara
penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen
campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solute-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. HPLC memiliki dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Fasa gerak yang digunakan yaitu methanol, karena methanol mempunyai kepolaran yang tinggi sehingga diharapkan mampu menarik senyawa yang terkandung dalam ekstrak tersebut. Fasa diam yang digunakan berupa kolom, yang di dalamnya berisi silica yang telah dibuat menjadi bersifat non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Karena silica yang digunkan bersifat non polar sehingga senyawa yang terelusi lebih dahulu yaitu senyawa yang polar sedangkan senyawa yang non polar akan keluar lebih lama melalui kolom karena berinteraksi dahulu dengan silica, adanya gaya tarik menarik dengan gugus hidrokarbon pada silica karena adanya gaya van der waals.
Sebelum pengukuran dan identifikasi dilakukan dahulu penyiapan larutan baku dari ekstrak sereh. Pada pembuatan larutan baku ekstrak sereh, dibuat dengan melarutkan ekstrak sereh dengan menggunakan pelarut metanol. Diencerkan baku tersebut dengan konsentrasi 100 ppm. Setelah itu masukkan kedalam vial volumenya 20 µl seharusnya sebelum dimasukkan kedalam vial disaring terlebih dahulu dengan penyaring membrane 0,45µm. Digunakan
detektor
UV-Vis,
detektor
ini
mampu
memberikan
kumpulan
kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan, suatu kromatogram pada panjang gelombang yang diinginkan dapat ditampilkan. Waktu yang kita guneakan untuk HPLC yaitu 30 menit. Panjang gelombang yang kami gunakan yaitu dicari berdasarkan literature yaitu 254 nm dan 280 nm. Ketika menggunakan panjang gelombang 254 hasil kromatogram yang didapatkan jelek yaitu ada peak yang menurun. Ketika digunakan panjang gelombang 280 didapatkan satu senyawa namun waktu retensinya tidak terdeteksi karena kemungkinan kadar senyawa tersebut sangat kecil. Karena banyak kemungkinan-kemungkinan kesalahan yang terjadi. Diantaranya :
Pada saat mengencerkan larutan baku tidak sesuai dengan seharusnya yaitu 100 ppm. Sehingga detektor tidak dapat membaca atau mengetahui kandungan apa saja yang ada di dalam ekstrak sereh tersebut (human error ).
Setelah
dilakukan
pengenceran
seharusnya
disaring
terlebih
dahulu
sebelum
memasukkannya kedalam vial. Tetapi kami tidak melakukan penyaringan dan langsung dimasukkan kedalam vial. Sehingga banyak pengotor yang masih tersisa didalam vial tersebut dan banyaknya pengotor yang terdeteksi di dalamnya.
Kurangnya pengetahuan tentang panjang gelombang yang seharusnya digunakan untuk mendeteksi kandungan sereh sehingga banyak senyawa-senyawa yang tidak terdeteksi.
BAB V PENUTUP 5.1. Kesimpulan 5.1. Saran
DAFTAR PUSTAKA
Gandjar, Ibnu Gholib.2007. Kimia Farmasi Analisa. Yogyakarta: Pustaka Pelajar. Kupiec, Tom. 2004. Quality-Control Analytical Method : High Performance Liquid Chromatography. International Journal of Pharmaceytical Compounding Vol. 8. Oklahoma City Sastrohamidjojo, Harjono. 2005. Kromatografi.Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada.
