Laporan Praktikum Mikrobiologi
Nama NIM Kelas Kelompok Hari, Tanggal Waktu PJP Asisten
: Iin Mardianah : J3L112055 : KIM A-P2 :6 : Sabtu, 15 Oktober 2013 : 13.00-16.20 WIB : Harry Noviardi, S.Si, M.Si : Ramdhani Sitohang Yeni Anggraini
KUANTITASI MIKROBE, PERHITUNGAN TIDAK LANGSUNG “Teknik Pencawanan Untuk Menghitung Sel Hidup”
PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
Pendahuluan Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Hastowo 1992). Prinsip metode cawan hitung (Plate Count) adalah jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode perhitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk menghitung jumlah mikroba karena alasan-alasan: Hanya sel yang masih hidup yang dihitung; Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus; dan Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan spesifik (Ferdiaz 1996). Tujuan Praktikum bertujuan untuk mempelajari cara melakukan pengenceran serial dan menentukan jumlah bakteri dalam suatu sampel dengan metode hitungan cawan. Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah rak tabung reaksi, pipet 1ml yang steril, cawan petri kosong yang steril, batang penyebar, dan bunsen. Bahan yang digunakan adalah 12 ml media PCA cair bersuhu 50oC dalam tabung, 9 ml larutan fisiologis (0,85% NaCl) dalam tabung, dan media PCA dalam cawan petri. Prosedur Disiapkan tabung-tabung berisi garam fisiologis dan disusun berderet. Sampel suspensi bakteri dikocok sampai kekeruhannya rata. Pengenceran serial dilakukan pada sampel suspensi bakteri. Diambil secara aseptik 1 ml suspensi bakteri lalu masukkan ke tabung 9 ml pertama (10 -1), dikocok sampai homogen. Lalu secara aseptik dipipet 1 ml sampel dari tabung pengencer pertama dan masukkan ke dalam tabung pengencer kedua (10-2), dan seterusnya untuk tabungtabung pengencer selanjutnya hingga pengenceran ke lima. Disiapkan tiga cawan petri steril dan 3 cawan petri berisi PCA, beri kode sesuai dengan kode tabung pengencer yang akan dituang atau disebar. Dipipet 0,05 ml sampel dari tabung pengencer 6 dan 7 lalu masing-masing sebar pada media PCA menggunakan sprider. Dipipet 0,05 ml sampel dari tabung 5, 6, dan 7 sekali lagi lalu dituangkan ke dalam cawan petri steril kemudian tambahkan media PCA cair dan selanjutnya
digoyangkan secara perlahan-lahan. Agar dalam cawan dibiarkan menjadi padat. Setelah itu diletakkan dalam posisi terbalik untuk diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Dihitung jumlah koloni yang tumbuh (30-300) dan kalikan dengan faktor pengenceran. Data dan Hasil Pengamatan Tabel 1 Hasil Pengamatan Perhitungan Bakteri Tidak Langsung Jumlah koloni No Metode Cawan sebar
10-5
10-6
10-7
-
TSUD
TBUD
1
Jumlah bakteri (CFU/ ml)
Gambar
-
Cawan tuang
TSUD
2
TBUD
TBUD -
Gambar
Pembahasan Penghitungan jumlah mikroba tidak langsung bukanlah menghitung satuan sel mikroba namun koloni yang terbentuk dari satuan sel. Koloni yang tumbuh di dalam suatu medium itu tidaklah selalu berasal dari satu sel mikroorganisme, karena beberapa mikroorganisme tertentu cenderung untuk berkelompok atau berantai. Bila ditumbuhkan pada suatu medium dengan lingkungan yang sesuai, maka kelompok bakteri ini hanya akan menghasilkan satu koloni saja. Berdasarkan hal tersebut sering kali digunakan istilah Colony Forming Units (CFU) yang digunakan untuk perhitungan jumlah mikroorganisme hidup (Dwidjoseputro 1996). Cara yang paling umum digunakan untuk menghitung jumlah bakteri adalah perhitungan jumlah bakteri hidup. Dengan metode tersebut, pengenceran berseri dari sampel yang mengandung mikroorganisme ditanam pada media pertumbuhan yang sesuai. Suspensi dapat disebarkan pada permukaan pelat agar (spread plate method) atau dicampur dengan agar cair, yang kemudian dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat. Pelat agar tersebut kemudian diinkubasi pada kondisi yang memungkinkan mikroorganisme bereproduksi dan membentuk koloni yang terlibat tanpa bantuan mikroskop. Diasumsikan bahwa
setiap koloni bakteri akan muncul dari 1 sel bakteri. Oleh karena itu, dengan menghitung jumlah koloni dan memperhitungkan faktor pengenceran, jumlah bakteri pada sample asal dapat ditentukan (Harmita 2006). Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel, mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme diperkirakan dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang relatif konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida (LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan dengan kurva standar (Harmita 2006). Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquades dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady 1999). Sebelum dimasukkan kedalam media agar, suspensi bakteri terlebih dahulu diencerkan sehingga konsentrasi bakteri yang ada tidak terlalu besar. Faktor pengenceran akan dikalikan untuk menghitung jumlah koloni yang tumbuh. Perhitungan bakteri secara tidak langsung dibagi menjadi dua metode yaitu metode agar tuang (Pour Plate Method) dan metode sebar di atas plate agar (Spread Plate Method). Pengamatan setelah 2x24 jam, hasil yang didapatkan adalah TBUD (Terlalu Banyak Untuk Dihitung). Jumlah koloni yang didapat lebih dari 300 koloni. Selain itu, terdapat juga koloni yang TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung). Jumlah koloni yang didapat kurang dari 30. Koloni yang tumbuh dan koloni yanng diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30- 300 koloni (Gobel 2008). Merujuk pada Sandjaja (1992) yang menyatakan bahwa penghitungan jumlah mikrobakteria sangat dipengaruhi oleh jenis medium, lamanya waktu inkubasi dan cara menghitung koloni yang harus teliti. Lamanya waktu inkubasi, dengan 2x24 jam memungkinkan untuk banyaknya koloni yang tumbuh dalam cawan. Idealnya waktu inkubasi adalah 1x24 jam. Kemungkinan lain adalah, proses pengenceran yang dilakukan kurang banyak sehingga konsentrasi suspensi bakteri yang ditumbuhkan masih terlalu pekat, menyebabkan koloni bakteri yang diperoleh terlalu banyak (TBUD) sehingga sulit untuk dihitung. Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh mikroorganisme baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya (Lay 1994). Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifannya sehingga hasil perhitungan kadang kala menjadi bias. Kondisi pertumbuhan bakteri, termasuk komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan pH, sangat menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada. Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Contoh yang alami, misalnya pada tanah yang
mengadung berbagai jenis microorganisme, tidak mungkin untuk menghitung semua mikroorganisme yang terkandung didalamnya dengan cara viable plating tersebut. Kekurangan tersebut dapat menjadi suatu keunggulan jika kita ingin menghitung populasi mikroorganisme spesifik. Sebagai contoh, kita dapat mendesain prosedur yang selektif untuk menghitung bakteri koliform atau kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya (Harmita 2006). Simpulan Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa dengan pengenceran 10-5, 10-6, 10-7 dan waktu inkubasi 2x24 jam perhitungan bakteri dengan teknik pencawanan tidak langsung tidak dapat dilakukan. Hasil pengenceran yang dilakukan masih terlalu pekat sehingga jumlah koloni yang diperoleh terlalu banyak untuk dihitung (TBUD). Selain itu, terdapat juga koloni yang TSUD (Terlalu Sedikit Untuk Dihitung). Jumlah koloni yang didapat kurang dari 30, yaitu 8 koloni. Daftar Pustaka Brady J E. 1999. Kimia Universitas Asas dan Struktur. Jakarta: Binarupa Aksara. Dwidjoseputro. 1996. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Djambatan. Fardiaz S. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama. Gobel, Risco, B dkk. 2008. Mikrobiologi Umum Dalam Praktek. Makassar: Universitas Hasanuddin. Hastowo S . 1992 . Mikrobiologi . Jakarta: Rajawali. Harmita. 2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. Lay B W . 1992 . Analisis Mikroba Di Laboratrium . Jakarta : Rajawali. Sandjaja B. 1992. Isolasi dan Identifikasi Mikrobakteria. Jakarta: Widya Medika.
