[UJI AKTIVITAS AMILASE] AMILASE]
20 April 2015
LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA II UJI AKTIVITAS AMILASE DARI BUAH NANAS KELOMPOK IV SIFT A SENIN, 20 April 2015
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
Fakultas Farmasi
Page 1
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
Kelompok IV Penyusun :
Nama
Npm
Liza Fauziyyah K
260110130018 ( pembahasan hasil)
Pratiwi Sri A
260110130019 (Metode, data pengamatan)
Hengki Sutrisno
260110130021(pendahuluan)
Sri Wahyuni
260110130022 (editor, simpulan)
Astri Sherly I
260110130023 (pembahasan prosedur)
Farianti Eko N
260110130024 (Abtrak)
Fakultas Farmasi
Page 2
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
Uji Aktivitas Amilase dari Buah Nanas Ananas comosus L.
Liza Fauziyyah Koswandy, Pratiwi Sri Anggrawati, Hengki Sutrisno, Sri Wahyuni, Astri Sherly Inggriani, Farianti Eko Nurkhasanah Jurusan Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
ABSTRAK Pada percobaan uji aktivitas enzim amylase dilakukan dengan sampel fraksi buah nanas dan larutan pati yang telah digelatinisasi sebagai substranya. Enzim amylase adalah suatu enzim yang dapat memutusakan ikatan glikosidik (α14) di antara satuan glukosa yang membentuk polimer, seperti pati. Hasil hidrolisis pati oleh amilase adalah glukosa. Untuk mengetahui ada tidaknya aktivitas enzim amylase pada fraksi, dapat ditentukan dengan metode Caraway — Somogyi menggunakan larutan iodin/kalium iodida. Metode ini menggunakan spektrofotometer yang mengukur penurunan absorbansi pati yang terjadi karena aktivitas amilase yang mendegradasi pati pada ikatan glikosidiknya. Pertama – tama dilakukan pengukuran absorbansi dari larutan standar pati untuk mendapatkan kurva bakunya. Kemudian dilakukan pengukuran sampel yaitu larutan pati yang telah ditambahkan fraksi sebagai enzim amilasenya. Untuk mengetahui kondisi optimum kerja enzim amylase maka pengukuran sampel (fraksi) dilakukan dengan variasi kondisi, seperti temperature dan pHnya berbeda beda. Nilai absorbansi sampel yang telah dilakukan pemanasan pada suhu 37 0C sebesar 1.999 sedangkan pada suhu 57 0C sebesar 1,352. Pada variasi kondisi dengan variasi pH absorbansi sampel sebesar 1,238 dengan kondisi pH 3,5 dan pada kondisi pH 5,6 nilai absorbansinya sebesar 1,239. ABSTRACT In the experiment amylase enzyme activity test conducted with a sample fraction of pineapple and starch solution which has digelatinisasi as substranya. Amylase enzyme is an enzyme that can memutusakan glycosidic bond (α1 4) in the glucose unit forming the polymer, such as starch. Results of starch hydrolysis by amylase is glucose. To determine the presence or absence of amylase enzyme activity in fractions, can be determined with Caraway-Somogyi method using a solution of iodine / potassium iodide. This method uses a spectrophotometer which measures the absorbance decrease in starch that occurs due to the activity of amylase which degrades starch at glikosidiknya bond. First -tama measured absorbance of standard solution of starch to obtain the raw curve. Then measuring the sample is a solution of starch which has been added as an enzyme fraction amilasenya. To determine the optimum conditions, the action of the enzyme amylase sample
Fakultas Farmasi
Page 3
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
measurement (fraction) is done with a variety of conditions, such as temperature and different pH. Absorbance value of the samples that have been performed by heating at a temperature of 370C 1999 while at a temperature of 570C for 1,352. In the variation of conditions with variations in the sample absorbance of 1.238 pH with pH 3.5 and at pH 5.6 absorbance value of 1.239.
Pendahuluan
Amilase (alfa, beta, glukoamilase) merupakan enzim yang penting dalam bidang pangan dan bioteknologi. Amilase mengacu pada sekelompok enzim katalis yang berfungsi untuk menghidrolisis gula dan pati. Amilase mencerna karbohidrat (polisakarida) menjadi unit-unit disakarida yang lebih kecil dan mengubahnya menjadi monosakarida seperti glukosa Amilase dapat diperoleh dari berbagai sumber seperti tanaman, binatang dan mikroorganisme. Enzim pada umumnya diproduksi oleh mikroorganisme melalui proses fermentasi. Amilase yang berasal dari mikroorganisme banyak digunakan dalam industri, hal ini dikarenakan mikroorganisme periode pertumbuhanya pendek. Amilase pertama kali yang diproduksi adalah amilase yang berasal dari fungi pada tahun 1894 (Oliveira, 2004). Amilase adalah enzim yang mengkatalisis pe mecahan pati menjadi gula. Enzim amilase terbagi menjadi α-Amilase, β-Amilase, γ-Amilase. Enzim Amilasemerupakan komponen yang sangat penting pada proses pencernaan makanan.Enzim ini mengubah karbohidrat menjadi gula
Fakultas Farmasi
yang pada akhirnya diubahmenjadi ATP(Sumardjo 2008). Enzim amilase yang terkandung dalam salivadapat menghidrolisis ikatan 1,4-glikosidik yang terdapat dalam amilummenghasilkan dextrin, maltosa, dan sejumlah kecil glukosa dengan konfigurasigula (Endah dan Nafizah 2011). Menurut Biogen (2008), secara umum amilase dibedakan menjadi tiga berdasarkan hasil pemecahan dan letak ikatan yang dipecah, yaitu:
Enzim alfa-amilase merupakan endoenzim yang memotong ikatan alfa-1,4 amilosa dan amilopektin dengan cepat pada larutan pati kental yang telah mengalami gelatinisasi. Proses ini juga dikenal dengan nama proses likuifikasi pati. Produk akhir yang dihasilkan dari aktivitasnya adalah dekstrin beserta sejumlah kecil glukosa dan maltosa. Alfaamilase akan menghidrolisis ikatan alfa-1-4 glikosida pada polisakarida dengan hasil degradasi secara acak di
Page 4
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
bagian tengah atau bagian dalam molekul.
Enzim beta-amilase atau disebut juga alfa-l,4glukanmaltohidrolas E.C. 3.2.1.2. bekerja pada ikatan alfa-1,4-glikosida dengan menginversi konfigurasi posisi atom C(l) atau C nomor 1 molekul glukosa dari alfa menjadi beta. Enzim ini memutus ikatan amilosa maupun amilopektin dari luar molekul dan menghasilkan unit-unit maltosa dari ujung non-pereduksi pada rantai polisakarida. Bila tiba pada ikatan alfa-1,6 glikosida aktivitas enzim ini akan berhenti. Enzim beta-amilase banyak ditemukan pada tanaman tingkat tinggi, seperti gandum, ubi, dan kacang kedelai. Disamping itu, betaamilase juga dapat ditemui pada beberapa mikroorganisme, antara lain Pseudomonassp, Bacillus sp, Streptococcus sp, dan Clostridium thermosulfurigenes.
Glukoamilase dikenal dengan nama lain alfa-1,4- glukan glukohidrolase atau EC 3.2.1.3. Enzim ini menghidrolisis ikatan glukosida alfa-1,4, tetapi hasilnya beta-glukosa yang
Fakultas Farmasi
20 April 2015
mempunyai konfigurasi berlawanan dengan hasil hidrolisis oleh enzim alfaamilase. Selain itu, enzim ini dapat pula menghidrolisis ikatan glikosida alfa-1,6 dan alfa-1,3 tetapi dengan laju yang lebih lambat dibandingkan dengan hidrolisis ikatan glikosida a1,4. Molekul pati mempunyai struktur tiga dimensi berupa spiral, dalam struktur ini molekul pati dapat mengikat molekul iodium secara fisik, dengan cara menempatkan iodium tersebut ke dalam spiral, sehingga kompleks tersebut berwarna biru. Bila larutan dipanaskan, struk tur spiral akan hilang sehingga molekul pati tidak dapat lagi mengikat iodium (Almatsier 2010). Prinsip uji percobaan ini adalah untuk mengetahui hidrolisis pati matang melalui uji Iod danBenedict serta mengetahui titik akromatiknya (Mark 2000). Pati matang yangdigunakan merupakan pati yang sebelumnya sudah mengalami pemanasan.Enzim tersusun oleh protein, sehingga sangat peka terhadap suhu. Padasuhu optimum amilase dapat menjalankan fungsinya mengubah amilum menjadimaltose. Amilum dan dekstrin yang molekulnya masih besar dengan iodiummenimbulkan warna biru, dekstrin-dekstrin memberi warna coklat kemerahan.Sedangkan dekstrin-
Page 5
20 April 2015
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
dekstrin yang molekulnya sudah kecil dan maltosa tidak memberi warna dengan iodium (Winarno 2002).
METODE
Suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat akan tetapi kenaikan suhu dapat menyebabkan terjadinya proses denaturasi serta mengurangi kecepatan reaksi. Suhu optimum yaitu suhu yang menyebabkan terjadinya reaksi kimia dengan kecepatan paling besa (Rinawati, 2009)
praktikum ini adalah tabung reaksi,
Daya katalis enzim akan menjadi rendah maupun tinggi karena terjadinya denaturasi protein. Enzim mempunyai gugus aktif yang bermuatan positif dan negatif. Aktivitas enzim akan optimum jika terdapat keseimbangan antara kedua muatannya. Pada keadaan asam, muatannya cenderung positif dan pada keadaan basa muatannya cenderung negatif sehingga aktivitas enzimnya menjadi berkurang dan bahkan menjadi tidak aktif. (Rinawati, 2009)
praktikum
Alat
Alat-alat
yang
digunakan
dalam
beaker glass, batang pengaduk, gelas ukur, pipet tetes, mikropipet, tip, timbangan digital, spektrofotometer, buret. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam ini adalah
pati
larut,
kalium dihidrogen fosfat, dikalium hidrogen fosfat, HCl 10%,
iodin,
kalium iodida. Pembuatan Pereaksi
Pada pembuatan Larutan pati larut 1%, 1 g pati larut dilarutkan dengan aquadest dalam labu ukur 100 mL(konsentrasi 10 mg/mL). Dibuat pereaksi larutan HCl 10% dengan cara dimasukkan 10 mL HCl
Larutan substrat yang digunakan adalah amilum, karena antara amilum dan amilase memiliki hubungan dalam proses pencernaan. Amilase akan menghidrolisis amilum menjadi maltosa. Penambahan HCl pada larutan substrat – ini sebagai pemberi elektrolit Cl agar aktivitas dari ptialin meningkat. (Rinawati,2009).
pekat ke dalam labu ukur 100 mL yang telah berisi 50 mL aquades, volume digenapkan hingga 100 mL dengan aquades. Pereaksi selanjutnya dibuat Larutan iodin-kalium iodida (iodin Lugol) yang didalam larutan 5% terdiri atas iodin 5 % dan KI 10% dicampur
dalam
aquades
dan
kandungan iodin total yang dimiliki sebanyak 126,5 mg/mL. Pereaksi
Fakultas Farmasi
Page 6
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
larutan bufer fosfat 0,1 M pH 3,5
hingga 1000 mL dengan aquades.
dibuat dengan dilarutkan 13,6 g
Dan yang terakhir pereaksi larutan
kalium
dalam
dapar amonium klorida pH 9,5 dibuat
900mL aquades. Cek pH dan atur pH
dengan dilarutkan 33,5 g amonium
hingga dicapai pH 3,5 dengan asam
klorida dalam 150 mL aquades,
fosfat, kemudian diencerkan hingga
ditambahkan
1000 mL dengan aquades. Pereaksi
diencerkan hingga 250 mL dengan
larutan bufer fosfat 0,1 M pH 4,5
aquades. Lalu disimpan dalam wadah
dilakukan dengan dilarutkan 13,6 g
polietilen.
dihidrogen
fosfat
amonia
pekat
dan
kalium dihidrogen fosfat dalam 900 mL aquades. Cek pH dan diatur pH
Gelatinisasi pati larut
hingga dicapai pH 4,5 dengan asam
Gelatinisasi
pati
larut
fosfat, kemudian diencerkan hingga
dilakukan dengan cara 40 mL pati
1000 mL dengan aquades. Kemudian
larut 1% ditambahkan pada 50 mL
pereaksi dapar fosfat 0,1 M pH 5,6
aquades
dibuat
glass,
dengan
dilarutkan
0,908
mendidih sambil
dalam
diaduk.
beaker
Kemudan
kalium dihidrogen fosfat dengan
digenapkan hingga 100 mL dengan
aduades dalam labu ukur 100 mL dan
air.
digenapkan
dibiarkan dingin pada suhu kamar
(larutan
I).
hingga
tanda
Larutkan
batas
pati
tergelatinisasi
g
(konsentrasi pati 4mg/mL). Diambil
dikalium hidrogen fosfat dengan
1 mL larutan pati tergelatinisasi,
aquades dalam labu ukur 100 mL dan
diencerkan hingga 100 mL dengan
digenapkan
aquades.
hingga
1,161
Larutan
tanda
batas
Larutan
ini
digunakan
(larutan II). 94,4 mL larutan I dan 5,6
sebagai larutan stok (substrat) yang
mL larutan II dicampurkan. Cek pH
digunakan
untuk
dan diatur pH hingga dicapai pH 5,6.
(konsentrasi
0,04
Pereaksi larutan dapar fosfat 0,1 M
µg/mL).
pengujian mg/mL
=
40
pH 7,5 dibuat dan dilarutkan 13,6 g kalium dihidrogen fosfat dalam 900
Pembuatan kurva standar pati
mL aquades. Cek pH dan atur pH
(duplo)
hingga dicapai pH 7,5 dengan larutan
Kurva standar pati dilakukan
kaliumhidroksida 300 g/L, encerkan
dengan tabung reaksi diisi 2,5 mL
Fakultas Farmasi
Page 7
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
larutan stok, 1,75 mL dapar fosfat
terhidrolisis
per
0,1 M pH 5,6 dan 0,75mL aquades.
ditentukan
Campuran reaksi diambil (variasi
konsentrasi pati (substrat) terhadap
volume, lihat tabel) dan dipindahkan
absorbansi.
dari
satuan kurva
waktu standar
ke tabung reaksi lain berisi 1,5 mL HCl
10%
untuk
menghentikan
reaksi. Ditambahka 1,5 mL indikator (larutan
iodin-kalium
Uji aktivitas amilase pada variasi pH (duplo)
iodida).
Tabung reaksi diisi 2,5 mL
Dilakukan absorbansi dibaca pada
larutan stok, 1,75 mL dapar pH 3,5;
620 nm. Blanko dibuat dengan
4,5; 5,6; 7,5; 9,5 dan 0,75 mL ekstrak
komposisi
yang
dengan
amilase. Campuran reaksi diinkubasi
campuran
reaksi,
tanpa
pada 37 oC selama 30 menit. diambil
sama kecuali
ditambahkan indikator.
1
mL
campuran
reaksi
dan
pindahkan ke tabung reaksi lain Uji aktivitas amilase pada variasi
berisi
3
mL
HCl
10%
untuk
suhu (duplo)
menghentikan reaksi. ditambahkan 3
Uji aktivitas amilase pada
mL indikator (larutan iodin-kalium
variasi suhu Tabung reaksi diisi 2,5
iodida). Dukur absorbansi pada 620
mL larutan stok, 1,75 mL dapar
nm, jangan lupa konsentrasi pati
fosfat 0,1 M pH 5,6 dan 0,75 mL
terhidrolisis dikalikan dengan faktor
ekstrak amilase. Campuran reaksi
pengenceran. Dibuat blanko. Jumlah
diinkubasi pada 27, 37, 47, 57, dan
pati terhidrolisis per satuan waktu
o
67 C selama 30 menit. diambil 1 mL
ditentukan
dari
kurva
standar
campuran reaksi dan dipindahkan ke
konsentrasi pati (substrat) terhadap
tabung reaksi lain berisi 3 mL HCl
absorbansi.
10% untuk menghentikan reaksi. Ditambahkan 3 mL indikator (larutan iodin-kalium
iodida).
Dilakukan
absorbansi yang dibaca pada 620 nm, konsentrasi
pati
terhidrolisis
dikalikan dengan faktor pengenceran. Dibuat
blanko.
Fakultas Farmasi
Jumlah
pati
Data pengamatan
N
Perlakuan
o 1.
Pengamat an
Siapkan tabung reaksi dan hasil
Page 8
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
fraksinasi 2.
3.
20 April 2015
Untuk variasi pH
Semua
3,5 dan 5,6
fraksi
Untuk variasi suhu
Semua
37°C dan 57°C
fraksi
- vial 1 dipipet
yang ada
sebanyak 0,15ml
pada
dimasukkan
tabung
kedalam dua
reaksi siap
tabung reaksi (pH
digunakan
3,5 dan 5,6)
- vial 1 dipipet sebanyak 0,15ml dimasukkan kedalam dua tabung reaksi (37°C dan 57°C)
untuk langkah
- vial 2 dipipet
selanjutny
sebanyak 0,15ml
a
pada tabung reaksi siap digunakan untuk langkah
- vial 2 dipipet
selanjutny
sebanyak 0,15ml
a
dimasukkan kedalam dua
dimasukkan
tabung reaksi (pH
kedalam dua
3,5 dan 5,6)
tabung reaksi
-vial 3 dipipet
(37°C dan 57°C)
sebanyak 0,15ml
- vial 3 dipipet
dimasukkan
sebanyak 0,15ml
kedalam dua
dimasukkan
tabung reaksi (pH
kedalam dua
3,5 dan 5,6)
tabung reaksi (37°C dan 57°C)
yang ada
4.
Semua tabung
Semua
reaksi untuk variasi
tabung
suhu dan pH
reaksi
dimasukkan 0,5ml
berisi
larutan stock.
hasil fraksinasi dan larutan stock
Fakultas Farmasi
Page 9
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
5.
Untuk variasi suhu
Semua
dimasukkan
7.
Untuk variasi suhu,
Ke 6
tabung
3 tabung reaksi
tabung
0,35ml dapar fosfat
reaksi
dipanaskan/diinkub
reaksi
0,1M pH 5,6
yang
asi hingga suhu
telah
digunakan
37oC selama 30
dipanaska
untuk
menit. Untuk 3
n sesuai
variasi
tabung reaksi yang
dengan
suhu
kedua dipanaskan/
suhunya.
berisi
diinkubasi hingga
fraksinasi,
57oC selama 3o
larutan
menit.
stock, dan dapar
8.
fosfat 6.
20 April 2015
Untuk variasi pH 6
6 tabung
tabung reaksi
reaksi
diinkubasi pada
telah
Untuk variasi pH
Tabung
37oC selama 30
diinkubasi
dimasukkan pH
raksi
menit.
selama 30
dapar fosfat yang
untuk
menit
sesuai untuk pH
variasi pH
pada suhu
pertama 3,5 dan
berisi
37oC
untuk pH ke dua
fraksinasi,
5,6.
larutan
9.
Semua tabung reaksi variasi suhu
stok, dan
dan pH
dapar
dimasukkan 0,6ml
fosfat
HCl 10%
sesuai dengan
10
Semua tabung
pH
.
reaksi variasi suhu
masing-
dan pH
masing
dimasukkan 0,6ml
yaitu 3,5
indicator.
dan 5,6.
Fakultas Farmasi
Page 10
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
o
11
Dibuat blangko,
Berisi
suhu 57 C
.
dengan prosedur
fraksinasi,
= 1,352
yang sama seperti
larutan
Absorbans
sebelumnya tetapi
stok,
i variasi
tidak digunakan
dapar
pH 5,6 =
atau dimasukkan
fosfat dan
1,239
indikator.
HCl 10%
12
Setiap tabung
Absorbans
.
diukur
i variasi
absorbansinya
suhu 37 oC = 1,999
Tabel 1. Data Pengamatan
Praktikum Hasil
Absorbans i blanko variasi suhu = 0,640 Absorbans i variasi pH 3,5 = 1,238 Absorbans i blanko
Setelah
semua
prosedur
dilakukan,
didapatkanlah
hasil
Absorbansi
blanko
suhu
variasi
yaitu 0,640, Absorbansi variasi suhu o
37 C
sebesar
1,999,
Absorbansi
variasi pH 3,5 1,238,
Absorbansi
blanko
variasi
pH
3,5
0,380,
Absorbansi blanko pH 5,6 sebesar 0,336, Absorbansi variasi suhu 57 oC 1,352, dan yang terakhir Absorbansi variasi pH 5,6 1,239.
variasi pH
Kurva Standar Pati
3,5 = 0,380 Absorbans i blanko pH 5,6 = 0,336
2 i s 1,5 n a b r 1 o s b A0,5
Series1
0 0
50
100
150
Konsentrasi
Absorbans i variasi
Fakultas Farmasi
Grafik 1. Kurva Standar Pati
Page 11
20 April 2015
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
pati
KONSENT RASI
ABSORB ANSI 40 1,18 3 60 1,31 8 80 1,40 8 100 1,73 5
a
pada
metode
ikatan
glikosidiknya,
juga
menggunakan
ini
iodin/kalium
iodida
sebagai
pengujian
aktivitas
indikatornya. Dalam
enzim amilase hal yang pertama dilakukan adalah membuat larutan pati
b x 0,0001953 1,11 1,18 8 6
larut
sebanyak 1,11823 163
1
Pati
gram,
ditimbang
kemudian
di
larutkan dengan aquades dalam labu ukur
Tabel 2. Absorbansi Larutan Baku
1%.
hingga
Konsentrasi
volume
yang
100ml.
didapat
yaitu
sebesar 10mg/mL. Pati ini digunakan sebagai zat uji yang akan diputus Pembahasan
ikatan glikosidik (α 1-4) oleh enzim amilase.
Enzim
adalah
molekul
biopolimer
yang
tersusun
serangkaian
asam
amino
dari dalam
komposisi dan susunan rantai yang teratur dan tetap. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas enzim amilase dari fraksi protein buah
nanas.
Amilase
dapat
memutuskan ikatan glikosidik (α 14) di antara satuan glukosa yang membentuk polimer, seperti pati. Metode
yang
digunakan
yaitu
metode Caraway-Somogyi, metode ini yang
menggunakan mengukur
spektofotometer penurunan
absorbansi pati yang terjadi karena
Kemudian
gelatinisasi
pati
dilakukan
larut.
Aquadest
50mL di didihkan dalam beaker glass, setelah mendidih pati larut 1% dimasukan sebanyak
kedalam 40mL.
aquadest
Dan
larutan
digenapkan hingga 100mL. Larutan pati tergelatinisasi dibiarkan dingin pada suhu kamar. Konsentrasi pati 4mg/mL.
Kemudian
dilakukan
pengenceran pati larut dengan cara pati larut dipipet 1 ml kemudian dimasukan kedalam labu ukur 100ml ditambahkan aquades hingga tanda batas. sebesar
Konsentrasi
yang
didapat
0,04mg/ml
atau
sebesar
40μg/ml. Pengenceran ini bertujuan
aktivitas amilase yang mendegradasi
Fakultas Farmasi
Page 12
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
untuk
menghindari
larutan
yang
20 April 2015
Kemudian
ditambahkan
terlalu pekat, karena larutan yang
1,5ml indikator iodin-kalium iodida.
terlalu pekat tidak akan terbaca
Absorbansi larutan dibaca dengan
absorbansinya pada spektrofotometer
menggunakan spektrofotometer pada
UV-vis.
panjang
Larutan
ini
digunakan
gelombang
620nm.
sebagai larutan stok (substrat) dalam
Sementara itu dibuat larutan blanko,
pengujian aktifitas enzim amilase.
blanko
Setelah
dengan
komposisi
dilakukan
yang sama dengan campuran reaksi,
pembuatan kurva standar larutan pati
kecuali tanpa penambahan indikator.
dengan
stok
Pada larutan blanko tidak diberi
dimasukan kedalam tabung reaksi,
penambahan enzim, karena larutan
1,75ml larutan dapar fosfat 0,1M pH
blanko
5,6 , dan 0,75ml aquadest. Campuran
pembanding
reaksi
blanko hanya berisi larutan pati dan
cara
itu
dibuat
2,5ml
diambil
larutan
dan
dipindahkan
disini
digunakan
larutan
uji.
Larutan
kedalam larutan HCl 10% sebanyak
iodium
1,5ml. HCl 10% dibuat dengan cara
warna ungu. Pada percobaan ini akan
larutan HCl pekat dipipet 10ml dan
dihasilkan nilai absorbansi blanko
dimasukan kedalam labu ukur yang
yang berfungsi sebagai larutan murni
telah berisi aquades 50mL, diaduk
tanpa adanya pengotor.
dan
volume
100mL.
digenapkan
hingga
digunakan
untuk
HCl
menghentikan reaksi dengan cara HCl akan berikatan dengan ujung karboksil dari enzim sehingga HCl akan menginaktifkan kerja enzim amilase untuk memecah pati. Selain itu, enzim amilase bekerja pada pH yang
relatif
basa
sehingga
jika
ditambahkan HCl yan memiliki sifat asam maka enzim amilase akan terinaktifasi.
Fakultas Farmasi
sehingga
sebagai
Kemudian
menghasilkan
dilakukan
pengujian aktivitas enzim amilase dengan variasi suhu. Tabung reaksi diisi 2,5ml larutan stok, 1,75ml dapar fosfat 0,1M pH 5,6 dan 0,75ml ekstrak amilase. Pada larutan uji, larutan pati yang ditambah dengan enzim
amilase
menjadi
akan
glukosa.
terhidrolisis Campuran
diinkubasi pada suhu 27, 37, 47, 57, dan 67oC selama 30 menit. Hal ini dimaksudkan
agar
terdegradasi
secara
pati
dapat
sempurna.
Page 13
20 April 2015
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
Sedangkan
Perbedaan
suhu
ini
tersebut
tidak
digunakan untuk mengetahui suhu
komplementer
optimum
sehingga
enzim
amilase
dalam
diteruskan.
campuran
larutan
diambil
dan
dari
tidak
melakukan aktivitasnya. Lalu 1ml reaksi
menyerap
ada
sinar
putih
warna
yang
Kemudian
dibaca
warna
absorbansi
pada
panjang
dipindahkan ke tabung reaksi lain
gelombang 620nm. Sesuai dengan
berisi 3ml HCl. HCl berperan dalam
literatur panjang gelombang yang
penghentian
jika
diserap larutan pati terkomplekskan
dihentikan
untuk mengahasilkan warna Biru-
maka enzim akan memutus ikatan
Hijau (yang dilihat oleh mata kita)
glikosidik
terletak pada rentang λ = 620-750
aktivitas
reaksi,
enzim
karena
tidak
secara
terus
menerus
sehingga aktivitas enzim tidak dapat
nm.
diketahui pada suhu yang optimal. Kemudian
ditambahkan
iodin-kalium
iodida.
indikator
Larutan
ini
berperan sebagai indikator perubahan warna dari larutan uji yang spesifik untuk menguji adanya kandungan amilum
dan
digunakan
untuk
membentuk larutan kompleks pada larutan pati. Larutan pati merupakan larutan
yang
sehingga
tidak
untuk
melakukan
pengukuran menggunakan
berwarna,
absorbansi spektrofotometer
larutan pati harus dijadikan larutan kompleks agar menjadi berwarna dan dapat diukur absorbansinya. Jika larutan pati tidak dikomplekskan maka
tidak
absorbansinya
dapat
diukur
menggunakan
spektrofotometer, karena larutan pati
Fakultas Farmasi
Kemudian
dilakukan
pengujian aktivitas enzim amilase dengan variasi pH dapar fosfat. Tabung reaksi diisi 2,5ml larutan stok, 1,75ml dapar fosfat 0,1M dengan variasi pH, yaitu pH 3,5; 4,5; 5,6; 7,5; 9,5. Campuran diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Perbedaan pH ini digunakan untuk mengetahui aktivitas enzim pada pH yang
optimum.
Karena
enzim
bekerja pada kisaran pH tertentu, enzim memiliki sifat ionik gugus karbosil
dan
asam
amino
yang
mudah dipengaruhi pH. Hal ini menyebabkan konformasi enzim dan fungsi
katalik
enzim
berubah,
sehingga enzim bisa terdenaturasi dan kehilangan aktivitasnya. Pada kondisi pH optimum protein enzim
Page 14
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
mengambil struktur 3 dimensi yang
pengamatan
sangat
mempunyai
tepat,
mengikat
sehingga
dan
ia
mengolah
dapat
substrat
20 April 2015
absorbansi waktu
tidak
yang
cukup
banyak.
dengan kecepatan yang setinggi-
Pada pengamatan uji aktivitas
tingginya. Di luar nilai pH optimum
amilase variasi suhu, variasi suhu
tersebut struktur 3 dimensi enzim
yang dipakai adalah suhu 37 0C dan
mulai berubah, sehingga substrat
570C. pada 2 tabung reaksi ini
tidak
menempati
hasilnya menghasilkan warna kuning
posisisnya dengan tepat pada bagian
kecoklatan, warna kecoklatan ini
molekul
mengolah
disebabkan karena indicator yang
substrat. Akibatnaya, proses katalisis
digunakan yaitu Iodin indicator ini
berjalan t idak optimum. Kemudian 1
digunakan untuk metode percobaan
ml campuran reaksi diambil dan
caraway-somogyi,
dipindahkan ke tabung reaksi lain
aktivitas amilase pada percobaan kali
berisi 3ml HCl. HCl digunakan untuk
ini menggunakan metode caraway-
menghentikan
dan
somogyi. Setelah itu 2 tabung reaksi
ditambahkan indikator iodin-kalium
dengan masing-masing suhu yang
iodida. Absorbansi larutan dibaca
telah
pada panjang gelombang 620nm.
diamati
dapat
lagi
enzim
yang
reaksi,
Pada kali ini parameter yang diamati adalah penurunan absorbansi dari setiap variasi suhu dan pH karena nilai absorbansi ini dapat menentukan seberapa besar aktivitas amilase pada fraksi protein yang didapat. Pada percobaan kali ini yang diamati
aktivitas
absorbansinya
hanya 1 vial yaitu vial ketiga yang fraksi proteinnya paling besar setelah diperiksa
pada
sebelumnya
yaitu
dikarenakan
untuk
Fakultas Farmasi
percobaan 1,999.
Ini
melakukan
dilakukan
maka
sesuai
dari
itu
prosedur
absorbansinya
pada
spektrofotometri dengan gelombang maksimum (λ ) 620 nm. Kemudian didapatkan absorbansinya yaitu pada 0
tabung reaksi dengan suhu 37 C adalah 1,999 dan pada suhu 57 0C absorbansinya berada pada 1,352. pada pengamatan ini juga harus dibuat
blanko
blanko
untuk
atau
pembanding,
variasi
suhu
ini
mempunyai absorbansi 0,640. Pada pengamatan uji aktivitas amilase variasi pH dapar fosfat digunakan variasi pH 3,5 dan pH 5,6.
Page 15
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
Pada kedua tabung reaksi ini pun
karena
ketika
mendegradasi suatu fraksi protein
di
indicator
campurkan
dengan
menghasilkan
warna
enzim
dengan
amilase
cara
dapat
memutuskan
atau
kuning kecoklatan. Pada pengamatan
memecahkan ikatan glikosidiknya.
variasi pH pun dibuat blankonya. 2
Pada variasi suhu diamati pada suhu
tabung reaksi dan blanko diukur
370C dan 570C. pada rentang suhu ini
absorbansi dan didapatkan hasilnya
terjadi penurunan absorbansi dari
yaitu pada tabung reaksi pH 3,5
1,999 ke 1,352 ini diartikan aktivitas
absorbansinya
amilase pada fraksi protein berjalan
adalah
1,238
sedangkan untuk blanko pH 3,5
dengan
adalah 0,380. Untuk tabung reaksi
glikosidik pada fraksi protein telah
dengan pH 5,6 absorbansinya adalah
diputus atau di degradasi. Ini artinya
0,336 sedangkan untuk blanko pH
suatu reaksi kimia dapat terjadi
5,6 adalah 0,336.
karena ada pengaruh oleh suhu selain
Hasil
dapat
dan
berarti
ikatan
diamati
katalis enzim. Maka dari itu semakin
terlebih dahulu adalah uji aktivitas
tinggi kenaikan suhu maka dapat
amilase
menyebabkan
sebelumnya
yang
baik
pada
variasi
suhu,
uji
aktivitas
amilase
pada
denaturasi
fraksi
protein
protein
sehingga
pada percobaan ini dilakukan dengan
konsentrasi dan kecepatan katalis
cara mengamati adanya penurunan
enzim pun berkurang.
absorbansi maka metode ini disebut dengan
metode
caraway-somogyi.
Selanjutnya
untuk
uji
aktivitas amilase pada variasi pH
Jadi metode caraway-somogyi ini
dapar
adalah
melihat
digunakan adalah pH 3,5 dan pH 5,6. Pada pH 3,5 mendapatkan absorbansi
metode
untuk
fosfat.
aktivitas
amilase
pada
suatu
fraksinasi
protein
dengan
cara
1,238
pada
mendapatkan
mengukur
absorbansi
spektrofotometer penurunannya,
dan dan
mengamati
bila
terdapat
Variasi
sedangkan
pH
pada
yang
pH
absorbansi
5,6
1,239.
Dilihat dari nilai absorbansi tidak ada penurunan nilai absorbansi berarti
penurunannya maka diduga terdapat
dapat
enzim amilase yang beraktivitas,
amilase
yang diamati adalah penurunannya
Karena umumnya enzim efektifitas
Fakultas Farmasi
diartikan terjadi
aktivitas
enzim
pemberhentian.
Page 16
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
maksimum pada pH optimum, yang
pembilasan spektrofotometer ketika
lazimnya berkisar antara pH 4,5-8.0.
telah
Pada pH yang terlalu tinggi atau
dilakukan dengan maksimal sehingga
terlalu
enzim
tidak tepat menyentuh angka 0. Maka
menjadi non aktif secara irreversibel
dari itu nilai absorbansi yang didapat
karena menjadi denaturasi protein.
sangat beda dan juga cukup jauh
Dilihat dari naiknya nilai pH terjadi
antara blanko dan sampel.
rendah
umumnya
menginject
sampel
tidak
denaturasi protein dan kerja enzim Simpulan
dihambat. Untuk
lebih
mengetahui
apakah yang dihasilkan benar-benar amilase atau tidak adalah dengan membuat blanko yang isinya sama seperti pada tabung reaksi tetapi tidak menggunakan indikator. Untuk blanko variasi suhu absorbansinya adalah
sebesar
dibandingkan
0,640,
dengan
bila sampel
absorbansinya cukup jauh. Untuk blanko variasi pH 3,5 absorbansinya yaitu 0,380 dan bila dibandingkan dengan sampel absorbansinya cukup jauh. Sedangkan untuk blanko variasi pH 5,6 absorbansinya yaitu 0,336 bila dibandingkan dengan sampel absorbansinya juga cukup jauh. Hasil ini yang menyebabkan perbedaan cukup jauh antara hasil absorbansi blanko
dan
sampel
adalah
dikarenakan praktikkan yang masih belum paham dalam mengamati nila i absorbansi
yang
Fakultas Farmasi
tertera,
dalam
Dari proses uji aktivitas amilase pada buah nanas didapatkan absorbansi blanko variasi suhu yaitu 0,640, Absorbansi variasi suhu 37oC sebesar 1,999, Absorbansi variasi pH 3,5 adalah sebesar 1,238, Absorbansi blanko variasi pH 3,5 0,380, Absorbansi blanko pH 5,6 sebesar 0,336, Absorbansi variasi suhu 57oC 1,352, dan yang terakhir Absorbansi variasi pH 5,6 1,239. Daftar Pustaka
Almatsier S. 2010. Prinsip Dasar Ilmu Giz i. Jakarta (ID) : Gramedia PustakaUtama Biogen. 2008. Amilase. Tersedia dalam http://biogen.litbang.deptan.g o.id/terbitan/agrobio/abstrak/ agrobio_vol 76 [diakses 24 April 2015] Endah, R dan Nafizah. 2011. Aktivitas Immobilized bamilase dari Zoogloearamigera ABL 1 dalam medium pati cair
Page 17
[UJI AKTIVITAS AMILASE]
20 April 2015
dengan perlakuan factor lingkunagan. Biota. 16 (1) : 95-98
online di http://eprints.undip.ac.id/292 3/ [diakses 24 April 2015]
Mark DB. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta(ID) : EGC
Sumardjo D. 2008. Pengantar Kimia : Buku Panduan Kuliah Mahasiswa Kedokteran dan Program Strata I Fakultas Bioeksakta. Jakarta (ID) : EGC
Oliveira. 2004. Rhizobia Amylase Production Using Various Starchy Substances as Carbon Substrates. Tersedia dalam http://www.scielo.br/pdf/bjm/ v31n4/a11v31n4.pdf . [diakses 24 April 2015]
Winarno FG. 2002. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta (ID) : Gramedia
Rinawati, M., Pipit, Wuryanti, Rahmanto, Wasino, 2009, Isolasi, Karakterisasi dan Amobilisasi Enzim Amilase dari Temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) Tersedia
Fakultas Farmasi
Page 18
