KONSEP VALIDASI METODE UJI
Tabel Daftar Metode Uji Standar Kelas 2B NO
NAMA
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
6
6
7
7
8 9 10 11 12 13 14 15
8 9 10 11 12 13 14 15
NIM
METODE STANDAR
JUDUL
Keterangan
METODE ABSOLUT & PERBANDINGAN
• Metode Absolut – Gravimetri – Gravimetri – Titrimetri – Titrimetri • Metode Perbandingan – Spektrofotometri – Spektrofotometri (UV/Vis, AAS, Spektrofluorometri) – Kromatografi – Kromatografi (TLC, GC, HPLC)
METODE ABSOLUT ( TERTELUSUR TERTELUSU R KE SI )
•
Ketertelusuran pengukuran massa (berat) di laboratoriumanalisis / penguji ke standar yang lebih tinggi (standar nasional dan SI); U adalah ketidakpastian
METODE STANDAR
METODE BERBASIS KINERJA ATAU UNJUK KERJA (PRESISI & AKURASI)
METODE STANDAR Secara
resmi disetujui dan disahkan
oleh Institusi Ilmiah yang berwenang (AOAC, ASTM, dll) Prosedur
diikuti agar dapat diperoleh
hasil yang benar
METODE BERBASIS KINERJA
Metode tidak lagi memerlukan status “resmi”
Unjuk
kerja metode didasarkan pada presisi
dan akurasi Untuk
itu dibutuhkan bahan acuan dengan
“nilai benar”
Bagaimana halnya dengan Metode Standar/Baku??? Bukankah metode standar sudah dilakukan validasi ? Siapa yang melakukan validasi metode tersebut ? Apabila metode metode standar digunakan digunakan di salah satu laboratorium, akan dipertanyakan: 1. Apakah analis di laboratorium tersebut sama skill nya dengan analis yang memvalidasi metode baku tersebut ? 2.Apakah peralatan analisis yang digunakan sama kondisi baiknya dengan peralatan yang digunakan untuk validasi metode tersebut? Oleh karenanya metode standar harus dilakukan verifikasi
Bagaimana menetapkan Unjuk kerja metode ????? Diatur dalam : NATA, Technical Note 17 — October 2013, Guidelines for the validation and verification of quantitative and qualitative test methods EURACHEM GUIDE mengenai Validasi Metode Apa itu Validasi Validasi Metode didefinisikan didefinisikan dalam ISO 17025 :2005
ISO/IEC 17025:2005 tentang Validasi Metode 5.4.5 Validasi Metode 5.4.5.1 Validasi adalah konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti yang objektif bahwa persyaratan tertentu untuk suatu s uatu maksud khusus dipenuhi 5.4.5.2 Laboratorium harus memvalidasi: a. metode titidak ba baku b. metode metode yang yang dide didesai sain/d n/dike ikemba mbangk ngkan an labor laborato atoriu rium m c. metode metode baku baku yang yang digun digunaka akan n dilua diluarr lingkup lingkup yang yang dima dimaksu ksudka dkan n d. meto metode de baku baku yang yang dimo dimodi difik fikas asii
e. metode metode baku untuk untuk meneg menegaska askan n dan dan mengk mengkonfi onfirmas rmasii bahwa bahwa metode itu sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan. 5.4.5.3 Laboratorium harus merekam hasil yang diperoleh, prosedur yang digunakan untuk validasi dan pernyataan bahwa metode tersebut tepat untuk penggunaan yang dimaksud.
Kapan Suatu Metode perlu di Validasi ? Apabila metode tersebut baru dikembangkan untuk suatu permasalahan yang khusus Apabila metode yang selama ini sudah rutin, direvisi untuk suatu pengembangan atau diperluas untuk memecahkan suatu permasalahan analisa yang baru Apabila hasil QC menunjukkan bahwa metode yang sudah rutin tersebut berubah terhadap waktu (QC charts) Apabila metode rutin digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dilakukan oleh analis yang berbeda atau dilakukan dengan peralatan yang berbeda
MENGAPA METODE DIVALIDASI -Untuk meyakinkan bahwa metode analisis dapat menghasilkan datadata yang handal sesuai kualitas yang diinginkan
-Menentukan karakteristik kinerja metode analisis untuk diterapkan oleh laboratorium pengguna -Menetapkan ruang lingkup dan batasannya -Menyediakan data untuk menyusun parameter pengendalian mutu yang tepat - Menyediakan informasi ketidakpastian uji
Kapan Suatu Metode perlu di Validasi ? 1. Apabila metode tersebut baru dikembangkan untuk suatu permasalahan yang khusus 2. Apabila metode yang selama ini sudah rutin, direvisi untuk suatu pengembangan atau diperluas untuk memecahkan suatu permasalahan analisa yang baru 3. Apabila hasil QC menunjukkan bahwa metode yang sudah rutin tersebut berubah terhadap waktu (QC charts) 4. Apabila metode rutin digunakan di laboratorium yang berbeda, atau dilakukan oleh analis yang berbeda atau dilakukan dengan peralatan yang berbeda
BAGAIMANA MEMVALIDASI METODE? 1. Tetapkan kriteria minimum (spesifikasi). 2. Demonstrasikan spesifisitas (membuktikan bahwa pengukuran analit tidak terganggu oleh kontaminan). 3. Tetapkan parameter/unjuk kerja metode uji
Dalam Proses Validasi Metode Penentuan parameter-parameter unjuk
kerja metode dilakukan menggunakan peralatan yang memenuhi spesifikasi, bekerja dengan baik dan terkalibrasi secara memadai. Dikerjakan
analis yang kompeten
ANALYTICAL METHOD VALIDATION (AMV) PRESISI AKURASI LIMIT DETEKSI (LOD) : IDL; MDL
LIMIT QUANTITASI PARAMETER /UNJUK KERJA
KONFIRMASI IDENTITAS
VALIDASI METODE UJI
SELEKTIVITAS
SPESIFISITAS
LINEARITAS & SENSITIVITAS DAERAH KERJA/ RANGE
ROBUSTNESS UNCERTAINTY/ KETIDAKPASTIAN
PARAMETER PRESISI Kedekatan beberapa nilai pengukuran dari sampel yang homogen pada kondisi normal (sampel yang sama dan diuji secara berurutan) Terdiri atas : Repeatability , intermediate precision dan reproducibility
PRESISI Repeatability
Within lab.precision Melihat konsistensi analis, tingkat kesulitan metode, kesesuaian metode dan conto uji. Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji yang dilakukan pada kondisi operator, alat, sample, lab yang sama dalam interval pemeriksaan waktu yang singkat
PRESISI
intermediate precis ion Memastikan bahwa dalam laboratorium yang sama metode akan menyediakan hasil yang sama Untuk mengevaluasi kinerja operator, mengetahui dan meningkatkan mutu lab dan mengetahui tingkat kesulitan metode Variasi pengukuran dengan waktu yang lebih lama dan ditentukan dengan membandingkan hasil antara metode yang dilakukan di lab.yang sama Hasil presisi dengan cara mengulang pemeriksaan dengan menggunakan alat yang berbeda, operator yang berbeda, hari yang berbeda, standar dan pereaksi dari suplier berbeda atau kombinasi di atas pada lab yang sama Evaluasi pengolahan data dapat menggunakan statistik dasar Uji F
PRESISI
reproducibility Between lab precision Memastikan bahwa metode menyediakan hasil yang sama di lab. yang berbeda Mengetahui kehandalan/kinerja lab Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji dari sampel yang sama pada kondisi operator, peralatan, lab dan waktu yang berbeda Validasi reprodusibilitas penting dilakukan jika metode akan digunakan di lab yang berbeda
Faktor yang mempengaruhi Reprodusibilitas
• Perbedaan suhu kamar dan kelembaban • Operator dengan pengalaman dan pengetahuan berbeda • Peralatan dengan karakteristik berbeda • Variasi bahan dan kondisi instrumen • Umur pakai alat yang berbeda • Pelarut, pereaksi dan bahan lain dengan mutu berbeda 2/16/2017
PRESISI
reproducibility Between lab precision Memastikan bahwa metode menyediakan hasil yang sama di lab. yang berbeda Mengetahui kehandalan/kinerja lab Presisi yang mengukur keragaman nilai hasil uji dari sampel yang sama pada kondisi operator, peralatan, lab dan waktu yang berbeda Validasi reprodusibilitas penting dilakukan jika metode akan digunakan di lab yang berbeda
TAHAPAN UJI PRESISI Langkah – langkah : Siapkan sampel sesuai dengan metode yang akan divalidasi / diverifikasi Hitung kadar contoh tersebut sebanyak minimal 7 kali Hitung standar deviasi (SD), presisi (RSD), dan koefisien variansi (CV%) dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
PRESISI
Bandingkan CV(%) hasil percobaan dengan CV(%) yang terdapat pada metode acuan. Jika pada metode acuan tidak terdapat CV(%) metode bandingkan dengan CV(%)Horwitz. Persyaratan hasilnya harus lebih rendah dari 2/3 CV(%) Horwitz
%CV HORWITZ = 2
1-0,5Log C
dimana: C adalah fraksi konsentrasi
PRESISI Untuk presisi yang dilakukan 2 kali pengulangan pengujian, evaluasi berdasarkan hasil RPD (( Relative Percent Difference ) yang dirumuskan sebagai berikut :
Dengan pengertian : X = Rerata hasil pengujian X1= Hasil pengujian pertama x2= Hasil pengujian kedua
LATIHAN HASIL UJI PRESISI (REPEATABILITLYI)
No
Abs
1
0.1625 0.1422 0.1598 0.1634 0.1602 0.1549 0.1557
2 3 4 5 6 7
Rerata SB (SD) % SBR (RSD) Syarat Keberterimaan %RSD < (2/3 CV Horwitz)= 10,43%)
Konsentrasi Fe (mg/L)
1.2077 1.0443 1.1860 1.2150 1.1892 1.1465 1.1530 1,16 0,06 5,01% 5,01% < 10,43%
Simpulan : Presisi diterima
LATIHAN HASIL UJI PRESISI ANTARA/INTERMEDIATE Ulangan
Kadar Fe dalam Logam Alloy (ppm) Analis 1
Analis 2
1
96,45
99,20
2
97,43
99,28
3
97,59
99,57
4
96,61
99,38
5
97,33
97,12
6
96,75
99,50
Rata-rata SD %RSD %RSD Gabungan Syarat Keberterimaan %RSD Gabungan
F hitung F table
% RSD gab < 5%
F hit < F tab
PARAMETER AKURASI •
• •
Menurut ISO, akurasi didefinisikan sebagai kesesuaian antara hasil uji analisis dengan nilai benar analit (atau nilai acuan analit yang dapat diterima). Menunjukkan kedekatan antara hasil percobaan dengan nilai acuan/sebenarnya ( Trueness/akurasi rata-rata). Adanya penyimpangan nilai rata-rata hasil pengukuran dari nilai sebenarnya disebabkan adanya bias Bias : perbedaan hasil analisis rata-rata dengan nilai acuan Bias : (A B) x 100 ; A = nilai acuan; B = rata-rata uji A Nilai keberterimaan : bias (-2.0) % s.d (+ 2,0) % –
• Akurasi dapat ditentukan melalui berbagai cara: – Pengukuran CRM (evaluasi : uji t tunggal, Recovery atau Bias) – Perbandingan dengan metode lain (evaluasi : uji beda nyata) – Pemakaian jumlah sampel yang berbeda (evaluasi : uji beda nyata) – teknik Recovery ( Rec = Kadar(perc)/Kadar(acuan))
AKURASI ( Penggunaan CRM ) • Yang diuji : CRM masing-masing dianalisis 10 kali memakai metode yang divalidasi • Yang dihitung : Hasil rata-rata CRM dikoreksi hasil rata-rata blanko pelarut Evaluasi akurasi dapat terdiri atas : (hasil
rata-rata CRM – nilai sertifikat) bias atau Uji t tunggal Recovery (nilai percobaan terhadap nilai benarnya) atau (nilai percobaan terhadap nilai teoritisnya)
AKURASI ( Penggunaan CRM ) Cara Menghitung Akurasi • Nilai benar kandungan benzoat dalam bahan acuan juice jeruk misal 50 ppm • Hasil analisis memberikan data sebesar 49,24 ppm • Bias (%) = /50 - 49,24/ x 100 % 50 = 1,52%
Recovery Latar Belakang •
Dalam suatu pengujian sampel, analit yang terkait dalam matriks sampel harus dilarutkan/diekstraksi/dibebaskan sebelum dapat diukur. • Agar hasil pengujian akurat maka efisiensi pelarutan/ekstraksi itu harus 100% • Selain itu, analit tidak boleh hilang (menguap, masih terikat pada kolom pemisahan, lolos pada penyaringan dsb.) selama proses preparasi contoh berlangsung. Uji Recovery ini terdiri dari : 1. Pengujian atas CRM 2. Pengujian sampel yang diperkaya (spike) dengan sejumlah kuantitatif standar analit yang akan ditetapkan. Pada uji Recovery teknik spiking ini dibutuhkan : - Sampel - Standar analit •
Permasalahan pada Teknik Recovery •
Kapan recovery harus diperhitungkan dalam metode analisis? Apabila prosedur pre-treatment sampel atau preparasinya pada metode yang digunakan cukup panjang
•
Bagaimana Jika preparasi sampel simple/pendek ? Sebagai ilustrasi, recovery tidak perlu diperhitungkan jika sampel hanya disaring dengan membran dan setelah itu siap diinjeksikan pada kolom HPLC .
Faktor-faktor yang dapat dievaluasi dari teknik recovery 1. Efisiensi desktruksi, ekstraksi terhadap lepasnya analit dari matriksnya (apa 100%?) 2. Kerusakan analit dalam hidrolisa sejauh mana, sehingga berpengaruh pada pengukuran analit. 3. pre treatment yang panjang seperi residu pestisida (apakah analit ada yang hilang??)
1. Recovery Menggunakan CRM CRM selalu disertai dengan sertifikat CRM tersebut • Pada sertifikat tertulis, konsentrasi analit = C.CRM (ppm) ± μ(ppm) μ adalah nilai ketidakpastian konsentrasi • Untuk percobaan recovery, diambil sejumlah tertentu CRM, analisis menggunakan metode yang akan divalidasi. Jika hasil analisisnya adalah : Canalisis (ppm) Ulangi percobaan diatas minimal 7 kali • Hitung nilai rata-rata Canalisis (ppm) Recovery dihitung sebagai berikut: Recovery metode = (Crata2 analisis/C.CRM) x 100%
Studi Kasus Percobaan Recovery menggunakan CRM dari unsur logam Pb dalamCRM Logam Alloy
• CCRM = (7,911 ± 0,005) µg/g • Dari 6 kali analisis yang dilakukan laboratorium menggunakan metode yang sedang divalidasi, diperoleh data bahwa konsentrasi rata-rata logam Pb dalam CRM Logam Alloy adalah: • Crata-rata = 7,123 µg/g • Recovery Metode = (7,123/7,911) x 100 % = 90,04 %
2. Recovery dengan teknik s piking : •
Mula-mula sampel diuji dan hasil pengujian = C1
•
Kepada sampel yang sama ditambahkan (spiking) sejumlah analit yang diketahui banyaknya, misalnya konsentrasi = C2, lalu dilakukan pengujian dengan hasil C3
• Analit yang diperoleh kembali = (C3 – C1) dari banyaknya yang ditambahkan (C2) •
Nilai perolehan kembali/Recovery (%) = (C3 – C1) x 100 C2
• Apabila dalam pengujian ini tidak ada kesalahan sistematik maka recovery tidak akan berbeda secara signifikan dari 100%
CONTOH : LANGKAH KERJA UJI RECOVERY TEKNIK SPIKING 1. Penetapan Fe dalam sampel
100 mL
0,01 - 1 g sampel alloy
Ukur Absorban Sebagai Kadar Fe dlm sampel (C1)
2. Uji Recovery
5 mL Fe 100 mg/L Spike Fe stdr ..... % (C2) bobot sampel alloy yg ditimbang (0,01 g)
100 mL
Dilakukan pengenceran 10x Ukur Absorban Kadar Fe dlm (sampel + spike) (C3)
Lanjutan : DATA HASIL UJI RECOVERY TEKNIK SPIKING 1. Data standar Fe Deret Std Fe ( mg/L )
0 0.5 1 2 3 4
Abs
2. Kadar rata-rata Fe dalam sampel = 22,91%
0.0080 0.0497 3. Standar Fe yang ditambahkan/spiking (5mL Fe 100 mg/L ke masing-masing bobot sampel 0.0986 0.1932 4. Data pengukuran Abs Fe dalam sampel yang 0.2810 Telah dispiking 0.3630 Abs Fe Analit Fe
Ulangan
1 2 3 4 5 6 7
Bobot sampel (g)
0.0104 0.0103 0.0102 0.0106 0.0103 0.0106 0.0104
dlm Kons kadar Fe yg Kadar stdr sampel (mg/L) yg sdh dispike Fe yg dispike yg sdh ( % ) (C2) sdh stdr dispike dispike ( % ) C3 stdr
0.2645 0.2657 0.2588 0.2686 0.2614 0.2665 0.2663 Rata-rata
% Rec
PARAMETER (LOD) LIMIT DETEKSI •
Limit deteksi (LD) menurut Greenberg, A.E dkk adalah konsentrasi terendah dari analit dalam sampel yang dapat dideteksi diatas noise atau blanko dalam suatu prosedur analisis untuk confidence limit (batas kepercayaan) tertentu. Confidence limi t perlu ditentukan agar kesalahan deteksi dan tidak terdeteksi peluangnya kecil yaitu maksimum 5%.
•
Menurut Greenberg, A.E dkk , beberapa istilah yang digunakan untuk menyatakan Limit deteksi khusus sbb : - LOD (IDL) (Instrument Detection Limit) - MDL (Method Detection Limit) - LOQ (Limit of Quantitation)
Seringkali IDL digunakan sebagai pedoman untuk menetapkan MDL. Hubungan antara Limit-Limit tersebut seperti berikut : LOD(IDL) : MDL : LOQ = 1 : 4 : 10
Beberapa Blanko Sampel : • Pada penetapan residu pestisida dalam beras, sebagai blanko sampel dapat dipakai beras organik • Pada penetapan kadar antibiotika dalam ikan; sebagai blanko sampel dapat digunakan ikan yang dibudidayakan tanpa penambahan antibiotika atau ikan yang ditangkap di tengah laut lepas • Pada penetapan aditif dalam juice jeruk, blanko sampel dibuat dari buah jeruk yang diperas.
CARA MENETAPKAN LIMIT DETEKSI (LOD) 1. LOD berdasarkan analisis kualitatif (visual evaluation) 2. LOD berdasarkan pengukuran larutan blanko (n > 20 untuk blanko; n > 10 untuk blanko sampel). Rumus yang digunakan : LOD teoritis = nilai rata-rata konsentrasi blanko + (3SDblanko);
kemudian LOD tersebut dikonfirmasi kembali melalui pengujian. (LOD ini merupakan LDI karena menggunakan instrumentasi) 3. LOD (LDI teoritis) berdasarkan persamaan kurva kalibrasi, kemudian LOD tersebut dikonfirmasi kembali melalui pengujian LODteoritiS = (3Sy/x)/b
; b = slope kurva
4. LOD berdasarkan signal terhadap noise (2:1) atau (3:1)
1. Evaluasi LOD berdasarkan analisis kualitatif :
• Ukur blanko yang ditambahi analit dengan berbagai konsentrasi yang berbeda, dimana untuk masing-masing konsentrasi 10 buah, semua diukur @ 1 kali • Tentukan tingkat konsentrasi di bawah mana identifikasi analit menjadi kurang andal
2/16/2017
Lanjutan 1. Contoh : Limit deteksi analisis kualitatif : • Kons analit (mg/L) 200 100 75 50 25
Replikasi analisis 10 10 10 10 10
Hasil +/-
10/0 10/0 5/5 1/9 0/10
Di bawah konsentrasi 100 mg/L identifikasi yang positif menjadi kurang andal
2/16/2017
2. Evaluasi LOD berdasarkan pengukuran larutan blanko a.
Deret Standar Fe ( mg/L ) 0.00 0.25 0.50 1.00 2.00 3.00 4.00
Rata - rata Abs
Ulangan blanko Abs sampel 1 0.0106 2 0.0100 3 0.0100 4 0.0091 5 0.0095 6 0.0108 7 0.0100 8 0.0090 9 0.0105 10 0.0089 Rerata SD 3 SD LOD Fe teoritis (mg/L)
b.
0.0047 0.0316 0.0633 0.0949 0.2033 0.3079 0.3884
Kurva Kalibrasi Fe
0.50 0.40 n 0.30 a b r o s b A0.20
y = 0.0970x + 0.0073
0.10
Conc Fe ( mg/L ) 0.0340 0.0278 0.0278 0.0186 0.0227 0.0361 0.0278 0.0175 0.0330 0.0165 0.0278 0.0066 0.0198
0.05
Dilanjutkan dengan pengujian konfirmasi LOD Teoritis yang diperoleh
0.00 0.00
1.00 Konsentrasi 2.00 Standar3.00 Fe ( µg/mL )4.00
5.00
2. lanjutan Evaluasi LOD berdasarkan pengukuran larutan blanko • Kasus : pada penetapan Fe, berdasarkan hasil pengukuran blanko diperoleh LOD teoritis sbb : LOD teoritis dengan rumus = nilai rata-rata konsentrasi blanko sampel + (3 SD) yaitu : 0,05 mg/L; maka dibuat 7x ulangan konsentrasi Fe 0,05 mg/L dan diukur kembali, hasil yang diperoleh sbb :
1. Tahap pertama : Jika 7 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 0,05 mg/L diperoleh data sbb: (0,03; 0,10; tt; 0,03; 0,08; tt; 0,1) mg/L; maka Buatlah larutan uji standar Fe kembali dengan konsentrasi > 0,05 mg/L sebanyak 7x ulangan (misalkan dibuat 0,10 mg/L) dan evaluasi kembali. 2. Hasil tahap kedua : Jika hasil 7x pengukuran larutan uji untuk LOD Fe dengan konsentrasi 0,10 mg/L diperoleh data sbb: (0,15; 0,20; 0,17; 0,05; 0,09; 0,18; 0,08 ) mg/L; maka 0,10 mg/L adalah LOD Fe.
3. Evaluasi LOD berdasarkan persamaan kurva kalibrasi Deret stdr
Fe stdr (mg/L)
rerata Abs (Yi)
yC
(yi - yC)2
1
0.00
-0.0308
-0.0196
0.00012555
2
1.00
0.0963
0.0827
0.00018615
3
2.00
0.1792
0.1849
0.00003258
4
3.00
0.3016
0.2872
0.00020854
5
4.00
0.3791
0.3894
0.00010631
6
5.00
0.4908
0.4917
0.00000074
∑
0.00065987
n=6 slope = b
0.1023
S(y/x) = √∑(yi-yC)2 /(n-2) LDI ppm = (3S y/x)/b
0.01284 0.38
LOD teoritis Fe yang diperoleh sebesar 0,38 mg/L; maka dibuat larutan uji standar Fe dengan konsentrasi 0,38 mg/L sebanyak 7x ulangan dan diukur kembali; Jika hasil pengujian 7x ulangantersebut diperoleh sebagai berikut (0,15; 0,05; 0,10; 0,40; 0,09; 0,35; dan 0,27) mg/L; maka LOD Fe sebesar 0,38 mg/L
4. LOD berdasarkan signal terhadap noise 0.5 ng/mL std
Oxolinic Acid
.
.
_
.
2 6 2 . 1 2
_ >
1 6 0 . 0 2 8 4 5 A r e a
Danofloxacin .
:
8 . 1 1 3 7
1 0 0
:
2 . 1 4 2 6
1 0 0
%
3 5 8 . 0 8
>
9 5 . 9 1 5 4 1 A r e a
%
3 7 7 .0 0
7 .5 0
8 .0 0
8 .5 0
9 .0 0
9 .5 0
IDL 0.24 ng /mL)
0.25 ng/mL std
6 1
T i m e
1 .5 0
2 .0 0
.
.
_
.
1 0 0
: 8 . 1 1 2 9
2 6 2 . 1 2
>
T im e 3 .5 0
3 .0 0
IDL 0.30 ng /mL)
.
_
1 0 0
2 .5 0
: 3 5 8 . 0 8
2 . 1 0 1 4
1 6 0 . 0 2 6 5 4 A r e a
>
9 5 . 9 1 5 2 3 A r e a
% % 3 . 2 9 1 1
5 0 7 .0 0
2/16/2017
8 .0 0
9 .0 0
T i m e
6 7 1 .5 0
2 .0 0
2 .5 0
3 .0 0
3 .5 0
T i m e
LOQ • Limit kuantisasi ( LOQ ) atau biasa disebut juga limit pelaporan (limit of reporting) adalah konsentrasi terendah analit dalam sampel yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati LoQ = nilai rata-rata blanko + (10 SD)
STUDI KASUS LOQ • Jika 6 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 5,57 ppb diperoleh data sbb: (5,3; 5,5; 5,7; 5,2; 5,8; 5,9) ppb maka 5,57 ppb adalah LOQ karena: KV dari kumpulan data adalah 5,04 %, Sedangkan persyaratan KV yang memadai untuk repeatabilitas 23,07% • Hasil 6 x pengulangan pengukuran larutan uji dengan konsentrasi 5,73 ppb diperoleh data sbb: (6,4; 5,5; 9,3; 3,2; 5,8; 4,2) ppb karena KV kumpulan data tersebut = 36,58%, Persyaratan yang memadai adalah 22,96% Maka : Buatlah contoh untuk penetapan LOQ dengan konsentrasi > 5,73 ppb
LIMIT DETEKSI METODE (LDM) atau MDL
Konsentrasi terkecil analit yang diinginkan setelah melalui metode analisis secara lengkap. Nilainya akan lebih besar dari limit deteksi terendah
Konsentrasi terbaik dari analit yang dapat dideteksi atau dapat menghasilkan respon yang nyata dibanding blanko
Tergantung matriks
Dinyatakan untuk masing-masing matrik
Analisis replikat dari 7 sampel yang dispike pada satu konsentrasi tertentu. Konsentrasi standar spike kira-kira sama dengan 5 kali IDL dibagi faktor konsentrasi metode
MDL = rata-rata konsentrasi blanko sampel + (t .tabel x SDsampel) MDL =(t .tabel x Sdsampel ) (jika respon blanko negatif) 2/16/2017
PARAMETER LINIERITAS • Kemampuan suatu metode analisis untuk menghasilkan hasil yang proporsional terhadap perubahan respon alat dengan konsentrasi analit dalam sampel pada kisaran yang ada. • Mengetahui kemampuan standar dalam mendeteksi analit dalam sampel • Uji ini dilakukan dengan suatu seri larutan baku yang terdiri dari minimal 6 konsentrasi yang menaik dengan rentang/kisaran (0 –150)% atau (50 –150)% dari konsentrasi komponen uji •
Diharapkan respon linier terhadap konsentrasi larutan baku dengan nilai koefisien korelasi mendekati 1,00
Linieritas Disebabkan oleh adanya kesalahan dalam proses pengukuran, pada suatu kurva kalibrasi, Tidak semua data akan jatuh secara tepat pada garis
Yang harus dicari adalah The “best” straight line
Analisis Regresi (Analisis Korelasi & Regresi) Menggunakan
Metoda Kuadrat Terkecil (Method of Least Squares)
Least Square
Least Square Kapan Metode Least Square digunakan untuk membuat Kurva Kalibrasi ?? Bila terdapat hubungan linier antara nilai input dan nilai isyarat (respon alat ). Hubungan ini dinyatakan sebagai : y = bx + a a : intercept (nilai dari y bila x = 0) b: slope/kemiringan dari garis Linear square regression
Least Square
Least Square • Linearitas adalah kemampuan metoda untuk mendatangkan hasil uji yang secara langsung sebanding dengan konsentrasi analit dalam suatu rentang kerja yang diberikan. • Koefisien Korelasi (r) : suatu ukuran hubungan linier antara dua set data Rentang dari
-1 (hubungan yg sempurna) 0 (tidak ada hubungan) +1 (hubungan yang sempurna)
Sensitivitas /kepekaan Metode Analisis: •
Menunjukkan kemampuan dari metode atau instrumen dalam membedakan konsentrasi-konsentrasi suatu anali yang perbedaannya kecil.
•
Ukuran kualitas metode yang menggambarkan kemampuannya untuk mendeteksi adanya suatu komponen (analit) dalam contoh yang dianalisis
•
Ratio antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur.
•
Sensitivitas dibedakan menjadi : - sensitivitas kalibrasi (IUPAC) adalah Slope = m dari kurva kalibrasi pada konsentrasi yang diinginkan. - sensitivitas analitik; merupakan nilai yang tergantung pada simpangan baku hasil analisis tidak tergantung pada satuan signal atau respon alat. 2/16/2017
Sensitivitas Kalibrasi : • Sensitivitas kalibrasi (IUPAC) berdasarkan nilai Slope = m pada kurva kalibrasi, S = mc + Sbl • Bila grafiknya linier dan memiliki persamaan y = bx + a, maka sensitivitasnya adalah b = (y-a)/x • Bila a = 0 (grafik melewati titik nol, maka sensitivitasnya b = y/x atau respons alat ukur dibagi dengan konsentrasi analit • Ratio y/x (1 : 1) antara perubahan respons alat ukur terhadap perubahan konsentrasi analit yang diukur merupankan nilai proporsional ditunjukkan derajat kemiringan kurva kalibrasi mendekati 45 o (tg 45o =1) 2/16/2017
Ilustrasi :
Berapa derajat kemiringannya? 2/16/2017
Contoh : Untuk instrument AAS; Sensitivitas konsentrasi analit yang memberikan respon absorban 0,0044 (ASTM E 663-86 (Reapproved 1991
)
Langkah – langkah:
• Pilih larutan standar yang nilai absorbansi 0,0044 (daerah linier pengukuran) atau larutan standar yang memberikan nilai absorbansi (0,2 – 0,4) • ukur serapan-masuknya (absorbans) sebanyak 10 kali • Hitung absorbansi rata-rata dan menghitung nilai sensitifitasnya dengan menggunakan rumus berikut:
• Bandingkan dengan sensitivitas yang ada pada manual book batas keberterimaan s ensitifitas
( T OLERANSI
30%)
Working range dan daerah linear range • Rentang kerja suatu metode analisis adalah interval antara konsentrasi tinggi dan rendah yang telah dianalisis/diuji dengan presisi, akurasi dan linieritas dengan menggunakan kondisi metode yang dievaluasi • Dalam analisis kuantitatif dimulai dari LOQ (batas terbawah) dan batas respon alat (batas tertinggi) • Di dalam batas rentang kerja ini ada linear range : bagian yang linier dapat diamati secara visual
Teknik Working range (Analisis 1) •
Blanko + bahan acuan atau blanko sampel yang ke dalamnya ditambahkan analit dengan berbagai konsentrasi berbeda. Diperlukan sedikitnya 6 konsentrasi + blanko sampel
•
Pengulangan 1 x
•
Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi yang diukur (sumbu x)
• Amati secara visual dan identifikasi daerah pengukuran yang linier batas atas bawah dari daerah kerja •
Dari pengerjaan ini akan didapat konfirmasi visual apakah daerah kerja itu linier atau tidak
2/16/2017
Lanjutan : Teknik Working range (Analisis 2) •
Bahan acuan atau blanko sampel yang kedalamnya ditambahkan analit pada sekurang-kurangnya 6 konsentrasi berbeda pada daerah kerja yang linier
•
Pengulangan 3X
•
Plot respon pengukuran (sumbu y) terhadap konsentrasi (sumbu x). Secara visual amati outlier yang tidak tergambarkan pada regresi
•
Hitung koefisien regresi. Hitung dan plot residu value (perbedaan antara nilai yang sebenarnya dengan nilai yang diprediksi oleh garis lurus untuk setiap harga x
•
Tahap ini diperlukan untuk menguji daerah kerja yang linier dan pada daerah mana dapat digunakan kalibrasi titik tunggal
2/16/2017
Working range dan daerah linear range LOL e s n o p s e r t n e m u r t s n I
LOQ => limit of quantitative measurement
LOL => limit of linear response
LOQ Useful range
Concentration
Uji Ruggedness/Robustness Metode •
Ukuran bagi suatu metode analisis dalam mempertahankan unjuk kerjanya dalam situasi dimana pengaturan kondisi analisis tidak sesempurna seperti yang ditetapkan dalam metode yang bersangkutan
•
Dalam metode analisis ada tahap-tahap kritis dimana bila tidak dikerjakan secara hati-hati akan menimbulkan kesalahan yang besar
•
Dilakukan dengan memvariasikan kondisi analisis sedemikian rupa dan mengukur pengaruhnya terhadap presisi dan akurasi yang dicapai.
•
Membantu dalam mengantisipasi dan mengeliminasi sumber kesalahan yang mungkin
•
Mendemonstrasikan bahwa metode stabil terhadap perubahan kondisi metode yang kecil
Uji Ruggedness (inter lab variation) Robustness (intra lab variation) Ketahanan suatu ±(10 –20) % dari
metode terhadap perubahan kecil kondisi pada prosedur, misalnya : jenis pelarut, konsentrasi pelarut, perubahan pH, waktu ekstraksi, perbedaan kolom, perubahan temperatur Ketahanan metode uji dievaluasi dengan uji standar keberterimaan akurasi dan presisi atau dengan uji-T dan uji F atau Cara pengujian : - dilakukan pengujian pada sampel uji berulang (minimal 7x) pada kondisi normal dan kondisi perubahannya. - kemudian dievaluasi terhadap standarkeberterimaan (akurasi dan presisi) sesuai syarat keberterimaan yang digunakan.
PARAMETER KONFIRMASI IDENTITAS/SPESIFISITAS • •
•
• •
Kemampuan metode itu dalam mendeteksi hanya satu senyawa dalam sampel yang dianalisis, meskipun matriks sampel tersebut sangat kompleks Harus selalu diyakinkan bahwa isyarat yang dihasilkan pada proses pengukuran hanya berasal dari analit dan bukan berasal dari: 1. senyawa lain atau 2. campuran analit + senyawa lain (yang kebetulan mempunyai sifat fisika/kimia serupa dengan analit yang akan Hanya perlu dilakukan untuk analisis yang bersifat ndividual misal Kromatografi Contohnya; pada analisis gula dengan Cara Luff Schrool, – glukosa, fruktosa digolongkan sebagai gula pereduksi – sukrosa, maltosa digolongkan sebagai gula non pereduksi Jadi contoh ini bukan termasuk analisis individual Kromatografi : TLC; GC; dan HPLC Pengujian konfirmasi identitas (spesifisitas) : analisis blanko (plasebo) dan S ampel yang telah diketahui kandungan analitnya.
Uji Plasebo
Konfirmasi Identitas pada TLC • Dilakukan dengan jalan menggunakan lebih dari 1 eluen – Pada metode analisis yang diterbitkan PPOM (MAPPOM), analisis TLC harus menggunakan sedikitnya 3 macam eluen berbeda
Konfirmasi Identitas pada GC & HPLC • Dikenal adanya beberapa cara untuk konfirmasi: a. Teknik Spiking b. Nilai Isyarat Relatif Detektor c. Detektor Diode Array d. Chromatography Cross Check : Menggunakan 2 kolom berbeda Menggunakan kolom sama, eluen berbeda e. Menggunakan Teknik lain (GC-MS, LC-MS)
a. Teknik Spiking (Menambahkan komponen yang diduga ke dalam sampel)
b. Menghitung Nilai Isyarat Relatif Detektor (NIRD)
Additive pada Juice
e. Melakukan Konfirmasi dengan Teknik Lain (GC-MS; LC-MS, dan lain-lain)
