Guía de Laboratorio No. 6.pdf

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR Alumno: ____________________________________________ Código: ___________ Alumno: _____________________________________________ Código: ___________ Práctica 6: Fraccionamiento subcelular e identificación de organelos a partir de Elodea

OBJETIVOS: Familiarizarse con la teoría de la centrifugación diferencial Determinar las condiciones requeridas para separar diferentes organelos de las células. Emplear técnicas citoquímicas para diferenciar los organelos presentes en cada una de las 4 fracciones subcelulares obtenidas a partir de células de Elodea.

1. INTRODUCCIÓN Para comprender el funcionamiento celular como un todo, es importante conocer cada componente de la célula y sus funciones. Ahora, damos por hecho que el núcleo es el lugar en la célula donde se almacena el material genético y que las mitocondrias son las plantas energéticas de las células; pero, ¿Cómo se llegó a estas conclusiones?

Nuestro entendimiento de las funciones que llevan a cabo las células y los organelos presentes en su interior, ha sido posible por una combinación de técnicas bioquímicas y d e microscopía. La microscopía ha permitido observar las diferentes estructuras subcelulares, entender cómo están organizadas, y conocer las diferencias en arquitectura que existen entre los distintos tipos tipos celulares, además de comprender, los cambios que pueden ocurrir bajo diferentes condiciones, como las de crecimiento. Esta herramienta nos ha dado algunas pistas sobre las funciones de los componentes intracelulares; pero es el uso de la microscopía, en conjunto con las técnicas de separación bioquímica y los métodos citoquímicos, lo que ha permitido la localización de moléculas específicas y reacciones metabólicas, que ocurren en cada uno de los organelos.

Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: [email protected] Editado por: Eliana Torres Bedoya

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En esta práctica de laboratorio, utilizaremos la técnica de centrifugación diferencial para separar un homogeneizado celular en varios componentes o fracciones. Inicialmente el homogeneizado contiene una mezcla de tejidos, organelos celulares y moléculas solubles, que mediante centrifugaciones secuenciales a velocidades cada vez mayores, se irán separando según sus características físicas (forma, masa, densidad, etc.). Los organelos con una mayor velocidad de sedimentación (mayor densidad), se recogerán en el fondo del tubo (pellet) cuando se somete a centrifugación a bajas velocidades. A medida que se incrementa la fuerza gravitacional (fuerzas g) y el tiempo de centrifugación, se recogerán en los pellets, organelos de menor tamaño.

Elaborado por: Eliana Torres Bedoya

Una vez que el homogeneizado celular ha sido separado en varias fracciones, se pueden emplear una serie de técnicas para identificar los componentes celulares presentes en cada fracción; dentro de estas técnicas se encuentran las tinciones específicas, que se utilizan para identificar las distintas clases de macromoléculas, por ejemplo, sustancias que se unen específicamente a los ácidos nucleicos, pueden emplearse para identificar la fracción nuclear. Esto es lo que se conoce con el nombre de citoquímica. Otro método de identificación es el uso de ensayos bioquímicos, en donde se recurre a demostrar las reacciones químicas que ocurren en determinados organelos para establecer la presencia o ausencia de los mismos; por ejemplo, las enzimas implicadas en la fotosíntesis, se espera que estén localizadas en los cloroplastos, las relacionadas con el ciclo de Krebs deberían estar restringidas a la mitocondria y estar ausentes en otros organelos, entonces se proporcionan los sustratos de la enzima para que ocurra la reacción catalítica, si esta se da, se demuestra la presencia de la enzima y por consiguiente, la del organelo donde se encuentra.


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2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA

2.1 Normas de seguridad: El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad. 2.2 Equipos de protección personal: Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:   

Bata de laboratorio. Guantes de nitrilo. Gafas de seguridad.

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su intercambio con los demás compañeros de laboratorio. 2.3 Manejo de residuos químicos: Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el estudiante debe: a. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar. b. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y potencialmente peligrosas. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le indicará la forma correcta de hacerlo. 2.4 Disposición y Descarte de Materiales a. Cada estudiante es responsable de su área de trabajo. b. Depositar el material de vidrio roto en el tarro de basura blanco. c. En caso de haber utilizado objetos corto-punzantes (lancetas, bisturís, agujas, etc.) descartarlos en el Guardián. d. Las láminas y laminillas contaminadas con muestras biológicas, deben ser depositadas en el Recipiente que contiene hipoclorito al 2%. e. Los medios de cultivo, una vez utilizados, deben ser depositados en la bolsa roja especial para autoclavar . f. Los implementos que contengan fluidos o muestras biológicas (guantes, toallas de papel, algodón, etc.) deben ser descartados en bolsa roja.


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3. PROCEDIMIENTO 3.1 MATERIALES Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja: ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM CANTIDAD Portaobjetos 8 Cubreobjetos 16 Pipeta Pasteur 1 Mortero 1 Elodea 1 Beaker de 100 ml plásticos 9 Tubos vaccuntainer tapa roja 5 Gradilla para tubo vaccuntainer 4 Recipiente para descartar material 3 contaminado

U.M. OBSERVACIONES Un Un Un Un Para la semana Kl Un Por clase Un Un Por clase Un

Por clase

3.2 REACTIVOS Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja: ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM

CANTIDAD

U.M.

Lugol

300

ml

Azul de metileno

300

ml

OBSERVACIONES Por clase divididos en 3 frascos con gotero Por clase divididos en 3 frascos con gotero

3.3 EQUIPOS Tabla 3. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja: ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM Microscopio Centrifuga (Rotofix 32 A) Balanza 100 g Vortex

CANTIDAD 1 1 3 3

U.M. OBSERVACIONES Un Un Por clase Un Por clase Un Por clase

3.4 SOLUCIONES Tabla 4. Listado de soluciones que requieren estar listas para el día de la práctica: ITEM

DESCRIPCION DEL ITEM Cloruro de sodio al 0.9%

CANTIDAD 1

U.M. L

OBSERVACIONES Para la semana


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TENGA EN CUENTA QUE…

Al utilizar la CENTRÍFUGA Siempre se debe ubicar en mesones planos y resistentes. Al cambiar de rotor es necesario verificar que sea el adecuado para el tipo de tubo que va a utilizar y que este asegurado. Para centrifugar una muestra DEBE preparar un tubo adicional y verificar que PESE LO MISMO que el tubo con su muestra para que haga contrapeso (puede utilizar agua o un tubo con otra muestra para equilibrar el peso). Al ubicar tubos en la centrífuga tenga en cuenta que el tubo que hace contrapeso debe estar EXACTAMENTE en la POSICIÓN OPUESTA al tubo con su muestra. Si trata de centrifugar tubos que no están correctamente balanceados éstos se quebrarán y tendrá que repetir su trabajo. PELIGRO!!! El mal balance de los tubos en la centrífuga podría dañarla o hacer que se desplace lentamente por el mesón y caer al piso. En caso de que los tubos hayan quedado mal balanceados APAGUE INMEDIATAMENTE la centrífuga y calibre los pesos nuevamente. Para operar, la tapa de la centrífuga siempre debe estar cerrada. Una vez en operación, nunca mueva ni se apoye contra la centrífuga.

3.5 CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL Y VISUALIZACIÓN DEL MACERADO DE ELODEA La Elodea es una planta acuática que se encuentra en forma abundante en nuestros ecosistemas; es fotosintéticamente muy activa por lo que contiene grandes cantidades de cloroplastos. El objetivo de esta actividad es realizar un homogenizado de Elodea y posteriormente fraccionarlo mediante centrifugación para observar las estructuras básicas de estas células (núcleos y cloroplastos).

a. b. c. d. e.

Marque 4 tubos de ensayo con los rótulos E1-E4 Colecte varias hojas de Elodea y dispóngalas en un mortero. Adicione 3 ml de Solución Salina al 0.9%. Macere fuertemente las hojas de Elodea. Transfiera el macerado en el tubo con el rótulo E1.


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f.

Utilizando una balanza, equilibre el tubo E1 (use dos cifras decimales) con otro que contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga. g. Centrifugue durante 10 segundos a 500 rpm h. Transfiera el sobrenadante del tubo E1 a otro tubo rotulado como E2. i. Resuspenda el pellet del tubo E1, en 3 ml de solución salina (0.9%). j. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E2 (use dos cifras decimales) con otro que contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga. k. Centrifugue durante 30 segundos a 2.000 rpm. l. Transfiera el sobrenadante del tubo E2 a otro rotulado como E3 m. Resuspenda el pellet del tubo E2, en 1 ml de solución salina (0.9%). n. Utilizando una balanza, equilibre el tubo E3 (use dos cifras decimales) con otro que contenga agua. Ubíquelos SIMÉTRICAMENTE en las canastillas de la centrífuga. o. Centrifugue durante 4 minutos a 4.000 rpm p. Transfiera el sobrenadante del tubo E3 a otro rotulado como E4 q. Resuspenda el pellet del tubo E3, en 1 ml de solución salina (0.9%). A continuación se presenta el esquema del procedimiento que debe realizar, observe con atención:

Elaborado por: Eliana Torres Bedoya

r.

Rotule 4 portaobjetos desde E1 hasta E4. Divida cada portaobjetos a la mitad utilizando un marcador. s. Disponga dos gotas de cada fracción en el portaobjetos rotulado para cada caso (Tubo E1/ Portaobjetos E1). Coloque una gota en ca da extremo. t. Cubra UNA de las gotas con una laminilla, ésta será la gota control Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: [email protected] Editado por: Eliana Torres Bedoya

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u. Adicione a la otra, una gota de azul de metileno. Cubra con una laminilla. v. Visualice cada preparación al microscopio para observar los diferentes componentes subcelulares. Realice dibujos de lo que observa (40x) en cada una de las laminillas indicando el tipo de muestra, de tinción utilizada y el nombre de cada organelo

E1 + ________ (40x)

E1 Control (40x)

E2 + ________ (40x)

E2 Control (40x)

E3 + ________ (40x)

E3 Control (40x)


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E4 + ________ (40x)

E4 Control (40x)

w. Tome nota de las fracciones en las que aparecen cada uno de los organelos y complete la Tabl a 2. Indique la cantidad relativa de cada uno de los organelos en cada una de las fracciones (mucho, algo, poco y nada)

Tabla 1. Datos de las observaciones de microscopía de los organelos de las células de Elodea. Fracción de células de Elodea

Azul de metileno (núcleos)

Control sin teñir (cloroplastos)

Pellet 1 (E1) Pellet 2 (E2) Pellet 3 (E3) Sobrenadante 4 (E4)

x. Basado en su conocimiento y en la lectura de la guía, ¿qué organelos esperaría observar mas abundantemente en: la fracción #1?

la fracción #2?

la fracción #3?

la fracción #4? Elaborado por: Rengifo | Profesor: Juliana Rengifo | Correo: [email protected] Editado por: Eliana Torres Bedoya

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y. ¿En qué casos sus predicciones concuerdan con las observaciones experimentales? Discuta porqué si o porqué no.

ELODEA Fracción #1:

Fracción #2:

Fracción #3:

Fracción #4:

z. Teniendo en cuenta que Ud. conoce los tamaños relativos de los diferentes componentes subcelulares, ¿qué fracción esperaría que contuviera l a mayor cantidad de proteína? ¿Por qué?

aa. El aislamiento de los cloroplastos, ¿es exclusivo de una de las fracciones? Si la respuesta en NO, ¿cuál podría ser la razón de la presencia de un organelo en varias fracciones?

REFERENCIAS Imágenes: http://www .microscopico.wordpress.com http://www.tuelsalvador.com

Fecha: Julio de 2011


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