Universidad de San Carlos de Guatemala Facultad de Agronomía Área de Ciencias Subárea de Ciencias Biológicas Laboratorio Fisiología Vegetal Aux. Camilo Wolford Estudiantes:
Melvin Estuardo Gómez Sija 201516703 Pedro Elmer del Cid Gómez 201400489
Practica 3. Pigmentos celulares. 1
INTRODUCCIÓN. La fotosíntesis es sin duda la reacción de mayor importancia para la planta pues le permite transformar la energía lumínica del sol en energía química que es clave para su funcionamiento y desarrollo. En dicho proceso, como se ha explicado con anterioridad, las plantas deben absorber la luz solar formando compuestos energéticos tales como el NADPH y el ATP. Dicha absorción la llevan a cabo dentro de la hoja diferentes pigmentos celulares entre los que se encuentran las clorofilas, los carotenos, entre otros. Es importante, por lo tanto, analizar dichos pigmentos y por tal razón, la presente practica pretende discutir algunas de las características fotoquímicas de dichos pigmentos así como cuantificar su presencia en hojas de espinaca y de esta manera determinar su importancia en el proceso fotosintético de las plantas.
2 OBJETIVOS 2.1 Extraer pigmentos fotosintéticos de la hoja de espinaca y determinar la Rf de cada uno de ellos. 2.2 Analizar y discutir los resultados de la Rf y determinar su funcionalidad en la determinación de pigmentos celulares. 2.3 Determinar cuantitativamente la presencia de clorofilas en la hoja de espinaca. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 3.1 Pigmentos fotosintéticos. Como se ha estudiado con anterioridad, el proceso fotosintético dentro de las plantas está afectado por muchos factores, entre los que podemos mencionar el CO2, la temperatura, el pH y la luz. En este sentido “la luz representa uno de los factores más heterogéneos, espacial y temporalmente, de entre los que afectan a las plantas.” (Manrique, 2003) La importancia de la luz es fundamental para llevar a cabo el proceso fotosintético y la energía lumínica que procede de ella es absorbida por la planta a través de diferentes pigmentos celulares.
“Se podría asegurar sin miedo a equivocarse que los pigmentos fotosintéticos son las base de la vida sobre el planeta Tierra. Son las sustancias capaces de captar energía lumínica y de transformarla en energía química mediante la fotosíntesis.” (Manrique, 2003) Las plantas contienen una gran variedad de pigmentos que le da a la planta sus característicos colores. “Obviamente, las flores y los frutos contienen muchas moléculas orgánicas que absorben luz. Las hojas, tallos, y raíces también contienen muchos pigmentos, que incluyen las antocianinas, flavonoides, flavinas, quinonas y citocromos. Sin embargo, ninguno de éstos debe ser considerado como un pigmento fotosintético”. (USDA, 2015) La planta, por lo tanto, posee, “pigmentos primarios, son los que tienen como finalidad principal la captación de la energía lumínica” (Manrique, 2003)tales como las clorofilas A y B y posee asimismo pigmentos accesorios “cuya función es por una parte ampliar el espectro de absorción de los pigmentos primarios y por otra de servirles como sistemas de protección frente a la luz excesiva” (Ibíd) 3.2
Pigmentos primarios. En la gran mayoría de plantas podemos encontrar los dos principales pigmentos primarios: Clorofila A y Clorofila B. (Chl a y Chl b). “La diferencia entre ambas clorofilas es que Chl a presenta un grupo metilo (-CH3) en el perímetro del anillo tetrapirrólico, mientras que en Chl b este grupo ha sido oxidado para formar un grupo formol (-CH=O), también conocido como grupo formilo. Tal diferencia permite que las clorofilas a y b absorban luz de longitudes de onda ligeramente diferentes dentro del espectro visible.” (USDA, 2015)La siguiente figura presenta las estructuras de la clorofila a y clorofila b así como el grupo funcional que las diferencia: FIGURA 1. Estructura de la clorofila a y clorofila b.
Fuente: Los pigmentos fotosintéticos, Universidad Nacional de Colombia.
Es importante resaltar que se han encontrado otras clorofilas pues “también existe una clorofila c, la cual se puede hallar en algas pardas pero es una clorofilina a la cual le falta la cola de fitol y los átomos de hidrogeno en las posiciones 7 y 8 en el anillo IV. La clorofila d ha sido encontrada en las algas rojas mientras que la bacterioclorofila es el pigmento típico de los bacterios fototrópicos.” (UNAL) 3.3 Pigmentos accesorios La otra clase de pigmentos fotosintéticos conocidos como accesorios son los carotenoides. La mayoría de las plantas “contienen una gran variedad de carotenoides, incluyendo beta-caroteno, luteina, neoxantina y violaxantina. La estructura básica de todas estas moléculas está compuesta de una unidad ramificada repetida de cinco carbonos.” (USDA, 2015) Se dividen, a su vez, “en Carotenos que son hidrocarburos insaturados y en Xantofilas que son derivados oxigenados de los anteriores.” (UNAL) Podemos asimismo encontrar FICOCIANINAS Y FICOERITRINAS que son “pigmentos de color azul-verdoso y rojo-morado están limitados a las cianofíceas (algas verde-azules) y rodofíceas (algas rojas), al lado de la clorofila a y algunos carotenoides. Son compuestos emparentados con las clorofilas por ser compuestos del tipo tetrapirrol, difieren de estas en sus propiedades físicas y químicas” (UNAL) Figura No. 1 Representación gráfica de los pigmentos fotosintéticos. El color verde en los vegetales es debido a la presencia de dos pigmentos estrechamente emparentados llamados clorofila a y clorofila b. Asociados con las clorofilas, existen también en los cloroplastos dos clases de pigmentos amarillos y amarillo-anaranjados que son las xantofilas y carotenos.
Fuente: (blafar.blogia.com, 2007)
4 METODOLOGÍA Separación de los pigmentos Fotosintéticos y Fluorescencia de la Clorofila. •
Macere completamente 2g de hoja mas 7 ml de acetona.
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preparar camara cromatografica agrgando 10ml de toluol.
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Saque el papel antes de que llegue al borde
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Observe la fluorecencia.
Determinación cuantitativa de las clorofilas •
Macerar 1g de hoja mas 4ml de acetona pura mas 20 ml de acetona.
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transfiera al embudi Buchner
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Agregue 30ml de acetona a la pulpa de hojas y reanudar molienda
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Lave mortero y embudo con 10 a 30ml de acetona
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Llene la cubeta del especto fotometro con el extracto de clorofilas
Otros pigmentos no fotosintéticos. •
30gr de petalos de flores azules en 100ml de H2O
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En 3 tubos de ensayo coloque 5ml de extracto y determine e pH y agregar acido acetico
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Introducir una flor azul una roja y una blanca y agregar NH4OH
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Repetir procedimiento con otro grupo de flores.
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Completar cuadros.
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cortar llemas entrocitos agrgar 3ml de HCL 1%
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Preparacion de placas cromatograficas. 5gr de celulosa, 2gr de silica gel y 40ml de agua.
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Dejar una pelicula de 0.3mm de grosor.
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a 2.5cm de la placa marcar una linea aplicar gotas del extracto
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Revelado, solvente n-butanol
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Coloque la placa en la camara por una o dos horas
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN En la figura siguiente se muestra los desplazamientos de los pigmentos de la muestra vegetal obtenidos en el experimento de cromatografía. FIGURA 2. Cromatoplaca utilizada para determinar distancias de pigmentos.
10.5cm
5.7cm
2.3 cm
0.68cm
Fuente: Grupo No. 3 Laboratorio Fisiología Vegetal FAUSAC Color Verde Amarillo Verde-azulado
Distancia (cm) 0.68 2.3 5.7
0.68𝑐𝑚
RF1= 10.5𝑐𝑚 = 0.06
Eluente (cm) 10.5 10.5 10.5
Rf 0.06 0.22 0.54
Tipo de pigmento Clorofila a xantoproteina Clorofila b
2.3𝑐𝑚
RF2= 10.5 𝑐𝑚 = 0.22
5.7𝑐𝑚
RF3= 10.5𝑐𝑚 = 0.54 Al romper las células en el mortero los pigmentos que se hallaban encerrados en los cloroplastos dentro de ellas pasan a la acetona. En la disolución extraída del vegetal se tendrá tantos pigmentos como bandas coloreadas aparezcan en la cromatografía. Al observar el papel se aprecian 3 bandas que corresponden a los distintos pigmentos
fotosintéticos presentes en las hojas del vegetal usado, que en orden de menor a mayor solubilidad en acetona.
En el cuadro siguiente se presentan los valores obtenidos de Absorbancia en clorofila de una muestra vegetal. La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y transmitida al pasar por la muestra. Mientras que la absorbancia es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma. Según J. Val, L. Heras y E. Monje la concentración esperada en la clorofila a es de 2.71 y se obtuvo 2.348, la esperada en la clorofila b es de 1.652 y la obtenida es de 1.654 es las absorbancias antes mencionadas. (Val, Heras, & Monje, 1985) Las ecuaciones que permiten el cálculo de las concentraciones su finalidad es minimizar la contribución del resto de componentes que tienen la misma longitud de onda, las clorofilas al tener sus espectros muy semejantes y absorber casi en las mismas longitudes de onda no cumplen lo anterior pudiendo influir una sobre otra La diferencia entre lo esperado y lo calculado puede estar relacionado con el error cometido en la extracción de la clorofila o en la lectura de las absorbancias.
6 CONCLUSIONES 6.1 Las rf de los pigmentos fotosintéticos obtenidos de la hoja de espinaca son 0.06, 0.22, 0.54. 6.2 El pigmento con rf=0.0.06 es una clorofila a, el pigmento con rf=0.22 es una xantofila y el pigmento con rf=0.54 es una clorofila B. 6.3 La clorofila total presente en la hoja de espinaca es de 4.003 μg* ml -1
7 Bibliografía blafar.blogia.com. (2007). los pigmentos vegetales. Recuperado el 25 de Octubre de 2016, de blafar.blogia.com: http://blafar.blogia.com/2007/040901-los-pigmentosvegetales.php Manrique, E. (2003). Los pigmentos fotosintéticos, algo más que la captación de luz. Recuperado el 24 de Octubre de 2016, de revistaecosistemas.net: http://www.revistaecosistemas.net/index.php/ecosistemas/article/viewFile/250/24 6 UNAL. (s.f.). Los pigmentos fotosíntetios . Recuperado el 25 de Octubre de 2016, de virtual.unal.edu.co: http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000051/lecciones/cap02/02_04.ht m UNAM. (2006). manual de prácticas de fotosíntesis . Recuperado el 2016 de Octubre de 2016, de books.google.com.gt: Disponible en: https://books.google.com.gt/books?id=FanXSdICoIC&pg=PA32&lpg=PA32&dq=rf+de+pigmentos+fotosinteticos&source=bl&ots=y 6Gwq8Y-La&sig=RkBX1sdjpRQ0NV USDA. (2015). Los pigmentos vegetales y la fotosíntesis . Recuperado el 24 de Octubre de 2016, de passel.unl.edu: http://passel.unl.edu/pages/informationmodule.php?idinformationmodule=101179 7732&topicorder=4&maxto=10&minto=1 Val, J., Heras, L., & Monje, E. (1985). Nuevas ecuaciones para determinación de pigmentos fotosintéticos en acetona, Zaragoza. Recuperado el 25 de Octubre de 2016, de digital.csic.es: http://digital.csic.es/bitstream/10261/13836/1/ANALES_17_3-4Nuevas%20ecuaciones.pdf Consultado el: 27/08
