LAPORAN
PRAKTIKUM PEMISAHAN DAN PENGUKURAN
PENENTUAN KADAR PARASETAMOL DAN KAFEIN DENGAN TEKNIK HPLC
Diajukan untuk memenuhi mata kuliah Praktikum Pemisahan dan Pengukuran
Dosen Pengampu :
Dra. Soja Siti Fatimah, M.Si
Disusun oleh :
Hesti Kusumaningtyas (1307031)
Ida Khoerunnisah (1302021)
Ikhlas Fathurohman (1301508)
Jurusan Pendidikan Kimia
Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
BANDUNG
2014
Tanggal Praktikum : 17 Februari 2015
Judul Praktikum :
Penentuan Kadar Paracetamol dan Kafein dengan Menggunakan Metode HPLC (High
Performance Liquid Chromatography)
1. Tujuan
1. Dapat memahami cara kerja instrumen HPLC
2. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat , serta dapat
mengikuti manual pengoperasian HPLC.
3. Dapat menentukan/menghitung kadar parasetamol dan kafein dalam
sampel obat.
2. Tinjauan Pustaka
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan tipe kromatografi
elusi yang paling serbaguna dan digunakan secara luas. Teknih ini digunakan
oleh para kimiawan untuk memisahkan dan menentukan spesi-spesi dalam
berbagai bahan atau senyawa seperti senyawa organik, anorganik, maupun
material biologis. Pada kromatografi cair, fasa gerak merupakan pelarut
cair berisi sampel yang berupa campuran dari bahan-bahan terlarut. Jenis-
jenis kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) biasanya dikelompokkan oleh
mekanisme pemisahannya ataupun jenis
fasa diamnya. Pengelompokkan tersebut diantaranya:
a) Partisi atau Kromatografi Cair-Cair
b) Adsorpsi atau kromatografi Padat-Cair
c) Penukar Ion atau Kromatografi Ion
d) Size-Exclusion Chromatography (Kromatografi Eksklusi Ukuran)
e) Kromatografi Afinitas
f) Kromatografi Kiral
Ada dua cara pengelusian dalam kromatografi cair kinerja tinggi, yaitu
elusi isokratis dan elusi gradien. Elusi yang menggunakan pelarut tunggal
dengan komposisi tetap atau campuran beberapa pelarut ynag komposisinya
dibuat tetap disebut elusi isokratik. Sedangkan pada elusi gradien,
digunakan dua (atau kadang lebih) pelarut dalam suatu sistem yang memiliki
perbedaan kepolaran yang besar / signifikan. Perbandingan dari kedua atau
lebih pelarut ini divariasikan melalui cara yang telah ditentukan dengan
program saat pemisahan berlangsung. Pengubahan perbandingan ini kadang
dilakukan secara terus-menerus dan kadang secara bertahap. Elusi gradien
seringkali meningkatkan efisiensi pemisahan, seperti halnya pemrograman
suhu pada GC. Instrumen HPLC modern biasanya dilengkapi dengan katup yan
berpotongan sehingga dapat memasukkan cairan dari dua atau lebih reservoir
dengan perbandingan yang dapat divariasikan secara terus menerus.
(Skoog, 2004: 973-977)
Fasa gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang
sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT/HPLC, tetapi ada beberapa
sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh denganharga murah (reasonable price)
Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur
pemumiannya kembali sangat membosankandan mahal biayanya. Dari semua
persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT/HPLC
yang menggunakan pompa bolak balik(reciprocating pump) sangat diperlukan
terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang
terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di
dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data
may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila
menggunakan kolom yang sangat sensitif terhadap udara (contoh :kolom
berikatan dengan NH2).
(Effendy De Lux Putra, 2004: 7-8)
Komponen-komponen alat dalam HPLC diantaranya ialah:
Reservoir (wadah pelarut / cairan)
Pompa
Sistem injeksi sampel
Kolom, terdiri dari
1. Kolom Analitik / Kolom Utama
2. Kolom Guard
3. Termostat
Detektor
Komputer (Pengolah data)
Reservoir merupakan wadah yang menampung cairan-cairan yang akan
digunakan dalam pemisahan. Cairan-cairan tersebut berupa pelarut. Masing-
masing reservoir dihubungkan kepada katup berpotongan, dimana katup ini
berfungsi untuk mengatur cairan-cairan yang masuk / dipompa kedalam kolom.
Pelarut dimasukkan ke kolom melalui pipa atau selang menggunakan
pompa. Pelarut dipompa dari reservoir sehingga dapat membawa sampel menuju
kolom. Pompa yang digunkan dalam HPLC hatus memenuhi kriteria sebagai
berikut:
1) Harus memiliki aliran terkontrol yang 'reproducible'
2) Harus menghasilkan aliran yang 'pulse-free' (bebas pulsa, tidak
menghasilkan gelembung)
3) Hold-up volume (volume tampungan) kecil
(R.P. Budhiraja, 2004: 172)
Karena HPLC menggunakan tekanan yang cukup tinggi, mustahil sampel
dapat diinjeksikan dengan cara yang sama seperti pada kromatografi gas.
Maka dari itu, sampel dimasukkan melalui loop injector. Sampling loop dapat
diganti dan tersedia pada volume 0,5 mikroliter sampai 2 mililiter. Pada
posisi terisi, sampling loop terisolasi dari fasa gerak dan terbuka
terhadap atmosfer. Sebuah syringe dengan kapasitas beberapa kali dari loop
sampling digunakan untuk menempatkan sampel kedalam loop.
Kolom yang paling umum digunakan untuk HPLC dibuat dari stainless
steel dengan diameter internal antara 2,1 mm dan 4,6 mm dengan panjang
mulai dari sekitar 30 mm sampai 300 mm. kolom-kolom ini dipak dengan 3-10
mikrometer partikel-partikel silika berpori yang dapat berbentuk irregular
atau spherical. Kolom ini berfungsi sebagai tempat pemisahan berlangsung.
Terdapat dua masalah yang menyebabkan kolom analitik berkurang masa
hidupnya. Pertama, zat terlarut yang mengikat fasa diam secara irreversibel
menurunkan performa kolom karena fasa diam yang tersedia menjadi berkurang.
Kedua, material partikulat yang diinjeksikan bersama sampel dapat menyumbat
kolom analitik. Maka dari itu, kolom guard ditempatkan sebelum kolom
analitik untuk meminimalisasi masalah-masalah tersebut. Kolom guard
biasanya berisi material partikulat packing dan fasa diam yang sama dengan
kolom analitik, namun jauh lebih pendek dan murah. Panjangnya 7,5 mm dan
harganya satu persepuluh dari kolom analitik. Hal ini dikarenakan kolom
guard digunakan sebagai "tumbal" dan diganti secara berkala.
Selanjutnya sampel yang telah terpisahkan dibawa menuju detektor.
Detektor ini berfungsi untuk memberikan sinyal sehingga data dapat diolah
dan ditampilkan. Detektor-detektor yang dapat digunakan dalam HPLC
diantaranya:
Detektor Spektroskopi (adsorpsi sinar UV)
Detektor elektrokimia
Selain itu, ada juga detektor yang menggunakan pengukuran pada perubahan
index refraksi dari fasa gerak, namun kurang berguna untuk elusi gradien
kecuali komponen-komponen fasa gerak memiliki index refraksi yang mirip.
(Harvey David, 2000: 578-585)
Keuntungan KCKT/HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam
banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan
yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada
KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang
labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun
demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan
yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi
populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah
sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair
klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari1 jam. Banyak analisis yang dapat
diselesaikan sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit
(uncomplicated), waktu analisis kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana
interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit
berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan
rasa diam.
Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan fasa diam dan fasa
gerak
pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
Sensitivitas detektor: Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT
dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam-
macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi
jumlah sampai picogram(10-12 gram). Detektor-detektor seperti
Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga
digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali: Berbeda dengan kolom kromatografi
klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis
yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum darijenis sampel yang
diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan Ideal
untuk zat bermolekul besar dan berionik :zat – zat yang tidak bisa
dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi
untuk menganalisi spsesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion
ideal sekali untuk mengalissis zat –zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak
menyebabkan destruktif(kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh
karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah dikumpulkan setelah
melewati detector.Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali
untuk kromatografi penukarion memerlukan prosedur khusus.
(Effendy De Lux Putra, 2004: 8)
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif.
Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran
luas/area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas/area
standar. Pada prakteknya, pembandingan kurang menghasilkan data yang
akurat bila hanya melibatkan satu standar. Oleh karena itu, maka
pembandingaan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi.
Parasetamol dan kafein pada umumnya terdapat bersama sama dalam satu
tablet obat yang memiliki sifat kepolaran berbeda. Gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karaktersitik
senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom
nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar campuran beberapa pelarut.
(Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran, 2015: 1)
Paracetamol
Paracetamol secara luas digunakan untuk obat yang diperuntukan sebagai
penawar rasa sakit, demam(mengurangi temperature). Tindakan ini dikenal
sebagai analgesik dan antipiretik. Paracetamol murni berbentuk kristal
padat yang meleleh pada suhu 167-171
. Daya larut dalam air dingin adalah 1,43 g/100 cm3, tetapi jauh
lebih larut dalam air panas yakni 5 g/100 cm3 dan dalam etanol kelarutannya
14 g/100 cm3.
(Frank Ellis dkk, 2002: 1)
Kafein
Alkaloid yang mempunyai lingkar purin (lingkar senyawa heterosiklik yang
majemuk, yang merupakan kondensasi antara lingkar imidazol dan lingkar
pirimidin). Dengan rumus molekul C5H10N4O2 yang terdapat dalam biji-biji
kopi dan daun teh. Kristal kafein berbentuk jarum-jarum berwarna putih,
tidak berbau, dan berasa pahit. Kafein yang tidak mengandung kristal
mencair pada suhu 238 . Kafein larut dalam larutan pirol dan
tetrahidrofuran. Kelarutan kafein dalam air berkurang degan adanya asam-
asam organik.
(Damin Sumardjo, 2009: 447)
Asetonitril
Metil Sianida CH3CN, zat cair toksik, disediakan dari asetilena dan
amonia atau oleh dihidrasi asetamida, digunakan untuk melarutkan senyawa
organik ataupun anorganik.
(Hadyana Pudjaatmaka, 2002: 76)
Isopropil Alkohol
Propil Alkohol mempunyai rumus CH3CH2CH2OH . Isopropil alkohol merupakan
isomer propil alkohol dengan rumus (CH3)2CHOH. Banyak digunakan untuk
membuat minyak wangi, pelitur dan sebagai pelarut.
(Hadiat Moejadi,dkk, 2004: 179)
Alat dan Bahan Praktikum
1. Alat Praktikum
Perangkat HPLC 1 set
Spatula 1 buah
Labu ukur 50 mL 1 buah
Labu ukur 10 mL 6 buah
Neraca analitik terkalibrasi 1 set
Corong pendek 1 buah
Pipet tetes 2 buah
Gelas kimia 50 mL 3 buah
Ultrasonic vibrator 1 set
Pipet Ukur 1 ml 1 buah
Pipet Ukur 2 ml 1 buah
Pipet Ukur 3 ml 1 buah
Pipet Ukur 4 ml 1 buah
Pipet Ukur 5 ml 1 buah
Pipet Ukur 6 ml 1 buah
Ball Filler 1 buah
Filter Membran Selulosa Nitrat 1 set
Botol Vial 2 buah
2. Bahan Praktikum
Parasetamol p.a 25 mg
Kafein 12,5 mg
Asetonitril 30 ml
KH2PO4 420 ml
Iso propil alkohol 30 ml
Metanol secukupnya
Sampel obat Bodrex 4,1 mg
Aquades secukupnya
Aquabides secukupnya
Membran PTFE/selulosa nitrat buah
Kertas saring 1 buah
3. Prosedur Kerja Praktikum
1. Pembuatan fasa gerak (Pelarut).
Sebanyak 420 mL KH2PO4- 0,01 M, ditambahkan metanol 20 mL, ditambahkan
asetonitril 30 mL, ditambahkan isopropil alkohol 30 mL, disaring
menggunakan membran whatman filter PTFE 0,2 μm, disonikasi selama 30 menit.
(Larutan Fasa Gerak sudah tersedia)
2. Pembuatan larutan induk parasetamol
Ditimbang seksama sejumlah 25 mg Parasetamol p.a dan 12,5 mg
kafein p.a dimasukkan kedalam labu 50 mL
Tambahkan pelarut sebanyak 20 mL, disonikasi selama 15 menit,
diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda batas..
Hitunglah konsentrasi larutan induk untuk parasetamol dan
kafein
3. Pembuatan deret larutan standar parasetamol + kafein
Pipet larutan induk parasetamol dan kafein masing-masing sebanyak
1 ; 2 ; 3 ; 4 ;5 dan 6 mL, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL.
Tambahkan pelarut(fasa gerak yang tersedia)hingga tanda batas
Lakukan sonikasi selama 5 menit.
Dilakukan degassing apabila masih terdapat gelembung dalam larutan
Injeksikan ke sistem HPLC dengan volume penyuntikan 20 μl
Selanjutnya dibuat kurva kalibrasi
4. Pembuatan larutan sampel obat bodrex
Tentukan berat rerata tablet(10 tablet)
Menimbang 4,1 mg, dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL, ditambahkan
pelarut(aquabides) hingga setengah volume labu ukur), disonikasi
selama 5 menit,
Encerkan dengan pelarut(aquabides) hingga garis tanda, dikocok
lalu disaring menggunakan kertas saring
Dipindahkan ke dalam botol vial
Kemudian proses melakukan penyaringan kedua menggunakan membran
whatman PTFE 0,2 μm (filtrat pertama dibuang(digunaakan untuk
membilas filter/injektor, kemudian ditampung filtrat selanjutnya).
Injeksikan sampel obat ke dalam HPLC.
5. Penyiapan Instrumen HPLC
Kondisi Analisis parasetamol dan kafein
Fasa gerak : KH2PO4 0,01 M 420mL, 20 ml metanol, 30
asetonitril 30 mL isopropil alkohol
Kolom (fasa diam) : C-18 (15 cm)
Panjang gelombang : 215 nm
Laju alir : 1 mL/menit
Volume injeksi : 20 µL
Pastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar.
Tekan tombol "ON" pada sakelar listrik.
Isi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan
botol penampung.
Tekan tombol "ON" pada alat, berturut-turut untuk power, detektor
dan pompa.
Lakukan pemrograman alat dengan computer.Ikuti langkahnya sesuai
instruksi dalam komputer.
Pilihlah mode yang akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi
instrumen.
Alirkan fasa gerak.
Apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah
menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan.
Injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi
terendah), dan terakhir larutan sampel
Cetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya.
Setelah selesai digunakan, matikan pompa dengan menyoroti tanda
pompa dalam computer.
Tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan computer.
Untuk mematikan, tekan tombol "Off" pada pompa, detector dan power
secara berurutan. Putuskan sambungan listrik.
6. Perhitungan hasil analisis
Dari hasil operasi instrumen akan diperoleh kurva kalibrasi. Bila kurva
kalibrasi diperoleh dengan koefisien regresi > 0,997 anda boleh melanjutkan
perhitungan kadar parasetamol dalam sampel. Hitunglah kadarnya dalam satuan
% b/b. Bila tidak diperoleh kurva yang linier, maka lakukan diskusi untuk
mencari penyebabnya.
Hasil dan Analisis Data
Tabel Penimbangan 1 Tablet Obat Bodrex
"No "Berat Setiap 1 Tablet"
" "Obat Bodrex "
" "0,8321 g "
" "0,8530 g "
" "0,8407 g "
" "0,8326 g "
" "0,8350 g "
" "0,8315 g "
" "0,8418 g "
" "0,8568 g "
" "0,8321 g "
" "0,8427 g "
"Rata-"0,84016 g "
"rata " "
Sampel Obat
"Diduga zat yang terkandung"Waktu Retensi "Luas "
" "(menit) "Area "
"Paracetamol "2.38 "11705288"
"Kafein "3.62 "2164128 "
Deret Standar Paracetamol
"Konsentrasi (ppm) "Luas "Waktu Retensi (menit) "
" "Area " "
"50 "2252106 "2.38 "
"100 "4239085 "2.38 "
"150 "6208253 "2.38 "
"200 "7979072 "2.38 "
"250 "10093086"2.39 "
"300 "12261550"2.38 "
Berdasarkan data hasil percobaan, luas area kandungan sampel yang diduga
paracetamol (11705288), berada pada rentang deret standar paracetamol
(10093086-12261550). Sehingga kadar paracetamol dapat dihitung
menggunakan persamaan garis
y = 39646 x + 234188
Sehingga,
y = 39646 x + 234188
11705288 = 39646 x + 234188
x =
x = 289,3381 ppm
mg paracetamol = ppm V (L)
= 289,3381 ppm 0,01 L
= 2,8934 mg
Bobot sampel = 4,1 mg
Berat Rata- rata penimbangan obat bodrex = 840,16 mg
Kadar mg Paracetamol dalam Hasil percobaan
Deret Standar Kafein
"Konsentrasi (ppm)"Luas "Waktu Retensi (menit) "
" "Area " "
"25 "2164416 "3.64 "
"50 "4252400 "3.62 "
"75 "6242196 "3.6 "
"100 "7989484 "3.58 "
"125 "10033548"3.59 "
"150 "12097707"3.56 "
Berdasarkan data hasil percobaan luas area kandungan sampel yang diduga
kafein (2164128) berada di luar rentang deret standar kafein ( < 2164416),
sehingga kadar kafein dalam sampel dihitung menggunakan perbandingan
standar dengan sampel, yaitu konsentrasi dan luas areanya.
=
[Sampel] =
[Sampel] =
[Sampel] = 24,9967 ppm
Mg kafein = ppm V (L)
= 24,9967 ppm 0,01 L
= 0,2500 mg
Kadar mg Kafein dalam Hasil percobaan
Percobaan kali ini bertujuan untuk menentukan kadar paracetamol dan
kafein dalam sampel obat menggunakan instrumen HPLC (High Performance
Liquid Chromatography). Prinsip dasar HPLC yaitu berdasarkan perbedaan
distribusi komponen-komponen dalam sampel di antara dua fase, fase gerak
dan fase diam. Fase gerak yang digunakan berupa campuran senyawa KH2PO4,
methanol, asetonitril, dan isopropyl alkohol dengan perbandingan 42 : 2 : 2
: 3. Sedangkan fase diam yang digunakan adalah kolom C-18 yang bersifat non
polar. Oleh karena itu percobaan kali ini menggunakan metode HPLC fase
terbalik, karena fase gerak yang digunakan bersifat polar sedangkan fase
diamnya bersifat non polar, dengan sistem elusi isokratik, artinya selama
analisis digunakan fase gerak dengan perbandingan pelarut yang tetap.
Dalam preparasi sampel, sampel ditimbang kemudian dilarutkan
menggunakan aquabidest. Digunakan aquabidest karena dalam analisis
menggunakan HPLC diperlukan pelarut dengan kemurnian yang tinggi, sebab
larutan sampel yang akan dianalisis jumlahnya sangat sedikit (sekitar 20µl)
sehingga apabila digunakan pelarut dengan kemurnian kurang akan dapat
mengganggu hasil pemisahan. Sebelum pengenceran sampel sampai 10 ml,
dilakukan sonikasi terlebih dahulu agar semua komponen dalam sampel larut
dan homogen. Setelah diencerkan sampai 10 ml secara kuantitatif, larutan
sampel disaring sebanyak dua kali. Penyaringan pertama dilakukan
menggunakan kertas saring kasar. Hal tersebut dilakukan karena dalam obat
tidak hanya mengandung paracetamol dan kafein, namun terdapat zat penyusun
lain yang belum larut seluruhnya yang masih berupa partikel-partikel padat
dalam larutan. Selanjutnya filtrate disaring kembali menggunakan membran
selulosa nitrat agar diperoleh larutan sampel murni tanpa ada partikel-
partikel pengganggu /pengotor yang dapat mempengaruhi hasil pemisahan.
Apabila langsung dilakukan penyaringan menggunakan membran selulosa nitrat,
dikhawatirkan partikel-partikel yang tidak larut dalam larutan sampel akan
menyumbat pori-pori membran sehingga penyaringan akan membutuhkan waktu
yang lama. Sebelum ditampung, sebagian filtrat dibuang terlebih dahulu yang
dimaksudkan untuk membilas membran agar dapat dipastikan tidak ada zat
kontaminan dari membran yang dapat ikut tertampung.
Analisis pada percobaan kali ini adalah analisis kualitatif dan
kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan waktu
retensi komponen dalam sampel dengan waktu reteensi standar. Puncak yang
akan muncul pada kromatogram adalah puncak komponen paracetamol terlebih
dahulu. Hal tersebut dapat ditentukan berdasarkan struktur kimia dari
masing-masing komponen.
Gambar Struktur Paracetamol
Gambar Struktur Kafein
Dapat dilihat bahwa paracetamol memiliki gugus hidroksi (-OH) yang dapat
membentuk ikatan hidrogen dengan air sehingga lebih mudah larut dalam air
atau senyawa polar lainnya sedangkan kafein memiliki struktur yang relatif
lebih non polar dibandingkan dengan paracetamol sehingga akan tertahan
lebih lama di kolom yang sifatnya non polar.
Pada analisis kuantitatif, dilakukan perhitungan kadar paracetamol dan
kafein dalam sampel berdasarkan luas area puncak menggunakan metode kurva
kalibrasi larutan derat standar yang dibuat dari pengenceran 1-6 ml larutan
induk paracetamol 500 ppm dan kafein 250 ppm dalam 10 ml larutan. Kadar
analit dapat ditentukan dengan menghitung konsentrasi analit menggunakan
persamaan garis y = mx + b yang diperoleh dari kurva kalibrasi deret
standar. Namun, apabila luas area puncak analit tidak masuk dalam area
deret standar maka digunakan perbandingan konsentrasi dan luas area deret
standar dengan sampel.
Sebelum dilakukan pemisahan, instrument HPLC harus dikondisikan pada
keadaan optimal agar hasil pemisahan yang didapatkan baik. Kemudian baik
sampel maupun deret standar, sebelum diinjeksikan ke dalam HPLC perlu
dilakukan degassing untuk menghilangkan gelembung udara karena gelembung
udara dapat terkumpul di kepala pompa ataupun detektor sehingga akan
mengganggu kondisi HPLC.
Berdasarkan data pengamatan, diperoleh kadar paracetamol dan kafein
dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070 mg/tablet dan 51,2293
mg/tablet. Hasil tersebut mendekati data kadar yang tercantum pada kemasan
obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan kafein sebanyak 50
mg/tablet.
Kesalahan-kesalahan yang mungkin terjadi selama analisis pada
percobaan ini di antaranya, masih terdapat sisa sampel yang telah ditimbang
yang tidak ikut dilarutkan sehingga kadar yang diperoleh kurang akurat,
masih terdapat gelembung setelah dilakukan penginjeksian, atau
pengoperasian instrument yang kurang tepat sehingga mempengaruhi hasil
kromatogram yang akan didapat.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang telah dilakukan, diperoleh kadar
paracetamol dan kafein dalam sampel obat masing-masing sebesar 592,9070
mg/tablet dan 51,2293 mg/tablet. Hasil tersebut mendekati kadar yang
tercantum pada kemasan obat yaitu paracetamol sebanyak 600 mg/tablet dan
kafein sebanyak 50 mg/tablet.
Daftar Pustaka
Budhiraja, R.P. (2004). Separation Chemistry. New Delhi: New Age
International (p) Ltd.
David, Haervey. (2000). Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill
De Lux Putra, Effendy. (2004). Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam
Bidang Farmasi Jurnal, hlm. 5-8.
Ellis, Frank dkk. (2002). Paracetamol-a curicullum resource. United Kingdom
:
Royal Society of Chemistry
Moejadi, Hadiat. (2004). Kamus Sains . Jakarta : Balai Pustaka
Pudjaatmaka, Hadyana. (2002). Kamus Kimia. Jakarta : Balai Pustaka
Skoog, dkk. (2004). Fundamentals of Analytical Chemistry. USA: Thomson
Brooks/Cole
Sumardjo, Damin. (2009). Pengantar Kimia Buku Panduan Kuliah Mahasiswa
Kedokteran. Jakarta : EGC
Tim Dosen Praktikum Pemisahan dan Pengukuran. (2015). Instruksi Kerja
Penentuan Kadar Parasetamol dan Kafein dengan Teknik HPLC. Bandung: UPI
Lampiran
Langkah Kerja & Tabel Pengamatan
"No "Langkah Kerja "Data Pengamatan "
"1. " " -Fasa Gerak "
" " "Sudah "
" " "disediakan "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " "-Fasa Gerak : "
" " "Cairan Tidak "
" " "Berwarna "
"2. "Pembuatan Larutan Induk Paracetamol & Kafein" "
" " " "
" " " "
" " "-Paracetamol : "
" " "Serbuk berwarna "
" " "putih keruh "
" " " "
" " "-Kafein : Serbuk "
" " "berwarna putih "
" " "keruh "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " "-Fasa Gerak : "
" " "Cairan tidak "
" " "berwarna "
" " "-Disonifikasi agar "
" " "larutan menjadi "
" " "homogen "
" " " "
" " "-Larutan Induk "
" " "Paracetamol + "
" " "kafein : Tidak "
" " "berwarna "
" " " "
" " "- Konsentrasi "
" " "Paracetamol : 500 "
" " "ppm "
" " "- Konsentrasi "
" " "Kafein : 250 ppm "
"3. "Pembuatan Deret Larutan Standar Kafein & " "
" "Paracetamol " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " " "
" " "-disonifikasi agar "
" " "homogen "
" " "- didegasing dengan"
" " "membuka tutup labu "
" " "ukur,agar gelembung"
" " "yg ada dapat hilang"
" " "- deret larutan "
" " "standar = tidak "
" " "berwarna "
" " " "
"4. "Pembuatan Larutan Sampel " "
" " "-Obat Bodrex : "
" " "Serbuk Berwarna "
" " "jingga "
" " "- Data Sampel Obat "
" " "pada kemasan "
" " "mengandung "
" " "paracetamol 800 mg "
" " "dan kafein 50 mg "
" " " "
" " "-Rata-rata berat "
" " "penimbangan sampel "
" " "obat = 0,84016 g "
" " "-Berat Kertas "
" " "Timbang = 0,1219 g"
" " "- Hasil penimbangan"
" " "Kertas Timbang + "
" " "Sampel Obat = "
" " "0,1260 g "
" " "- Massa Obat = "
" " "0,0041 g/ 0,41 mg "
" " "- Pelarut = "
" " "Aquabides "
" " " "
" " "- Larutan sampel "
" " "saat penambahan "
" " "hingga setengah "
" " "volume labu ukur = "
" " "berwarna jingga "
" " "- Larutan sampel "
" " "saat ditanda "
" " "bataskan = tidak "
" " "berwarna "
" " " "
" " " "
" " "-Kertas Saring = "
" " "Berwarna Putih "
" " " "
" " " "
" " "-Membran Selulosa "
" " "Nitrat = Berwarna "
" " "Putih "
" " "- Volume yg "
" " "diinjeksikan = 20 "
" " "L "
"5. "Penyiapan Instrumen HPLC " "
" "Kondisi Analisis Paracetamol & Kafein " "
Perhitungan
Pembuatan Larutan Induk
Larutan Induk
Larutan Deret Standar Paracetamol
a. 1 ml larutan induk
b. 2 ml larutan induk
c. 3 ml larutan induk
d. 4 ml larutan induk
e. 5 ml larutan induk
f. 6 ml larutan induk
Larutan Deret Standar Kafein
a. 1 ml larutan induk
b. 2 ml larutan induk
c. 3 ml larutan induk
d. 4 ml larutan induk
e. 5 ml larutan induk
f. 6 ml larutan induk
Lampiran Foto Selana Praktikum
1. Alat yang dibutuhkan selama praktikum
2. Pelarut/ Fasa Gerak
3. Pelarut/ Aquabides
4. Instrumen HPLC
5. Instrumen HPLC tampak samping
6. Penimbangan Sampel untuk membuat larutan Induk dan Larutan sampel
7. Sampel Obat Bodrex
8. Data pnimbangan 10 tablet obat bodrex
9. Penambahan pelarut(aquabides/ fasa gerak)untuk membuat larutan induk,
larutan sampel
10. Hasil pembuatan deret larutan standar 1 mL;2 mL; 3 mL;4 mL ; 5 mL ; 6
mL
11. Hail penambahan pelarut (aquabides) pada sampel obat, hingga setengah
volume ukuran labu ukur
12. Proses Sonifikasi pada Ultrasonic Vibrator
13. Larutan Sampel Obat
14. Penyaringan Sampel Obat menggunakan kertas saring
15. Hasil Penyaringan menggunakan kertas saring
16. Penyaringan kedua menggunakan membran selulosa nitrat
17. Hasil penyaringan menggunakan membran selusosa nitrat
18. Penginkjeksian Deret larutan standar/ Larutan sampel
19. Deret Larutan Standar/ Larutan sampel siap diinjeksikan, sudah tidak
terdapat gelembung dalam syringe.
20. Proses Penginjeksian
21. Hasil Pemisahan ditunjukan dalam bentuk kromatogram dalam komputer
-----------------------
-diambil 420 mL KH2PO4 0,01 M pada gelas kimia
- ditambahkan Metanol 20 mL
- ditambahkan Asetonitril 30 mL
- ditambahkan Isopropil Alkohol 30 Ml
- disaring menggunakan membran whatman filter PTFE 0,2 m
- disonifikasi selama 30 menit
Kafein
Paracetamol
Fasa Gerak (Pelarut)
Pembuatan Fasa Gerak (Pelarut)
- ditimbang sebanyak 25 mg
- keduanya dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL
- ditambahkan pelarut (fasa gerak)
- disonifikasi selama +/- 5 menit
- diencerkan dengan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas
- disonifikasi selama 5 menit
- dihitung konsentrasi larutan induk paracetamol & kafein
Konsentrasi Larutan Induk
Larutan Induk Kafein + Paracetamol
Kafein + Paracetamol
- ditimbang sebanyak 12,5 mg
Larutan Induk Kafein + Paracetamol
- dipipet sebanyak 1ml;2ml;3ml;4ml;5ml;6ml
- dimasukkan masing-masing ke dalam labu ukur 10 ml
- ditambahkan pelarut (fasa gerak) hingga tanda batas
- disonifikasi selama 5 menit
- didegasing
Deret Larutan Standar
- diinjeksikan larutan sebnayak 20 L
- dibuat kurva kalibrasi
Kurva Kalibrasi
Sampel Siap untuk Diinjeksikan
- 1ml filtrat dibuang (digunakan untuk membilas injeksi, botol vial)
- 1 ml berikutnya ditampung
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
- siap untuk diinjeksikan
Hasil Filtrat
- ditambahkan pelarut hingga setengah volume labu ukur
- disonifikasi selama 5 menit
- ditambahkan pelarut hingga tanda batas
- dikocok
- disaring menggunakan kertas saring
- ditentukan berat rata-rata tablet obat
- ditimbang sebanyak 4 mg
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
Labu Ukur 10 ml
Serbuk Tablet Obat
- ditampung dalam botol vial
- disaring menggunakan membran selulosa nitrat
- dimasukkan ke dalam ukur 10 mL
Hasil Filtrat ke-2
Fasa Gerak
- dipastikan kabel penghubung listrik telah tersambung dengan benar
- ditekan tombol "on" pada sakelar listrik
- diisi botol fasa gerak dengan volume yang memadai dan kosongkan botol
penampung
- ditekan tombol o+eÚÛc µ · å æ
-_Œ?Ž– º¿n pada alat, berturut-turut untuk power, detektor dan pompa
-dilakukan pemrograman alat dengan komputer, ikuti langkahnya sesuai
instruksi dalam komputer
-dipilih mode yg akan digunakan sesuai dengan parameter kondisi instrumen
- dialirkan fasa gerak
- apabila respon kromatogram tidak muncul lagi, artinya alat telah
menunjukkan base line yang mendatar, maka instrumen siap digunakan
- injeksikan berturut-turut larutan standar (mulai dari konsentrasi rendah)
dan terakhir larutan sampel
- dicetak hasil pengukuran, catat kondisi percobaannya
- setelah selesai digunakan, dimatikan pompa dengan menyoroti tanda pompa
dalam komputer
- tutup file sesuai petunjuk, lalu matikan komputer
- untuk mematikan, tekan tombol off pada pompa, detector dan power secara
berurutan
-putuskan sambungan listrik
Preparasi Sistem HPLC
- panjang 15 cm
- C-18
- panjang gelombang 215 nm
- laju alir 1 ml/menit
-Volume injeksi 20 L
Kolom (Fasa Diam)
- KH2PO4 0,01 M 420ml
- 20 ml metanol
- 30 ml asetonitril
- 30 ml Iso Propil Alkohol
Analisis dilakukan oleh operator dan praktikan
