1. OBJETIVOS Extraer el ADN de una muestra vegetal (tomate) y una fruta (plátano).
2. FUNDAMENTO TEORICO El ácido desoxiribon desoxiribonuclei ucleico co o ADN (DNA) es la molécula molécula que guarda guarda el códi código go gené genéti tico co de toda todas s las las célul células. as. Sin Sin impo importa rtarr que que el organ organis ismo mo sea multice multicelul lular ar o unicelul unicelular, ar, eucariot eucariota a o procario procariota, ta, todos todos tienen tienen el DNA como vehículo de su código genético. Muchas Muchas de las técnica técnicas s de biolog biología ía molecu molecular lar incluye incluyen n algún algún tipo de manipulación del material genético. Estos procedimientos han logrado adelantar hasta tal grado el conocimien-to del código genético, que ya es posible clonar organismos enteros. Los procedimientos iniciales eran largos y tediosos y podían pasar varios días antes de saber con certeza que se había logrado obtener DNA en calidad y cantidad suficiente para poder manipularlo. Además algunos de los react reactiv ivos os usado usados s para para esto estos s proce proceso sos s son son tóxic tóxicos os y muta mutagé géni nico cos. s. Hoy Hoy día día podemos obtener suficiente DNA de buena calidad en unas horas. Los ácidos nucleicos están siempre asociados con proteínas, de allí que una vez hecha la ruptura de las células se proceda a la desproteinización. Esta puede realiza realizarse rse agitand agitando o suaveme suavemente nte la mezcla mezcla ácido ácido nucleic nucleico-p o-prote roteina ina con una solució solución n de fenol fenol y/o una mezcla mezcla de clorof cloroform ormo-a o-alco lcohol hol isoamílic isoamílico o a fin de precipitar las proteinas, la que se remueven por centrifugación. Las proteinas pueden también disociarse de los ácidos nucleicos con detergentes, cloruro de guanidina o altas concentraciones salinas, pueden también degradarse mediante proetasas, tal como la pronasa. Se obtiene así una mezcla de RNA y DNA que puede aislarse precipitando con etanol. El RNA se recupera de estos precipitados tratándolo con DNAsa pancreática para eliminar el DNA, y el DNA puede liberarse del RNA tratando el precipitado con RNasa. El DNA y RNA pueden también separase por ultracentrifugaciones. En todo este proceso y las maniulaciones subsecuentes, los ácidos nucleidos deben protegerse de la acción degradativa de las nucleasas. Estas pueden inhibirse por agentes quelantes como el EDTA que secuestra los iones metálicos divalentes que son esenciales para la actividad de las las nucl nuclea easa sas. s. Los Los ácid ácido os nucl nuclei eico cos s son son gene genera ralm lmen ente te de más más fáci fácill
manipulación que las proteínas por carecer, en la mayoría de los casos, de estructura terciaria, haciéndolas más tolerantes a condiciones extremas.
3. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL a. Se trituró la muestra con un poco de agua destilada en el mortero. b. Se tamizó el triturado celular en un recipiente limpio. Se tomó 5 ml del triturado celular tamizado en un recipiente limpio y se agregó 5 ml del tampón frío. Se agitó vigorosamente durante 2 minutos. c. Se tomó 5 ml de la suspensión molecular en un tubo de ensayo (el sobrenadante) y se añadió 5 ml de alcohol isoamílico a 0ºC. d. Se dejo reposar e. Se realizó los pasos a, b, c y d, para el plátano.
4. OBSERVACIONES Y DATOS TABULADOS FALTA 5. RESULTADOS Y CALCULOS Muestra 1: Tomate Muestra 1, después de agregar alcohol
Después de 5 minutos de reposo:
Muestra 2: Plátano Muestra 2, después de agregarle alcohol
Muestra 2, después de 5 minutos de reposo
6. DISCUSIÓN La extracción de ADN empieza cuando se rompen las células mediante un detergente, vertiendo a este contenido molecular una disolución tampón. El tampón ahora contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se fraccionan en cadenas más pequeñas y separadas de él por acción del detergente. El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua.
7. CONCLUSIONES La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas. En primer lugar tienen que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN. Por último hay que proteger el ADN de enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay que hacer que precipite en alcohol.
8. BIBLIOGRAFÍA
FALTA
10.CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es la función del cloruro de sodio, detergente, alcohol isoamilico?
a. Cloruro de Sodio: El NaCl tiene como función de proteger y guardar el ADN.
b. Detergente (shampoo): El detergente es utilizado para realizar una mezcla homogénea de los tejidos utilizados.
c. Alcohol Isoamílico: El ADN se precipita en el alcohol fuera de la solución, donde puede ser visto. Además de permitirnos ver el ADN, el alcohol separa el ADN de otros componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa. 2. ¿Cuál es la función del detergente sobre la membrana celular? La función del detergente sirve para romper la membrana plasmática y nuclear e incluso la pared celular. 3. ¿Por qué el ADN precipita en alcohol? El alcohol se utiliza para precipitar el ADN que es soluble en agua pero, cuando se encuentra en alcohol se desenrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el agua. 4. ¿Por qué se debe trabajar a bajas temperaturas? A menor temperatura menor solubilidad. El ADN es muy poco soluble en alcohol, y menos aun en alcohol frio, por lo que precipita más rápido. 5. ¿Por qué el azul de metileno tiñe las fibras del ADN? El azul de metileno tiñe el ADN, porque este posee un grupo fosfato en su estructura. 6. ¿Qué otros colorantes que pueden ser utilizados para teñir las fibras de ADN? Se puede utilizar el verde de metilo para teñir las fibras del ADN.
7. Explique, cómo se puede determinar la concentración del ADN. Para determinar la concentración del ADN obtenido, se puede utilizar el siguiente procedimiento: a. Diluir 20 ml de muestra de DNA en 980 ml de agua desionizada y esteril (dilución 1/50) b. Medir absorbancia a 260 nm usando cubetas de 1 ml, que puedan usarse a luz ultravioleta. c. La concentración de DNA a A260 = 1.0 en una cubeta de 1 cm equivale a 50 mg de DNA por ml de agua. Para calcular la concentración de la muestra: [DNA] = 50 mg / ml x A260 x factor de dilución (50) [DNA total] = [DNA] x volumen eluído en ml
