KO-26
0096: Bambang Srijanto dkk.
PEMURNIAN EKSTRAK ETANOL ETANOL SAMBILOTO (ANDROGRAPHIS PANICULATA NESS.) DENGAN TEKNIK EKSTRAKSI CAIR-CAIR Bambang Srijanto , Olivia Bunga P., Lely Khojayanti, Eriawan Rismana, dan Sriningsih ∗
Pusat Teknologi Farmasi dan Medika-BPPT Gd. BPPT II lantai 15, Jl MH Thamrin No 8 Jakarta 10340 Telp/ faks: 012-3169505 ∗
e-Mail:
[email protected]
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK Sambiloto merupakan salah satu jenis tanaman yang banyak digunakan sebagai bahan baku pembuatan jamu dan obat. Khasiat sambiloto dalam menyembuhkan berbagai penyakit terutama disebabkan oleh adanya senyawa aktif andrografolid dan turunannya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi optimal proses ekstraksi cair-cair ekstrak ekstrak etanol sambiloto sambiloto terpurifikasi terpurifikasi dengan kadar andrografolid andrografolid yang paling paling optimal. optimal. Optimalisas Optimalisasii ekstraksi ekstraksi cair-cair cair-cair dilakukan dilakukan dengan dengan menggunakan response surface methodology, methodology, Central Composite Design dipilih sebagai rancangan penelitian dengan dua faktor dan tiga tingkat (levels). Variabel bebas yang digunakan adalah waktu dan nisbah pelarut-bahan baku v/v sedangkan variabel tidak bebas adalah kadar andrograf andrografolid. olid. Dalam penelitian penelitian ini, ekstrak ekstrak etanol etanol sambiloto sambiloto dipurifikasi dipurifikasi dengan teknik ekstraksi ekstraksi cair-cair menggunakan pelarut etil asetat. Kondisi optimal purifikasi terhadap ekstrak etanol sambiloto dengan teknik ekstraksi cair-cair adalah waktu 5-13 menit dan nisbah ekstrak etanol sambiloto-pelarut etil asetat 1:1,25 s/d 1:1,9 v/v. Kata Kunci: Optimasi ekstraksi cair-cair, ekstrak sambiloto, kadar andrografolid
I. PENDA PENDAHU HULU LUAN AN
(Puri (Puri dkk.,1 dkk.,1993 993), ), pengob pengobata atan n leukim leukimia ia (T. (T. Matsud Matsudaa 1994), pengobatan pengobatan dan pencegahan pencegahan pilek (CacSambiloto Sambiloto (Andrograp (Andrographis his paniculata paniculata Ness.) meru- dkk., 1994), pakan pakan tanama tanaman n perdu perdu yang yang tumbuh tumbuh tegak tegak dengan dengan eres dkk., 1997), antidiabetes (Reyes dkk., 2006). Dalam penelitian terhadap terhadap tikus berpenyakit berpenyakit diabetes diabetes yang ting tinggi gi anta antara ra 0,50,5-11 mete meterr. Bagi Bagian an yang yang digu diguna naka kan n penelitian diindu dii nduksi ksi dengan den gan strept str eptozo ozotos tosin, in, dapat dap at dibukt dibuktika ikan n adalah daun dan batang Tanaman ini tumbuh secara luas di Asia Selatan dan Tenggara seperti India, Pak- bahwa senyawa andrografolid berperan dalam pengobistan, istan, Sri Lanka, Lanka, Indone Indonesia sia,, Malays Malaysia ia dan Thaila Thailand. nd. atan peningkatan penggunaan glukosa darah sehingga menurunka nkan n kadar kadar glukos glukosaa dalam dalam darah darah pada pada tikus tikus (Yu (Yu Di Cina dan Thailand, sambiloto sambiloto dibudidayaka dibudidayakan n se- menuru dkk., 2003). cara besar-besar besar-besaran an (Sandberg, (Sandberg, F. 1994). Senyawa Senyawa aktif Andrograf Andrografolid olid adalah senyawa senyawa utama utama yang diekutama utama dari sambiloto sambiloto adalah andrografoli andrografolid. d. Senyawa Senyawa ini termasuk senyawa diterpen lakton dan larut dalam strak dari daun sambiloto. Penelitian terhadap khasiat pelaru pelarutt organ organik. ik. Andro Androgra grafol folid id terkandun terkandung g paling paling andrografolid terhadap aktivitas hepatoprotektor dila banyak di daun (kurang lebih 2,39 %) dan paling sedikit kukan oleh Handa dan Sharma (1990) dengan menggunakan hewan coba yang diinduksi parasetamol parasetamol dan pada biji (Sharma (Sharma dkk.,1992). dkk.,1992). Senyawa Senyawa lain yang ter- gunakan galaktosamin. n. Hasilnya Hasilnya menunjukkan menunjukkan bahwa androandrodapat di dalam sambiloto adalah deoksiandrografolid- galaktosami 19-β -D-glukosida -D-glukosida dan neo-andrografolid yang keselu- grafolid mampu menetralkan racun yang terdapat di ruha ruhann nnya ya diis diisol olas asii dari dari daun daun (Che (Chem m dan dan Lian Liang, g, dalam hati tikus. Penelitian ini diperkuat oleh Sarawat dkk. (199 (1995) 5) dan dan Vise Visen n dkk. (199 (1993) 3) yang yang menya menya-1982), 1982), 14-deoksi-1 14-deoksi-11,121,12- didehydroa didehydroandro ndrografo grafolid lid (andro(andro- B. dkk. andrografolid mampu mampu memprote memproteksi ksi hati tikus grafolid - D), homoandrografolid, andrografan, andro- takan andrografolid berturut-turu turutt diinduksi diinduksi dengan galaktosam galaktosamin in grafon, grafon, andrografo andrografosteri sterin, n, dan stigmaster stigmasterol ol (Siripong (Siripong yang berturutdan parasetamol. dkk., 1992). Ekstra Ekstrak k cair cair yang yang diper diperole oleh h dari dari prose prosess ekstra ekstraksi ksi Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui khasiat dari sambiloto sambiloto dan dapat disimpulkan disimpulkan simplisia tanaman obat dengan menggunakan pelarut organik ik atau atau air, air, sering seringkal kalii mengan mengandun dung g senyaw senyawaa bahwa sambiloto berkhasiat sebagai imunostimulan organ Prosiding InSINas 2012
0096: Bambang Srijanto dkk.
yang tidak diinginkan seperti zat warna (pigment), tanin, karbohidrat, lilin, resin dan sejenisnya. Ke beradaan tanin akan menyebabkan kekeruhan selama penyimpanan atau proses berikutnya, sedangkan zat warna, karbohidrat, lilin, resin dan sejenisnya ditin jau dari sudut pandang aktifitas sangat jarang diperlukan bahkan seringkali menjadikan ketidakstabilan sifat fisika ekstrak ketika akan diformulasikan. Ke beradaan senyawa atau zat tersebut lebih banyak merugikan pada kestabilan dan mengurangi kadar senyawa aktif di dalam ekstrak sehingga harus dihilangkan. Purifikasi ekstrak diharapkan akan meningkatkan khasiat ekstrak disamping memperkecil jumlah dosis pemberian kepada pengguna. Berbagai teknik purifikasi ekstrak dapat dilakukan di antaranya adalah teknik ekstraksi cair-cair. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan kondisi optimal proses purifikasi ekstrak etanol sambiloto melalui teknik ekstraksi cair-cair ekstrak etanol sambiloto sehingga diperoleh ekstrak etanol terpurifikasi dengan kadar andrografolid yang paling optimal. Meskipun proses ekstraksi tanaman obat sudah banyak dilakukan di kalangan industri obat alami atau farmasi, namun kegiatan optimalisasi proses belum banyak disentuh. Dengan demikian diharapkan hasil dari penelitian ini dapat dijadikan sebagai bahan masukan dalam pemrosesan komoditas sambiloto di kalangan industri obat alami.
II.
METODOLOGI
Bahan Sambiloto (Andrographis paniculata Ness.) yang digunakan pada penelitian ini berasal dari Balitro, Bogor. Metanol p.a. (Merck), andrografolid standar (SigmaAldrich), etanol 95 % food grade (P.T. Brataco), etil asetat food grade (P.T. Brataco) dan air bebas mineral.
G AMBAR 1: Pengaruh waktu dan nisbah bahan baku-pelarut terhadap kadar andrografolid pada ekstrak etanol sambiloto terpuri fikasi
KO-27
Preparasi Bahan Perlakuan pendahuluan terhadap bahan baku meliputi pengeringan dalam oven pada suhu 50 C sampai kadar air kurang dari 10 % dan digiling dengan menggunakan alat grinder. Setelah itu sampel diayak menggunakan pengayak berukuran 20, 40, 70, dan 100 mesh. Persentasi ukuran butiran bahan baku yang digunakan adalah -20+40 mesh sebanyak 64, 54 %, -40+70 mesh sebanyak 21,28 %, -70+100 mesh sebanyak 8,51 % serta yang lolos mesh 100 adalah 5,67 %. Bahan simplisia yang telah diayak diambil 4,0kg dan dimaserasi dengan menggunakan etanol 96 % food grade pada perbandingan bahan baku - pelarut 1:6 b/v selama 18 jam. Setelah itu dilakukan penyaringan dan ekstrak etanol sambiloto disimpan pada suhu -20 C. ◦
◦
Prosedur ekstraksi cair-cair Etil asetat dengan volume tertentu dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer berukuran 2000ml dan dipanaskan sampai suhu 35 C. Kemudian sebanyak 500 ml ekstrak etanol sambiloto diambil dan dimasukkan ke dalamnya untuk dipurifikasi dengan kondisi operasional waktu dan nisbah pelarut tertentu. Ekstraksi cair-cair dilakukan sebanyak tiga kali ulangan dengan pengadukan pada putaran 100 rpm dengan 2 variabel, yaitu: waktu ( 10 menit, 15 menit dan 20 menit) dan perbandingan ekstrak etanol sambiloto etil asetat, v/v (1:1, 1:2 dan 1:3). Pada setiap proses ekstraksi cair-cair, penambahan air bebas mineral se banyak 100 ml dilakukan agar proses pemisahan dua fase dapat terlihat jelas. Setelah ekstraksi cair-cair selesai, ekstrak etanol sambiloto dipisahkan dengan menggunakan corong pisah. Fase etil asetat dipekatkan dengan rotavapour (Heidolph laborota 4000) untuk mendapatkan ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi. Penguapan dilakukan pada suhu 40 C dan penggunaan air pendingin pada suhu 5 C. Proses penguapan dihentikan ketika sudah tidak ada distilat yang menetes. Analisis kadar andrografolid: Ekstrak etanol sam biloto terpurifikasi yang dihasilkan dari proses ekstraksi cair-cair diambil cuplikannya sebanyak 1 mg, kemudian dilarutkan menggunakan 1 ml metanol p.a., setelah terlarut diambil 50 µl dan dimasukkan kedalam tabung sentrifus lalu dikeringkan pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah kering kemudian ditimbang dan dilarutkan kembali dalam 1 ml metanol p.a. untuk diambil 50 µl dan dimasukkan kedalam vial dan kemudian diencerkan sampai volume 1ml. Analisis dilakukan dengan menggunakan HPLC (Knauer) yang dilengkapi dengan photodiode array detector, autosampler. Sebanyak 20 µl bahan disuntikkan ke dalam kolom Hypersill C-18 (4,5×250 mm),dengan fase gerak:metanol:air (60:40), flow rate: 1 ml/menit dan panjang gelombang: 225nm serta detektor: UV model K-2501. Kadar andrografolid yang terhitung kemudian ◦
◦
◦
Prosiding InSINas 2012
KO-28
dikonversikan ke dalam bobot bahan yang digunakan. Rancangan percobaan: Optimalisasi ekstraksi caircair dilakukan dengan menggunakan response surface methodology (Montgomery, 2001), Central Composite Design dipilih sebagai rancangan penelitian dengan dua faktor dan tiga tingkat (levels). Variabel bebas yang digunakan adalah waktu dan perbandingan bahan baku-pelarut v/v, sedangkan variabel tidak bebas adalah kadar andrografolid pada ekstrak etanol sem biloto terpurifikasi. Data dianalisis secara statistik dengan menggunakan perangkat lunak MINITAB release 13.30 (MINITAB Inc). Hasil pengolahan dengan response surface methodology selanjutnya diujikan terhadap uji statistik Anova, koefisien kuadratik dan Duncan untuk mengetahui perbedaannya.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis proksimat herba sambiloto dilakukan untuk mengetahui komposisi kimia yang dikandungnya. Analisis proksimat bahan baku herba sambiloto menunjukkan kadar air 4,57 %, kadar abu, 1,66 % dan kadar androgarfolid 2,72 %. Hasil ini tidak berbeda jauh dengan beberapa hasil penelitian yang telah dilakukan oleh peneliti lain. Raina dkk., 2007, melaporkan hasil penelitiannya tentang kandungan senyawa andrografolid dalam daun kering herba sambiloto yang berkisar 1,14 % hingga 2,50 %. Sementara itu Pandey dkk., 2010, melaporkan variasi kadar andrografolid dari ber bagai sumber di India Tengah dalam kisaran 1,04 % hingga 2,24 %. Perbedaan kandungan andrografolid yang diperoleh dapat disebabkan oleh beberapa faktor, antara lain umur rimpang, tempat tumbuh, dan metode analisis yang digunakan. Ekstraksi senyawa yang terkandung di daun sam biloto dengan menggunakan etanol akan melarutkan klorofil, senyawa andrografolid dan turunannya serta senyawa lainnya. Pemurnian ekstrak etanol sambiloto dengan menggunakan teknik ekstraksi cair-cair dengan pelarut etil asetat akan menghasilkan dua lapisan cairan, yakni fasa etanol dan fasa etil asetat. Klorofil lebih mudah terlarut di etanol sehingga fasa etanol se bagian besar mengandung klorofil dan akan berada di atas karena densitasnya lebih kecil. Sementara itu fasa etil asetat akan mengandung banyak senyawa senyawa aktif andrografolid dan turunannya. Basarkan hasil penelitian menunjukkan bahwa semakin besar nisbah pelarut-bahan baku maka kadar andrografolid di dalam ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi akan semakin meningkat dan akan menurun seiring dengan pertambahan jumlah pelarut seperti terlihat pada G AMBAR 1. Bertambahnya volume pelarut etil asetat ternyata justru menurunkan kadar andrografolid di ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi. Hal ini dimungkinkan karena semakin besar volume pelarut etil asetat akan
0096: Bambang Srijanto dkk.
menyebabkan bertambahnya kelarutan senyawa aktif lainnya sehingga menurunkan kadar andrografolid. Jika diinginkan kadar andrografolid yang tinggi di dalam ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi maka se baiknya jumlah pelarut etil asetat tidak terlalu besar. Sementara itu waktu ekstraksi juga memberikan pengaruh pada kadar andrografolid di dalam ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi. Semakin lama waktu ekstraksi maka semakin besar kadar andrografolid di dalam ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi sampai pada batas tertentu, kemudian mengalami penurunan. Perbedaan polaritas senyawa-senyawa yang terkandung di sambiloto menyebabkan perbedaan kelarutannya di dalam fasa etil asetat. Pada kajian ini, diduga senyawa andrografolid mempunyai kelarutan yang lebih besar jika dibandingkan dengan kelarutan senyawa lainnya, namun dengan bertambahnya waktu, jumlah senyawa lain yang terlarut semakin bertambah sehingga memperkecil kadar senyawa andrografolid di fasa etil asetat. Hal ini dapat dibuktikan dengan adanya perbedaan senyawa yang terdapat pada masing-masing ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi dari hasil pemurnian dengan kondisi operasional yang berbeda seperti terlihat di G AMBAR 2. Dari hasil kajian tersebut terlihat bahwa kondisi optimal untuk memurnikan ekstrak etanol sambiloto dapat dilakukan dengan teknik ekstraksi cair-cair pada kondisi operasional waktu dan nisbah ekstrak etanol sambiloto-pelarut etil asetat berturut-turut 5-13 menit dan 1:1,25 sampai dengan 1:1,9 v/v. Sementara itu TABEL 1 menunjukkan koefisien regresi dan analisis varian (ANOVA) dari pendekatan model persamaan kuadratik dengan kadar andrografolid se-
G AMBAR 2: Perbedaan kromatogram senyawa yang terkandung dalam ekstrak sambiloto terpurifikasi
Prosiding InSINas 2012
0096: Bambang Srijanto dkk. TABEL 1: Koefisien regresi dan analisis varian untuk model persamaan kuadratik yang digunakan a
Variabel Konstanta X 1 X 2 X 1 2 X 2 2 X 1 ×X 2
Model R2 Keterangan: a Model polinomial
Koefisien -0.035 -0.0298 0.0308 0.007 ) -0.008 0.003
[4] [5]
∗
∗∗
)
[6]
0.976
Y = β 0 + Σ3i 1 β i X i + Σ3i=1 β ii X i2 + Σ3i=1 β ij X i X j X 1 : waktu ekstraksi X 2 : nisbah bahan baku-pelarut ) berbeda nyata pada p<0.01 ) berbeda nyata pada p<0.05
[7]
−
∗
∗∗
bagai variabel tak bebas. Terlihat bahwa nisbah ekstrak etanol sambiloto-pelarut etil asetat sangat berpengaruh terhadap proses optimalisasi pemurnian ekstrak etanol sambiloto dan model yang digunakan sangat sesuai dengan data hasil penelitian. Waktu kontak kurang berpengaruh terhadap hasil pemurnian ekstrak etanol sambiloto.
IV.
KESIMPULAN
Nisbah bahan baku-pelarut pada pemurnian ekstrak etanol sambiloto dengan menggunakan teknik ekstraksi cair-cair sangat berpengaruh terhadap jumlah andrografolid yang terekstraksi di dalam fasa etil asetat, waktu ekstraksi tidak memberikan pengaruh yang nyata. Kadar optimal androgarfolid yang terekstraksi dicapai pada kisaran nisbah bahan baku-pelarut dan waktu ekstraksi masing-masing 1,25-1,9 v/v dan 5-13 menit. Ucapan terima kasih disampaikan kepada Kementerian Riset dan Teknologi yang telah memberika dana penelitian melalui Program Insentif SINas.
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
DAFTAR PUSTAKA [1] D.D. Caceres, J.L. Hancke, R.A. Burgos, and G.K. Wikman, 1997, Prevention of common colds with Andrographis paniculata Ness. dried extract: A pilot double-blind trial, Phytomedicine. 4(2): 101-4 [2] S.S. Handa and A. Sharma, 1990: Hepatoprotective activity of andrographolide from Andrographis paniculata against carbontetrachloride. Indian J. Med. Res., 1990, 92, 276-83. [3] T. Matsuda, M. Kuroyanagi, S. Sugiyama, K. Umehara, A. Ueno, and K. Nishi. 1994, Cell differentiation-inducing diterpenes from Andrographis paniculata Ness., Chem. Pharm. Bull.
[14]
KO-29
(Tokyo) 42(6):1216-25. D.C. Montgomery, 2001, Design and Analysis of Experiments, 5th ed., John Wiley & Sons, New York. A.K. Pandey and A.K. Mandal, 2010, Variation in Morphological Characteristic and Andrographolide Content in Andrographis paniculata (Burm.f.) Ness of Central India, Iranica Journal of Energy & Enviroment, 1 (2): 165-169. A.Puri, R. Saxena, R.P. Saxena, and K.C. Saxena, 1993, Immunostimulant agents from Andrographis paniculata Ness., J. Natural Products 56(7):995-99 A.P. Raina, A. Kumar and S.K. Pareek, 2007, HPTLC analysis of hepatoprotective diterpenoid andrographolide from Andrographis paniculata Nees (Kalmegh). Indian J. Pharm. Sci., 69(3): 473475. B.A.S. Reyes et al., 2006, Anti-diabetic potentials of Momordica charantia and Andrographis paniculata Ness. and their effects on estrous cyclicity of alloxan-induced diabetic rats, Journal of Ethnopharmacology, Vol.105, Issues 1-2, pp.196200 Sandberg, F. 1994. Andrographidis herba Chuanxinlian: A review. Gothenburg, Sweden: Swedish Herbal Institute. Available from the American Botanical Council (USA). B. Saraswat et al., 1995, Effect of andrographolide against galactosamine-induced hepatotoxicity. Fitoterapia, 66:415. A. Sharma, L. Krishan, and S.S. Handa, 1992, Standardization of the Indian crude drug Kalmegh by high pressure liquid chromatographic determination of andrographolide, Phytochemical analysis (3):129-31 P. Siripong, B. Kongkathip, K. Preechanukool, P. Picha, K. Tunsuwan, and W.C. Taylor. 1992. Cytotoxic diterpenoid constituents from Andrographis paniculata Ness. leaves, J. Sci. Soc. Thailand, 18(4):187-194 Yu B.C., Hung C.R., Chen W.C., Cheng J.T., 2003, Antihyperglycemic effect of andrographolide in streptozotocin-induced diabetic rats, Planta Med., 69(12), pp.1075-1079. Visen P.K.S. et al., 1993, Andrographolide protects rat hepatocytes against paracetamolinduced damage. Journal of Ethnopharmacology, 40:131-136.
Prosiding InSINas 2012
