Asignatura: Genética Microbiana CB507 ABI Semestre 2014-1
GUÍA DE PRÁCTICAS Profesora: María Antonieta Quispe Ricalde.
CONTENIDO DE LAS PRÁCTIAS. Práctica 1: Plásmidos bacterianos: visualización e identificación. (2 clases) Práctica 2: Clonaje: Preparación del inserto y del vector. (1 clases) Práctica 3: Reacción de ligación y preparación de material para el análisis del clonaje. (2 clases) Práctica 4: Selección de mutantes: comprobar la construcción de una bacteria recombinante. (2 clases) Práctica 5: PCR a tiempo real. (1 clase) Práctica 6: Bioética de la manipulación genética. (1 clase) Primera evaluación. Práctica 7: Bioinformática: Búsqueda de secuencias, secuencias, diseño de cebadores. (1 clase) Práctica 8: Amplificación de un fragmento del genoma de un microorganismo mediante la técnica de PCR (PCR-HSP70 y electroforesis horizontal). horizontal). (2 clases) Práctica 9: Purificación de fragmentos de ADN y cuantificación del ADN purificado. (2 clases) Práctica 10: RFLP: Análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción. (1 clase) Segunda evaluación.
PRÁCTICA 1: PLÁSMIDOS BACTERIANOS: VISUALIZACIÓN E IDENTIFICACIÓN. (2 CLASES) A) Purificación de plásmidos mediante el método de lisis alcalina. B) Electroforesis de ADN en geles de agarosa. C) Purificación de fragmentos de ADN desde geles de agarosa. D) Cuantificación de inserto y vector. E) Clonaje (I): Ligación de un inserto en un vector de expresión. Introducción Los plásmidos bacterianos son moléculas de DNA extracromosómico capaces de replicarse de manera autónoma. La mayoría están constituidos por un DNA bicatenario circular cerrado de tamaño muy variable (1 a >200 kb), que se puede aislar de la bacteria en forma superenrollada. La replicación y trascripción de los plásmidos dependen, en mayor o menor medida, de proteínas codificadas por genes de la bacteria. A su vez, los plásmidos contienen con frecuencia genes que codifican enzimas útiles para la bacteria huésped como genes de resistencia a antibióticos, a degradación de compuestos orgánicos, a toxinas entre otros. Los plásmidos pueden utilizarse como vectores de clonaje y amplificación de fragmentos de DNA que se hayan insertado en los mismos mediante técnicas de Ingeniería Genética. Estos fragmentos se replican y se transmiten a las células hijas conjuntamente con el resto del plásmido. Los primeros plásmidos usados como vectores eran de origen natural, pero en la actualidad se usan plásmidos modificados en los que se han introducido características útiles para el clonaje. Por ejemplo: 1. Marcadores de selección. Generalmente genes de resistencia a antibióticos como ampicilina, kanamicina, tetraciclina, etc. 2. Un sitio de policlonaje que es una secuencia sintética que contiene las secuencias reconocidas por varias enzimas de restricción.
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3. Este sitio de policlonaje puede estar insertado dentro de un gen marcador lo que permite la selección directa de los recombinates. Por ejemplo, existen plásmidos en los que el sitio N-
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activo puede complementar con otro -galactosidasa codificado en ciertas bacterias huésped, -galactosidasa activa. Cuando se inserta el DNA foráneo en el vector se terias que contienen el plásmido -galactosidasa. Existen métodos sencillos que permiten -galactosidasa en las mismas. 4. El origen de replicación del plásmido ColE1, para conseguir un número de copias elevado del plásmido, y otro origen de replicación derivado de un fago con DNA monocatenario (M13, f1), que permite producir fagos filamentosos con copias monocatenarias del DNA clonado, útiles para secuenciación, mutagénesis, etc. 5. Promotores de fagos (T7, SP6) delante del sitio de policlonaje. Útiles para la transcripción/traducción in vitro del DNA clonado, o para su expresión regulada in vivo si el plásmido recombinante se introduce en bacterias que expresan la RNA polimerasa viral. 6. En los vectores de expresión, se suelen introducir además de promotores regulables, para expresar el gen clonado en respuesta a cambios en las condiciones de cultivo, la secuencia Shine-Dalgarno, que confiere alta eficiencia de traducción, y una secuencia de nucleótidos que codifica un pequeño polipéptido (una “etiqueta”) que puede ser reconocido por anticuerpos específicos. El gen clonado y la etiqueta se expresan conjuntamente originando una proteína de fusión, fácilmente detectable con los anticuerpos. También existen “etiquetas” que permiten la purificación rápida de la proteína de fusión por
cromatografía de afinidad. Protocolo de purificación de plásmidos mediante el método de lisis alcalina. Fundamento.- La técnica se basa en la fragmentación lineal que ocurre durante la lisis celular del ADN genómico. Al incrementar su pH cerca de 12 pueden eliminarse los puentes de hidrógeno y separarse cada una de las cadenas del ADN. Los plásmidos son resistentes y no se alteran por lisis celular, permaneciendo como ADN bacteriano circular superenrrollado. Cuando el pH disminuye, las uniones entre las cadenas en el plásmido se remueven y entran en un estado más relajado. Sin embargo los fragmentos lineales del ADN genómico no tienden a re-naturalizarse, por lo que pueden agregarse en una malla insoluble que se remueve por centrifugación, mientras que los plásmidos permanecen en solución. Los otros componentes celulares que incluyen restos de pared celular y proteínas, se remueven por este procedimiento. Materiales.Solución de lisis alcalina (STET): Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 0.1M y Tritón X-100 5%. Medio de cultivo LB: Triptona 10 g, Extracto de levadura 5g, NaCl 10 g, agua para 1L. Medio LB-agar: Triptona 10 g, Extracto de levadura 5g, NaCl 10 g , agar 20 g, agua para 1L. Ampicilina 100 mg/ml. Kanamicina 100 mg/ml. 3
Fenol Cloroformo Isopropanol Colonias de E. coli transformadas. Placas de Petri con medio LB-agar con ampicilina 100 ug/ml y kanamicina 25 ug/ml. Tubos eppendorf. Puntas de micropipeta estériles p10, p100 y p1000. Equipos.Micropipetas de 1-10 ul, 10-100 ul y 100-1000 ul. Mechero Bunsen. Estufa de cultivo con agitación. Microcentrífuga. Metodología experimental.1. Crecer la bacteria que lleva el plásmido en medio LB (10 ml) durante toda la noche a 37°C con agitación constante de > 200rpm. 2. Centrifugar a velocidad máxima por 3 minuto 1.5 ml del cultivo a temperatura ambiente. 3. Remover el sobrenadante dejando el pellet lo más seco posible, teniendo cuidado de no retirar el pellet. 4. Resuspender el pellet en 350 ul de solución alcalina fría, mezclar vigorosamente con la misma punta de la pipeta p1000. Mantener en frío 5-10 minutos. 5. Hervir 45 segundos y centrifugar 5 minutos. 6. Retirar el moco formado con un palillo estéril. 7. Añadir 150 ul de una mezcla fenol-cloroformo 1:1, agitar en vortex y centrifugar 10 minutos. Se obtienen 2 fases claramente diferenciadas. En la fase acuosa (superior) se encuentra el ADN. 8. Pasar la fase acuosa a otro eppendorf estéril y debidamente rotulado, con la pipeta de p1000, intentando no recoger las impurezas de la interfase. 9. Añadir 200 ul de isopropanol y dejar 10 minutos s a -20°C. 10. Centrifugar 10 minutos a 14000 rpm. Tirar el líquido y cuando el tubo esté bien seco, añadir 10 ul de agua milliQ y resuspender el ADN, que se encuentra pegado a la pared del tubo aunque no se vea. 11. Mantener a -20°C hasta su utilización. Protocolo de electroforesis en geles de agarosa. Fundamento.- el fraccionamiento, identificación y purificación de moléculas de DNA se hace normalmente mediante electroforesis en geles de agarosa. La agarosa es un polímero lineal constituido por unidades alternantes de D- y L-galactosa unidas por enlaces glicosídicos (1 -(14). Al solidificar forma un entramado tridimensional con poros de un diámetro entre 50 nm a >200 nm. En estos geles, las moléculas lineales de DNA migran hacia el polo positivo con una velocidad inversamente proporcional a su tamaño, dentro de ciertos límites. Estos geles también son útiles para distinguir diversas estructuras que puede formar una 4
misma molécula de DNA bicatenaria, como DNA lineal, DNA circular cerrado con superhélices o DNA circular abierto (la migración relativa depende de las condiciones de la electroforesis). La movilidad del DNA depende principalmente del tamaño del DNA, de su estructura, de la presencia o no de agentes intercalantes, del voltaje aplicado, de la concentración iónica del tampón de electroforesis y de la concentración de agarosa, ya que a mayor concentración menor es el tamaño del poro formado. Por lo tanto, se deben usar concentraciones más altas a medida que se desea analizar moléculas más pequeñas de DNA. A los geles de agarosa se suele añadir bromuro de etidio (3,8 diamino-6-etil-5-fenilfenatridium bromuro) para visualizar el DNA. Este compuesto, que es un mutágeno muy potente, se intercala entre las bases del DNA. Absorbe radiaciones a 302 y 366 nm (emitidas por las fuentes comerciales de luz ultravioleta). Materiales Pipetas automáticas y puntas para pipetas. Tubos de microcentrífuga de 1.5 ml, gradillas. Espátula, balanza, matraces de 250 ml, probetas y guantes. Microentrífuga, frigorífico, congelador y hielo. Equipos de electroforesis y fuentes de alimentación. Transiluminador de luz ultravioleta, gafas protectoras, equipo de fotografía. Agarosa. Tampón TAE: 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA. Bromuro de etidio 5 mg/ml. Marcadores de peso molecular de DNA. Tampón de carga de electroforesis (6X): 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF, 40% (p/v) sacarosa en agua. QIAquick gel extraction kit (Qiagen) para purificación de DNA de geles de agarosa.
Nota: El bromuro de etidio (EtBr) es un agente mutagénico muy potente por lo que es obligatorio el uso de guantes durante la manipulación de todas las disoluciones, geles, cubetas, etc., que contengan o estén en contacto con este compuesto. También es necesario usar mascarilla al pesarlo para la preparación de la disolución stock. Metodología experimental. 1. Preparar agarosa al 1% en tampón TAE siguiendo los pasos siguientes: a) Pesar 0.25 g de agarosa y ponerla en un matraz. b) Añadir 25 ml de tampón TAE (1X) preparado a partir de un stock TAE (50X). c) Disolver la agarosa en un microondas hasta ebullición. d) Dejar enfriar hasta unos 60°C y añadir bromuro de etidio hasta una concentración de 0.5 ug/ml (stock 5 mg/ml). 2. Preparar la cubeta de electroforesis sellándola en los dos extremos abiertos. Poner el peine y añadir lentamente la agarosa disuelta. Dejar polimerizar, evitando mover el peine. 3. Cuando haya polimerizado el gel: a) retirar el peine; b) introducir la cubeta en el tanque de electroforesis; c) añadir tampón TAE (1X), hasta cubrir el gel completamente. 4. Preparar las muestras. 5. Añadir a cada muestra X ul de tampón de carga de electroforesis (6X). 5
6. Cargar los X ul totales de cada muestra en los pocillos del gel, evitando romper los pocillos y aplicando suavemente para evitar pérdidas. 7. Conectar el tanque de electroforesis (el DNA migra hacia el polo positivo) y correr la electroforesis a 50-100 V hasta que el colorante azul haya recorrido unas ¾ partes del gel. El azul de bromofenol migra aproximadamente como un DNA bicatenario lineal de 300 bp (prácticamente con el frente) y el xylene cyanol FF como un DNA bicatenario lineal de 4 kb. 8. Visualizar los DNAs exponiendo el gel bajo la luz ultravioleta (hay que usar gafas protectoras). Hacer una fotografía. 9. Analizar los resultados obtenidos. Al colocar las muestras en el gel, mantener el siguiente orden: Calle 1: Marcador de tamaño molecular. Calle 2: ADN plasmídico grupo 1 Calle 3: ADN plasmídico grupo 2 Calle 4: ADN plasmídico grupo 3 Calle 5: ADN total bacteriano Cuestionario práctica 1. 1. ¿Cuál es el tamaño molecular del ADN plasmídico?
2. ¿Qué concentración de ADN plasmídico se obtuvo en la práctica?
3. ¿Qué técnica se utilizó para la cuantificación del ADN plasmídico?
4. ¿Cuántas bandas de ADN plasmídico se pueden observar y porque?
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Práctica 2: Clonaje: Preparación del inserto y del vector. (1 clases) La clonación puede definirse como el proceso por el que se consiguen copias idénticas de una molécula, en nuestro caso particular, lo que deseamos obtener es gran cantidad del fragmento de una proteína denominada hsp70c. El vector que utilizaremos es el pQE31 y el fragmento que deseamos clonar es hsp70c. Procedimiento A) Digestión de los DNAs. 1. Poner en dos tubos eppendorf de 1,5 ml los componentes siguientes: Nota: Calcular los volúmenes de cada componente de la reacción teniendo en cuenta las concentraciones de las disoluciones stock de los DNAs, de la enzima de restricción y del tampón de reacción. Las enzimas se suministran en 50% glicerol y concentraciones superiores al 5% de glicerol en la mezcla de digestión afectan a la especificidad de la enzima por lo que el volumen de enzima no debe superar 1/10 del volumen final de la mezcla de reacción. Al ser enzimas incompatibles se usaran por separado cada una con su tampón especifico. Para ello digerimos con una enzima, purificamos y por ultimo digerimos con la siguiente. Conc. Stock --------------Vector pQE31 Hsp70c Tampón Hind III H2O
2 ug 10X
conc. Final ------------2 ug -------1X ~10 U Volumen final:
pQE31 -----------21,5 ul 21,5 ul 2,5 ul 1 ul X ul 25 ul
hsp70c --------------------2,5 ul 1 ul X ul 25 ul
2. Incubar a 37°C durante 1 hora. 3. Seguidamente se digiere con la otra enzima de restricción SacI Conc. Stock --------------Vector pQE31 pGEMT-Hsp70c Tampón Sac I H2O
10X
conc. Final ------------2 ug 2 ug 1X ~10 U Volumen final:
4. Incubar a 37ºC durante 1 hora.
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pQE31 -----------21,5 ul -------2,5 ul 1 ul X ul 25 ul
hsp70c --------------------21,5 ul 2,5 ul 1 ul X ul 25 ul
Cuestionario práctica 2.
1. Defina enzima de restricción.
2. Defina secuencia palindrómica.
3. Busque la secuencia palindrómica de las enzimas HindIII y SacI.
4. ¿Por qué tanto el vector como el inserto se digieren con las mismas enzimas de restricción?
5. ¿Cómo se realiza un clonaje dirigido?
6. ¿Cómo se realiza un clonaje al azar?
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Práctica 3: Reacción de ligación y preparación de material para el análisis del clonaje. (2 clases) A) Medir las concentraciones del plásmido vector y del fragmento Hsp70c purificados. Las concentraciones de cada muestra se medirán empleando un gel de agarosa. B) Ligación del inserto hsp70c al plásmido pQE31. 1. Preparar dos tubos eppendorf de 1.5 ml conteniendo los componentes siguientes:
Inserto [*] Vector (50ng) Tampón 10X H2O T4 Ligasa Vol. final
Tubo control transformación
Tubo control ligación
Tubo control digestión
-----------
1X
----------pQE31 Hind III 1X
----------pQE31 Hind III/Sac I 1X
Tubo problema 1:1 [*] pQE31 Hind III/Sac I 1X
1-2 U
1-2 U
1-2 U
1-2 U
pQE31
Tubo problema 3:1 3 x [*] pQE31 Hind III/Sac I 1X 1-2 U
* Calcular teniendo en cuenta que para favorecer la formación de moléculas recombinantes se debe usar una razón molar vector/inserto igual a 1/3. 100ng vector x tamaño de inserto (Kb)
1 X
Tamaño vector (Kb)
3
=
*
ηg de inserto
2. Incubar a 16 ºC durante 1hora y a continuación a 4ºC durante toda la noche.
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Práctica 4: Selección de mutantes: comprobar la construcción de una bacteria recombinante. (2 clases) Fundamento.- En los procesos de clonación se utiliza un gran número de células (E. coli), las mismas que han podido ser incorporar el plásmido recombinante o no. Al final del proceso, entonces, se hace necesario separar las células que contienen el ADN recombinante de las que no lo contienen. La detección y la selección de colonias se realizan en los medios de cultivo, y el modo más adecuado es la selección en placas de medio LB con y sin antibiótico. El vector contiene el gen de resistencia a antibióticos (ampicilina y/o kanamicina), por lo tanto se pueden utilizar estos antibióticos en la selección de aquellos clones que llevan el inserto. Materiales.Placas con medio LB-agar + ampilina (100 ug/ml) + kanamici na (25 ug/ml). Placas con medio LB-agar sin antibióticos. Placas con medio LB-agar + gentamicina 1% + Asas de siembra. Pipetas p10, p100 y p1000. Asas drigalsky. Equipos.Autoclave. Balanza. Mechero bunsen. Incubadora 37ºC. Procedimiento 1. Sembrar 100 ul del cultivo bacteriano que contiene nuestras células transformadas con el plásmido recombinante en: A. Una placa con LB-agar sin antibióticos. B. Una placa con LB-agar + ampicilina +kanamicina. C. Una placa con LB-agar + gentamincina + 2. Extender los 100 ul del cultivo bacteriano con una asa drigalsky de forma homogénea en toda la placa. 3. Incubar a 37°C toda la noche. 4. Evaluar los resultados.
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Cuestionario Práctica 4. 1. ¿Cuántas colonias encontramos en las placas LB-agar sin antibióticos?. Explique el porqué.
2. ¿Cuántas colonias encontramos en las placas LB-agar con antibióticos ampilina y kanamicina?. Explique el porqué.
3. ¿Cuántas colonias encontramos en las placas LB-agar con antibióticos gentamicina y Explique el porqué.
?.
4. ¿Cuál sería el modo de comprobar si la bacteria contienen el plásmido recombinante introducido?
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