Laporan Biokimia INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE
Nama : Ansori Muchtar NIM : 10510071 Kelompok : 05 Tanggal Praktikum : 04 April 2013 Tanggal Laporan : 11 April 2013 Asisten: Raden Prima Hari Febrian
Laboratorium Biokimia Program Studi Kimia Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Teknologi Bandung 2013
INDUKSI BETA GALAKTOSIDASE
I.
Tujuan
Menentukan aktivitas beta oksdase dari E. Coli menggunakan teknik spektrofotometri.
II.
Teori Dasar Pengendalian metabolisme pada dasarnya adalah pengendalian aktivitas atau sintesis enzim-enzim kunci pada jalur metabolisme. Salah satu contoh klasik pengendalian sintesis enzim adalah lac operon. Operon adalah beberapa gen struktur yang diekspresikan oleh satu promoter yang sama. Operon dibagi menjadi beberapa macam, salah satunya adalah lacoperon. Lac-operon adalah operon yang dibutuhkan pada metabolisme laktosa pada bakteri E.Coli. Pada percobaan ini, kultur E.coli ditumbuhkan dulu dalam media (NB) yang berisi berbagai gula yang berbeda-beda. Gula-gula tersebut dijadikan sumber energi bakteri selama inkubasi semalaman. Sebagai substrat, tidak digunakan laktosa, melainkan ONPG (orthonitrophenyl-βD- galaktosides), suatu senyawa β-galaktosida. Setelah ONPG dipotong oleh enzim β-galaktosidase, akan dihasilkan ONP (orthonitrophenol) yang berwarna kuning (λmaks = 420 nm). Dengan demikian, penentuan efek induksi gula pada sintesis β-galaktosidase dapat ditentukan dengan metode spektrofotometri.
III.
Data Pengamatan Adsorban t inkubasi (min) 0
10
20
30
40
OD
Medium 1
0.062 0.164 0.084 0.175 0.048 0.691
Medium 2
0.073 0.235 0.096 0.104 0.023 0.562
Medium 3
0.077 0.086 0.068 0.062 0.096 0.597
V =1.060 mL Media 1: NB Media 2: NB+laktosa Media 3: NB+laktosa+glukosa
Pengolahan Data kurva waktu terhadap adsorban
medium 1
adsorban
IV.
medium 2 medium 3
waktu (menit)
untuk t = 10 menit maka, sehingga aktivitas enzim dari medium dan waktu inkubasi lain adalah sebagai berikut: Medium t inkubasi
0
10 menit
20 menit
30 menit
40 menit
1
0
22.3903
5.734102
7.96403
1.638315
2
0
39.44806 8.057477 5.819289 0.965219
3
0
13.58996 5.372776 3.265805 3.792548
aktivitas enzim
kurva aktivitas enzim terhadap waktu
medium 1 medium 2 medium 3 waktu (menit)
V.
Pembahasan Pada
percobaan
ini
dilakukan
pengukuran
aktivitas
beta
galaktosidase dengan metoda spektrofotometri. Enzim β-galaktosidase adalah enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis β-galaktosida seperti laktosa menjadi galaktosa dan glukosa. Enzim β-galaktosidase bekerja dengan cara memotong ikatan β-glikosidik antara galaktosa dan suatu komponen organik lain. Penamaan enzim β-galaktosidase ditentukan juga oleh substrat yang akan dihidrolisis. Jika substrat yang dihidrolisis adalah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa enzim β-galaktosidase tersebut adalah laktase.
β-galaktosidase merupakan suatu enzim induktif yaitu enzim yang tidak selalu diproduksi namun perlu ada suatu senyawa penginduksi (hormon ataupun substrat). Substrat penginduksi β-galaktosidase tidak lain adalah laktosa. Enzim merupakan suatu protein yang diproduksi oleh gen melalui regulasi tertentu. Suatu unit terkoordinasi yang terlibat dalam ekspresi gen disebut dengan operon. Salah satu operon yang dikenal adalah lac operon (lactose operon).
Lac operon terdiri dari 2 bagian besar, yaitu gen regulator dan gen struktural. Tiga gen struktural pada lac operon:
lacZ: mengkode β-galaktosidase
lacY: mengkode β-galaktosidase permease, protein transpor yang terikat pada membran dan memompa laktosa ke dalam sel
lacA: mengkode β-galaktosidase transasetilase, enzim yang mentransfer gugus asetil dari asetil-CoA kepada β-galaktosidase Pada katabolisme laktosa hanyaanya lacZ dan lacY yang diperlukan.
Pada penentuan aktivitas dari beta galaktosa dilakukan dengan substrat pengganti yaitu ONPG. Hal ini dilakukan karena laktosa yang dihasilkan tidak berwarna dalam artian tidak menyerap pada sinar tampak sehingga tidak dapat diukur absorbansinya dengan spektrofotometer. Oleh karena itu digunakan ONPG yang dapat dihidrolisa dengan enzim yang sama menghasilkan larutan berwarna ONP, sehingga pengukuran dapat dilakukan pada panjang gelombang 420 nm. Reaksi ONPG dengan beta galaktosidase adalah sebagai berikut:
Enzim yang digunakan di isolasi dari bakteri Escherecia Coli. Dinding dari bakteri dilisis menggunakan SDS dan alkohol teknis sehingga enzim dapat
keluar melalui dinding sel. Kerja dari enzim sangat optimum pada suhu tubuh akan tetapi kondisi lingkungan pada praktikum tidak sesuai dengan suhu tubuh sehingga dilakukan modifikasi lingkungan dengan cara penambahan buffer Z dan diinkubasi pada suhu 37 derajat celcius. Selain itu faktor lain yang mempengaruhi kerja enzim adalah pH. Enzim tertentu memiliki pH optimum tertentu pula perubahn pH yang sangat drastis dapat mempengaruhi kerja enzim. Pada percobaan ini kerja enzim dihentikan dengan penambahan natrium karbonat sehingga pH berubah drastis menjadi sangat basa. Selain itu untuk menghentikan kerja enzim juga media dimasukkan ke penangas es sehingga suhu menjadi turun mendekati nol dan kinetika reaksi enzim menjadi berkurang. Adanya tambahan glukosa mengubah regulasi lac operon menjadi suatu mekanisme regulasi yang dikenal dengan catabolite repression. Dalam kata lain, kehadiran glukosa menghambat ekspresi gen struktural yang dibutuhkan dalam metabolisme laktosa. Regulasi ini dimediasi oleh cAMP sebagai protein koaktivator dan aktivator CAP dan CRP sebagai reseptor. Glukosa dalam jumlah kecil meningkatkan jumlah cAMP yang terikat pada CRP sehingga meningkatkan ekspresi dari lac operon yang berujung pada ekspresi gen struktural dengan adanya laktosa. Sebaliknya glukosa dalam jumlah besar menghambat produksi dari cAMP sehingga tidak ada yang terikat pada CRP akibatnya ekspresi lac operon pun terhambat yang juga akan menghambat pembentukan β-galaktosidase. Alasan inilah yang mengakibatkan hasil dari praktikum aktivitas enzim pada medium NB + Laktosa> NB saja> NB + Glukosa + Laktosa.
VI.
Kesimpulan Urutan besar aktifitas enzim β-galaktosidase E.coli dari paling besar berturut-turut adalah yang ditumbuhkan pada medium NB + Laktosa, NB saja, NB + Glukosa + Laktosa.
VII.
Daftar Pustaka
Nelson, L. D., Cox, M. M., 2004, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th ed, W. H. Freeman, hal 1081-1088
Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L., Stryer, Lubert. “Biochemistry”, 6th ed. 2006. W. H. Freeman and Company. (page 892-901)
