UNIVERSIDAD NACIONAL NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS IC A ) (Universidad del Perú, D E C A N A D E A M E R IC FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA EAP de Farmacia y Bioquímica
CÁTEDRA DE QUÍMICA ANALÍTICA INSTRUMENTAL
Mesa: 2 Docente: Mg. Docente: Mg. Norma Angélica Carlos Casas Alumnos: Acuña Alayo, Manuel Manuel Antonio Castro Rojas, Elizabeth Hijar López, Julio Armando Miranda Zevallos, Wilfredo Daniel Palma Albino, Cleni Teodora Santa Cruz, Lucía del Pilar Vásquez Quispe, Kelly Lizbet
13040089 13040129 13040011 13040110 13040019 13040062 13040030
Grupo de laboratorio: Viernes // 8:00 am. – 2:00 pm. Ciclo académico: 2014-II académico: 2014-II
1. OBJETIVO Aplicar el método espectrofotométrico para la determinación cuantitativa de un principio activo por medio de la formación de complejos coloreados.
2. MARCO TEÓRICO El análisis cuantitativo utilizando la espectrofotometría UV-visible se puede realizar a través de una solución patrón de concentración conocida seguido del análisis del compuesto desconocido. La concentración de la muestra desconocida se calculará mediante la expresión siguiente:
= ( ) Donde: C = concentración del problema Cs = concentración del patrón Ap = absorbancia que presenta la muestra As = absorbancia que presenta la muestra patrón En este caso el cálculo de la concentración del problema depende d el hecho de que problema y patrón se vean sometidos a un tratamiento experimental idéntico. Además ha de asumirse que existe proporcionalidad lineal entre la absorbancia y la concentración, en el intervalo de concentraciones objeto de estudio; es decir, que si la solución problema posee una concentración doble que la solución patrón, deberá por tanto, mostrar doble valor de absorbancia que el patrón. Es frecuente utilización de dicha ecuación en química clínica, como ejemplo tenemos la determinación de ácido úrico por el método propuesto.
3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Materiales, equipos y reactivos Espectrofotómetro UV –visible, celdas de vidrio y de cuarzo Pipetas volumétricas de 1,0; 2,5; 5,0 mL al centésimo, vasos de precipitados, fiolas de 10 mL. Framicetina al 1% (FRAMIDEX), nitroprusiato de sodio al 10%, acetona, tetraborato de sodio (sol. saturada)
A
D
B
C
E
Fig. 1. Materiales y equipo. A. Espectrofotómetro UV-Vis. B. Celdas de vidrio. C. Fiola de 10mL. D. Pipetas de 1, 5, 10mL. E. Vaso de precipitación
3.2. Métodos Se dispone de tres fiolas 10mL cada una, marcando respectivamente estándar (St), muestra problema (MP) y blanco (Bl). Se midió 1mL de Framicetina al 1% (Framidex) y se colocó en la fiola St. Para la segunda se agregó un volumen adecuado de Framicetina a la fiola MP y en la última fiola se llenó con 1mL de agua; ya que la Framicetina es incolora, no se puede leer en el espectrofotómetro UV-Vis es por eso que se le agrega otros compuestos para así poder colorearlo y tener una lectura.
Para ello se pesó 1g de nitroprusiato de sodio y se llevó a una fiola de 10mL para así tener una solución al 10%, también se preparó una solución sobresaturada de tetraborato de sodio disolviendo una cierta cantidad hasta que dejara de disolver. Después a cada una de las fiolas se les agrega de manera ordenada lo siguiente: 0.4mL de nitroprusiato de sodio al 10% que sirve para poder darle color a la Framicetina formando un complejo color púrpura, 0.8mL de acetona que ayuda a la solubilidad del compuesto y 2mL de una solución sobresaturada de tetraborato de sodio que actúa como un buffer; luego se llena con agua destilada hasta el aforo y se homogeniza.
A
B
C
Fig. 2. Fiolas con sus respectivas soluciones. A. Fiola que contiene al blanco. B. Fiola que contiene al estándar. C. Fiola que contiene a la muestra problema
Una vez obtenidas las tres soluciones se espera 15 minutos para que se dé la reacción, pasado ese tiempo se procedió a realizar la lectura en el espectrofotómetro modelo GENESYS 10S UV-VIS MARCA THERMO SCIENTIFIC a una longitud de onda óptima de 585nm, ubicando en la posición del blanco al blanco (agua destilada); en la posición 1 al blanco preparado; en la posición 2 a la sustancia estándar y en la posición 3 a la muestra problema.
4. RESULTADOS 4.1. Desarrollar los cálculos previos. Detallar los cálculos del factor de dilución (FD) Se diluyó la muestra problema, se tomó 1 mL de muestra y se trasvasó a una fiola de 10 mL, por lo que el factor de dilución (FD) es
se
trabajó con un estándar de concentración conocida de 1000 µg/mL. Los datos dados por el espectrofotómetro UV- visible a λ=585 nm son los siguientes: Para la muestra en blanco (agua más acetona y más nitroprusiato de Na) se obtuvo T% 60.7, pasando a absorbancia fue de A=0.2168. Para la solución estándar se obtuvo T% 17.1, pasando a absorbancia fue de As=0.767 Para la solución problema se obtuvo T%17, pasando a absorbancia fue de Ap= 0.770 Para hacer la aplicación de la fórmula primero debemos tener en cuenta la absorbancia del estabilizador (Nitroprusiato de Na) y el solvente (acetona), para eso debemos restar estas absorbancias a las del estándar y de la muestra problema. Absorbancia del estándar=As-A=0.767-0.2168=0.5502 Absorbancia de la solución problema =Ap-A=0.770-0.2168=0.5532
4.2. Hacer los cálculos de la concentración de la Framicetina en la forma farmacéutica expresados en mg/Ml Aplicando la fórmula:
= ( )
0.5532 = (0.5502)1000 / = 1005.4525 / Pero recordemos que hemos hecho una dilución para eso multiplicamos por el Factor de dilución
10 1 = = 1005.4525 1 1000 = 10.054525 /
4.3. Concluya si la muestra se acepta o se rechaza ¿por qué? El fabricante nos dice que la concentración de Framicetina (sulfato de neomicina) en el fármaco es 10 mg/mL Sacando el porcentaje con respecto a lo que nos da el fabricante con lo que calculamos, nos da:
10.054525 / % = 10 / 100% = 100.54525%
La USP número 36 nos indica que el sulfato de neomicina, usado como ungüento oftálmico contiene el equivalente al no menos de 90.0% y no más del 135.0% de la cantidad declarada de neomicina 1; por lo que nuestra muestra es ACEPTADA ya que está dentro del rango permitido de concentración (90.0% < 100.54525% < 135.0%)
5. CUESTIONARIO 5.1. Desarrolle la ecuación química del fundamento
5.2. ¿Cuál es la ventaja de esta forma de cuantificación? Se puede emplear en condiciones tales que la contribución de los interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se puede realizar la oportuna corrección del error determinado por el interferente2
5.3. ¿En qué consiste un patrón externo? Ejemplos prácticos Este método de análisis se aplica en la determinación de un analito, en el cual los componentes de la matriz de la muestra como también los reactivos usados en la preparación de la misma no interfieren en el análisis, es decir no se tiene un efecto de la matriz en la señal medida. También se puede emplear en condiciones tales que la contribución de los interferentes, sobre las medidas se mantiene constante, con lo cual se puede realizar la oportuna corrección del error determinado por el interferente. Los estándares de calibrado seleccionados deben aproximarse tanto en la concentración del analito como en su composición de los diferentes componentes químicos, presentes en la matriz de la muestra. Este requerimiento es aplicado en todos los métodos de calibración propuestos 3 Ejemplo 1: Se tienen tres muestras de agua potable A, B y C de 10 mL cada una, en la cual se debe cuantificar la cantidad de cobre presente por absorción atómica. Para ello, la muestra es filtrada, acidificada con ácido nítrico y se diluye a un volumen final de 25 mL. Posteriormente, se mide la respuesta instrumental de cada muestra de agua. Adicionalmente, se prepara una serie de patrones de Cu en agua destilada y desionizada que también se acidifica y se mide su respuesta instrumental junto con una solución blanco (solución que no contiene analito). Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 1.
Tabla 1. Resultados obtenidos con una serie de estándares de Cu y la solución blanco. Cu(mg/L) Respuesta instrumental 0 0,001 1 0,1 2 0,2 3 0,3 4 0,4 5 0,5 6 0,6 7 0,7
Una vez que se calibra el instrumento, utilizando los estándares y aplicando el mismo procedimiento, se miden las muestras de agua y se registran los resultados que se presentan en la tabla 2. Muestra Respuesta instrumental A 0,39 B 0,45 C 0,41 Tanto los resultados obtenidos de las señales medidas correspondientes a las soluciones estándares como a las muestras, deben corregirse utilizando la medida del blanco. Luego se procede a realizar el análisis estadístico de la data experimental y la gráfica correspondiente. A partir de la gráfica 1, se observa que la relación entre la respuesta instrumental y la concentración de los estándares de cobre, muestran una relación lineal indicativo de que la respuesta instrumental es directamente proporcional a la concentración. Por ello, es posible relacionar la respuesta del instrumento con el contenido de Cu en las muestras de agua, y la cual puede expresarse por la ecuación 1:
Señal analítica (y) = constante x conc. Est. + Señal Blanco (Ec.1) Por mínimos cuadrados se obtiene: Constante = 0,1 señal analítica/concentración Intercepto=5,5 E-17 señal analítica Sustituyendo estos valores en la Ec.1 se obtiene
Señal (y) = 0,1 x concentración de Cu (mg/L) + 5,5E-17, la cual se utiliza para determinar las concentraciones de Cu en las muestras de agua potable analizadas, y que se presentan en la tabla 3.
Fig. 3. Curva de calibración sencilla para el cobre
Tabla 3. Resultados del análisis de las muestras de agua en concentración
Número muestra Cu(mg/L) A 9,75 B 11,25 C 10,25 * Resultados aplicando el factor de dilución, al cual se sometió inicialmente las muestras de agua.
EJEMPLOS PRÁCTICOS Determinar aproximadamente en las muestras a analizar los intervalos de concentración para cada componente de interés por normalización. Preparar estándares de concentraciones similares a los intervalos en los que van a estar en el problema los componentes de interés. Si el intervalo de concentraciones a determinar de un componente es estrecho se pueden usar distintos volúmenes de una única disolución estándar.
Si el intervalo es amplio preparar disoluciones de distinta concentración para que los volúmenes inyectados no sean muy distintos. Preparar una curva de calibrado para cada componente de interés a determinar.
5.4. Determinar el valor de K de los datos obtenidos en la preparación de la curva de calibración y observe si es constante o no. Interprete A ST /CST = K En la solución estándar (st): Ast=0.5502 Cst=1000
/
0.55320 = 1000 / =5.53210− En la solución problema (p): Ap=0.5532 Cp=1005.4525
/
0.5532 = 1005.4525 μg/mL =5.50210− El valor K de los datos obtenidos en la muestra estándar y problema son casi constantes (no tiene una diferencia significativa), esto quiere decir que la framicetina será aceptada para su uso.
5.5. ¿Cómo se puede calibrar la influencia de la matriz en el método? Las interferencias multiplicativas o de la matriz son causadas por componentes de la matriz que alteran la respuesta de la señal del componente analito en una forma proporcional a la señal (por ejemplo cambio en la pendiente de la línea de calibración) 4 Una posibilidad para evitar el efecto matriz sería c onstruir siempre la recta de calibrado tomando una muestra parecida a la muestra problema pero libre del constituyente a determinar (un blanco de muestra), y añadirle cantidades conocidas del constituyente para formar soluciones patrón. Sin embargo, esta aproximación resulta, en numerosos casos, impracticable, pues el efecto matriz puede variar de una muestra a otra y además, no siempre se puede disponer de una muestra sin el constituyente en cuestión. La mejor alternativa, sin embargo, para soslayar el efecto matriz es utilizar la técnica de las adiciones estándar, que consiste en la adición de cantidades conocidas y crecientes del constituyente a la propia muestra problema, la lectura de las correspondientes respuestas instrumentales y la posterior construcción de la recta de adiciones estándar. La posterior cuantificación del constituyente se realiza por extrapolación de la recta de calibrado al punto del eje de abscisas donde la respuesta e s cero. El mayor inconveniente de esta técnica es que se necesita construir una recta de adiciones estándar para cada muestra que se quiera analizar, lo cual supone un incremento sustancial en el volumen de trabajo del laboratorio. La separación del elemento objetivo de los elementos de la matriz es una forma eficiente de evitar tales problemas pero por lo general, ocupa mucho tiempo y es costosa. Por lo tanto, se escogen otros enfoques para minimizar las interferencias de la matriz tales como el método del estándar interno, la compatibilización de matrices o el método de adición de estándar 5
6. DISCUSIÓN Para cuantificar por espectrofotometría hay tres maneras, de las cuales necesitamos saber la longitud óptima, esta se obtiene de la curva espectral; con esta longitud podemos usarla indirectamente para cuantificar; puesto que, este dato es fundamental para hacer la curva de calibración, y para hacer las lecturas de absorción respectivas. Para mejorar esta cuantificación, se usa la espectrofotometría de derivada, que tiene aplicación para la investigación farmacéutica y toxicológica en cualquiera de sus áreas de aplicación para contribuir al desarrollo de mejores medicamentos, tratamientos más eficaces de intoxicaciones y la prevención de reacciones indeseables. Esta técnica es obtenida por diferenciación de espectros ultravioleta y visible permite una medición muy exacta de la longitud de onda de máxima absorbancia y una perfecta resolución de los espectros, suministrando una información de la sustancia analizada mucho más completa que el espectro original, al tiempo que permite eliminar las interferencias en las medidas, causadas por la presencia en el medio de la matriz biológica, de excipientes, disolventes 6 Según la revista IMBIOMET las concentraciones de los problemas se obtendrán por procedimientos que dependen del tipo de relación obtenida: a) si es lineal y parte de cero, se determinará el factor de calibración química (se le llama así para distinguirlo de la calibración instrumental), que e s el inverso de la pendiente de la recta, que a su vez es una constante y se denomina absortividad; al multiplicar el factor por las absorbencias de los problemas se obtienen las concentraciones buscadas. b) Si es una recta que no parte de cero, entonces las concentraciones buscadas se calcularán por regresión lineal. c) Si la relación no es lineal, se deberán aplicar otros modelos matemáticos o en su defecto, interpolar en la gráfica correspondiente para obtener los resultados buscados. Desafortunadamente, la comercialización de juegos de reactivos ya preparados ha propiciado una práctica mala de laboratorio, que es el uso del factor de calibración química (o cotangente), que proviene de un sólo patrón de concentración conocida en sustitución de las curvas de calibración, olvidando que esto sólo es válido cuando la relación entre absorbencia y concentración es
una línea recta que parte de cero. Lo inconveniente de esta práctica es que se desconozca el tipo de relación geométrica y los límites de concentración o linealidad, en los que se cumple la ley de Beer. Adicionalmente se ignora el hecho de que estos límites pueden cambiar, dependiendo de las condiciones de transporte y conservación de los reactivos 7 Se debe tomar en cuenta las interferencias que puede haber en una cuantificación por comparación con un estándar. Idealmente, los estándares y el blanco deberían contener exactamente la misma concentración de todos los elementos de la matriz que la muestra excepto para el analito. A menudo en la práctica, esto no puede realizarse. Entonces, debe verificarse que no existan interferencias que comprometan la exactitud del resultado analítico. Las interferencias surgen debido a las diferencias en composición de la muestra analizada y de los estándares externos y los blancos utilizados para la calibración. Pueden subdividirse en interferencia por el blanco o aditiva e interferencia por la matriz o multiplicativa. Una interferencia aditiva puede ser causada por los componentes de la matriz que producen una señal no compensada independiente de la concentración de analitos 8 9 En la USP 36 se especifica los rangos de valores para el sulfato de neomicina en diferentes preparados, por ejemplo para una suspensión ótica se acepta para valores entre 90% a 130%, para una crema o ungüento con hidrocortisona se acepta el rango de 90% a 135%, así para un ungüento de sulfato de neomicina con gramicidina se acepta un rango de 90% a 140%. En contraste con nuestros resultados. Una solución oftálmica de sulfato de neomicina y fosfato sódico de dexametasona se acepta un rango de 90% a 130% y no de 90% a 135% como en nuestro caso.1 Todos los resultados analíticos dependen de la medida final de una propiedad física o química del analito. Las valoraciones o titulaciones se encuentran entre los métodos analíticos más precisos. En una valoración, el analito reacc iona con un reactivo estandarizado mediante una reacción de estequiometria conocida. La cantidad de reactivo estandarizado necesario para alcanzar la condición de
equivalencia se relaciona con la cantidad de analito presente. Por tanto, la valoración es un tipo de comparación química 10 En nuestra práctica, analizamos el contenido declarado de la Framicetina haciendo uso del método externo en espectroscopia y comparándola con otra muestra de Framicetina a la misma concentración, lo cual nos arrojó una diferencia de 0.5% de concentración con respecto al estándar, lo cual nos indica y corrobora la correcta concentración de la Framicetina con respecto a lo declarado en concentración y además nos permite observar de manera practica la aplicación del método externo.
7. CONCLUSIONES Concluimos que debe verificarse que no existan interferencias que comprometan la exactitud del resultado analítico, para ello se minimizan utilizando el método del estándar interno, la compatibilización de matrices o el método de adición de estándar. Se concluyó que el rango de porcentaje de aceptación de un fármaco (USP) no es el mismo para otro fármaco, así tenga el mismo principio activo, es decir, el rango de aceptación cambia con respecto a todos los componentes del fármaco (principio activo y excipientes) El método del patrón externo nos permite realizar análisis con mayor exactitud ya que solo se trabaja con 2 muestras y el error instrumental se omite ya que ambas se pueden analizar bajo las mismas circunstancias. Se aplicó el método de Espectrofotométrico para la determinación cuantitativa de un principio activo como es la Framicetina en una solución oto-oftalmica por medio de la formación de complejos coloreados donde participaron el nitroprusiato de sodio, acetona y tetraborato de sodio respectivamente.
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