LAPORAN RESMI PRAKTIKUM BIOFARMASETIKA
ABSORPSI PERKUTAN OBAT SECARA IN VITRO
Disusun oleh : 1. Surya Indra Kharisma ( FA / 08534 ) 2. Anggit Yustitia A
( FA / 08537 )
3. Muhamad Nur Arifin
( FA / 08543 )
4. Putu Dian Marani K.
( FA / 08549 )
Golongan
: c.II.d
Kelas
: C 2010
Tanggal Praktikum
: Jum’at, 5 Oktober 2012
Asisten Jaga
: Dewa Ayu, Indri, Yudi, Lina
Asisten Koreksi
:
Dosen
: Dr. rer. nat. Ronny Martien, M.Si
LABORATORIUM BIOFARMASETIKA BAGIAN FARMASETIKA FAKULTAS FARMASI UGM 2012
PERCOBAAN 5 ABSORPSI PERKUTAN OBAT SECARA I N VI VI T R O
I.
TUJUAN
Tujuan percobaan ini adalah untuk mempelajari absorpsi obat secara perkutan secara in vitro
II. ALAT BAHAN A. Alat
1. Sel difusi tipe horizontal
12. Gelas ukur 10 ml; 100 ml
2. Sel difusi tipe vertikal
13. Labu takar 5 ml; 250 ml
3. Spektrofotometer + kuvet
14. Gelas Beaker
4. Gunting bedah
15. Pro pipet
5. Pinset
16. Pipet volume 1 ml; 2ml; 5 ml
6. Electric clipper
17. Pipet tetes
7. Neraca analitik
18. Corong kaca
8. Sonikator
19. Cawan petri
9. Magnetic stirrer
20. Kertas saring
10. Stirrer
21. Papan Bedah
11. Tabung reaksi
B. Bahan
1. Membran milipore 2. Kulit tikus 3. Aquadest 4. Fosfat Buffer Saline pH 7.4 5. Isopropyl miristat 6. Asam salisilat
III. CARA KERJA Penyiapan membran lipid buatan sebagai membran difusi :
Membran millipore dipotong millipore dipotong bentuk lingkaran sesuai dengan ukuran ↓ Diimpregnasikan membran tersebut dengan isopropil miristat kurang lebih 15 menit
↓ Ditempatkan di kertas saring selama 5 menit
Penyiapan kulit tikus segar sebagai membran difusi :
Kulit tikus dibagian punggung dipotong dengan electric clipper ↓ Dipisahkan kulit bangian dorsal dari tubuh tikus dengan hati-hati menggunakan gunting bedah ↓ Lemak yang terdapat dikulit dihilangkan ↓ Dipotong kulit bagian punggung sesuai dengan ukuran
Pelaksanaan uji difusi :
Membran direndam pada larutan dapar fosfat buffer saline pH 7.4 selama 30 menit ↓ Membran diambil dan ditempatkan di sel difusi horizontal (untuk membran buatan) dan vertikal (untuk membran kulit) ↓ Sel difusi dipasang dengan mengencangkan mur yang ada ↓ Larutan donor asam salisilat ditempatkan pada kompartemen donor dan fosfat buffer saline pH 7.4 dibagian akseptor ↓ Dijalankan stirrer baik pada sisi donor dan aseptor ↓ Dilakukan pengukuran transport obat ke kompartemen aseptor pada menit ke 0; 15; 30; 45; 60; dan 90 ↓ Diukur absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer pada λ 296 nm ↓ Dicatat dan dihitung kadar ↓ Dibuat profil hubungan antara kumulatif transpor terhadap waktu dan ditentukan nilai Flux
IV. HASIL DAN PERHITUNGAN DATA PERCOBAAN
Nama obat
: Asam salisilat
Bentuk sediaan
: Larutan
Bahan pembawa
: Aquadest
Bobot sampel
: 375 mg
Obat yang diberikan
: Asam salisilat
Jenis membran
: Buatan (membran milipore) dan kulit hewan
Hewan percobaan
: Tikus galur wistar
Diameter membran
: milipore= 3,2 cm; Kulit hewan = 2,5 cm
Luas membran
: milipore= 32,154 cm2; kulit hewan= 19,625 m 2
Persamaan kurva baku
: Y = 0,2499 X + 0,0048
Kadar sampel
: 1,5 mg/ml
Menggunakan membran buatan :
Menggunakan membran dari kulit hewan :
Waktu sampling
Waktu sampling
(menit)
Absorbansi
(menit)
Absorbansi
0
0,050
0
0,048
15
0,318
15
0,038
30
0,580
30
0,042
45
0,758
45
0,056
60
0,398*
60
0,064
90
0,523*
90
0,075
* Setelah pengenceran 2,5X (dari 2 ml sampel diencerkan dengan dapar phospat pH 7,4 sampai volume 5 ml)
PERHITUNGAN
Persamaan kurva baku asam salisilat dalam fosfat buffer salin pH 7,4 : Y = 0,2499 X + 0,0048
Y = absorbansi X = kadar obat dalam (mg/ml)
PADA MEMBRAN BUATAN PERHITUNGAN KADAR OBAT Kadar obat =
Y−, ,99
Dari perhitungan diperoleh data :
Waktu sampling (menit)
Absorbansi Kadar obat (mg/ml)
0
0,050
0,1809
15
0,318
1,2533
30
0,580
2,3017
45
0,758
3,1401
60
0,398
3,9336
90
0,523
5,1841
Perhitungan Kadar Obat (mg/ml): Kadar obat =
Y−, x faktor pengenceran ,99
menit ke-0 : kadar obat =
,−, = 0,1809 mg/ml ,99
menit ke-15 : kadar obat =
,−, = 1,2533 mg/ml ,99
menit ke-30 : kadar obat =
,−, = 2,3017 mg/ml ,99
menit ke-45: kadar obat =
,7−, = 3,1401 mg/ml ,99
menit ke-60 : kadar obat =
,9−, x 2,5 = 3,9336 mg/ml ,99
menit ke-90 : kadar obat =
,−, x 2,5 = 5,1841 mg/ml ,99
Perhitungan kadar terkoreksi : Kadar terkoreksi (Kt) = Kadar pada waktu t + (
Kt0 = 0,1809 mg/ml + (
volume pengambilan volume total
kadar terkoreksi sebelumnya )
x 0) = 0,1809 mg/ml
Kt15 = 1,2533 mg/ml + ( Kt30 = 2,3017 mg/ml + (
x 0,1809) = 1,2895 mg/ ml
x 1,2533) = 2,5524 mg/ml
Kt45 = 3,1401 mg/ml + (
x 2,3017) = 3,6004 mg/ml
Kt60 = 3,9336 mg/ml + (
x 3,1401) = 4,5616 mg/ml
Kt90 = 5,1841 mg/ml + (
x 3,9336) = 5,9708 mg/ml
Perhitungan Jumlah Obat yang Berdifusi
Jumlah obat yg berdifusi bukan sejumlah yang
Jumlah obat yang berdifusi = Kt x volume pengambilan
disampling ( 5ml ) tapi dikali
Volume pengambilan = 5 ml
jumlah total akseptor
Waktu Sampling
Kt (mg/ml) Jumlah Obat yang Jumlah Obat Kumulatif
(menit)
Berdifusi (mg)
(mg)
0
0,1809
0,9045
0,9045
Bukan begini seharusnya
15
1,2895
6,4475
7,3520
kadar obat kumulatif
30
2,5524
12,7620
20,1140
45
3,6004
18,0020
38,1160
60
4,5616
22,8080
60,9240
90
5,9708
29,8540
90,7780
terkoreksi
Persamaan Regresi Linear Waktu Sampling (menit) vs Jumlah Obat Kumulatif (mg) y = 1,0527x-5,7445 A = -5,7445 B = 1,0527 r = 0,9811
waktu sampling (menit) vs jumlah obat kumulatif (mg) 100 y = 1.0527x - 5.7445 R² = 0.9811
80 60 40 20 0 0
20
40
60
80
100
-20
Perhitungan slope
Dari grafik hubungan jumlah obat kumulatif vs waktu dapat dibuat persamaan regresi linier. y = 1,0527x-5,7445 A = -5,7445 B = 1,0527 (slope kurva(mg/menit)) r = 0,9811
sop (⁄) Flux = uas ar dfus () =
,7 / ,
= 0,0328 mg/menit.cm2
Perhitungan Cp
T1/2el = 2,5 jam = 150 menit Clirens total (Cl) = 1,38 L/jam = 0,023 L/menit K= Cp =
0,693 T1/2 el
=
0,693 150
Sop x (1- e -kt) C
= 4,62 x 10-3 /menit
Menit ke-0
Cp =
Menit ke-15
Cp =
,7 x (1- e -4,62.10-3 x 45) = 8,5915 mg/L ,
Menit ke-60
Cp =
,7 x (1- e -4,62.10-3 x 30) = 5,9237 mg/L ,
Menit ke-45
Cp =
,7 x (1- e -4,62.10-3 x15) = 3,0644 mg/L ,
Menit ke-30
Cp =
,7 x (1- e -4,62.10-3 x 0) = 0 mg/L ,
,7 x (1- e -4,62.10-3 x 60) = 11,0807 mg/L ,
Menit ke-90
Cp =
,7 x (1- e -4,62.10-3 x 90) = 15,5702 mg/L ,
Waktu(menit)
Cp (mg/L)
ln Cp
0
0
0
15
3,0644
1,1199
30
5,9237
1,7790
45
8,59915
2,1517
60
11,0807
2,4052
90
15,5702
2,7454
waktu sampling (menit) vs Ln Cp 3.5 y = 0.0286x + 0.5547 R² = 0.8565
3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
10
20
30
40
Permeabilitas Membran
Permeabilitas = =
flux Kadar awal obat
, /. , /
= 0,0219 ml/menit.cm 2
50
60
70
80
90
100
PADA MEMBRAN DARI KULIT HEWAN PERHITUNGAN KADAR OBAT Kadar obat =
Y−, ,99
Dari perhitungan diperoleh data : Waktu sampling
Absorbansi
Kadar Obat (mg/mL)
0
0,048*
0,1993
15
0,038
0,1032
30
0,042
0,2233
45
0,056
0,1793
60
0,064
0,1993
90
0,075
0,2953
*: direject Perhitungan Kadar Obat (mg/ml): Kadar obat =
Y−, x faktor pengenceran ,99
menit ke-0 : kadar obat =
,−, = 0,1729 mg/ml (direject) ,99
menit ke-15 : kadar obat =
,−, = 0,1329 mg/ml ,99
menit ke-30 : kadar obat =
,−, = 0,1489 mg/ml ,99
menit ke-45: kadar obat =
,−, = 0,2049 mg/ml ,99
menit ke-60 : kadar obat =
,−, = 0,2369 mg/ml ,99
menit ke-90 : kadar obat =
,7−, = 0,2809 mg/ml ,99
Perhitungan kadar terkoreksi : Kadar terkoreksi (Kt) = Kadar pada waktu t +(
Kt0 = 0,1729 mg/ml + ( Kt15 = 0,1329 mg/ml + ( Kt30 = 0,1489 mg/ml + (
volume pengambilan volume total
kadar terkoreksi sebelumnya )
x 0) = 0,1729 mg/ml (direject) 7
x 0,1729) = 0,1532 mg/ ml 7
x 0,1532) = 0,1669 mg/ml 7
Kt45 = 0,2049 mg/ml + (
x 0,1669) = 0,2245 mg/ml 7
Kt60 = 0,2369 mg/ml + (
x 0,2245) = 0,2633 mg/ml 7
Kt90 = 0,2809 mg/ml + (
x 0,2633) = 0,3119 mg/ml 7
Perhitungan Jumlah Obat yang Berdifusi
Jumlah obat yang berdifusi = Kt x volume pengambilan Volume pengambilan = 2 ml Waktu Sampling
Kt (mg/ml)
(menit)
Jumlah Obat yang Berdifusi
Jumlah Obat
(mg)
kumulatif (mg)
0
0,1729
0,3458
0,3458*
15
0,1532
0,3064
0,6522
30
0,1669
0,3338
0,9860
45
0,2245
0,4490
1,4350
60
0,2633
0,5266
1,9616
90
0,3119
0,6238
2,5854
Kalo direject kenapa dijumlahkan?
*: direject
waktu sampling (menit) vs jumlah obat kumulatif (mg) 3 y = 0.0258x + 0.2939 R² = 0.9927
2.5 2 1.5 1 0.5 0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Perhitungan slope
Dari grafik hubungan jumlah obat kumulatif vs waktu dapat dibuat persamaan regresi linier. y = 0,0258x+0,2939 A = 0,2939 B = 0,0258 (slope kurva(mg/menit)) R = 0,9927 Flux = =
slope luas area difusi
, / 9,
= 1,3146 x 10 -3 mg/menit.cm2 Perhitungan Cp
T1/2el = 2,5 jam = 150 menit Clirens total (Cl) = 1,38 L/jam = 0,023 L/menit 0,693
K=
T1/2 el
Cp =
=
0,693 150
= 4,62 x 10-3 /menit
Sop x (1- e-kt) C
Menit ke-0
Cp =
0,0258 ,
x (1- e-4,62.10-3 x 15) = 0,0751 mg/L
0,0258 ,
x (1- e-4,62.10-3 x 30) = 0,1452 mg/L
Menit ke-45
Cp =
x (1- e-4,62.10-3 x 0) = 0 mg/L
Menit ke-30
Cp =
,
Menit ke-15
Cp =
0,0258
0,0258 ,
x (1- e-4,62.10-3 x 45) = 0,2106 mg/L
Menit ke-60
Cp =
0,0258 ,
x (1- e-4,62.10-3 x 60) = 0,2716 mg/L
Menit ke-90
Cp =
0,0258 ,
x (1- e-4,62.10-3 x 90) = 0,3816 mg/L Waktu(menit)
Cp (mg/L)
ln Cp
0
0
0
15
0,0751
-2,5889
30
0,1453
-1,9290
45
0,2106
-1,5578
60
0,2716
-1,3034
90
0,3816
-0,9634
0 0
10
-0.5
20
30
40
50
60
70
waktu sampling (menit) vs Ln Cp
-1 -1.5 -2 -2.5 -3
Permeabilitas Membran
Permeabilitas =
=
flux Kadar awal obat 1,3146 x 103 mg/menit.cm2 1,5 mg/ml
= 8,764 x 10 -4 ml/menit.cm2
80
90
100
V. PEMBAHASAN
Percobaan pada praktikum ini bertujuan untuk mempelajari absorpsi obat perkutan secara in vitro. Dalam absorpsi obat perkutan, terdapat fungsi stratum korneum sebagai penghalang mekanik. Diharapkan, melalui percobaan ini akan dapat diketahui fungsi stratum korneum tersebut sebagai penghalang mekanik absorpsi obat perkutan. Kulit sebagai organ tubuh terbesar memiliki beberapa susunan yang berlapis-lapis dengan struktur dan fungsi yang kompleks.
Lapisan-lapisan tersebut secara umum dapat dibagi menjadi 3, yaitu epidermis, dermis, dan jaringan subdermis yang berlemak.
Epidermis merupakan lapisan terluar kulit yang berfungsi untuk menghalangi hilangnya air, elektrolit, nutrient tubuh, dan juga berfungsi sebagai penahan masuknya senyawa asing dari luar. Epidermis tersusun dari 5 lapisan dari bawah ke atas, yaitu stratum corneum (lapisan tanduk), stratum lucidum (daerah sawar), stratum granulosum (lapisan seperti butir), stratum spinosum (lapisan sel duri), dan stratum germinativum (lapisan sel basal). Stratum corneum merupakan lapisan teratas epidermis yang mempunyai 10-15 lapis sel dengan ketebalan sekitar 10 μm (dalam keadaan kering), dan akan mengambang sampai beberapa kalinya jika terkena air. Sel-sel stratum corneum merupakan sel mati yang rata dan mengandung keratin, yaitu suatu protein hasil diferensiasi dengan kandungan 65%. Sel-sel ini memiliki bobot jenis 1,5 g/cm3 dengan ketebalan tiap selnya adalah 0,5-1,5 μm. Karena stratum corneum merupakan lapisan teratas dari epidermis, oleh karena itu fungsinya adalah sebagai penghalang terhadap masuknya benda-benda asing kedalam kulit sehingga memegang peranan penting dalam mengontrol absorbsi perkutan molekul-molekul obat. Permeabilitas selektif stratum corneum merupakan tema sentral dalam berbagai aspek untuk studi biofarmasetika produk-produk topikal.
Dermis merupakan lapisan kulit yang terletak diantara epidermis dan jaringan lemak subkutan. Memiliki tebal sekitar 3-5 mm. Lapisan dermis mengandung jaringan padat
dari serabut protein, seperti kolagen, reticulum, dan elastin yang disimpan dalam substansi dasar amorf dari mukopolisakarida. Di dalam dermis terdapat pembuluh pembuluh darah, syaraf, limfatik, kelenjar apokrin, kelenjar ekrin, folikel rambut, dan kelenjar sebasea. Dermis berfungsi sebagai pelindung tubuh dari luka, membuat lapisan epidermis menjadi lebih fleksibel, penghalang terhadap infeksi, dan sebagai organ penyimpan air.
Kelenjar keringat merupakan komponen kulit yang bertugas untuk mensekresi suatu larutan encer garam dan beberapa komponen lain, yaitu dalam bentuk keringat dimana 95% nya berupa air. Keringat yang dihasilkan oleh kelenjar keringat berfungsi seba gai pertahanan terhadap zat asing yang masuk karena keringat memiliki pH yang cukup asam yaitu 4,5-5,5. Kelenjar keringat sendiri berfungsi sebagai pengontrol panas dan sekresinya dirangsang oleh temperature luar yang tinggi dan proses dalam tubuh yang menghasilkan panas.
Kelenjar sebasea terdapat pada bagian leher tiap folikel rambut dengan diameter 2002000 μm. Kelenjar sebasea mensekresi material minyak dengan komposisi trigliserida 57,5%, ester-ester lilin 26%, squalane 12%, ester-ester kolesterol 3% dan kolesterol 1,5%. Komposisi ini bervariasi tergantung umur, jenis kelamin, dan bangsa. Sebum yang disekresikan ini menyebabkan terbentuknya lapisan tipis diskontinyu bahan lipofil pada beberapa permukaan kulit oleh karena itu sebum merupakan rute absorbsi obat untuk obat-obat larut lemak. Karena kulit terdiri dari berbagai lapisan seperti yang telah diuraikan diatas, maka
kulit yang utuh merupakan rintangan/ penghalang terhadap absorpsi obat melalui kulit. Langkah-langkah absorpsi obat melalui kulit yaitu: 1) Difusi bahan aktif (obat) pada lapisan batas antara pembawa (basis) dengan kulit. 2) Penetrasi melalui stratum corneum. 3) Permeasi obat ke dalam korium. 4) Resorpsi ke dalam peredaran darah. 5) Pengangkutan dan distribusi oleh darah. Sedangkan penetrasi obat melalui kulit dapat terjadi dengan 2 cara: 1) Rute transepidermal, yaitu difusi obat menembus stratum corneum. 2) Rute transfolikular, yaitu difusi obat melewati pori kel enjar keringat dan sebum. Secara skematis, dapat digambarkan sebagai berikut,
Disolusi obat ke dalam pembawa
Difusi obat melalui pembawa ke permukaan kulit
Rute transepidermal
Rute transfolikuler
Partisi ke dalam stratum korneum
Partisi ke dalam sebum
Difusi melintasi matriks protein-lipid dari
Difusi melintasi lipid di dalam pori
stratum korneum
sebasea
Partisi ke dalam epidermis
Difusi melintasi massa seluler dari epidermis
Difusi melintasi massa fibrous ke epidermis
Masuk ke dalam kapiler dan difusi sistemik
Skema absorpsi obat perkutan Rute transepidermal merupakan rute yang penting dikarenakan permukaan epidermis memiliki luas beberapa kali dari rute transfolikuler. Rute penembusan secara transepidermal disebut juga dengan transeluler. Rute transepidermal dan transfolikuler merupakan fungsi dari sifat dasar molekul yang dioleskan pada kulit. Difusi dapat terjadi jika ukuran molekul obat kecil yaitu ditentukan dari bobot molekulnya. Selain itu, obat juga bersifat lipofil sehingga obat dapat cepat tersebar pada lapisan tanduk dan dalam lipida yang terdapat dalam kelenjar sebasea. Penyerapan terjadi pada kedua tahap tersebut dengan intensitas yang tergantung pada permukaan relatif kedua struktur tersebut. Obat yang berdifusi dalam jumlah sedikit akan lebih cepat melintasi sebum dibandingkan dengan melalui lapisan tanduk. Pada tahap awal, yang paling menentukan adalah rute transfolikuler, selanjutnya pada tahap kedua yang paling menentukan adalah rute transepidermal karena terjadinya perbedaan difusi pada lapisan tanduk.
Absorpsi obat perkutan dipengaruhi oleh faktor fisiologi kulit dan faktor dari obat dan pembawanya. Faktor fisiologis dari kulit diantaranya adalah: a. Keadaan dan umur kulit Stratum korneum merupakan penghalang utama absorpsi obat perkutan karena stratum korneum terdiri dari sel-sel mati yang keras. Adanya kerusakan/ delipidasi pada stratum korneum akan meningkatkan efektivitas difusi obat kedalam kulit, kerena terjadinya delipidasi akan membentuk ‘shunts’ buatan dalam membrane, sehingga mengurangi tahanannya terhadap difusi. Umur kulit ditentukan dari umur manusia itu sendiri. Kulit anak-anak yang masih lentur akan lebih mudah mengabsorpsi obat dibandingkan dengan kulit orang dewasa. b. Aliran darah Perubahan debit darah ke kulit secara nyata mengubah kecepatan penembusan molekul. Semakin cepat aliran darah maka semakin cepat proses absorpsi. c. Tempat pengolesan Jumlah yang diserap untuk suatu molekul yang sama, akan berbeda tergantung pada anatomi tempat pengolesan, yaitu pada ketebalannya. Perbedaan ketebalan terutama disebabkan ketebalan lapisan tanduk yang berbeda pada setiap bagian tubuh. Beragamnya ketebalan membran, sesuai dengan hukum Fick, pada satu sisi menyebabkan
peningkatan
waktu
laten
yang
diperlukan
untuk
mencapai
kesetimbangan konsentrasi pada lapisan tanduk, di sisi lain menyebabkan pengurangan aliran darah. d. Kelembapan dan suhu Stratum korneum yang lembab mempunyai afinitas yang sama terhadap senyawa-senyawa yang larut dalam air atau dalam lipida. Sifat ini disebabkan oleh struktur histologi sel tanduk dan terutama oleh helai-helai keratin yang dapat mengembang dalam air dan pada media lipida amorf yang meresap di sekitarnya. Kelembapan dapat mengembangkan lapisan tanduk dengan pengurangan bobot jenisnya atau tahanan difusi. Suhu yang semakin tinggi akan meningkatkan laju penyerapan dikarenakan permeabilitas kulit yang meningkat. Hal ini disebabkan oleh vasodilatasi dan kenaikan aliran darah ke kulit se hingga difusi obat akan meningkat.
Kemampuan penembusan dan penyerapan perkutan obat terutama tergantung pada sifat-sifat fisiko-kimia dan pemilihan pembawanya. Peran bahan pembawa pada peristiwa ini sangat kompleks, pada keadaan bila senyawa tidak mengganggu fungsi fisiologis kulit, maka dapat dipastikan kulit tidak dapat melewatkan senyawa-sen yawa yang tidak diserap. 1. Faktor fisiko-kimia a. Tetapan difusi Tetapan difusi suatu membran berkaitan dengan tahanan yang menunjukkan keadaan perpindahan. Dikaitkan dengan gerakan Brown, tetapan difusi merupakan fungsi bobot molekul senyawa dan interaksi kimia dengan konstituen membran, dapat pula tergantung pada kekentalan media dan suhu. b. Konsentrasi zat aktif Menurut hukum Fick tentang difusi pasif, jumlah yang diserap setiap satua n luas permukaan dan satuan waktu adalah sebanding dengan konsentrasi senyawa dalam media pembawa. Maka, semakin besar konsentrasi zat maka difusi akan menjadi lebih cepat. c. Koefisien partisi Koefisien
partisi
antara
stratum
korneum-pembawa
ditentukan
dengan
keseimbangan pembagian molekul, keadaan ini tercapai setelah kontak yang lama antara lapisan tanduk dengan pembawa. Koefisien partisi yang tinggi mencerminkan afinitas senyawa yang diteliti dengan pembawanya. Koefisien partisi yang mendekati 1 menunjukkan bahwa molekul bergerak dalam jumlah yang sama menuju lapisan tanduk dan pembawa. Maka, senyawa yang mempunyai afinitas yang tinggi terhadap pembawanya tidak akan berdifusi dalam lapisan tanduk. Kelarutan senyawa dalam pembawanya berpengaruh terhadap koefisien partisi. 2.
Pemilihan pembawa Bahan pembawa dapat mempengaruhi struktur sawar kulit dan meningkatkan penyerapan senyawa yang terkait. Pemilihan bahan pembawa perlu diperhatikan agar bahan aktif dapat berdifusi dengan mudah ke dalam struktur.
Dalam percobaan ini digunakan bahan obat asam salisilat yang dilarutkan ke dalam aquadest. Adapun pemerian dari asam salisilat adalah sebagai berikut: Acidum Salicylicum
Rumus Molekul : C 7H6O3 Berat Molekul :138,12 Pemerian
: Hablur ringan tidak berwarna atau serbuk berwarna putih, hampir tidak berbau, rasa agak manis dan tajam. Hablur putih, biasanya ber bentuk jarum halus, atau serbuk hablur putih, tajam, dan stabil di udara.
Kelarutan
: Sukar larut dalam air dan dalam benzena, mudah larut dalam etanol dan dalam eter, larut dalam air mendidih, agak sukar larut dalam kloroform.
Penyimpanan
: Dalam wadah tertutup rapat (Anonim, 1995).
Sebanyak 375 mg asam salisilat dilarutkan ke dalam 250 ml aquadest sehingga kadarnya adalah 1,5 mg/ml. Pelarutan asam salisilat menggunakan sonikasi untuk mempercepat proses pelarutan karena asam salisilat merupakan bahan obat yang sukar larut dalam air. Pada percobaan ini digunakan membrane milipore sebagai membrane buatan, dan kulit tikus sebagai membrane asli. Langkah awal yang dilakukan adalah, menyiapkan tikus putih yang telah dimatikan untuk dicukur bulunya menggunakan electric clipper. Bulu-bulu tikus harus dicukur dahulu agar tidak mengganggu dalam pengamatan. Perlu diperhatikan juga bahwa pada saat mencukur, harus dilakukan dengan hati-hati agar tidak mengenai stratum korneumnya karena stratum korneum merupakan bagian kulit yang berperan sebagai barrier pertama dan utama dalam absorpsi obat perkutan sehingga bila mengenai stratum korneum maka data pengamatan yang diperoleh tidak valid. Pencukuran bulu dilakukan di kulit bagian dorsal (punggung) dari tubuh tikus. Kulit yang telah dicukur bulunya kemudian dipisahkan dari bagian lemak subkutan. Pemisahan lemak perlu dilakukan agar tidak menghambat absorpsi obat karena adanya lemak dapat menyebabkan terbentuknya lapisan diskontinyu bahan lipofil pada beberapa permukaan kulit sehingga lemak dapat menjadi rute absorpsi obat
untuk obat-obat larut lemak. Lemak yang menempel dipisahkan dengan menggunakan gunting bedah. Kulit kemudian dipotong melingkar yang sebelumnya ukurannya ditentukan dengan menggunakan malkulit, yaitu berukuran sesuai dengan bentuk dan luas kontak sel difusi. Kulit yang sudah dipotong kemudian direndam menggunakan buffer fosfat salin pH 7,4 untuk proses hidrasi membrane kulit sehingga akan terjadi partisi buffer fosfat kedalam membrane, akibatnya pori-pori kulit akan membuka dan kulit akan menjadi lembap. Proses hidrasi ini dilakukan selama 30 menit. Setelah 30 menit, membrane kulit diangkat dan selanjutnya dipasangkan pada alat sel difusi vertical. Membrane kulit ditempatkan diantara kompartemen
donor
dan
aseptor.
Kompartemen
donor
dan
aseptor
dihubungkan
menggunakan ring karet yang berguna untuk mencegah kebocoran. Kebocoran yang terjadi akan mengurangi volume cairan yang terdapat baik di dalam kompartemen donor maupun aseptor sehingga nantinya kadar obat yang diperoleh menjadi berkurang (tidak valid). Kemudian, sel difusi dipasang dengan menggunakan mur yang ada sehingga akan terbentuk suatu sistem sel side by side. Pemasangan mur harus dilakukan secara bersamaan agar sel difusi dapat terpasang dengan baik dan tidak terjadi kebocoran cairan. Larutan asam salisilat sebanyak 17 mL dengan kadar 1,5 mg/mL kemudian ditempatkan ke dalam kompartemen donor, sedangkan buffer fosfat salin pH 7,4 sebanyak 17 mL ditempatkan ke dalam kompartemen akseptor. Pemasukan kedua larutan tersebut dilakukan secara perlahan dan hati-hati, dan dicegah agar tidak timbul gelembung udara. Adanya gelembung udara dapat mengganggu proses difusi. Ke dalam kompartemen aseptor juga dimasukkan magnetic stirrer yang dijalankan. Magnetic stirrer digunakan dengan tujuan untuk menghomogenkan obat (asam salisilat) yang berdifusi dari kompartemen donor ke kompartemen aseptor melalui membrane kulit. Kecepatan putar magnetic stirrer harus dijaga agar alirannya tidak turbulen karena hal ini dapat menyebabkan zat terkonsentrasi di satu titik saja. Setelah itu, alat sel difusi dinyalakan, dan dianggap sebagai menit ke-0, kemudian dilakukan sampling dengan mengambil 2 mL larutan buffer fosfat salin pH 7,4 yang terdapat di dalam kompartemen aseptor. Pengambilan sampel dilakukan dengan pipet volume 1 mL dan dilakukan dengan hati-hati. Larutan yang telah diambil lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setiap kali pengambilan sampel, harus dilakukan juga penambahan larutan buffer fosfat salin pH 7,4 sebanyak volume pengambilan sampel, yaitu 2 mL. Penambahan ini bertujuan untuk mengembalikan buffer fosfat yang diambil pada saat sampling sehingga volume larutan di dalam kompartemen aseptor tetap (tidak berkurang). Karena adanya penambahan ini, maka perlu diperhatikan juga adanya faktor pengenceran terhadap sampel (asam salisilat).
Membran buatan yang digunakan dalam percobaan ini adalah membran millipore. Membran dipotong melingkar dengan diameter 3,2 cm menyesuaikan cincin penghubung antara kompartemen donor dan kompartemen akseptor pada sel difusi dan diletakkan pada cincin penghubung tersebut. Membran tersebut ditetesi dengan isopropyl miristat ke semua bagiannya secara merata dan didiamkan kurang lebih 5 menit. Hal ini bertujuan untuk memberikan kondisi yang sama terhadap kondisi adanya lipid pada membran kulit pada manusia. Kelebihan lipid dihilangkan dengan cara meletakkan membran di atas kertas saring. Membran dimasukkan ke dalam beker glass yang berisi buffer fosfat salin dengan pH 7,4 untuk proses hidrasi membran sehingga akan terjadi partisi buffer fosfat ke dalam membran selama 10 menit. Membran hasil hidrasi lalu diletakkan di antara kompartemen donor
dan akseptor. Untuk mencegah kebocoran, ditempatkan ring karet diantara
kompartemen tersebut. Sel difusi dipasang dengan mengencangkan mur yang ada sehingga terbentuk suatu sistem sel side by side. Larutan donor asam salisilat sebanyak 250 ml ditempatkan pada kompartemen donor dan larutan buffer fosfat salin pH 7,4 ditempatkan pada kompartemen akseptor. Pemasukan larutan hendaknya secara perlahan dan hati-hati melalui dinding kompartemen agar tidak keluar dan menyebabkan adanya gelembung udara yang akan mengganggu proses difusi. Jika terdapat adanya gelembung udara pada sel difusi maka alat dapat dimiringkan ke arah yang berlawanan agar gele mbung udara tersebut hilang. Sebelum masing-masing cairan pada kompartemen diaduk dengan mesin pengaduk listrik, dilakukan sampling sebagai menit ke-0. Sampel diambil dari kompartemen akseptor. Ketika mulai dilakukannya pengadukan, diusahakan posisi pengaduk adalah sedemikian rupa dengan kecepatan yang tidak menyebabkan aliran turbulen karena dapat menyebabkan zat terkonsentrasi pada satu titik saja atau bahkan cairan keluar dari wadah kompartemen. Perlakuan pengadukan terhadap dua kompartemen tersebut harus sama agar zat aktif dapat terdistribusi merata ke semua bagian. Selain sampling pada menit ke-0, pengukuran transpor dari kompartemen donor ke kompartemen akseptor ini dilakukan pada menit ke-15, 30, 45, 60, 75, dan 90. Pengukuran kadar asam salisilat dilakukan dengan pembacaan absorbansi dengan mengunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 296 nm (spektrofotometer UV). Blangko yang digunakan adalah buffer fosfat salin. Pengambilan sampel sebanyak 5 ml dan setiap kali pengambilan dilakukan pengembalian dengan menggunakan buffer fosfat salin pH 7,4 sebanyak 5 ml. Hal ini dimaksudkan agar volume larutan tetap (tidak berkurang) dan tetap dalam keadaan sink (Cs >> C). Pada praktikum kali ini, percobaan dilakukan dengan asumsi:
1. Lag time kinetik asam salisilat in vivo dapat diabaikan. 2. Fluks asam salisilat dari donor ke akseptor menggambarkan fluks asam salisilat dari donor menembus kulit menuju plasma. 3. Luas area difusi menggambarkan luas kontak antara sediaan transdermal dengan permukaan kulit. Berdasarkan kurva baku yang telah tersedia, maka dapat dihitung kadar asam salisilat yang terkandung dalam kompartemen akseptor per satuan waktu dengan memasukkan nilai absorbansi yang diperoleh setelah pengukuran dengan spektrofotometer. Kurva baku untuk pelarut buffer fosfat salin pH 7,4 yaitu: Y = 0,2499 X + 0,0048 Untuk kulit tikus setelah terbaca absorbansi pada menit ke-0, kemudian dilakukan pembacaan absorbansi pada menit ke-15, 30, 45, 60, 90, dan 120. Namun pengukuran pada menit ke-120 tidak dilakukan karena waktu praktikum sudah hampir berakhir. Dari hasil pengukuran, diperoleh absorbansi pada menit ke-0, 15, 30, 45, 60, dan 90 secara berturutturut adalah 0,048; 0,038; 0,042; 0,056; 0,064; dan 0,075 mg/ mL. Namun hasil pengukuran absorbansi pada menit ke-0 direject sehingga yang digunakan adalah absorbansi dari menit ke-15, 30, 45, 60, dan 90 saja. Dari kurva baku yang telah ditentukan yaitu y=0,2499x+0,0048, maka dapat dihitung kadar asam salisilat yang berada di kompartemen akseptor per satuan waktu dengan memasukkan nilai absorbansi yang diperoleh. Dari hasil perhitungan, dapat dilihat bahwa dari menit ke-0 sampai menit ke-90, jumlah obat yang berdifusi semakin meningkat, atau dengan kata lain, semakin lama kecepatan absorpsi obat melewati membrane kulit semakin cepat. Hal ini kemungkinan disebabkan karena terjadinya hidrasi pada membrane kulit yang mengakibatkan pengurangan densitas pori sehingga mengurangi ketahanan untuk ditembus molekul obat. Kadar asam salisilat per satuan waktu semakin lama semakin bertambah, begitu pula pada nilai Cp yang diperoleh sampai menit ke-90 yang mencapai 0,3119 mg/ mL. Pada percobaan in vitro, proses eliminasi tidak terjadi sehingga kadar obat di kompartemen akseptor akan selalu bertambah hingga tercapai kesetimbangan konsentrasi diantara kompartemen donor dengan kompartemen akseptor. Sedangkan pada percobaan in vivo, berlangsung proses distribusi dan eliminasi sehingga proses absorpsi akan terus berlangsung karena proses gradient konsentrasi selalu berjalan sehingga asam salisilat dapat terabsorpsi seluruhnya. Melalui perhitungan dengan kurva baku tersebut, diperoleh kadar obat untuk membran buatan, yaitu sebagai berikut:
Waktu sampling (menit) Kadar obat (mg/ml) 0
0,1809
15
1,2533
30
2,3017
45
3,1401
60
3,9336
90
5,1841
Adanya proses pengambilan dan pengembalian volume dikhawatirkan dapat mempengaruhi kadar yang diperoleh. Oleh karena itu, pada pengolahan data dilakukan penghitungan kadar terkoreksi untuk mengantisipasi hilangnya sebagian asam salisilat oleh karena pencuplikan, serta pengukuran jumlah kumulatif asam salisilat sehingga tetap menggambarkan jumlah asam salisilat yang seharusnya. Dengan demikian, diperoleh hasil sebagai berikut: Waktu Sampling (menit)
Kadar Terkoreksi Jumlah Obat yang
Jumlah Obat Kumulatif (mg)
(mg/ml)
Berdifusi (mg)
0
0,1809
0,9045
0,9045
15
1,2895
6,4475
7,3520
30
2,5524
12,7620
20,1140
45
3,6004
18,0020
38,1160
60
4,5616
22,8080
60,9240
90
5,9708
29,8540
90,7780
Apabila ditarik hubungan antara waktu sampling (menit) dengan jumlah obat kumulatif (mg), maka diperoleh persamaan: Y = 1,0527 X – 5,7445 Berdarkan tabel hasil perhitungan, dapat dilihat bahwa jumlah obat yang berdifusi bertambah tiap satuan waktu. Dengan kata lain semakin lama kecepatan absorpsi melewati membran millipore semakin besar (cepat), kemungkinan disebabkan karena terjadi hidrasi pada membran millipore yang akan mengurangi densitas (kerapatan) dari pori sehingga mengurangi ketahanan untuk ditembus oleh molekul obat. Hal ini dapat pula berpengaruh terhadap nilai Cp. Cp dihitung dengan unsur-unsur yaitu waktu paruh eliminasi (T 1/2el), konstanta kecepatan eliminasi (K), dan klirens total (Cl). Hasil perhitungan nilai Cp yaitu: Waktu(menit)
Cp (mg/L)
0
0
15
3,0644
30
5,9237
45
8,59915
60
11,0807
90
15,5702
Pada tabel dapat dilihat bahwa ternyata Cp juga mengalami kenaikan tiap satuan waktunya. Dalam percobaan secara in vitro tidak terja di proses eliminasi, sehingga kadar obat di kompartemen akseptor akan selalu bertambah sampai dengan dicapainya keadaan kesetimbangan konsentrasi obat antara kompartemen donor dan akseptor. Proses difusi terjadi karena adanya gradien konsentrasi sebagai driving force (tenaga pendorong). Sedangkan dalam percobaan in vivo berlangsung proses distribusi dan eliminasi s ehingga proses absorpsi terus berlangsung karena akan selalu terdapat gradien konsentrasi, sehingga asam salisilat dapat habis terabsorpsi semua. Dengan persamaan yang telah disebutkan sebelumnya, slope yang diperoleh (1,0527 mg/menit) dapat digunakan untuk menentukan fluks (kecepatan transfer obat melewati membran per satuan luas tempat pengaplikasian) yang menggambarkan jumlah obat yang melewati sawar fisik. sop (⁄) Fluks = uas ar dfus ()
Fluks yang diperoleh untuk percobaan menggunakan membran ini adalah 0,0328 mg/menit.cm2. Sedangkan nilai fluks untuk membran kulit adalah 1,3146x10 -3 mg/menit.cm2. Semakin besar nilai fluks berarti semakin mudah dan cepat absorpsi obat melewati membrane kulit, jadi untuk sediaan yang ditujukan berefek cepat, maka sebaiknya dibuat sediaan yang nilai fluksnya besar, dan sebaliknya. Selain fluks, dihitung pula parameter lainnya yaitu koefisien permeabilitas membran (P), yang menggambarkan permeabilitas membran millipore dan membran kulit untuk dilewati obat. Semakin besar nilai koefisien permeabilitas maka semakin mudah obat melewati membran dan sebaliknya. Dari percobaan ini diperoleh harga permeabilitas sebesar 0,0219
ml/menit.cm 2 untuk membran millipore dan 8,764 x 10 -4
ml/menit.cm2 untuk
membran kulit. Harga ini cukup memperlihatkan mudahnya obat melewati membran millipore dalam percobaan sedangkan untuk membran kulit, harga P yang diperoleh menunjukkan bahwa kemampuan obat untuk melewati membran kulit cukup sulit. Hal ini disebabkan karena pada kulit terdapat faktor penghalang yang tidak dimiliki oleh membran millipore, yaitu seperti lemak, dan lapisan-lapisan pada kulit. Dari percobaan, hasil yang
diperoleh sudah sesuai dengan teori, yaitu kemampuan obat melewati membran millipore lebih mudah jika dibandingkan dengan melewati membran kulit. Faktor-faktor penting yang mempengaruhi penetrasi dari suatu obat ke dalam kulit adalah: 1) Konsentrasi obat terlarut Cs, karena laju penetrasi sebanding dengan konsentrasi. 2) Koefisien partisi K antara kulit dan pembawa yang merupakan ukuran afinitas relatif dari obat tersebut untuk kulit dan pembawanya. 3) Koefisien difusi yang menggambarkan tahanan pergerakan molekul obat melalui barrier pembawa dan pembatas kulit. Besaran relatif dari kedua koefisien difusi menentukan apakah pelepasan dari pembawa atau perjalanan melalui kulit merupakan tahap penentu laju.
VI. KESIMPULAN
1. Absorpsi obat secara perkutan dipengaruhi oleh kelarutan dan koefisien partisi obat, konsentrasi obat, kondisi kulit atau membran, hidrasi membran, dan basis yang digunakan. 2. Pada uji in vitro absorpsi perkutan tidak terjadi proses eliminasi dan distribusi sehingga proses transfer massa molekul obat terhenti setelah keadaan setimbang di dalam kompartemen donor dan kompartemen akseptor. 3. Kadar asam salisilat per satuan waktu semakin lama semakin meningkat dikarenakan berkurangnya tahanan membrane (kulit) terhadap molekul obat. 4. Harga Cp dari menit ke-0 sampai menit ke-90 semakin lama semakin meningkat, menunjukkan bahwa absorpsi obat semakin meningkat. 5. Dari hasil percobaan dapat dilihat bahwa jumlah kumulatif obat yang berdifusi dan kadar obat yang berdifusi naik seiring dengan kenaikan waktu. 6. Hasil
percobaan
ml/menit.cm2 membran kulit
menunjukkan
dan nilai flux 8,764 x 10-4
nilai
0,0328
permeabilitas
membran
buatan
0,0219
mg/menit.cm2 . Sedangkan permeabilitas
ml/menit.cm2 dan nilai flux
1,3146 x 10-3
mg/menit.cm2 7. Kemampuan obat (asam salisilat) untuk melewati membran millipore lebih mudah dibandingkan dengan melewati membran kulit.
VII.DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Ansel, H., 1989, Pengantar Bentuk sediaan Farmasi, edisi keempat, Universitas Indonesia, Jakarta Grassi, Mario, etc., 2007, Understanding Drug Release and Absorption Mechanisms : A Physical and Mathematical Approach, CRC Press, Boca Raton. Martin, A., 1993, Farmasi Fisik, Dasar-dasar Farmasi Fisik dalam Ilmu Farmasetik , Universitas Indonesia, Jakarta Shargel, L dan Yu, A.B.C.,2005, Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan, Airlangga University Press Yogyakarta, 19 Oktober 2012 Praktikan Surya Indra K
(08534)
Anggit Yustitia A. (08537) M. N. Arifin
(08543)
Putu Dian M.K.
(08549)
LAMPIRAN
Jawaban Pertanyaan 1. Mengapa uji in vitro perlu dilakukan sebelum uji in vivo? Jawab : Karena studi absorpsi obat secara in vitro ini dapat untuk mengetahui profil dari suatu obat sehingga dapat digunakan untuk memperkirakan profil obat sebenarnya dan dapat digunakan sebagai acuan dalam melakukan uji in vivo. Sehingga uji in vitro ini dapat menghemat waktu dan biaya sebelum melakukan uji in vivo.
2. Bagaimanakah kriteria suatu obat agar formulasinya secara transdermal memberikan transport yang menjanjikan? Jawab: Sistem penghantaran transdermal merupakan formulasi obat yang mengandung bahan bahan yang membantu proses penetrasi obat melalui kulit. Penghalang kulit yang terdiri dari stratum korneum, epidermis dan dermis merupakan penghalang yang cukup tebal sehingga hanya obat-obat tertentu yang dapat diberikan melalui rute transdermal. Sebelum mencapai darah, obat melintasi penghalang stratum korneum yang lipofil kemudian epidermis yang hidrofil. Senyawa obat yang lipofil mudah menembus stratum korneum, namun tidak menembus epidermis, sehingga perjalanan menuju pembuluh darah obat terhambat. Senyawa obat yang hidrofil juga mengalami hambatan dalam penetrasi menembus stratum korneum yang sangat lipofil sehingga absorpsi sistemiknya terhambat. Cara pengatasannya adalah dengan mengubah sifat fisikokimia obat antara lain dengan penggunaan enhancer untuk senyawa hidrofil sehingga mudah penetrasi melalui stratum korneum. Pemberian enhancer bersama obat polar akan meningkatkan jumlah obat yang berdifusi melalui stratum korneum dan menembus epidermis serta dermis
untuk
mencapai
pembuluh
darah.
Mekanisme
kerja
enhancer
meningkatkan permeabilitas melalui jalur polar, lipid dan polar, maupun lipid.
adalah
