ISOLASI ACTINOMYCETES

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP
ISOLASI ACTINOMYCETES DARI TANAH PENGHASIL ANTIBIOTIK

OLEH :

Kelompok 2
Golongan : Jumat Siang
Asisten :
Satria Putra Penarosa, S.Si., Apt.

MAKASSAR
2014
BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Actinomycetes termasuk dalam divisi Schyzophyta. Tumbuh sebagai filament sel yang bercabang panjang atau pendek. Organisme ini membelah dengan pembelahan biner, dan mungkin menghasilkan spora eksternal atau tidak. Begitu jauh, mayoritas organisme ini adalah saprofit tanah dan air (organisme yang hidup dari benda organik yang membusuk dan sangat penting karena perannya dalam daur alam, seperti pembusukan bahan organik dan penambatan nitrogen). Bangsa Actinomycetes terdiri dari tiga suku yaitu suku Mycobacteriaceae, suku Actinomycetaceae, dan suku Streptomycetaceae.
Actinomycetes merupakan mikroorganisme tanah yang umum dijumpai pada berbagai jenis tanah. Populasinya berada pada urutan kedua setelah bakteri, bahkan kadang-kadang hampir sama Actinomycetes hidup sebagai saprofit dan aktif mendekomposisi bahan organik, sehingga dapat meningkatkan kesuburan tanah. Actinomycetes merupakan salah satu mikroorganisme yang mampu mendegradasi selulosa di samping bakteri, kapang, dan khamir. Jenis Actinomycetes tergantung pada tipe tanah, karakteristrik fisik, kadar bahan organik, dan pH lingkungan.
Actinomycetes kelihatan dari luar seperti jamur dan dalam banyak buku dibicarakan bersama dengan fungi eukariot. Akan tetapi, organisme ini adalah bakteri benar sesuai dengan semua kriteria untuk sel prokariot. Dinding selnya mengandung asam muramat, tidak mempunyai mitrokondrion, mengandung ribosom 70S (sel eukariot mempunyai ribosom 80S dalam sitoplasmanya), tidak mempunyai pembungkus nukleus, garis tengah selnya berkisar dari 0,5 sampai 2,0 µm, dan dapat dimatikan atau dihambat oleh banyak antibiotika bakteri. Dari banyak macam marga yang diklasifikasi dalam bangsa Actinomycetales, hanya sedikit yang dapat menimbulkan penyakit pada manusia. (1: 149-151)
I.2. Maksud dan Tujuan Percobaan
I.2.1 Maksud Percobaan
Mengetahui dan memahami cara mengisolasi mikroorganisme penghasil antibiotik dari sampel Tanah Peternakan Sapi.
I.2.2 Tujuan Percobaan
Mengetahui dan memahami cara pengambilan dan pengolahan sampel secara mikrobiologi.
Mengetahui dan memahami bagaimana isolasi dan pemurnian mikroba penghasil anti mikroba secara mikrobiologis.
Mengetahui dan memahami bagaimana cara peremajaan dan pembenihan mikroba secara mikrobiologi.
Mengetahui dan memahami cara pengujian aktivitas mikrobiologis
I.3. Prinsip Percobaan
Pengambilan sampel dari Tanah sekitar Peternakan sapi dan mengolahnya dengan cara pengenceran dengan menggunakan air steril hingga pengenceran 10-5
Pengisolasian sampel dan pemurnian mikroorganisme bakteri actinomycetes, isolasi dilakukan dengan pengenceran 10-1 , 10-2, dan 10-3 menggunakan medium SNA (Starch Nutrient Agar) dengan metode penggoresan dan diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.
Pengujian antagonis menggunakan biakan Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Salmonella thypos dan Pseudomonas aeruginosa yang akan menghasilkan zona bening di daerah sekitar isolat, dengan menempelkan isolat pada suspensi medium dan bakteri, kemudian diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.
Fermentasi dilakukan dengan menggunakan kultur murni atau starter. Banyaknya mikroba (starter/inokulum) yang ditambahkan berkisar antara 3–10 % dari volume medium. Medium fermentasi yang digunakan adalah SNB (Starch Nutrient Borth) dan diinkubasi selama 7 x 24 jam pada suhu 37oC dan dilakukan shaker 1x sehari selama 1 jam.
Ekstraksi actinomycetes dilakukan dengan menggunakan Etil asetat sebagai pelarut untuk mengambil komponen kimia antimikroba dari actinomycetes, dengan mencampurkan medium hasil fermentasi dan pelarut etil asetat kedalam corong pisah dan dilakukan penggojokan selama 1 jam yang akan menghasilkan filtrat dan supernatan. Filtrat kemudian diambil dan diuapkan.
Pengujian daya hambat actinomycetes menggunakan biakan Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan Salmonella thyposa dengan melarutkan ekstrak isolat menggunakan pelarut DMSO (Dimethyl Sulfoxide) lalu dicelupkan paper disk kedalam larutan tersebut, kemudian paper disk ditempelkan pada suspensi medium dan biakan bakteri dan diinkubasi 1 x 24 jam pada suhu 37oC.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II.1. Teori Umum
Timbulnya berbagai penyakit infeksi baru yang membutuhkan antibiotik di satusisi dan adanya sifat resistensi kuman terhadap antibiotik yang telah ada di sisilain, mendorong terus dilakukannya penelitian untuk menghasilkan antibiotik jenis baru yang lebih ampuh untuk membunuh kuman penyakit. Saat ini banyak penelitian yang difokuskan pada Actinomycetes yang diindikasikan sebagai bakteri yang mampu menghasilkan antibiotik terbanyak. Sekitar 70% dari antibiotik yang telah ditemukan dihasilkan oleh Actinomycetes terutama Streptomyces (2).
Hampir 95% dari 2000 antibiotik yang ada dihasilkan oleh Streptomyces. Streptomyces dikenal mampu menghasilkan banyak antibiotik seperti streptomycin yang dihasilkan oleh Streptomycesgriseus, aureomisin yang dihasilkan oleh S.aureofaciens, oleandomycin yang dihasilkan oleh S. antibioticus, spiramycin yang dihasilkan oleh S. ambofaciens, dan eritromisin yang dihasilkan oleh S. erythreus, yang masing-masing mempunyai khasiat yang berlainan. Selain Streptomyces, masih ada anggota actinomicetes yang juga mampu menghasilkan antibiotik dan antitumor, Micromonospora, Saccharopolyspora, Actinomodura, dan Dactylosporangium (3 : 11-19).
Actinomycetes termasuk bakteri yang berbentuk batang, gram positif, bersifat anaerobik atau fakultatif. Struktur Actinomycetes berupa filamen lembut yang sering disebut hifa atau miselia, sebagaimana yang terdapat pada fungi, memiliki konidia pada hifa yang menegak. Actinomycetes merupakan bakteri yang bereproduksi dengan pembelahan sel, rentan terhadap pinicilin tetapi tahan terhadap zat antifungi (4, 11).
Actinomycetes selalu ditemukan pada substrat alam, seperti tanah dan kompos,air kolam, bahan makanan, dan di atmosfer. Laut dalam, bukan merupakan habitat yang baik bagi Actinomycetes. Actinomycetes hidup dan memperbanyak diri dalam tanah dan kompos pada kedalaman yang bervariasi, pada daerah yang dingin dan tropik. Tanah yang basa dan netral lebih disukai dari pada tanah yang asam seperti humus hutan dan rawa-rawa. Streptomyces merupakan genus yang paling banyak ditemukan di tanah dan kompos. Pada tanah yang kering dan panas (hangat), banyak ditemukan Actinomycetes, seperti : Streptomyces, kelompok mikroorganisme ini menyebabkan bau musty, yaitu bau seperti tanah yang baru dibajak (12).
Keberadaan Actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji peneliti. Sebanyak 22 genus Actinomycetales telah berhasil diisolasi dari sampel tanah yang berasal dari 12 tempat di Yunnan dan 91% diindikasikan sebagai Streptomyces. Penelitian ini juga menyimpulkan bahwa pada tanah yang lebih kering, lebih tandus dan lebih dingin, lebih banyak ditemukan Streptomyces. Di Sabah juga telah ditemukan sebanyak 78 strain Actinomycetes yang diisolasi dari tanah yang berasal dari 22 lokasi, diketahui pula bahwa strain terbanyak adalah Streptomyces dan menemukan 50 strain Actinomycetes yang berbeda pada sampel ladang pertanian yang diambil dari daerah Manisa di Turki. Ternyata 34% dari keseluruhan isolat berpotensi sebagai antibiotik, dan 7 isolat menghasilkan antibiotik baru. Ada juga yang berhasil menemukan 40 strain Actinomycetes yang diisolasi dari Antarctica. Setelah diujikan pada 7 spesies bakteri didapatkan hasil 60% strain berpotensi sebagai antibiotik, dan 10 strain mempunyai daya hambat dengan spektrum yang luas. Selain itu juga berhasil ditemukan 106 isolat Actinomycetes pada sampel tanah yang diambil dari Lobuche dan Lukla, dua wilayah di Nepal. Dari 106 isolat hanya 36 isolat yang berpotensi sebagai antibiotik, dua isolat hanya menghambat bakteri gram negatif, delapan isolat menghambat bakteri gram positif dan 26 isolat menghambat keduanya (3,5,9).
Keberadaan Actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji peneliti. Actinomycetes ternyata tidak hanya di temukan dalam tanah. Telah berhasil menemukan 186 isolat Actinomycetes dari 78 sampel sedimen ekosistemair hitam yang terletak di Kalimantan Tengah, dari 186 isolat diketahui 58 isolat dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, 38 isolat mampu menghambat E coli dan 17 isolat mampu menghambat keduanya. Dhanasekaran juga telah berhasil menemukan 230 isolat Actinomycetes dari sampel yang diambil dari tempat yang sama. Tanah merupakan salah satu habitat bagi mikroorganisme, dalam satu gram tanah terdapat jutaan bakteri, fungi, protozoa dan mikroorganisme lain. Sawah sebagai salah satu bentuk tanah pertanian juga merupakan habitat bagi Actinomycetes (4,10).
Populasi mikroorganisme dalam tanah dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu : (4)
Jumlah dan jenis zat hara dalam tanah
Kelembaban
Tingkat aerasi
Suhu
pH
Perlakuan pada tanah, sepertipemupukan atau terjadinya banjir.
Antibiotik yang dihasilkan oleh anggota genus Streptomyces dapat dikelompokkan dalam lima kelompok, yaitu : (6)
1. Tetrasiklin
Tetrasiklin dan derifatnya meliputi antibiotik tetrasiklin, klortetrasiklin, dan dimetil tetrasiklin yang dihasilkan oleh Steptomyces aureofaciens, serta oksitetrasiklin(S. rimosus) (Perlman, 1970;Pelczar & Chan, 1988). Antibiotik ini bekerja pada semua mikroorganisme yang peka terhadap penisilin, berbagai bakteri gram positif dan negatif, mikoplasmaspirokhaeta, leptospira, rickettsia, dan khlamidia (6)
2. Kloramfenikol
Kloramfenikol adalah antibiotik kloramfenikol yang dihasilkan oleh Steptomycesvenezuelae. Antibiotik ini mempunyai spektrum kerja seperti tetrasiklin namun sekarang sudah jarang dipakai. Indikasi kloramfenikol untuk mengobati tifus, paratifus dan menginitis. Kloramfenikol aktif terhadap bakteri gram positif, gram negatif dan rickettsia (6).
3. Makrolida (kelompok eritromisin)
Makrolida meliputi eritromisin yang dihasilkan oleh S. erythreus, oleandomisin (S. antibioticus) (Perlman, 1970) dan spiramisin (S. ambofaciens). Spektrum kerjanya meliputi bakteri gram positif (6)
4. Linkomisin
Linkomisin dan derifatnya meliputi linkomisin yang dihasilkan oleh S. Lincolnensisdan klindamisin (turunan linkomisisn). Spektrum kerja linkomisin aktif pada bakteri gram positif terutama infeksi yang disebabkan anggota genus Staphylococcus. Intensitas kerja klindamisin dua sampai sepuluh kali lebih besar dari pada linkomisin (6).
5. Antibiotika aminoglikosida
Aminoglikosida meliputi streptomisin yang dihasilkan oleh S. griceus, dihidrostreptomisin (turunan streptomisin), kanamisin (S.Kanamyceticus.), dan neomisin (S. Fradiae), tobramisin(S. tenebrarius), spektinomisin (S.Spectabilis), Streptomisin, dihidrostreptomisin, kanamisin dan neomisin aktif terhadap bakteri gram positif, gram negatif dan bakteri penyebab tuberkulosis tobramisin terutama aktif pada Pseudomonas aeruginosa, spektinomisin aktif pada bakteri gram negatif dan untuk pengobatan Neisseriagonorrhoeae. Pengujian kemampuan suatu isolat sebagai penghasil antibiotik dapat dilakukan dengan suatu perlakuan pada bakteri uji untuk menentukan adanya daerah hambatan, yaitu daerah jernih yang tidak ditumbuhi mikroorganisme lain. Jika pada perlakuan tersebut terdapat daerah hambatan maka isolat tersebut berpotensi sebagai penghasil antibiotik, sebaliknya jika tidak terbentuk daerah hambatan maka isolat tersebut tidak berpotensi menghasilkan antibiotik. Bakteri yang sering digunakan pada penelitian adalah Escherichia coli yang mewakili kelompok bakteri gram negatif dan Staphylococcus aureus dan Bacillus subtilis sebagai wakil kelompok bakteri gram positif. Dalam penelitian ini digunakan Escherichia coli dan Staphylococcus aureus. (6)
Actinomycetes mempunyai beberapa manfaat yaitu mendekomposisi bahan organik, menghasilkan antibiotik yang dapat menghambat bahkan mematikan mikroba lainnya (khususnya yang patogen), mengikat struktur tanah liat sehingga dapat memperbaiki sifat fisik tanah, dan dapat menghilangkan bau dengan zat-zat metabolik yang dikeluarkannya. Selain itu, actinomycetes memegang peranan penting dalam proses biodegradasi senyawa polimer dan memobilisasi unsur hara makro dan mikro, sehingga berperan sentral dalam menjaga kestabilan ekosistem (5).
Isolasi mikrobia pada prinsipnya adalah memisahkan suatu jenis mikrobia dengan jenis mikrobia lainnya dengan asal mikrobia yang terdiri dari berbagai macam spesies. Hal ini dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada media padat. Pada media padat ini sel-sel akan membentuk suatu koloni sel yang tetap. Jika sel-sel tersebut tertangkap oleh media pada beberapa tempat yang terpisah maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi suatu koloni yang terpisah sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya (7).

II.2. Uraian Mikroba
Escherichia coli (7 : 122-123)
Kingdom : Bacteria
Divisi : Proteobacteria
Kelas : Gamma proteobacteria
Ordo : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli merupakan spesies dengan habitat alami dalam saluan pencernaan manusia maupun hewan. Escherichia coli pertama kali di isolasi oleh Theodor Escherichia dari tinja seorang anak kecil pada tahun 1885. Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,4-0,7 µm, termasuk gram negatif, dapa hidup soliter maupun berkelompok, umumnya motil, tidak berbentuk spora serta fakultatif anaerob. (8 : 949)
Staphylococcus aureus (7 :122-123)
Kingdom : Protista
Divisi : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Enterobacteriaceae
Famili : Micrococcaceae
Genus : Staphylococcus
Spesies : Staphylococcus aureus
Merupakan bakteri gram positif, tidak bergerak, tidak berspora dan mampu membentuk kapsul, berbebtuk coccus, dan tersusun sepeti buah anggur. (8 : 954)
Pseudomonas aeruginosa (7 :122)
Kingdom : Prokaryotae
Divisio : Schizophyta
Class : Schizomycetes
Ordo : Pseudomonadales
Famili : Pseudomonadaceae
Genus : Pseudomonas
Spesies : Pseudomonas aeruginosa
Merupakan sel tunggal, batang lurus atau melengkung, namun tidak berbentuk heliks. Pada umumnya berukuran 0,5–1,0 µm x 1,5–4,0 µm. Motil flagellum polar, monotrikus atau multitrikus. Tidak menghasilkan selongsong prosteka. Beberapa merupakan kemolitotrof fakultatif, dapat menggunakan H2S atau Co sebagai sumber energy. Aerobic sejati, kecuali spesies-spesies yang dapat menggunakan denitrifikasi sebagai cara respirasi anaerobic. Katalase positif. (8 : 952)
Bacillus subtilis (7 : 122-123)
Ordo : Eubacteriales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis
Merupakan sel berbentuk batang, 0,3–2,2 µm x 1,27–7,0 µm. sebagian besar motil, flagellum khas lateral. Membentuk endospora, tidak lebih dari satu dalam satu sel sporangium. Gram positif, kemoorganotrof. Metabolisme dengan respirasi sejati, fermentasi sejati, atau kedua-duanya, yaitu respirasi dan fermentasi aerobic sejati dan anaerobic fakultatif. Umumnya dijumpai dalam tanah. (5 : 947)
Salmonella thyposa (9 : 122-123)
Ordo : Eubacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Salmonella
Spesies : Salmonella thyposa
Berbentuk batang, biasanya motil dengan flagellum penitrikus, mungkin terdapat muatan non motil. Kebanvakan akan tumbuh pada medium sintens tanpa faktor tumbuh khusus dan juga dapat menggunakan sitrat sebagai karbon. (8)

BAB III
METODE KERJA
III.1 Alat dan Bahan
III.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah batang pengaduk, botol semprot, cawan petri, erlenmeyer, inkubator, kertas perkamen, ose bulat, ose lurus, paper disk, pinset, rak tabung, spoit, sendok tanduk, sentrifuge, shaker, tabung reaksi, tabung sentrifuge, dan timbangan analitik.
III.1.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah air steril, Aluminium foil, biakan Escherichia coli, S. thyposa, Basillus subtilis Staphylococcus aureus, P. aurogenosa, etanol, medium NA (Nutrient Agar), medium SNA (Starch Nutrient Agar), SNB (Starch Nutrient Borth), medium produksi.
III.2 Cara Kerja
Pengisolasian
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
Sampel tanah peternakan sapi dimasukkan ke dalam botol vial untuk dibuat pengenceran 10-1 sampai 10-7 dan diambil 1 ml pengenceran 10-1,10-2,10-3 ke dalam cawan petri yang berisi medium SNA dengan metode tuang.
Diinkubasi 1x24 jam lalu dilihat pertumbuhan mikroorganisme sampel
Penginokulasian
Cawan petri yang berisi biakan bakteri sampel kemudian diinokulasikan ke dalam medium SNA yang baru untuk mendapatkan koloni murni
Hasil koloni murni dipindahkan kedalam agar miring berisi SNA sebagai isolat
Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 amati pertumbuhan bakteri
Kemudian hasil koloni dari agar miring diambil lalu diinokulasikan lagi ke dalam cawan petri yang berisi medium SNA.
Uji Antagonis
Alat dan bahan yang digunakan disiapkan
Biakan bakteri Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, Pseudomonas aeruginosa dan Bacillus subtilis diambil menggunakan spoit sebanyak 1ml kemudian dimasukkan kedalam masing-masing cawan petri setelah itu dimasukkan medium NA lalu dihomogenkan
Bakteri sampel 10-1 dan 10-2 yang telah diinokulasikan ke dalam cawan petri dicuplikan menggunakan ose lalu ditanamkan ke dalam masing-masing cawan yang berisi medium dan biakan bakteri
Diinkubasi pada suhu 37oc selama 1x24 jam kemudiaan di amati zona bening yang dibentuk oleh bakteri sampel
Uji Fermentasi
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
Koloni diinokulasikan kedalam medium SNB sebanyak 50 ml, lalu dishaker sebagai medium starter
Diinkubasi 1x24 jam dan dilihat terjadi perubahan warna pada medium.
Hasil medium starter dicampurkan kedalam medium SNB sebanyak 100 ml sebagai medium produksi, lalu dishaker 1 jam selama 7 hari.
Tahap Ekstraksi
Disiapkan alat dan bahan yang digunakan.
Dimasukan medium hasil fermentasi kedalam corong pisah sebanyak 50 ml
Dimasukan pelarut etil asetat sebanyak 50 ml ke dalam corong pisah
Digojok corong pisah selama ± 1 jam
Didiamkan selama beberapa menit hingga terpisah antara filtrat dan supernatan, kemudian diambil bagian filtrat dan dimasukan pada mangkok kaca
Filtrat yang ada dimangkok diuapkan pada suhu ruangan.

Uji Daya Hambat
Disuspensikan biakan bakteri dan medium NA ke dalam cawan petri steril, padatkan.
Dibagi dua bagian pada permukaan belakang cawan petri, ditandai bagian kontrol dan bagian ekstrak.
Ekstrak yang terdapat pada mangkok dilarutkan menggunakan pelarut DMSO secukupnya.
Dicelupkan paper disk kedalam larutan, kemudian ditempelkan pada cawan petri yang berisi padatan medium (b) bagian ekstrak.
Dicelupkan paper disk kedalam pelarut DMSO, kemudian ditempelkan pada cawan petri yang berisi padatan medium (b) bagian kontrol.
Dibungkus cawan petri menggunakan kertas putih dan diinkubasi selama 1 x 24 jam pada suhu 37°C.
Diamati zona bening yang terbentuk.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN
IV.1 TABEL PENGAMATAN
No
Bakteri
Control
Sampel
1
Escherichia coli
0,8 cm
0,675 cm
0,9 cm
0,95 cm
1 cm
1,3 cm

0, 792 cm
1, 083 cm
2
Staphylococcus aureus
1,1 cm
0,95 cm
1,35 cm
1,1, cm
0,9 cm
1,3 cm

1,133 cm
1,1 cm
3
Salmonella thyposa
0,85 cm
1,05 cm
0,85 cm
1,3 cm
1,2 cm
1,45 cm

0,927 cm
1,317 cm

IV.2 Gambar Pengamatan
IV.2.1 Tahap Isolasi
FAKULTAS FARMASI

Ket : Isolasi pengenceran 10-1

FAKULTAS FARMASI


FAKULTAS FARMASI


IV.2.2 Tahap Inokulasi
FAKULTAS FARMASI

Ket : Inokulasi pengenceran 10-1

FAKULTAS FARMASI

Ket : Inokulasi pengenceran 10-2

FAKULTAS FARMASI

Ket : Inokulasi tahap kedua pengenceran 10-2

FAKULTAS FARMASI

Ket : Inokulasi tahap kedua pengenceran 10-2

IV.2.3 Pemurnian
FAKULTAS FARMASI

Ket : isolat murni
FAKULTAS FARMASI

Ket : kultur murni

IV.2.4 Uji Antagonis
FAKULTAS FARMASI

Ket : Staphylococcus aureus

FAKULTAS FARMASI

Ket : Escherichia coli

FAKULTAS FARMASI


FAKULTAS FARMASI


FAKULTAS FARMASI

Ket : Salmonella thyposa

FAKULTAS FARMASI

Ket : Pseudomonas aureginosa

FAKULTAS FARMASI

Ket : Bacillus subtilis

IV.2.5 Uji Fermentasi
FAKULTAS FARMASI

Ket : starter

IV.2.6 Uji Daya Hambat
FAKULTAS FARMASI


FAKULTAS FARMASI

Ket : Salmonella thyposa

FAKULTAS FARMASI


BAB V
PEMBAHASAN
Pada isolasi mikroorganisme penghasil antibiotik ini, digunakan sampel dari tanah peternakan sapi. Pada dasarnya, tanah merupakan salah satu habitat dari mikroorganisme. Mikroorganisme yang umumnya terdapat di tanah adalah populasi actinomycetes. Keberadaan actinomycetes dalam tanah telah banyak dikaji peneliti. (3:2)
Langkah awal dari isolasi actinomycetes pada tanah sekitar peternakan sapi yaitu dengan melakukan pengenceran sampel dengan pengenceran 10-1 , 10-2, dan 10-3, menggunakan medium SNA (Starch Nutrient Agar) dan diinkubasi1-2 hari pada suhu 37oC. Setelah diinkubasi, diperoleh 3 jenis koloni yang berbeda, yaitu koloni berwarna putih, koloni berwarna hitam, dan koloni berwarna kuning. Salah satu karakteristik dari bakteri actinomycetes yaitu dengan adanya pigmen sehingga menghasilkan koloni yang berwarna.
Ketiga koloni bakteri actinomycetes tersebut, dilakukan uji antagonis terhadap bakteri Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, Eschericia coli, dan Pseudomonas aureginosa. Setelah diinkubasi, diperoleh bahwa koloni putih yang merupakan hasil inokulasi menunjukkan aktivitas yang dapat menghambat bakteri Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, Eschericia coli, tetapi tidak untuk bakteri Bacillus subtilis, dan Pseudomonas aureginosa.
Aktivitas yang ditunjukkan oleh koloni putih (isolat) tersebut, dilanjutkan dengan melakukan proses fermentasi. Sebelum fermentasi dilakukan, terlebih dahulu dilakukan starter dengan menginokulasikan koloni putih tersebut ke dalam medium SNB (Starch Nutrient Broth) 50 ml selama 7 hari penginkubasian dengan dikocok setiap harinya selama 5 menit. Tujuan dilakukannya tahap starter dengan perlakuan dikocok setiap harinya yaitu untuk mendapatkan koloni bakteri yang tumbuh dalam medium SNB tersebut.
Setelah 7 hari penginkubasian dalam medium starter dan didapatkan bakteri yang tumbuh, maka dilanjutkan ke tahap fermentasi dengan menggunakan medium SNB (Starch Nutrient Broth) sebanyak 100 ml dan ditambahkan dengan medium starter. Tahap fermentasi dilakukan selama 2 minggu dengan perlakuan yang sama pada tahap starter, tetapi lama pengocokan yang berbeda, yaitu selama 1 jam.
Setelah tahap fermentasi, dilanjutkan dengan tahap ekstraksi isolat dengan menggunakan pelarut etil asetat (1:1) yang dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian digojog selama ± 30 menit, sehingga akan menghasilkan filtrat dan residu. Selain etil asetat, dapat pula digunakan pelarut yang memiliki sifat yang sama dengan etil asetat yaitu pelarut non polar yang tidak dapat bercampur dengan isolat yang dihasilkan. Contohnya seperti pelarut n-heksan.
Filtrat yang dihasilkan, selanjutnya dikeringkan sehingga di dapatkan ekstrak dari isolat tersebut. Ekstrak yang dihasilkan selanjutnya dilarutkan menggunakan pelarut organik, yaitu pelarut Dimethyl Sulfo Okside (DMSO). Pelarut DMSO yang digunakan, karena pelarut ini merupakan pelarut yang tidak menghambat aktivitas mikroorganisme.
Ekstrak yang telah dilarutkan dengan pelarut DMSO, selanjutnya dilakukan uji daya hambat kembali, yang merupakan tahap akhir dari isolasi ini. Uji daya hambat ini dilakukan terhadap tiga bakteri yaitu Staphylococcus aureus, Salmonella thyposa, dan Eschericia coli.
Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh bahwa isolat yang dihasilkan mampu menghambat ketiga jenis bakteri tersebut, terutama untuk bakteri Salmonella thyposa yang menunjukkan hasil yang paling baik dibanding kontrol yaitu masing-masing sebesar 1,32 cm dan 0,92 cm, begitupun terhadap bakteri Eschericia coli yang menunjukkan luas daya hambat yang lebih besar dibanding kontrol, masing-masing sebesar 1,08 cm dan 0,79 cm. Akan tetapi, untuk bakteri Staphylococcus aureus daya hambat yang ditunjukkan hampir sama dengan kontrol yaitu masing-masing sebesar 1,1 cm, sedangkan kontrol sebesar 1,2 cm. Aktivitas yang ditunjukkan oleh isolat yang dapat menghambat ketiga jenis bakteri tersebut menunjukkan bahwa isolat tersebut mampu menghasilkan antibiotik.

BAB VI
PENUTUP
VI.I Kesimpulan
Berdasarkan hasil percobaan, maka dapat disimpulkan bahwa :
1. Isolat murni yang dihasilkan dari tanah sekitar peternakan sapi mempunyai aktivitas antibiotik terhadap bakteri Salmonella thyposa, Escherichia coli dan Staphylococcus aureus.
2. Aktivitas daya hambat isolat terbesar ditunjukkan terhadap bakteri Salmonella thyposa yaitu sebesar 1,32 cm dibandingkan dengan kontrol hanya sebesar 0,92 cm.
VI.2. Saran
Adapun saran dari penulis yaitu :
Perlu dilakukan pengembangan lebih lanjut terhadap isolat bakteri actynomicetes penghasil antibiotik dari tanah sekitar peternakan sapi.
Perlu dilakukan aktivitas biokimia terhada isolat yang dihasilkan.
Perlu pula dilakukan adanya penentuan struktur terhadap antibiotik yang di hasilkan. Instrumen yang dibutuhkan seperti Spektrofotometri UV-Vis, PCR, dan NMR.

DAFTAR PUSTAKA
Volk dan Wheeler, 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid 1. Jakarta : Erlangga.
Suwandi, U., 1993. Perkembangan Antibiotik. Cermin Dunia Kedokteran No. 83. Pusat Penelitian dan Pengembangan PT. Kalbe Farma, Jakarta.
Okami Y, Hotta K. 1988. Actinomycetes in Biotechnology. London: Academic Pr. Hal. 11-19.
Budiyanto, M.A.K. 2004. Mikrobiologi Terapan. Malang: UMM-Press.
Dhanasekaran D et al. 2005. Screening of salt pans Actinomycetes for antibacterial agents. The Internet J Microbiol 1:2.
Mutschler, E. 1991, Dinamika Obat, edisi kelima, Penerbit ITB, Bandung.
Suriawiria, Unus. 1983. Pengantar Mikrobiologi Umum. Angkasa : Bandung.
Lay, Bibiana W. 1990. Mikrobiologi. Bandung : Institut Pertanian Bogor.
Sutedjo, M. 1996. Mikrobiologi Tanah. Jakarta. Rineka Cipta.
Cross, T. .1988. Actinomycetes: A Continuing Sources of New Metabolites. Invitation ONR Lecture . Postgraduate School of Studies in Biological Science,University of Bradford, BradfordDB7 IDP, Great Britain
Locci. R., & G.P. Sharples. 1983.Morphology of Actinomycetes InGoodfellow M., Mordarski, M. &Williams, S.T. (Eds.) The Biologyof the Actinomycetes. AcademicPress, London, pp. 7164
Jiang, C-L, & Xu, L.-H, 1990, Characteristics Of The Populations Of Soil ActinomycetesIn Yunnan, Juornal : Actinomycetes 1990 Vol. 1, Part.3. p67-74. ISSN: 0732-0574.

LAMPIRAN
Skema kerja
diencerkanTahap isolasi
diencerkan
Tanah sekitar peternakan sapi10-510-410-310-210-1
Tanah sekitar peternakan sapi
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1

10-3 10-210-1
10-3
10-2
10-1

Di spoit 1 ml
Di spoit 1 ml
Medium SNA
Medium SNA
Di inkubasi 1x24 jam (37°C)

Diambil 1 oseTahap inokulasi
Diambil 1 ose
Metode goresHasil isolasiMedium SNA
Metode gores
Hasil isolasi
Medium SNA

Tahap antagonis

ditempelkanPotongan isolatBiakan bakteri1 mlMedium NA15 mlDi inkubasi 1x24 jam (37°C)isolat+
ditempelkan
Potongan isolat
Biakan bakteri
1 ml
Medium NA
15 ml

isolat
+

Tahap fermentasi
Potongan isolat
Potongan isolat
Diinkubasi 7x24 jam(di shaker 1 x sehari, 5 menit) isolatMedium starter(SNB) 10 ml
Diinkubasi 7x24 jam
(di shaker 1 x sehari, 5 menit)
isolat
Medium starter
(SNB) 10 ml

Diinkubasi 7x24 jam(di shaker 1 x sehari, 1 jam) Medium fermentasi(SNB) 100 ml
Diinkubasi 7x24 jam
(di shaker 1 x sehari, 1 jam)
Medium fermentasi
(SNB) 100 ml

Ekstraksi isolat

50 ml50 ml
50 ml
50 ml
Digojok ± 30 menitHasil fermentasiEtil asetat
Digojok ± 30 menit
Hasil fermentasi
Etil asetat

Diambil filtrat
Diambil filtrat

diuapkan
diuapkan

ditempelkanUji daya hambat
ditempelkan
dcelupkan
dcelupkan

Medium NAEkstrak dilarutkan dengan DMSOPaper disk+Biakan bakteri+ v
Medium NA
Ekstrak dilarutkan dengan DMSO
Paper disk
+
Biakan bakteri
+

Diinkubasi 1x24 jam (37oC)
Diinkubasi 1x24 jam (37oC)
Amati zona bening
Amati zona bening

ISOLASI ACTINOMYCETES

Recommend Documents