BAB 1 PENDAHULUAN 1.1
Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peniliti yang berkaitan dengan genetika maupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekular ini telah dimulai pada akhir abad ke-19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang kimia dan biologi. biologi. Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19, setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau ata u molekul-molekul yang bermuatan listrik, list rik, dalam hal ini juga termasuk protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport
atau
perpindahan
melalui
partikel-partikel
listrik.
Metode
elektroforesis telah digunakan dan dikembangkan dalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya yang sangat sederhana dan sangat mudah. Didalam ilmu biologi maupun biologi molecular, metode elektroforesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik, dan genetic dari hewan ataupun tumbuhan.
BAB II ISI 2.1
Pengertian Elektroforesis
Fenomena elektroforesis dapat diketahui jika suatu fase zat bermuatan dan diberi beda potensial, maka fase itu akan berpindah sepanjang medium yang kontinyu ke arah katoda atau anoda sesuai dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan komponen atau molekul yang bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (katode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode). Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan : Fe = q.E
Dimana F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik. Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari
fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu. 2.2
Prinsip Operasi Elektroforesis
Elektroforesis merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi : memisahkan campuran bahan bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis, pemisahan dilakukan berdasarkan adanya pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada kutub negative (-) serta komponen bermuatan negative (-) pada kutub positif (+). Pergerakan yang terjadi disebut elektrokinetik. Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalah elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran. 2.3
Cara Kerja Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat).
Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan pada kolomkolom (disebut well atau "sumur") pada sisi elektroda negatif, kemudian dialirkan listrik dengan kutub yang terpisah satu sisi dengan sisi lainnya. Ketika aliran listrik diberikan, maka terjadi pengaliran elektron, sehingga zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah
salah
satu
kutub
listrik
sesuai
dengan
muatannya.
Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Pada elektroforesis terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak. Fase diam berfungsi menyaring objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis. Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi 2, yaitu : 1. Elektroforesis Planar 2. Elektroforesis Kolom Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis melainkan “elektrokromatografi”. Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut “efek joule” yang disebabkan karena adanya tumbukan partikel electron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara, yakni : 1. Pendinginan
2. Efek Konveksi Efek konvensi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat dari silica yang bermuatan netral atau negative. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur. 2.4
Jenis-jenis elektroforesis
Jenis elektroforesis antara lain, elektroforesis kertas, elektroforesis gel, dan elektroforesis kapiler. 2.4.1
Elektroforesis Kertas
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat terlarut. Teknik pemisahan DNA/RNA berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat
siklik,
yang
kemudian
menghasilkan nukleosida
2′ -
monoposfat dan 3′ -monoposfat . Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida ‘siklik’ yang membawa pada
kesimpulan
melalui
pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu
dinamakan
bahwa
‘elektroforesis‘,
yang
hidrolisis
dibuat
dari
RNA
kertas
terjadi
saring
Whatman nomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di
atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis. Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
2′ -monoposfat dan nukleosida
3′ -monoposfat)
yang
menyebabkan mobilitas alias pergerakan mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut. 2.4.2
Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam
untuk
memisahkan
molekul-molekul.
Awalnya
elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam)
untuk
memisahkan biomolekul yang
lebih
besar
seperti protein- protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media. Tahun 1955, Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam ( stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu. Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun =
kemudian
ditemukan
gel
poliakrilamida
( PAGE
Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui
proses
polimerisasi akrilamida
dan bis-akrilamida. PAGE ini
sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dangan ukuran lebih besar. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi yaitu memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Elektroforesis gel memisahkan
makromolekul
berdasarkan
laju
perpindahannya
melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik. Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu sebagai berikut : 1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer. 2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar. 3. Gel
agarosa
formaldehid
denaturasi,
berfungsi
untuk
menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar. Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari molekul DNA, yaitu: 1. Ukuran Molekul DNA Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar. 2. Konsentrasi gel semakin tinggi karena konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA dengan ukuran yang lebih besar.
3. Bentuk molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan yang berbentuk bulat. 4. Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah. 5. Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA. 6. Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA. 7. Larutan buffer, elektroforesis Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat migrasi DNA. Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya.
Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui
ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker
DNA adalah
lambda Hind III. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan DNA marker tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110--20.000 pb. Elektroforesis gel memiliki beberapa komponen yang terdiri dari: 1. Comb
:digunakan untuk membentuk well pada gel
agarosa. 2. Tray
:digunakan
untuk
sebagai
cetakan
agarosa. 3. Chamber
:digunakan sebagai wadah gel agarosa.
gel
4. Sumber listrik
:digunakan untuk memberi arus saat proses
elektroforesis. Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel. Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, lalu dapat di sequencing, dan juga untuk
pemurnian
diaplikasikan
atau purifikasi
untuk
membandingkan
gen
berbagai homolog
DNA.
macam dari
Elektroforesis kegiatan,
spesies
antara
yang
dapat lain
berbeda,
mengetahui susunan sekuens berbagai genom, DNA finger printing , mengetahui ada atau tidaknya gen-gen penyebab kelainan genetik atau penyakit tertentu, mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu, mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme atau aktivitas gen sebelum dan sesudah diberi perlakuan tertentu, mempelajari evolusi di tingkat molekular, mengetahui variasi genetik dalam populasi natural di alam, menentukan atau mengidentifikasi berat molekul fragmen DNA, RNA, protein dan aktivitas enzimatik, menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi melalui PCR, mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu, dan menentukan jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan plasmid DNA. Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi
berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan
silang
(cross-linker),
menghasilkan
jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan. Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan
ukuran
(yaitu
panjangnya),
zat
seperti
natrium
hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif. Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul
Etidium
sampel
bromida,
yang
perak,
telah
atau
terpisah
pewarna
dapat
"biru
dilihat.
Coomassie"
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel
berpendar
dalam
sinar
ultraviolet
(misalnya
setelah
"diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat. 2.4.3
Elektroforesis Kapiler
Elektroforesis digunakan
kapiler
adalah
untuk
metode elektroforesis yang memisahkan asam
amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi
tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Untuk aplikasi dalam berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis
farmasi.
Elektroforesis
kapiler
menggunakan
listrik
bertegangan tinggi yang menyebabkan semua komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan dengan teknik
pendeteksian
pemisahan
ini
spektrometri dipengaruhi
atau
elektrokimia.
Teknik
oleh
tegangan
listrik,
koefisien difusi, panjang, dan diameter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel. Metode ini memiliki efisiensi dan selektivitas yang baik namun boros listrik karena menggunakan tegangan tinggi dan alatnya juga mahal. Karakteristik elektroforesis kapiler yaitu : 1. Menggunakan pipa kapiler pada pemisahan elektroforesis. 2. Memanfaatkan medan listrik berkekuatan tinggi, lebih dari 5 V/cm. 3. Menggunakan detektor berteknologi modern, sebagaimana yang ada pada
kromatogram.
4. Efisiensinya kadangkala sama dengan kromatografi gas kapiler, namun juga bisa lebih besar. 5. Membutuhkan waktu beberapa menit untuk mengamati sampel. 6. Mudah diotomatiskan untuk menganalisis dalam segi kuantitatif, dan mudah digunakan. 7. Terbatas dalam mengkomsumsi atau melibatkan sejumlah reagent. 8. Metode ini lebih aplikatif untuk menyeleksi dalam ukuran luas, dibandingkan dengan teknik separasi lainnya. Dalam kromatografi modern, efisiensi (N) merupakan faktor penentu keberhasilan pemisahan. Oleh karena keluaran elektroforesis kapiler
menyerupai
kromatogram
maka
peak
elektroforesis
merupakan indicator efisiensi, semakin tajam suatu peak semakin
efisiensi
pemisahan
tersebut.
Selain
efisiensi
pemisahan
elektroforesis dapat dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat dinyatakan dalam formula berikut :
Dimana, µef menyatakan mobilitas elektroforetik, µeo adalah mobilitas alektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang diberikan, dan D adalah koefisien difusi solute. Salah satu keuntungan utama dari CE adalah dibutuhkan peralatan yang sederhana. CE terdiri dari satu daya tegangan tinggi, penyangga
reservoir,
sebuah
kapiler,
dan
sebuah
detektor.
Pengaturan dasar dapat diuraikan dengn peningkatan fitur seperti sampel, peralatan injeksi ganda, mengontrol suhu kapiler, pengaturan penyediaan daya, detektor ganda, dan kumpulan fraksi. Berbagai
model
elektroforesis
kapiler
dapat
dilakukan
menggunakan instrumen CE. Dasar dari perbedaan model pemisahan dapat dikarenakan bahwa elektroforesis kapiler telah dikembangkan dari suatu kombinasi elektroforesis dan teknik kromatografi. Istilah umumnya ini dapat dianggap sebagai pemisahan elektroforesis dari sejumlah senyawa di dalam tabung sempit. Walaupun sebagian besar aplikasi telah dilakukan menggunakan cairan sebagai media pemisah, teknik elektroforesis kapiler dimana kapiler berisi elektroforesis gel, lapisan kromatografi. Instrumentasi CE terdiri dari : 1. Pipa kapiler Pipa kapiler bertindak sebagai kolom tempat proses pemisahan pengganti kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvensional. Pipa kapiler terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 µm dan panjang antara 50-100 cm. semakin kecil ukuran diameter pipa kapiler maka semakin besar
harga N. Oleh karena itu, semakin besar diameter (>100) maka pemisahan semakin tidak efisien. 2. Larutan buffer Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut tercelup dalam larutan buffer. Larutan buffer berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan arus listrik dan untuk pengontrol muatan molekul. Karena molekul dapat bermuatan positif, negative, atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dalam menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan elektroforesis.
3. Sumber arus searah Dalam elektoforesi konvesional dialirkan arus searah sekitar 100 volt tetapi dalam elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertegangan sangat tinggi 10.000-30.000 volt. Oleh karena itu, ekperimen elektroforesis kapiler dapat dilakukan dalam beberapa menit sedangkan eksperimen elektroforesis konvensional dilakukan dalam waktu sehari. 4. Detector Detector dapat diletakkan disalah satu ujung pipa kapiler yaitu dekat katoda. Berbagai detector telah digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain : spektrometri
(seperti
UV
dan
fluoresen)
dan
detector
elektrokimia (seperti konduktometri dan amperometri). Contoh Aplikasi Elektroforesis : 1. Pemisahan ion Li+ dan Na+ Kedua kation ini, Li + dan Na+ sama-sama memiliki muatan +1, namun memiliki ukuran berbeda. Ion Li + memiliki ukuran yang lebih kecil dari Na+. Ion Li + akan lebih tersolvasi dengan air sehingga akan mengikat banyak molekul air. Akibatnya mobilitas
Li+ akan menjadi kecil dan ion Na + akan lebih dahulu keluar dari kapiler. 2. Pemisahan
NO2- dan
NO3- menggunakan
EOF
(El e c t r o
Osmotic Flow) HNO3 merupakan asam kuat, dalam air akan terurai sempurna menjadi H+ dan NO3- , sedangkan HNO 2 merupakan asam lemah, dalam air akan terdisosiasi sebagian. Pada pH 7, HNO2 akan terdisosiasi sebagian, menyisakan spesi HNO 2. Hal ini tidak baik untuk pemisahan karena tidak semua HNO 2 berada dalam spesi NO2-. Untuk melakukan pemisahan dengan baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga kedua spesi tersebut dapat berada dalam bentuk anionnya. Namun ketika pH sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak pada elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan menuju pada kutub yang sama. Pemisahan dapat tetap dilakukan dengan baik asalkan muatan detektor diatur menjadi positif dan muatan injektor diatur menjadi negatif. Sistem yang berdasarkan pada skema (a) hanya akan menghasilkan satu puncak, artinya pemisahan tidak berlangsung dengan baik. Pada skema (b) akan muncul dua puncak, artinya pemisahan NO 3- dan NO2-terjadi dengan baik. Hal ini disebabkan karena nilai mobilitas elektroforetik (μep) NO 3- lebih kecil dibanding μep NO2- , akibatnya mobilitas total (μt) NO2- menjadi lebih besar dari μt NO3- . Hal ini akan berakibat NO2- akan keluar terlebih dahulu dibanding NO 3- . Untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya : a. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap sebuah kasus.
b. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR. c. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA. 2.5
Medium Pendukung
Elektroforesis untuk makromolekuler memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu cairan dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relative stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan
penyerapan,
migrasi
penyaringan
berdasarkan
ukuran
electron
(elektro
molekulnya
osmosis),
yang
atau
kesemuanya
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa. 2.5.1
Cellulose asetat
2.5.2
Larutan Buffer
Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu : 1. Komposisi Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat.
2. Konsentrasi Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa akan meningkat dan bagian aliran yang dibawa
sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas jugs meningkat, biasanya dipilih konsentrasi sebesar 0,05 – 0,10 M. 3. pH Tingkat ionisasi asam-asam organic akan bertambah apabila pH bertambah sebaliknya untuk basa-basa organic. Oleh sebab itu, tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. 2.5.3
Medan Elektrik
Apabila voltase diberikan diantara dua elektroda, arus ditentukan oleh tahanan dalam medium : 1. Voltase Apabila jarak antara dua elektroda adalah 1 meter dan perbedaan potensial antara keduanya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion. 2. Aliran listrik Arus aliran listrik dalam larutan antara dua elektroda disebabkan umumnya oleh ion buffer dan sedikit oleh ion dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya. 3. Tahanan Medium elektroforesa menimbulkan aliran ion sebandin dengan jenis medium, jenis buffer, dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun
berkurang
dengan
bertambahnya
elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.
luas
permukaan
BAB III PENUTUP 3.1
Kesimpulan
Dari pembahasan materi yang telah dijabarkan, dapat ditarik beberapa kesimpulan, antara lain sebagai berikut: 1. Elektroforesis
merupakan
teknik
pemisahan
komponen
atau
molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. 2. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi, yaitu memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. 3. Jenis-jenis elektroforesis yaitu elektroforesis kertas, elektroforesis gel dan elektroforesis kapiler. 4. Elektroforesis
dapat
berbagai bidang.
digunakan
untuk
meneliti
DNA
dalam
MAKALAH ANALISA KIMIA HASIL PERTANIAN “KROMATOGRAFI
ELEKTROFORESIS”
Disusun oleh : 1. Anan Prayogo (15/17963) 2. Debora Cita Ariani Saragih Sumbayak (15/17829) 3. Wuriyan Pangestu (15/17537)
SARJANA TEKNOLOGI INDUSTRI PERKEBUNAN DAN PANGAN JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN STIPER YOGYAKARTA 2017
