CATÁLISIS ENZIMÁTICA: ACCIÓN DE LA CATALASA SOBRE EL PERÓXIDO DE HIDROGENO I.
OBJETIVOS
I.1. Medir los volúmenes de oxigeno liberado en cada tiempo para los ensayos con diferentes concentraciones del sustrato h2o2,[S], a determinada temperatura manteniendo la masa constante de enzima (E) presente en tubérculos o frutas.
I.2. Determinar la velocidad inicial (Vo) de la reacción de la enzima (E) catalasa con diferentes muestras del sustrato H2O2 a temperatura constante.
I.3. Hallar los parámetros cinéticos: velocidad máxima (Vmax) y la contante de michaelismenten(KM) representando 1/V0 vs 1/[S] y presentar la ecuación de lineweaver-burk o de la doble recíproca.
I.4. Representar V0 experimental vs [S] para mostrar Vmax, ,KM, la ecuación de Henry-michaeleisHenry-michaeleismenten y trazar la curva corregida con las V0 corrergidas con la ecuación de lineweaver-burk.
I.5. Explicar el significado de V max y KM en la presente catalizis enzimática. I.6. Hallar los parámetros cinéticos: velocidad máxima y la contante de michaelis-mentem (KM) representado por [S]/V0 vs [S] y representar la ecuación de hanes.
I.7. Hallar los parámetros cinéticos: velocidad máxima (Vmas) y la contante de michaelismenten (KM) representado por V0 vsV0/[S] y representar la ecuación de eadie-hofstee.
I.8. Comprobar los resultados del I.3, I.6 Y I.7, luego fundamentar cuál de ellos es más conveniente.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO Cinética enzimática La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico, su papel en el metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por fármacos o venenos o potenciada por otro tipo de moléculas. Las enzimas son proteínas (macromoléculas) con la capacidad de manipular otras moléculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro catalítico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos polipéptidos. En otros casos, se produce la unión simultánea de dos sustratos, como en el caso de la ADN
polimerasa, que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, también suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Esta etapa limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato.
Cinética de Michaelis-Menten Como las reacciones catalizadas por enzimas son saturables, la velocidad de catálisis no muestra un comportamiento lineal en una gráfica al aumentar la concentración de sustrato. Si la velocidad inicial de la reacción se mide a una determinada concentración de sustrato (representado como [S]), la velocidad de la reacción (representado como V) aumenta linealmente con el aumento de la [S], como se puede ver en la figura. Sin embargo, cuando aumentamos la [S], la enzima se satura de sustrato y alcanza su velocidad máxima (Vmax), que no sobrepasará en ningún caso, independientemente de la [S].
Mecanismo de unión de único sustrato para una reacción enzimática. k1, k-1 y k2 son las constantes cinéticas para cada una de las etapas de la reacción. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)
El modelo de cinética micheliana para una reacción de único sustrato se puede ver en la figura de la izquierda. Primeramente, tiene lugar una reacción química bimolecular entre la enzima E y el sustrato S, formándose el complejo enzima-sustrato ES. Aunque el mecanismo enzimático para una reacción unimolecular
puede ser bastante complejo, existe una etapa
enzimática limitante que permite que el mecanismo sea simplificado como una etapa cinética única cuya constante es k 2.
(Ecuación 1) k2 también llamado kcat o número de recambio, hace referencia al máximo número de reacciones enzimáticas catalizadas por segundo. A bajas concentraciones de sustrato, la enzima permanece en un equilibrio constante entre la forma libre E y el complejo enzima-sustrato ES. Aumentando la [S] también aumentamos la [ES] a expensas de la [E], desplazando el equilibrio de la reacción hacia la derecha. Puesto que la velocidad de reacción depende de la [ES], la velocidad es sensible a pequeños cambios en la [S]. Sin embargo, a altas [S], la enzima se satura y solo queda la forma unida al sustrato ES. Bajo estas condiciones, la velocidad de la reacción ( v
≈ k2[E]tot
= Vmax) deja de ser sensible a pequeños
cambios en la [S]. En este caso, la concentración total de enzima ([E]tot) es aproximadamente igual a la concentración del complejo ES:
La ecuación de Michaelis-Menten 7 describe como la velocidad de la reacción depende del equilibrio entre la [S] y la constante k2. Leonor Michaelis y Maud Menten demostraron que si k2 es mucho menor que k1 (aproximación del equilibrio) se puede deducir la siguiente ecuación:
(Ecua ción 2) Esta famosa ecuación es la base de la
mayoría
de
las
cinéticas
Representación gráfica de la curva de saturación de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad de la reacción. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)
enzimáticas de sustrato único.
Representación de la ecuación de Michaelis-Menten La gráfica de velocidad frente a [S] mostrada anteriormente no es lineal. Aunque a bajas concentraciones de sustrato se mantenga lineal, se va curvando a medida que aumenta la concentración de sustrato. Antes de la llegada de los ordenadores, que permiten ajustar regresiones no lineales de forma sencilla, podía llegar a ser realmente difícil estimar los valores de la Km y la Vmax en las gráficas no lineales. Esto dio lugar a que varios investigadores concentraran sus esfuerzos en desarrollar linearizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten, dando como resultado la gráfica de Lineweaver-Burke y el diagrama de Eadie-Hofstee. Con el siguiente tutorial de la cinética de Michaelis-Menten realizado en la Universidad de Virginia α, se puede simular el comportamiento de una enzima variando las constantes cinéticas. La gráfica de Lineweaver-Burk o representación de doble recíproco es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten. Como se puede apreciar en la figura de la derecha, el resultado de este tipo de representación es una línea recta cuya ecuación es y = mx + c, siendo el punto de corte entre la recta y el eje de ordenadas equivalente a 1/Vmax, y el punto de corte entre la recta y el eje de abscisas equivalente a -1/Km.
Obviamente, no se pueden tomar valores negativos para 1/[S]; el mínimo valor posible es 1/[S] = 0, que correspondería a una concentración infinita de sustrato, donde 1/v = 1/Vmax. El valor del punto de corte entre la
La gráfica de Lineweaver-Burke o del doble recíproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, y el gradiente de la velocidad. (Standard RF, MedicalRF.com/Corbis. ©1999)
recta y el eje x es una extrapolación de datos experimentales obtenidos en laboratorio. Generalmente, las gráficas de Lineweaver-Burke distorsionan las medidas realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a estimaciones no muy exactas de la V max y de la Km.9 Un modelo lineal mucho más exacto es el diagrama de Eadie-Hofstee, pero en las investigaciones científicas actuales, todo este tipo de linearizaciones han quedado obsoletos y han sido sustituidos por métodos más fiables basados en análisis de regresión no lineal. Para analizar los datos es conveniente la normalización de los mismos, ya que esto puede ayudar disminuyendo la cantidad de trabajo experimental a realizar e incrementando la fiabilidad del análisis.
Especificidad Las enzimas suelen ser muy específicas tanto del tipo de reacción que catalizan como del sustrato involucrado en la reacción. La forma, la carga y las características hidrofílicas/hidrofóbicas de las enzimas y los sustratos son los responsables de dicha especificidad. Las enzimas también pueden mostrar un elevado grado de estereoespecificidad, regioselectividad y quimioselectividad. Algunas de estas enzimas que muestran una elevada especificidad y precisión en su actividad son aquellas involucradas en la replicación y expresión del genoma. Estas enzimas tienen eficientes sistemas de comprobación y corrección de errores, como en el caso de la ADN polimerasa, que cataliza una reacción de replicación en un primer paso, para comprobar posteriormente si el producto obtenido es el correcto. Este proceso, que tiene lugar en dos pasos, da como resultado una media de tasa de error increiblemente baja, en torno a 1 error cada 100 millones de reacciones en determinadas polimerasas de mamíferos. Este tipo de mecanismos de comprobación también han sido observados en la ARN polimerasa, en la ARNt aminoacil sintetasa y en los ribosomas. Aquellas enzimas que producen metabolitos secundarios son denominadas promiscuas, ya que pueden actuar sobre una gran variedad de sustratos. Por ello, se ha sugerido que esta amplia especificidad de sustrato podría ser clave en la evolución y diseño de nuevas rutas biosintéticas.
La enzima [E] catalasa y el sustrato [S] peróxido de hidrogeno
La enzima catalasa transforma una molécula de peróxido de hidrogeno (H2O2) en una molécula de agua y media molécula de oxígeno, o lo que es lo mismo, dos moléculas de peróxido de hidrogeno se transforman en dos moléculas de aguas y una molécula de oxígeno. La catalasa en una enzima común encontrada en organismos vivos, donde funciona como catalizadores en las reacciones de descomposición del peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno. La catalasa en una enzima que se encuentra en las células de los organismos vivos, ya sean tejidos animales o vegetales. La enzima catalasa también se encuentra en cerveza, vino y zumo de frutas. La presencia de la catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para para utilizar el agua oxigenada como desinfectante, así se desprende oxigeno cuando se hecha sobre una herida. El PH óptimo para la catalasa es aproximadamente de 7, la temperatura varia por especie. La función de la enzima catalasa en los tejidos es vital y para eliminar las moléculas toxicas de peróxido de hidrogeno producidas durante el metabolismo celular, el mismo que es transformado enseguida en agua y oxígeno.
II.
MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES
2 soportes universales
2 portaburetas dobles de Fisher
2 buretas de 10 y 25 ml
2 termometros de 0-50 °C
1 piseta
4 capsulas de Petri con tapa
EQUIPOS
1 equipo gasométrico y accesorios
1 balanza analítica digital
2 termostatos
2 cronometros
REACTIVOS
50 ml de H2O2 al 30%w/v
2 papas
III.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Se instaló el equipo gasométrico de acuerdo a las indicaciones de la guía de práctica. 2. Regulamos la cubas termostaticas para mantener a temperatura constante de 30 °C. 3. Preparamos las muestras de sustrato, peróxido de hidrogeno, utilizando 15.0, 12.0, 9.0, 6.0 ml de H2O2 al 30 %w/v y añadimos agua destilada para que el volumen total sea 15 ml. Etiquetamos y tapamos. 4. Termostatizamos las muestras de sustrato de 7-12 min. 5. Pesamos cuatro muestras con una masa contante de da la fuete de catalasa (papa), de forma circular con una altura de 1-2 mm y cuya masa constante fue 1.2827 g y lo depositamos en cajas Petri con tapa. 6.
Nos aseguramos de la hermeticidad de los equipos. Nivelamos el volumen de agua en cero.
7. Colocamos la papa en el matraz kitasato la muestra de papa he instantáneamente cerramos la llave y la tapa del matraz, estando el nivel del agua en la bureta en cero. 8. Registramos cada minuto (durante 7 minutos) el volumen de oxigeno liberado, en ml. IV.
CALCULOS, GRAFICAS Y RESULTADOS.
Tabla N°1.1. Preparación de cuatro muestras: sustrato(H2O2) y enzima(catalasa) Ensayo
VH2O2 al 30 % w/v , ml
V H2O, ml
%W H2O2/v
Mtuberculo , g
1
15.0
0.0
3%
1.2827 g
2
12.0
3.0
2.4%
1.2827 g
3
9.0
6.0
1.8%
1.2827 g
4
6.0
9.0
1.2%
1.2822 g
a). determinamos %W H2O2/w 15.0 ml………… 3% 12.0ml…………..X
=
. ∗ %
= . %
b). determinar el número de moles iniciales de H2O2, luego la concentración molar inicial de H 2O2: VT = depende de cada ensayo: VH2O2 + VH2O
100 mL…………………3.0 g 15 mL…………………..?
¿? = 0.45 g n° H2O2 = C°H2O2 =
0.45 34.016 /
= 0.01323 moles
0.01323 moles 0.015
= 0.8819 mol/L
Ensayo
VH2O2 al 3% w/v, mL
V H2O, mL
n° H2O2 ,moles
C° H2O2, mol/L,
iniciales
iniciales
1
15
0
0.01323
0.8819
2
12
3
0.01058
0.7056
3
9
6
0.00794
0.5292
4
6
9
0.00529
0.3528
Tabla N°1.2 determinación del volumen de oxigeno liberado durante cada tiempo “t” y por cada concentración de sustrato (H2O2) a temperatura contante de 30 °C.
S+E
SE
H2O2 (ac) + catalasa
E+P H2O2.catalasa
T, min
catalasa + ½ O 2 (g) + H2O(l) Vo2, ml
Ensayo 1
Ensayo2
Ensayo 3
Ensayo4
[H2O2]=[S]=3%
[H2O2]=[S]=2.4% [H2O2]=[S]=1.8% [H2O2]=[S]=1.2%
0
0
0
0
0
1
1
2.7
0.130
0.70
2
2
3.57
6.30
1.30
3
2.5
4.52
8.0
2.00
4
3.7
5.51
9.6
2.50
5
4.7
6.66
10.2
2.70
6
5.9
7.30
11.7
3.50
Determinar el número de moles de oxigeno formados, luego determinar el número de moles de H2O2 que reaccionan: 2 mol H2O2
2 mol H2O + 1mol O 2
PV = nRT n = PV/RT =
0.72105 ∗ 0.001 (0.08205 −/∗)∗303,15
n = 0.0000190 moles de O 2 # de moles de oxígeno, mol tiempo, min
ensayo N° 1
ensayo N° 2
ensayo N° 3
ensayo N° 4
[H2O2] = [S]1 = 3%w/v
[H2O2] = [S]2 = 2.4%w/v
[H2O2] = [S]3 = 1.8%w/v
[H2O2] = [S]4 = 1.2%w/v
0
0.0000000
0.0000000
0.0000000
0.0000000
1
0.0000290
0.0000783
0.0000038
0.0000203
2
0.0000580
0.0001035
0.0001826
0.0000377
3
0.0000725
0.0001310
0.0002319
0.0000580
4
0.0001073
0.0001597
0.0002783
0.0000725
5
0.0001363
0.0001931
0.0002957
0.0000783
6
0.0001710
0.0002116
0.0003392
0.0001015
2H2O2
2H2O + O2 2 22
nRxH2O2 =0.0000290 moles de O 2 *(
1 2
)= 0.000057981 moles de H 2O2
nt1H2O2 = n° H2O2 - nRxH2O2 nt1H2O2 = 0.01323 - 0.000057981 = 0.013172019 moles
nRxH2O2 tiempo, min
ensayo N° 1
ensayo N° 2
ensayo N° 3
ensayo N° 4
[H2O2] = [S]1 = 3%w/v
[H2O2] = [S]2 = 2.4%w/v
[H2O2] = [S]3 = 1.8%w/v
[H2O2] = [S]4 = 1.2%w/v
0
0.000000000
0.000000000
0.000000000
0.000000000
1
0.000057981
0.000156550
0.000007538
0.000040587
2
0.000115963
0.000206994
0.000365283
0.000075376
3
0.000144954
0.000262076
0.000463852
0.000115963
4
0.000214531
0.000319478
0.000556622
0.000144954
5
0.000272513
0.000386157
0.000591411
0.000156550
6
0.000342091
0.000423265
0.000678383
0.000202935
ntH2O2 = n° H2O2 - nRxH2O2 tiempo, min
ensayo N° 1
ensayo N° 2
ensayo N° 3
ensayo N° 4
[H2O2] = [S]1 = 3%w/v
[H2O2] = [S]2 = 2.4%w/v
[H2O2] = [S]3 = 1.8%w/v
[H2O2] = [S]4 = 1.2%w/v
0
0.013230000
0.010580000
0.007940000
0.005290000
1
0.013172019
0.010423450
0.007932462
0.005249413
2
0.013114037
0.010373006
0.007574717
0.005214624
3
0.013085046
0.010317924
0.007476148
0.005174037
4
0.013015469
0.010260522
0.007383378
0.005145046
5
0.012957487
0.010193843
0.007348589
0.005133450
6
0.012887909
0.010156735
0.007261617
0.005087065
1. Construir las figuras N° 1.1, 1.2, 1.3, y 1.4 para cada concentración de sustrato frente a los tiempos leídos.
y = 0.85x + 0.1357 Vo =
[s]=0.85*3=2.55
V O2 [s]2 vs. T,min 9 8 7 6 2 5 O V4 3 2 1 0
y = 1.1343x + 0.92 R² = 0.9565
0
1
2
3
4
t, min
y = 1.1343x + 0.92
5
6
7
Vo =
[s]=1.1343*2.4=2.722
V O2 [s]3 vs. T,min 14
y = 2.0907x + 0.2893 R² = 0.9037
12 2 O V
10 8 6 4 2 0 0
1
2
3
4
5
6
7
t, min
y = 2.0907x + 0.2893 Vo =
[s]=2.0907*1.8=3.7636
V O2 [S] vs. T,min 4
y = 0.5607x + 0.1321 R² = 0.986
3.5 3 2.5 2 O V
2
1.5 1 0.5 0 0
1
2
3
4
t,min
y = 0.5607x + 0.1321 Vo =
[s]=0.5607*1.2=0.6728
5
6
7
2. Calcular la VO para cada concentración de [S] 3. Calcular 1/Vo y 1/ [S]. Vo
[S]
2.55 2.722 3.7636 0.6728
1/Vo
1/[S]
3
0.39215686 0.33333333
2.4
0.36737693 0.41666667
1.8
0.26570305 0.55555556
1.2
1.4863258 0.83333333
4. Construir la figura N° 1.5 (gráfica de Lineweark – Burk) aplicando el método de los mínimos cuadrados hallar la pendiente, m, la ordenada, b, y el coeficiente de determinación, R2. 1/[S] vs. 1/Vo 1.6 1.4
y = 2.2695x - 0.5856 R² = 0.7485
1.2 1 o V / 0.8 1
0.6 0.4 0.2 0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
1/[S]
y = 2.2695x - 0.5856 y = mx + b
m = 2.2695 b = -0.5856
0.6
0.7
0.8
0.9
R² = 0.7485
2. Ubicar los puntos corregidos (0) y trazar la recta corregida con línea entrecortada. Extrapolar hasta interceptar el eje X. 1/Vo =
1
1
( ) + []
y = 2.2695x - 0.5856 1/Vo
Corregido:
1/[S]
1/Vo = y
0.39215686 0.33333333
0.7565
0.36737693 0.41666667
0.945625
0.26570305 0.55555556 1.26083333 1.4863258 0.83333333
1.89125
1/Vo(corrergido) vs. 1/[S] 2 1.8
y = 2.2695x - 2E-15 R² = 1
1.6 ) o 1.4 d i g 1.2 e r r 1 o c ( o 0.8 V / 0.6 1
0.4 0.2 0 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1/[S]
y = 2.2695x - 2E15 R² = 1
7. Leer el valor de 1/Vmax y compararlo con b. calcular Vmax.
y = 2.2695x - 2E-15
1/Vo =
1
(x) +
1
I.
=- 2E-15 , Vmax = 5*10^14
CONCLUSIONES Se determinó los volúmenes de oxigeno liberado en la reacción de peróxido de hidrogeno con la enzima catalasa en la muestra de papa de masa contante. Se hizo el ensayo a temperatura constante de 30 °C y manteniendo la masa de papa constante de 1.2827g.
Se determinó las velocidades iniciales de reacción de la enzima catalasa con diferente muestra de sustrato H2O2 a temperatura constante. Vo
2.55 2.722 3.7636 0.6728
II.
REVISION BIBLIOGRAFICA. LAIDLER, K.J. -MEISER, J.H…=”FISICOQUIMICA”. Edit. SECSA.Mexico.1997.
LEVITT, B.P…”Química Física Practica”. Novena edición. Editorial
Reverte.España.1997.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIA ESCUELA DE FORMACIÓN PROFESIONAL DE INGENIERÍA QUÍMICA
Laboratorio de Fisicoquímica ASIGNATURA: QU - 343 FISICOQUÍMICA II PRÁCTICA Nº 10
CATÁLISIS ENZIMÁTICA: ACCION DE LA CATALASA SOBRE EL PERÓXIDO DE HIDROGENO PROFESOR DE TEORÍA:
Ing. QUISPE MISAICO, Hernán
PROFESOR DE PRÁCTICA: Ing. QUISPE MISAICO, Hernán ALUMNO: RODRIGUEZ VILCHEZ, Melvin YARANGA ACCORI, Jhon Mike MIGUEL YUPANQUI, Richard
DÍA DE PRÁCTICA:
miércoles HORA: 7:00 - 10:00 am
AYACUCHO – PERÚ 2017
