Instituto de Ciencias Biológicas UNIVERSIDAD DE TALCA
Bases Biológicas y Bioquímicas Laboratorio 4, 17 de Junio de 2014 Odontología
OBSERVACION Y FUNCIÓN DE ORGANELOS CELULARES I. Mitocondrias. La respiración celular es el conjunto de reacciones bioquímicas por las cuales determinados compuestos orgánicos son degradados completamente, por oxidación, hasta convertirse en sustancias inorgánicas, proceso que rinde energía (en forma de ATP) aprovechable por la célula. En eucariotes, el proceso completo puede ser dividido en tres etapas, tres de las cuales se realizan en la mitocondria. La primera etapa ocurre en el citoplasma y concluye con la formación de 2 moléculas de ácido Pirúvico, si el sustrato es glucosa. Estas ingresan a la matriz mitocondrial para ser metabolizadas completamente en el ciclo de Krebs, dando como producto CO 2 y electrones o equivalentes reductores (NADH 2, FADH2). Los equivalentes reductores pasan a la cadena respiratoria (también llamada cadena de transporte de electrones) ubicada en la membrana interna mitocondrial, donde se utiliza oxígeno como último aceptor de electrones, formándose agua y generándose un gradiente de protones entre el espacio intermembrana y la matriz mitocondrial que, finalmente, permite la formación del nucleótido adenosintrifosfato (ATP), lo cual es mediado por el complejo Fo-F1 de la ATP sintetasa, en una etapa llamada fosforilación oxidativa. Estas tres últimas fases (el cíclo de Krebs, la cadena respiratoria y la fosforilación oxidativa) se producen solo si el medio es aeróbico y las células poseen mitocondrias. En todo el proceso participa gran cantidad de enzimas y se verifican muchas reacciones de óxido reducción.
MATERIALES. ! ! ! ! ! ! ! !
Solución de glucosa al 5% Microscopio compuesto Porta y cubre objetos Verde de Janus al 0.001 P/V Aceite de inmersión Agua destilada Caja de Petrí 24 horas antes de la práctica, agregar 10 granos de levadura a 5 cc de solución de glucosa al 5%. La suspensión se incuba a temperatura ambiente y sin cubrir el envase ( ambiente aeróbico). Transportarla de igual manera.
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PROCEDIMIENTO. A. Observación Microscópica de Levaduras:
Coloque sobre un portaobjetos bien limpio dos gotas de agua y agregue un granito de levadura. Agite suavemente la suspensión hasta que la levadura está bien repartida en toda el agua. Observe al microscopio, primero con lente de aumento menor, luego con aumento mayor y finalmente con objetivo de inmersión. Construya esquemas de lo observado y complete su informe de laboratorio. B. Observación de Mitocondrias:
Coloque en una caja de Petrí 5 gotas de levadura en incubación, agregue una gota de colorante verde de Janus y deje actuar durante 2 minutos. Luego de hacer una preparación microscópica, obsérvela con el objetivo de inmersión. Seleccione levaduras grandes donde pueda observar las mitocondrias y el núcleo de las células. Haga esquemas de lo observado y complete su informe de laboratorio. 2. Actividad Catalasa
El término peroxisoma fue introducido por De Duve para identificar cualquier microcuerpo que presente la secuencia flavín oxidasa-catalasa. Los peroxisomas son cuerpos delimitados por una membrana y contienen algunas enzimas. Son abundantes en las células hepáticas y en la de los túbulos renales, pero muy escasos o ausentes en otros tipos de células. Los peroxisomas contienen enzimas que actúan catalizando reacciones utilizando oxígeno molecular con formación de agua oxigenada: Flavin-Oxidasa RH2 + O2
R + H2O2
El agua oxigenada es un producto tóxico, que se degrada rápidamente dentro del propio peroxisoma por la enzima oxidativa CATALASA, en agua y oxígeno. Esta enzima constituye alrededor de 40% del total de proteínas del peroxisoma. Catalasa
2H2O2
2H2O + O2 (gas)
Los peroxisomas además de compartir con las mitocondrias la utilización de oxígeno molecular en la célula, también realizan !-oxidación de ácidos grasos, en especial aquellos de cadena larga, para su completa oxidación en las mitocondrias.
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MATERIALES. !
Cápsula petri ! Papa y rábano* ! Agua oxigenada (Peróxido de hidrógeno) ! Trozo de hígado y riñón de cerdo o ave. ! Hojas de afeitar (dos) El material marcado con asterisco lo aporta el estudiante por gru po.
PROCEDIMIENTO: Para poder estimar la velocidad de reacción considere una escala entre 0 y 5 (0 = no hay reacción; 1 = muy lento; 5 = muy rápido). Registre los datos en una tabla.
A. Actividad de la Catalasa de Tejido Vegetal sobre Agua Oxigenada. Haga un corte fino de rábano y uno de papa, cuyas dimensiones sean iguales. Coloque cada uno en diferente cajas Petri. Agregue sobre cada trozo tres gotas de H2O2. ¿Qué observa?.
B. Actividad de la Catalasa de tejidos animales sobre Agua Oxigenada. Hacer un corte fino de tejido hepático y renal, cuyas dimensiones sean iguales. Colóquelos sobre diferentes placas Petri y agregue tres gotas de agua oxigenada.
Tejido/Escala Papa Rábano Hígado Riñón
0
1
2
3
4
INTERPRETACION DE RESULTADOS: ¿Cuál es el tejido con mayor actividad y cuál el que tiene menor actividad? ¿Qué tienen en común y en qué se diferencian?. Mencione algunos procesos metabólicos de la célula que producen H2O2. El H2O2 se usa frecuentemente, como antiséptico. ¿Por qué? . Cuando es agregado a heridas produce burbujas. ¿Qué indica esto?.
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