PERSPECTIV CTI VASCLIN CLI NICAS CASY EXP EXPE ERIMEN RIMENTALES LE SEN EL US USO O DE LA HORMONA MELATONINA COMO ANTIOXIDA NTIOXIDANT NTE E CELULA CELULAR R
GREGORIO TISKOW DROST
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO”
BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
PERSPECTIV CTIVASCLINI CLINICAS CASY EXP EXPE ERI RIME MEN NTALESEN EL US USO O DE LA HORMONA MELATONINA COMO ANTIOXIDA NTIOXIDANT NTE E CELULA CELULAR R
Por GREGORIO TISKOW DROST
TRA RABA BAJJO DE ASCEN CENSO PAR PARA A OPTAR A LA CATEGORÍ CATE GORÍA A DE PROFES ROFESOR AS ASOCIA OCIADO EN EN EL ESCALAFÓN CALAFÓN DEL DEL PERSONA ONAL DOCENT DOCENTE E Y DE DE INV INVESTIG TIGACIÓN
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO” DECANATO DE MEDICINA
BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
PERSPECTIV CTIVASCLINI CLINICAS CASY EXP EXPE ERI RIME MEN NTALESEN EL US USO O DE LA HORMONA MELATONINA COMO ANTIOXIDA NTIOXIDANT NTE E CELULA CELULAR R
Por GREGORIO TISKOW DROST
TRA RABA BAJJO DE ASCEN CENSO PAR PARA A OPTAR A LA CATEGORÍ CATE GORÍA A DE PROFES ROFESOR AS ASOCIA OCIADO EN EN EL ESCALAFÓN CALAFÓN DEL DEL PERSONA ONAL DOCENT DOCENTE E Y DE DE INV INVESTIG TIGACIÓN
UNIVERSIDAD CENTROCCIDENTAL “LISANDRO ALVARADO” DECANATO DE MEDICINA
BARQUISIMETO, FEBRERO DEL AÑO 2005
PERSPECTIV CTI VASCLIN CLI NICAS CASY EXP EXPE ERIMEN RIMENTALES LE SEN EL US USO O DE LA HORMONA MELATONINA COMO ANTIOXIDA NTIOXIDANT NTE E CELULA CELULAR R
Por GREGORIO TISKOW DROST
TRABAJ RABAJO APROBA APROBADO DO
_________________________ RIGOB RI GOBE ERTO RTO GUERRE GUERRERO RO COORDINADOR
_______________________ LUIS LUISBA BAT TALLA LLA SOTELO OTE LO
__________________________ AURA LOPEZ DE ORTEGA
BARQUISIMETO, 29 DE MARZO DE 2005
PENSAMIENTOS Sólo 3 frases celebres llenarán este espacio, un espacio de reflexión para todo aquél queaún logra visualizar las maravillas del Universo: Un plan es cosa real, y las cosas proyectadas son experimentadas. Una vez hecho y visualizado un plan se convierte en una realidad junto con otras realidades- nunca sedestruirá, pero es fácil de ser atacado…. John Steinbeck
En nuestra época, en la que todo lo sabido está aprendido del ayer, es deber lógico rememorar y aceptar los orígenes verdaderos de las cosas… Gabriel Rojas
Nos juzgamos por lo que creemos que somos capaces de hacer; en tanto, queotros nos juzgan por lo que yahemos hecho… Henry W. Longfellow
IV
AGRADECIMIENTOS
.-Al Laboratorio de Bioenergética Celular del Centro de Biofísica del IVIC, en las personas de mis tutores de siempre: Dr. Reinaldo Marín, Dr. Fulgencio Proverbio y la Sra. Teresa de Proverbio. Siempre juntos….
.-Al personal de Laboratorio de la Unidad de Investigación en Fisiología, empleados, técnicos y obreros por el apoyo incondicional de siempre…
.-Al personal de la Biblioteca “Marcel Roche” del IVIC, Centro de Referencia Documental y Científico de Latinoamérica, quienes por dos meses apoyaron con su entusiasmo y colaboración esta obra…
.-Al personal docente de la Sección de Fisiología del Decanato de Medicina, mi segundo hogar, quienes con su apoyo irrestricto me permitieron consolidar el año sabático y la ejecución de esta obra…
A todos ellos…. Muchas Gracias….
V
DEDICATORIA
A N ohelli ohell i y F l avia, las l as que si si empre mpr e han sab sabii do qu que e esta e ess mi pas pasii ón y que todo es este trabajo trabaj o te tendr ndr áun be benefi nefi cio al f i nal… nal … U n be besso para par a las l as dos dos… …
VI
RESUMEN La melatonina tonina (N(N-aceti cetill-5-metoxi toxi-tripta triptam mina) es una hormona producida por la glándula ndula pine pineal cer cerebra bral y otra otras estr estructur uctura as del del cuer cuerpo, que fue aisla slada por vez vez pri primera en 1959 1959 por Lerne rner y su su equi equipo po de tra trabaj bajo. Desde esa fecha ha sido aisla slada en num nume erosos osos orga organism nismos, desde desde vertebra tebrados ha hasta unice unicellula ulares y pla plantas ntas superior riore es. La La producció producción n de la hormona en toda todass la las especies species,, incl incluy uyendo a los humanos, es regul regula ada por el el entorno entorno cícli cíclico fotoperiódico, con la fase diurna de luz asociada a bajos niveles de melatoni tonina na y la fase de oscuri oscuridad, dad, a elevados niveles niveles de la mi misma sma. A causa causa de su su me mecani canism smo re regulatori gulatorio dependi dependie ente de la luz, luz, la melatoni tonina na es produci producida da y liberada berada baj bajo un esquema circadi circadia ano. Ti Tiene como caracter racterística stica fundamental la de ser liposoluble e hidrosoluble, lo que la hace una molé olécula cula que puede puede dif difundir undir con fa facil cilidad dad a travé travéss de los comparti rtimientos cel celula ulares. Ent E ntrre las princi principa palles funcione funcioness que que se han han atri tribuido a la horm hormona se encuentran, la de control de los ritmos biológicos, el ciclo sueño-vigilia, ser inmunoestimulador, intervenir en el control del inicio de la pubertad, agente nte oncostáti oncostático co y una, una, que en la la últi últim ma década ha cobr cobra ado ele elevado interés entre los pinealólogos, la de ser un antioxidante celular, es decir un agente que puede neutralizar a los radicales libres derivados del oxígeno. Según Según numerosos osos autor utores, la la melatoni tonina na reduce el estré strés oxida oxidatitivo vo de distinta distintas ma maneras; neras; en for form ma directa directa,, re removie oviendo los los ra radica dicalles lilibre bres y en forma indirecta, estimulando los otros mecanismos defensivos contra la acción cción noci nociva va de los ra radica dicalles lilibres. bres. En ensa ensayos re realiza zados dosin vit e in vivivo , la vitro ro VII
melatoni tonina na ha sido sido util utilizada zada en dosi dosiss farmacológi cológica cas, s, encontr ncontrá ándose que es efectiva ctiva para reducir el daño daño ocasi ocasionado a dive diversas rsas estructur structura as cel celula ulares por los age agentes oxida oxidatitivos. vos. La melatoni tonina na car carece de toxi toxici cida dad d a dosis dosis el elevada vadas, s, suministrada nistradas incl inclusive usive a dia diario, rio, sin mayore ores efectos col colateral terales, económica y de fácil cil administración. nistración. Otra tra acción cción que se está investi nvestig gando con insistencia, es el de la función de la melatonina en el envejecimiento celular; el papel de los niveles fisiológicos de la hormona, que decaen progr progre esivam sivamente nte con la edad, está está siendo siendo eval evaluada por por su im impor portancia tancia en la la capa capaci cida dad d de def defensa antioxi ntioxida dante nte tota total del del orga organism nismo. Otros tros autor autore es por su parte parte, han cri critica ticado do fue fuerrtemente nte el hecho que esta horm hormona ona se sea a prop propue uesta sta como como un antioxi ntioxida dante nte celula ular, ya que no cumple los los re requisitos quisitos para tal fifin; prop propon one en que la melatoni tonina na puede actuar com como un re remove ovedor de radica dicalles libre bres de tipo tipo pre preventivo, ventivo, pero de la cla clase catal cataloga ogada como desa desactiva ctivador dore es de iones metálicos tálicos fa favore vorecedor cedore es de la gener neración ción de radi radica calles lilibre bres. Los Los datos experi xperim menta ntales aportados portados por el autor utor de del pre prese sente nte tra trabaj bajo, favore vorecen cen la idea dea que que la melatoni tonina na si si se comporta comporta como como un agente neutr neutra alizador de la peroxidación lipídica, requiriéndose más investigaciones para confirmar si efectiva ctivam mente la la melatoni tonina na puede se serr cla clasif sificada cada bajo los esque esquemas actual actuale es como un clásico y efectivo antioxidante celular.
Palabra Palabras Cl Claves: Melatonina, Antioxidante Celular, Radicales Libres, Peroxidación Lipídica, Glándula Pineal, Ritmos Biológicos, Neurociencias
VIII
INDICE Cápitulo Pensamientos Agradecimientos Dedicatoria Resumen ListadeFiguras ListadeTablas ListadeGráficos ListadeCuadros I.
MARCO TEORICO (Antecedentes, Introducción, Planteamiento del Problema, Objetivos)
II.
LA GLANDULA PINEAL (Anatomía, Fisiologíay Bioquímica) A.-Anatomía delaGlándulaPineal 1.-Dimensiones, ubicación, peso 2.-Situación anatómica-conformación-relaciones 3.-Embriología-Evolución 4.-Inervación B.-FisiologíadelaGlándula Pineal 1.-Control del inicio dela pubertad 2.-Regulación de ritmos biológicos 3.-Regulación de la temperatura corporal 4.-Inducción del sueño 5.-Influencia en el crecimiento corporal IX
Pag. IV V VI VII XII XIII XIV XV
1 12 12 12 12 14 16 18 19 21 22 23 23
Cápitulo
Pag. 6.-Efectos sobrediversos órganos endocrinos a.-Cortezaadrenal b-Glándula tiroides c.-Otras glándulas
25 25 26 26
C.-Biosíntesis, Secreción y Metabolismo de las Hormonas Pineales
27
1.-Sitios de producción de melatonina a.-Síntesis de melatonina en la pineal (1).-Melatonina en los fluidos corporales b.-Producción demelatoninaen otros tejidos c.-Regulación neuro-farmacológica de la síntesis de melatonina d.-Distribución y metabolismo de melatonina e.-Regulación dela síntesis demelatonina
37 43 46
D.-Estructura y Propiedades Fisicoquímicas dela Melatonina
49
E.-Receptores Celulares de la Melatonina
52
F.-Acción de la Melatonina en Células y Tejidos Corporales
59
1.- A nivel cerebral 2.- A nivel de sistema inmunológico 3.- A nivel endocrino y sistemas de control y retroalimentación 4.-Otras acciones
X
28 28 34 36
59 61 62 65
Cápitulo
Pag.
III.
67
MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR A.-Papel de los Radicales Libres en el Proceso de Salud y Enfermedad B.-¿Por quélaMelatoninacomo Antioxidante Celular? C.-¿Qué Características Bioquímicas dela Melatonina han Permitido Postular a esta Molécula como Antioxidante?
72 73
D.-Acciones protectoras dela melatonina en su papel de Antioxidante a nivel de órganos y tejidos corporales
83
1.-Sistema nervioso central 2.-Sistema gastrointestinal 3.-Piel 4.-Otras acciones antioxidantes
81
83 87 89 89
E.-Evaluación del Estrés Oxidativo en Ratas con Diabetes Mellitus tipo I Inducida por Estreptozotocina: Posible Papel Protector dela Melatonina
96
F.-Niveles de Peroxidación Lipídica en Fantasmas de Glóbulos Rojos Sometidos a Radiación Ultravioleta Tratados o no con Melatonina
109
G.-Otras Acciones delaMelatonina
117
XI
Cápitulo
IV.
Pag.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
119
BIBLIOGRAFIA
124
ANEXOS
137
XII
LISTA DE FIGURAS Pag. Fig. 1
Visión de Descartes acercade la glándula pineal la sededel alma
3
Fig. 2
Ubicación anatómica de la glándula pineal cerebral
13
Fig. 3
Ruta de biosíntesis de la hormona melatonina
31
Fig. 4
Mecanismos de transducción de señales intracelulares para la síntesis de melatonina
33
Fig. 5
Esquema de la inervación de la glándula pineal y un ejemplo de su acción a nivel endocrino
39
Fig. 6
Estructura química de la melatonina
50
Fig. 7
Representación tridimensional de la unión de la melatonina asu receptor
53
Fig. 8
Modelo propuesto de acción inhibitoria de la melatonina sobre células gonadótropas neonatales de ratas
Fig. 9
58
Representación esquemática del proceso de peroxidación lipídica 146 XIII
LISTA DE TABLAS Pag. Tabla I
Valores de melatoninaen fluidos corporales humanos
35
Tabla II
Propiedades fisicoquímicas de lamelatonina
51
TablaIII
Clasificación de los receptores de melatonina
56
Tabla IV
Niveles de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza de riñones de animales controles y experimentales 107
Tabla V
Niveles de peroxidación lipídica en membranas de glóbulos rojos sometidos o no a radiación U.V., tratados o no con melatonina0 hidroxi-tolueno-butilado 115
XIV
LISTA DE GRAFICOS
Pág. Gráfico 1
Parámetro fisiológico analizado: peso corporal
102
Gráfico 2
Parámetro fisiológico analizado: volumen deorina
105
Gráfico 3
Parámetro bioquímico analizado: nivel de glicemia
106
XV
LISTA DE CUADROS
Pág. Cuadro 1
Peso de los animales control y experimental
102
Cuadro 2
Volumen de orina excretado en 24 horas en animales controles y experimentales
105
Cuadro 3
Niveles de glicemia en animales control y experimental
XVI
106
I.- MARCO TEORICO (ANTECEDENTES, INTRODUCCIÓN GENERAL, PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA, OBJETIVOS)
La glándula pineal (Epiphysis cerebri ), ubicada cerca del centro de
nuestro principal órgano de control y pensamiento, el cerebro, es la encargada de producir la hormona denominada Melatonina. La glándula pineal o cuerpo pineal, ha sido estudiada con insistencia por los fisiólogos y bioquímicos desde hace ya varias décadas y aún, la misma no se comprende del todo. Ha sido siempre un tópico de especulación filosófica y controversia científica. Por mucho tiempo, se tenía la idea errada que la pineal en mamíferos representaba apenas un órgano vestigial de la evolución de las especies, considerándola como un mero apéndice epitálamico. La función de la glándula pineal y su principal hormona, la melatonina, es uno de los misterios más subyugantes en la fisiología de los órganos de los mamíferos, aunque con los adelantos actuales de la biología molecular y celular, este misterio pudiera tener una pronta solución y esté a la vuelta de la esquina. Se ha planteado con sólidos argumentos experimentales que lo apoyan, que la glándula pineal es un complicado y sensible “Reloj Biológico” encargado de convertir información proveniente del ambiente, en este caso, señales fóticas, en actividad cíclica nerviosa que posteriormente se traduce en información hormonal, orquestada por el sistemaendocrino.
Se conoce la existencia de la glándula pineal desde hace más de dos mil años, cuando Galeno de Pergamon en el Siglo II escribió que a los anatomistas griegos les había llamado la atención la situación particular de dicho cuerpo, concluyendo que servía de drenaje o regulador del flujo de pensamiento, que se creía almacenado en los ventrículos laterales del cerebro. En el Siglo XV, Berengario da Carpi, relacionó este órgano con la idea de un filtro del líquido cerebroespinal. En el Siglo XVII, René Descartes propuso que la glándula pineal era la sede del alma racional del hombre, cuando postuló su Teoría Mecanística de la Percepción. En la misma, Descartes proponía que el ser humano percibía con sus ojos los eventos reales que se sucedían en el entorno y se transmitían a la pineal por medio de cordones o haces en el cerebro. La pineal respondería permitiendo que los humores secretados pasaran a los músculos donde se producirían las respuestas adecuadas (Wurtmann, 1965). Por lo menos, los estudios han demostrado en éste, como en otros aspectos de su pensamiento, la gran intuición del filósofo. Ver Fig. No. 1 Hacia finales del Siglo XIX y comienzos del Siglo XX a la glándula pineal se le dio mayor relevancia con un enfoque más científico que metafísico. En 1898 Otto Heubner, médico alemán, publicó un caso clínico de un adulto joven que tenía como antecedente una pubertad precoz correlacionándolo con un tumor de la pineal (pinealoma). En años sucesivos continuaron describiéndose más casos de niños con pinealomas, casi todos varones y desarrollo de pubertad precoz. En 1954 Julian Kitay de la Escuela
Figura No. 1 Visión deDescartes acerca dela GlándulaPineal como la sede del alma
Médica de Harvard halló en su trabajo descriptivo de tumores pineales que la gran mayoría de casos clínicos de retraso en la pubertad eran consecuencia de tumores pineales con una actividad incrementada de la glándula. Descubrimientos histopatológicos posteriores describieron que la pineal después de la pubertad, comenzaba un proceso de calcificación progresiva. En 1918 Nils Holmgren, anatomista sueco, examinó la región pineal de ranas mediante microscopia de luz y advirtió que la pineal contenía células sensoriales de diferente naturaleza, que asemejaban a los conos de la retina y estaban enlazados a células nerviosas. A partir de entonces se sugirió que, la pineal pudiera funcionar como un órgano fotorreceptor o “tercer ojo” en los vertebrados inferiores. Curiosamente en 1917, Carey McCord y Floyd Allen del Johns Hopkins University (citado en Bardasano-Rubio, 1978), observaron que extractos de glándula pineal de bovinos adicionados a un medio en el cual se sumergía piel de batracios, lamisma blanqueaba, perdía color. A comienzos de los años sesenta, Eberhardt Dodt en Alemania, demostraba que la pineal de sapo, es un auténtico discriminador de longitudes de onda de luz, convirtiendo energía lumínica en impulsos nerviosos. No estaba lejos de la propuesta de Descartes. En esa misma década, Johannes Ariens Kappers, neuroanatomista alemán (citado en Bardasano-Rubio, 1978), publicó un estudio detallado de las conexiones nerviosas de glándula pineal en ratas, hecho interesante que demostró que a pesar que este órgano se originaba
embriológicamente en el cerebro, perdía todas las conexiones nerviosas con el mismo luego del nacimiento. De esta forma, quedaba claro que no existían conexiones o tractos nerviosos procedentes del cerebro y que tuvieran influencia neural sobre la glándula, al menos en ratas. Este autor demostró también que la pineal estaba intensamente inervada por fibras procedentes del sistema simpático, originados en el ganglio cervical superior ubicado en el cuello. Pero, a juicio crítico del autor del presente trabajo, es a finales de los años cincuenta cuando se produce el descubrimiento más importante relacionado con la glándula pineal y su función. En 1958, Aaron Lerner, dermatólogo, y su equipo de trabajo de la Escuela Médica de la Universidad de Yale, identificaron un componente químico único, aislado de la glándula pineal de bovinos, la cual denominaron posteriormente Melatonina1 (Nacetil-5-metoxitriptamina) con la propiedad de aclarar la piel de anfibios, mediante la agregación de los gránulos de melanina dentro de los melanocitos (Lerner, 1959) Posteriormente Nicholas Giarman, farmacólogo de la Universidad de Yale, analizó extractos pineales de mamíferos encontrando la presencia de serotonina, una amina de estructura molecular parecida a la melatonina. Ese mismo año, Julius Axelrod y Hebert Weissbach caracterizan bioquímicamente la acción metoxilante de la enzima hidroxi-indol-O-metil transferasa (HIOMT) que convierte la N-Acetilserotonina en melatonina. 1
Melatonina: su nombre se debe a que la hormona tiene la propiedad de actuar sobre los MELAnóforos, aclarando la piel en anfibios, y de sero TONINA, su precursor inmediato.
En 1960 Virginia Fiske del Wellesley Collage, reportó que la exposición de ratas a iluminación continua por varias semanas, conducía a una disminución en el peso de sus pineales y cambios en la función gonadal (incrementos en el peso de los ovarios y aceleración del ciclo estral). Sobre la base de estos datos y otros estudios, Richard Wurtmann, William Roth y Elizabeth Chu, postularon que la melatonina era una hormona y que se comportaba como el elemento clave de un transductor neuroendocrino como lo es la glándula pineal (Wurtmann, 1965). Después de dilucidar la cascada enzimática que produce la melatonina en la pineal, Hoffman y Reiter en 1965, comprobaron que la disminución en los pesos de las gónadas de hamsters inducido por exposición de los mismos a períodos largos de oscuridad, era completamente bloqueado por la pinealectomía (Lerchi, 2002). Finalmente, Wurtmann y Axelrod presentaron dos hipótesis magistrales para la investigación en esta glándula: una que, la pineal era un transductor neuroendocrino y que la melatonina era la hormona que mediaba los efectos del fotoperíodo (ciclos de luz-oscuridad) a nivel sistémico. En los años 80, se demostró que la melatonina no sólo estaba presente en animales, sino también en plantas y hasta en organismos unicelulares (Lerchi, 2002) Por más de 30 años luego de su descubrimiento, la melatonina ha sido evaluada ampliamente en referencia a sus efectos, fundamentalmente sobre el sistema neuroendocrino, en especial el sistema reproductor. Desde 1990 los estudios se han ido extendiendo, evaluando el efecto de la hormona sobre otros sistemas fisiológicos y adjudicándole otras
propiedades. Como dato curioso, se puede mencionar que el creciente conocimiento acerca de la pineal y la melatonina, es reflejado en un incremento en el número de publicaciones relativas a las mismas, pasando de unas cuantas en 1960 a más de4000en el año 2001 (Lerchi, 2002) En adición a los efectos mencionados, la melatonina está envuelta en el control de los ritmos biológicos en organismos superiores e inferiores de la escala evolutiva; en muchas especies la hormona regula los ciclos estacionales dereproducción, alimentación, termorregulación e hibernación. La melatonina tradicionalmente ha sido vista como la “hormona de la oscuridad”, ya que se secreta en mayor cantidad en la fase de oscuridad del fotoperíodo. Esta señal es usada por muchos organismos para ajustar sus relojes internos y sus sistemas fisiológicos al tiempo real del día o aciclos estacionales. Otras funciones que se han atribuido recientemente a la melatonina incluyen control del metabolismo celular, efectos oncostáticos, estimulación del sistema inmunológico, control del apetito, inducción del sueño, control del inicio de la pubertad, efectos anti-envejecimiento, y una que desde 1993 se ha venido manejando con insistencia, encontrando apoyo entre los investigadores, pero también con muchos detractores, aquella por la cual, la melatonina puede actuar como sustancia removedora de radicales libres, es decir, comportarse como un antioxidante celular. Los radicales libres son moléculas o agentes químicos, que poseen un electrón desapareado en su orbital más externo, altamente reactivos con componentes celulares y que
generan alteraciones o daños, reversibles eirreversibles a nivel celular y tisular. Se ha propuesto que la melatonina es capaz de remover o neutralizar estos radicales libres. La hormona es una sustancia natural cuyas concentraciones requeridas para ejercer esta acción podrían ser del rango fisiológico (picogramos), pero hay muchas discrepancias a este respecto, ya que todos los ensayos realizados al presente han empleado dosis farmacológicas (en el rango micromolar o milimolar), lo que a juicio de muchos autores, no podría catalogarse a la melatonina a este respecto como un verdadero antioxidante. La melatonina a dosis farmacológicas se ha demostrado ejerce protección importante contra la acción de los radicales libres en diversas situaciones patológicas como, diabetes mellitus, toxicidad por metales pesados, asbestosis, toxicidad por pesticidas, colitis ulcerativa, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, procesos inflamatorios, enfisema pulmonar, catarata senil, degeneración macular, iniciación y crecimiento neoplásicos, daños por isquemia-reperfusión, entre otros (Reiter, 2000) Numerosas evidencias apuntan a que la melatonina puede comportarse como un verdadero antioxidante celular; los hallazgos han sugerido entre otros postulados que, la eficacia de la hormona como antioxidante pudiera estar relacionada a la facilidad con la cual cruza la membrana celular. Otras investigaciones han sugerido que la melatonina remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos, por lo
menos in vitro , donando un electrón a estos compuestos electrofílicos (Poeggeler, 1994) Otros investigadores han postulado que la melatonina promueve la estabilización de la membrana celular. De interés particular es que, la melatonina sólo influye sobre la fluidez de la membrana cuando se acompaña de estrés oxidativo. Esta acción estabilizante pudiera ser otro factor importante por el cual la hormona reduce el daño oxidativo a órganos y tejidos corporales. También se ha descrito que la melatonina promovería la actividad de enzimas antioxidantes presentes en el organismo (Poeggeler, 1994) y (Reiter, 2001) Contrario a las premisas anteriores, un grupo de investigadores han señalado que la combinación in vivo de las propiedades antioxidantes muy débiles de la melatonina y, su relativa baja concentración en el plasma y tejidos corporales, hacen improbable que la hormona pueda ser considerada como un elemento removedor de radicales libres o inhibidor de la lipoperoxidación celular al grado queseha planteado (Antunes, 1999) Por lo antes expuesto, el autor ha considerado que es de relevante importancia contribuir a esclarecer las dudas que se han suscitado entre la comunidad científica encargada del estudio de la hormona melatonina, sus efectos y consecuencias, tomando en cuenta el interés del autor por el tema, las investigaciones realizadas en el campo de acción de los radicales libres sobre tejidos y órganos animales y recientemente, los efectos protectores de
la melatonina en afecciones como la diabetes mellitus y la hipertensión arterial inducida por el embarazo (pre-eclampsia), es que se realiza este trabajo que abarca dos aspectos fundamentales: una revisión integral y amplia acerca de la fisiología y bioquímica de la glándula pineal y su principal hormona, la melatonina, así como dilucidar si ésta última, cumple los requisitos bioquímicos y fisiológicos mínimos para ser considerada como una sustancia antioxidante.
OBJETIVOS DEL TRABAJO:
En base a la exposición realizada y los argumentos que conllevaron a plantear el problema expuesto, se formularon los siguientes objetivos para la realización de este trabajo: 1.- Evaluar con sentido crítico los más recientes descubrimientos relacionados con la fisiología, la bioquímica y biología molecular de la glándula pineal y su hormona, lamelatonina. 2.-Caracterizar en base a los hallazgos experimentales del autor, a la melatonina como probable agente removedor de radicales libres derivados del oxígeno, esto es, como antioxidante celular. Para una comprensión adecuada del tema propuesto, se ha dividido el trabajo en tres grandes aspectos: a) los relacionados con la anatomía, la fisiología y la bioquímica de la glándula pineal; b) aquellos que permiten la
caracterización bioquímica y molecular de la hormona melatonina en base a las investigaciones más recientes y, c) los que permiten comprender el mecanismo de acción de los radicales libres en células, tejidos y órganos del cuerpo y como la melatonina pudiera ser considerada o no un agente antioxidante.
II.- GLANDULA PINEAL ANATOMIA, FISIOLOGÍA Y BIOQUÍMICA
A.-ANATOMIA DE LA GLANDULA PINEAL 1.-Ubicación, Peso, Dimensiones La glándula pineal
o epífisis cerebral, es un cuerpo impar, de color
grisáceo-rojizo, de ubicación central en el cerebro que se desarrolla a expensas de una evaginación de la bóveda del tercer ventrículo. Mide por término medio de 7 a 8 mm y de 4 a 6 mm de anchura en un adulto joven. Pesa ordinariamente menos de 200 mg. Se halla recubierta por la piamadre. Su peso específico es de1,047 a1,050
2.-Situación Anatómica-Conformación-Relaciones En el ser humano se sitúa por debajo del rodete del cuerpo calloso, entre los dos tubérculos cuadrigéminos anteriores que le forman lo que se ha denominado el lecho de la glándula pineal. Por debajo de la glándula, se observa el abocamiento del acueducto de Silvio en el tercer ventrículo (Ver Fig. No. 2). La pineal se ha comparado siempre a una piña, a un cono con la base dirigida hacia delante, de ahí los diversos nombres que se le han dado: pineal, cuerpo pineal, conarium, entre otros. Se considera en ella una parte media o cuerpo, un extremo anterior o base y un extremo posterior o vértice.
Glándula Pineal
Figura No. 2 Ubicación anatómica de glándula pineal en el cerebro
El cuerpo es ligeramente liso o granuloso; se relaciona por arriba con las venas de Galeno y el rodete del cuerpo calloso; por abajo, con el surco longitudinal que separa los dos tubérculos cuadrigéminos anteriores; por los lados, con los plexos coroideos del tercer ventrículo. La base dirigida hacia delante, se desdobla en dos laminillas transversales, una superior y otra inferior. El vértice dirigido hacia atrás y abajo, es a veces redondeado, otras veces puntiagudo. Dicho vértice flota libremente por encima de los tubérculos cuadrigéminos, en los espacios subaracnoideos. La glándula está unida al cerebro por un conjunto de fascículos nerviosos que nacen de su base. Estos fascículos, denominados pedúnculos de la glándula pineal, son en número de seis, ubicados tres acada lado.
3.- Embriología-Evolución Como parte integrante del epitálamo diencefálico, la pineal se desarrolla como un divertículo de la línea media de la parte caudal del techo del tercer ventrículo cerebral. Comienza su desarrollo al final del segundo mes fetal. Un hecho interesante de su desarrollo es que, la pineal pierde en el adulto casi todas las conexiones neurales pinealofugales y en lugar de ello resulta inervado de una forma nueva e inusual. Los pinealocitos o sea, las células parenquimatosas de la glándula, reciben los impulsos nerviosos a través de neuronas simpáticas post-ganglionares, cuyos cuerpos celulares se hallan en el ganglio cervical superior del cuello.
Un rasgo común de todos los órganos pineales, tanto los de función fotorreceptora en vertebrados inferiores, como los de función glandular en vertebrados superiores (incluyendo los mamíferos), es el desarrollo de distintos tipos de células a partir de la matriz ependimaria. La ulterior diferenciación en dirección a un órgano sensorial o a glándula endocrina, se lleva a cabo en las distintas especies gracias a un desarrollo y proliferación característicos de los elementos celulares (Bardasano-Rubio, 1978) En humanos, existen dos tipos de células diferenciadas a partir de las células primordiales neuroepiteliales, de las cuales se desarrolla la pineal embrionaria humana. Uno de los tipos celulares madura hacia las células astrocíticas con prolongaciones bien definidas y diferenciadas. El otro tipo celular se convierte en los pinealocitos, formando nidos y sólidos cordones dentro de la matriz glial. Las prolongaciones de los pinealocitos rodean a los vasos sanguíneos encargados de su nutrición. Se asemejan a las neuronas, con un pericarion y un número desconocido de procesos citoplasmáticos; el núcleo es grande y con un nucléolo prominente (Bardasano-Rubio, 1978) También se han encontrado restos de fibras musculares estriadas en el órgano pineal de ciertos mamíferos, lo que sugiere la existencia de un posible “ojo ancestral” que tal vez tuvo movimiento voluntario (BardasanoRubio, 1978). No se han encontrado en pinealocitos de mamíferos elementos fotorreceptores, a diferencia de otros vertebrados inferiores y anfibios. Diversos autores están de acuerdo en señalar que, al menos 3 grandes cambios estructurales han ocurrido en el desarrollo filogenético de la pineal
de mamíferos, los cuales están envueltos en las respuestas de la pineal a la luz (Wurtman, 1980): a) Un nuevo tipo celular, el pinealocito, desarrollado, careciendo de organelas subcelulares para la fotorrecepción, pero conteniendo otras organelas como por ejemplo, abundante retículo endoplasmático, característico de células secretorias. b) Un nuevo patrón único de inervación de la glándula. La abundante cantidad de fibras nerviosas simpáticas post-ganglionares que llegan a la pineal desde el ganglio cervical superior, y que terminan, no en los vasos sanguíneos como era de esperarse, sino sobre o cerca de los pinealocitos, las células secretoras de la melatonina. Estos nervios median el control cerebral de la pineal. c) Una porción del tracto óptico conteniendo fibras cuyos cuerpos celulares descansan en la retina, divergiendo para formar una haz nervioso, el tracto óptico accesorio inferior, los cuales transmiten la porción del estímulo lumínico que alcanza la pineal.
4.- Inervación La inervación de la glándula pineal en mamíferos ha sido claramente definida tanto morfológica como funcionalmente. Como ya mencionado, las fibras nerviosas provienen del ganglio cervical superior, proporcionando la inervación simpática, corren por la arteria carótida interna y penetran a la pineal como nervios conarios. En un principio se creía que la pineal no
recibía inervación central, pero esto ha cambiado. Fibras nerviosas alcanzan la glándula vía habenular y a través de las comisuras posteriores, y ahora, con las modernas técnicas neurobiológicas disponibles, se ha aclarado que estas fibras tienen importancia funcional. Estudios con peroxidasa de rábano y microlesiones dirigidas, han revelado que estas fibras nerviosas pinealopetales centrales se originan en diversas regiones del cerebro, incluyendo la habénula, núcleos supraquiasmático y paraventricular del hipotálamo, amígdala, centros olfatorios, área pre-óptica, cuerpos geniculados laterales y ciertas zonas de la estria medular. En estas fibras se han caracterizado entre otras, neuropéptidos como oxitocina, vasopresina, hormona liberadora de hormona luteinizante, péptido intestinal vasoactivo. Las fibras eventualmente se distribuyen en la glándula, algunas insertándose en la periferia y otras en el centro. Sorprendentemente, en ratas el 90% de las fibras nerviosas que se internan en la pineal tienen una localización perivascular, el resto permaneciendo entre pinealocitos. Ello es muy curioso, ya que las fibras nerviosas simpáticas predominan en los espacios perivasculares y los nervios conarios llegan a la pineal independientemente de los vasos sanguíneos (Thipayang, 1998)
B.- FISIOLOGIA DE LA GLANDULA PINEAL Lejos de ser el órgano rudimentario que muchos investigadores creyeron que era, hoy día se reconoce que la glándula pineal posee una intensa actividad bioquímica y reviste enorme importancia fisiológica en el control de numerosas funciones corporales en las distintas especies animales. La pineal es de mayor tamaño en el hombre que en la mujer y en la infancia lo es más que en la edad madura; comienza a disminuir de tamaño a partir de los 7u 8 años de edad. Esta involución en el tamaño o atrofia de una glándula, lejos de ser negativa, parece tener implicaciones funcionales importantes o madurativas en los seres vivos. Entre los fisiólogos existieron importantes controversias para catalogar a la glándula pineal como un transductor neuroendocrino, controversias afortunadamente solventadas en la propia década de los años sesenta. Esta claramente definido que, para transmitir información desde el sistema nervioso a un órgano endocrino, un transductor neuroendocrino debería presentar algunas características especiales, tanto del tejido neural como del endocrino. Debe además, responder a sustancias liberadas localmente desde las terminaciones nerviosas, y debe contener la maquinaria bioquímica necesaria para sintetizar una hormona y liberarla a la circulación sanguínea. La pineal, cumpliendo estos requisitos ha sido catalogada como un transductor neuroendocrino, capaz de convertir un impulso nervioso de entrada (input) (proveniente del estímulo fótico, en una respuesta de salida hormonal (output) (secreción de melatonina) (Axelrod, 1963), (Wurtman, 1980) y(Alonso-Solis, 1992)
La pineal es el órgano del sistema visual, el cual transduce el mensaje fotoperiódico en una señal química la cual sirve como un mensajero para cada órgano del cuerpo. La pineal es pues, el intermediario entre la señal fotoperiódica externa y el medio interno corporal. Entre las numerosas funciones que se han asignado a la glándula pineal se pueden enumerar y destacar las siguientes:
1.- Control en el inicio dela pubertad. Desde el mismo momento del nacimiento, los testículos y los ovarios poseen una estructura lo suficientemente adecuada como para que en presencia de las gonadotropinas se inicie su maduración en forma inmediata. Sin embargo, este estímulo se halla reprimido, frenado a nivel de la hipófisis cerebral. La hipófisis, capacitada para producir dichas gonadotropinas en presencia del adecuado estímulo hipotálamico de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), no las produce por carencia de éste. En el adulto, los esteroides sexuales se autorregulan al unirse a receptores hipotalámicos específicos que, a partir de cierta concentración sanguínea disparan la vía opioide u opiatérgica productora de endorfinas (opiáceos fisiológicos). Esta a su vez, distorsiona la pulsatilidad de la GnRH que frena la producción y liberación de gonadotropinas, por lo que las gónadas en ausencia de dicho estímulo, dejan de producir esteroides sexuales, disminuyendo su concentración en el plasma. Con ello, los esteroides unidos a los receptores respectivos, se liberan y se vuelve a activar la liberación de GnRH. En el periodo pre-púber debería pasar lo
mismo, pero no es así. La hormona melatonina, esta descrito, tiene la misma afinidad por los receptores hipotalámicos de esteroides sexuales que éstos. En la niñez, se produce mayor cantidad de melatonina que en periodo postpúberal, de forma que constantemente se halla unida a tales receptores hipotalámicos, activando la vía opiatérgica, impidiendo así la liberación de GnRH, y en consecuencia la maduración de las gónadas (Alonso-Solis, 1992) y (Ganong, 2003) A partir de los 7 años de edad, la pineal disminuye progresivamente de tamaño, y en consecuencia, la concentración de melatonina también lo hace, hasta un punto en que ya no se une a suficiente número de receptores hipotalámicos, bloqueándose la vía opiatérgica, produciéndose entonces la síntesis y liberación por primera vez de GnRH. Ello sucede a partir de los 11-12 años en la mujer, y de los 13-14 años en el hombre. Se da inicio así a la pubertad. Descubrimientos histopatológicos han descrito que la pineal comienza acalcificarse al inicio de la pubertad (arenilla pineal) De esta manera, la melatonina ha sido caracterizada como una hormona con propiedades anti-gonadales (Wurtman, 1977). Trabajos complementarios han demostrado que la pinealectomía en ratas machos o hembras jóvenes pre-púberes, induce a una maduración sexual prematura. El mismo efecto lo causa la iluminación continua, pues como se verá más adelante, la pineal inhibe la producción de melatonina bajo esta condición. Cuando los animales son expuestos por su parte a oscuridad continua o se les induce ceguera, se describe retardo en el desarrollo sexual y disminución en el tamaño de órganos reproductivos (Romijn, 1978)
2.-Regulación delosRitmosBiológicos. En la naturaleza los niveles de luz cambian con los ciclos diurnos y anuales, aunque los humanos poco lo percibamos. De hecho, casi no percibimos las maravillas del Universo. La relación día/ noche (fotoperíodo) varía con un ritmo anual que alcanza su nadir en el solsticio de invierno y su cenit el primer día de verano. Se ha demostrado sobre todo en animales inferiores que, los ciclos de luz-oscuridad son muy importantes en la regulación de diversos tipos de función endocrina, entre ellos la reproducción. Tales ritmos se han denominado circadianos (del latín circiter que se traduce por “alrededor de un día”, 24 horas). Los ritmos circadianos endógenos o regulados internamente incluyen la actividad motora, ciclo sueño-vigilia, temperatura corporal, presión arterial, patrones de secreción de diversas hormonas, valores basales de numerosas sustancias o sustratos fisiológicos, entre otros. Una de las principales funciones de la glándula pineal es precisamente la sincronización de los ritmos biológicos del cuerpo. Este efecto es más prominente en aves y reptiles, donde la pineal es una parte integral del sistema de control circadiano. Se ha descrito que en mamíferos los ritmos circadianos pueden persistir, aún en animales pinealectomizados sin interferencias obvias. Ello hace presumir la existencia de otro(s) órganos(s) encargado(s) del control de los ritmos endógenos. También en mamíferos, el más importante de los papeles de la pineal y su hormona, la melatonina, es mediar la regulación de los ritmos estacionales mediante la percepción de fotoperíodos. La adaptación a las estaciones envuelve cambios en el status
reproductivo, pautas de alimentación, calidad y coloración de las pieles, y adaptabilidad a la hibernación. Estos cambios incrementan la viabilidad de sobrevivencia de los organismos durante las estaciones más desfavorables del año. El ritmo estacional de fertilidad en animales es regulado por cambios en la frecuencia de pulsos de liberación de la hormona GnRH. (Vanecek, 1998). En líneas generales, se puede postular que la pineal actúa sin duda como un órgano sincronizador, estabilizador y modulador de los distintos procesos fisiológicos del organismo.
3-Regulación de la temperatura corporal. El papel de la pineal y de la melatonina en el control de la temperatura corporal central ha sido conocido desde hace bastante tiempo. Se ha visto que en humanos la melatonina tiene distintos impactos sobre la temperatura corporal. Y esto es verdadero para situaciones naturales bajo las cuales la síntesis de la hormona está inversamente correlacionada con los cambios de temperatura, así como también cuando la melatonina es suministrada exógenamente (Lerchi, 2002). Ensayos efectuados en gorriones (Passer domesticus ), a los cuales se les monitoreaba continuamente la temperatura central por radio-telemetría, mostraron que el ritmo diurno normal de temperatura corporal persistía como ritmo circadiano aún cuando los animales eran colocados en oscuridad constante. La pinealectomía sin embargo, abolía este ritmo circadiano en oscuridad constante y reducía la temperatura corporal. Se concluyó así que la pineal era esencial para la función normal del reloj biológico que controla el ritmo de temperatura corporal, ubicándoseeste reloj en el hipotálamo (Romijn, 1978)
Así se le asignaba a la pineal otro papel, el de regulador fino del proceso de termorregulación.
4.-Induccióndel sueño. Hay evidencias concluyentes que señalan que la pineal y la melatonina son inductoras potenciales del sueño. De hecho, la pineal esta involucrada directamente en el control del ritmo sueño-vigilia, ritmo que posee circadianidad. Lo que no esta claro aún es, cómo la melatonina ejerce una acción de tal naturaleza a nivel cerebral. Cuando se aisló por vez primera la melatonina se descubrió que tenía un efecto sedante moderado en los animales. En 1982 Wurtman y colaboradores, demostraron que la hormona puede inducir el sueño en las personas también. En sus primeros ensayos, se utilizaron dosis elevadas de melatonina (hasta 240 mg) y se describió que tales dosis dejaban muy cansadas a las personas al día siguiente. En otra serie de ensayos, dosis entre 0,1 y 10 mg de melatonina causaron aumento de la somnolencia con menor cansancio post-sueño. Dosis muy pequeñas de melatonina son suficientes para subir los niveles al punto de inducir sueño relajador, y dado que no causa efectos colaterales ni dependencia, se ha venido usando con frecuencia e insistencia para tratar casos de insomnio, sobre todo en ancianos (Pierpaoli, 1996)
5.-Influencia sobreel crecimiento corporal. De acuerdo a Hester (citado en Romijn, 1978), la pineal ejerce un efecto inhibitorio sobre el crecimiento. En sus estudios el autor utilizó ratas machos y hembras, enucleadas unilateral y bilateralmente en combinación o
no con pinealectomía. Las autopsias efectuadas entre los 25 y 125 días posteriores a las maniobras, revelaron mediante pesaje de órganos que en ratas hembras la enucleación solamente retardó el crecimiento ovárico, uterino, adrenal y pituitario; la pinealectomía previno esta inhibición del crecimiento en todos los casos. En machos se detectó tamaño corporal reducido, pesos disminuidos de los testículos, vesículas seminales, glándulas adrenales y la pituitaria. Este efecto fue contrarrestado por la pinealectomía. Estos resultados indujeron al autor postular que la melatonina inhibe o causa una reducción en la secreción de somatotropina, gonadotropinas y adrenocorticotropinas en la hipófisis. Trabajos posteriores efectuados por diversos investigadores han indicado que, por lo menos en ratas la melatonina actuaría como un bloqueador general o inhibidor competitivo a nivel de hipotálamo o hipófisis, bloqueando o frenando la producción de factores del crecimiento. Otros trabajos más interesantes, señalan que la pineal no sólo ejerce un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de tejidos sanos, sino también actuaría como agente oncostático, inhibiendo el crecimiento tumoral (Lerchi, 2002). Estos efectos no sólo se han demostrado in vitro sino también in vivo ; en un estudio realizado por investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Texas, descubrieron que la melatonina podría reducir en un 50% la tasa de crecimiento de tumores de próstata en ratas. La melatonina podría impedir el desarrollo de tumores sensibles a hormonas sexuales, normalizando la producción de éstas últimas. En todo caso, las últimas investigaciones han indicado que la hormona pudiera actuar a través de diversas vías atacando a las células neoplásicas. Una de ellas podría ser bloqueando el proceso de
división celular, ya que se ha visto que la melatonina impide la formación de husos mitóticos. Otros hallazgos demuestran que la melatonina aumenta el número de receptores de estrógeno en células cancerosas humanas; aunque parezca paradójico, este aumento del número de receptores por razones aún no claras, podría desempeñar un papel crucial en la inhibición de la proliferación celular (Pierpaoli, 1996). Los estudios más recientes han demostrado la acción protectora de la melatonina contra la acción de los radicales libres, sustancias éstas envueltas directamente en la aparición y desarrollo de neoplasias. Respecto a este punto y por su trascendental importancia, se reserva más adelante un aparte especial en el capítulo dedicado a la melatonina ysu mecanismo de acción.
6.-Efectos sobre diversos órganos endocrinos. a.-Corteza A drenal: diversos estudios indican que la pineal restringe y modula la esteroidogénesis adrenal bajo condiciones normales y de estrés. Ensayos efectuados por Kinson y su grupo (citado en Romijn, 1978) en ratas a los cuales indujeron pinealectomía, un mes después del mismo se observó que la secreción de aldosterona y corticosterona adrenal habían aumentando, al igual que los valores de presión arterial en los animales. Así se propuso que la pineal debe normalmente ejercer un efecto inhibitorio sobre la glándula adrenal, efecto que no sólo debe estar confinado a la aldosterona. Investigaciones hechas por De Fronzo (citado en Romijn, 1978) sugirieron que la pineal inhibe la función adrenal vía la intermediación de la
hipófisis. De esta forma, se puede proponer que la pineal tendría como otra función elemental, controlar y modular las reacciones fisiológicas de defensa y adaptación a cambios en el entorno y a situaciones de estrés. b.-Glá ndula Tiroides : En este caso también se han reportado efectos
inhibitorios de la pineal sobre la función tiroidea. Tratamiento con melatonina a ratas adultas causa una reducción en el peso de la glándula y disminución en la captación de yodo y secreción de hormona tiroidea. La pinealectomía tiene el efecto opuesto (Romijn, 1978) c.-Otras glá ndulas: Dado el papel modulador de la pineal y en lo que
respecta a otras funciones endocrinas, se han descrito interacciones recíprocas entre la pineal y otras glándulas como el páncreas donde la melatonina ejercería un efecto tónico sobre la secreción de insulina y sobre el timo, donde ejercería efectos estimulatorios y reguladores (Romijn, 1978)
C.-BIOSINTESIS, SECRECION Y METABOLISMO DE LAS HORMONASPINEALES La melatonina ha sido caracterizada en todos los mamíferos vertebrados, en especies invertebradas, 16 familias de plantas superiores, eucariotas unicelulares, levaduras y procariotas. En la glándula pineal de los vertebrados inferiores y superiores se han caracterizado diversas sustancias de estructura química muy peculiar, incluyendo no solo la melatonina como la hormona más representativa, sino a la arginina-vasotocina, vasopresina y oxitocina, así como las respectivas neurofisinas, componentes de la familia de la propiomelanocortina, componentes del sistema renina-angiotensina y distintos neuropéptidos como somatostatina, neuropéptido Y, polipéptido intestinal vasoactivo, hormona liberadora de tirotropina, hormona liberadora de hormona luteótropa. Lo que permanece en estudio es si tales sustancias tienen origen neural o son producidas por los pinealocitos. Lo que si está bien aclarado es que, la pineal sintetiza a través de los pinealocitos, diversas indolaminas a partir del triptófano circulante (Alonso-Solis, 1992) y (Ganong, 2003) Dado que el objetivo fundamental de este trabajo es el de caracterizar bioquímica y farmacológicamente a la melatonina, en las páginas sucesivas se procederá a la descripción detallada de esta hormona así como de sus metabolitos principales. Aún queda mucho camino por recorrer en la investigación acerca de la bioquímica de la glándula pineal, por lo que mientras las investigaciones en el área de estudio de las otras sustancias que
se han descrito en la pineal continúan, se profundizará en el estudio de la melatoninacomo principal indolamina sintetizadapor éste órgano cerebral.
1.-Sitios de producción demelatonina Dentro del sistema neuroendocrino difuso (SNED), dos grandes poblaciones celulares productoras de melatonina pueden ser distinguidos: el central y el periférico. El central incluye a los pinealocitos ubicados en la glándula pineal, y el sistema visual que abarca la retina y la glándula Harderiana, todos los cuales exhiben un ritmo de secreción de melatonina que se adapta al ciclo biológico de luz-oscuridad. El periférico da cuenta de todas las células localizadas fuera de las áreas nombradas, producen la hormona y su función no depende probablemente del grado de iluminación ambiental; es el caso de los intestinos (Kventoy, 1999)
a.-Síntesis demelatoninaen la glándula pineal Las rutas de síntesis de la hormona melatonina en la glándula pineal de mamíferos esta bien caracterizada desde principios de los años setenta. Para la síntesis de melatonina se requiere que el pinealocito capte el aminoácido triptófano de la circulación general, probablemente por un mecanismo de transporte activo. Se ha reportado que los niveles de triptófano son mayores al final del período de iluminación ambiental con un decaimiento progresivo a medida que avanzan las horas nocturnas. La captación de triptófano hacia el pinealocito está bajo control de mecanismos simpáticos noradrenérgicos (Ebels, 1986), (Kennaway, 2002) y (Ganong, 2003). Se ha demostrado que adición de l-noradrenalina a cultivos
de pinealocitos causan un marcado incremento en la formación de melatonina a partir del triptófano (Axelrod, 1974) Luego que el aminoácido es captado es inmediatamente hidroxilado a 5-hidroxitriptófano (5-HTP) por la enzima triptófano hidroxilasa, que requiere de oxígeno molecular y tetrahidrobiopterina (una pteridina reducida) como cofactores. Se ha detectado que la concentración de tetrahidrobiopterina es mayor en tejido pineal que en cualquier otra localización cerebral. La actividad de esta enzima es regulada por receptores ß-adrenérgicos que utiliza a su vez, AMPc como segundo mensajero. Se ha reportado que la actividad de esta enzima en mamíferos es mayor en horas nocturnas. Siguiendo hacia la formación de melatonina, el (5-HTP) es descarboxilado a serotonina (5-hidroxitriptamina) / 5-HT) por la acción de la 5-hidroxitriptófano decarboxilasa, la cual tiene una distribución muy abundante en la pineal y no exhibe un patrón circadiano de actividad. La enzima requiere de 5-fosfato piridoxal como cofactor (Zinder, 1967) Aparentemente esta enzima no responde a la estimulación noradrenérgica. Respecto a la serotonina, se ha descrito que el contenido de la misma en la pineal de distintas clases de mamíferos, es mayor durante el día y disminuye en horas de lanoche. La serotonina (5-HT) tiene una variedad de rutas metabólicas dentro de la pineal. Las principales rutas incluyen la deaminación oxidativa para originar 5-hidroxi-indol acetaldehído por acción de una mono-aminooxidasa
(MAO), orto-metilación que resulta en la formación de 5-metoxitriptamina, y por supuesto, la de mayor interés fisiológico, la N-acetilación para formar N-acetilserotonina, precursor inmediato de la melatonina (Ganong, 2003) Para detalles de la ruta metabólicareferirse alaFig. No.3 La serotonina en presencia de acetil-Coa y la enzima N-acetil transferasa (NAT) (EC 2.3.1.87), es convertida a N-acetilserotonina. La actividad de la NAT fue de las primeras enzimas en ser demostrada que poseía un ritmo circadiano de 24 horas en la pineal. La NAT tiene un peso molecular de 39.000 daltons y transfiere un grupo acetilo desde la acetilCoA a un aceptor de amina en este caso, la serotonina. Se ha definido que la actividad de la NAT es la limitante en la tasa de producción de melatonina pineal. La actividad de la NAT es iniciada en la glándula pineal en horas nocturnas por estimulación de la adenilato ciclasa, vía de un receptor ß1adrenérgico. El proceso comienza con la liberación de noradrenalina a partir de las terminaciones nerviosas simpáticas post-ganglionares que finalizan en la pineal. Después de su interacción con los receptores adrenérgicos en la membrana celular de los pinealocitos, se produce estimulación de la producción de AMPc intracelular con la activación de la cascada de segundos mensajeros correspondientes. Se requiere de la síntesis de ARNm para la inducción de la actividad de la NAT. Ciertas drogas como la adrenalina, isoproterenol y L-Dopa causan un marcado incremento en la actividad de la NAT durante el día; bloqueantes ß-adrenérgicos como el lpropranolol previenen esta elevación (Axelrod, 1974)
Triptófano Hidroxilasa
Tri tófano
5-OH-Tri tófano Triptófano Decarboxilasa
Serotonina
5-OH-indol-acetaldehído
N-acetil-serotonina
5-OH-triptofol
5-OH-indol-acético
MELATONINA
5-metoxi-tri tofol
5-metoxi-indol-acético
Figura No. 3 Rutade biosíntesisdela hormonamelatonina
En adición a la activación de receptores ß1-adrenérgicos, la noradrenalina también se une a receptores a-adrenérgicos en la membrana del pinealocito, incrementando el recambio de fosfatidilinositol que resulta en la liberación intracelular de otros segundos mensajeros, como diacilglicerol (DAG), ácido fosfatídico e inositol trifosfato (IP3). Esta ruta sin duda, envuelve un efecto de potenciación de la activación de los receptores beta por parte de los receptores alfa para una mayor actividad de la enzima NAT. La N-acetil serotonina formada por N-acetilación, es el precursor inmediato de la melatonina. La cantidad de N-acetilserotonina formada en la pineal semeja la actividad de la enzima NAT; así, los valores son mayores en la noche de N-acetil serotonina cuando la actividad de Nacetilación de laserotoninaes mayor. Ver Figura No. 4 La O-metilación de la N-acetilserotonina conduce a la formación de melatonina. Este paso requiere de la enzima hidroxi-indol-ortometiltransferasa (HIOMT) (EC 2.1.1.4); esta enzima no sólo está envuelta en la síntesis de melatonina, sino en la producción de otros metoxi-indoles pineales. La HIOMT tiene dos subunidades pequeñas de 39.000 daltons y representa entre 2-5% del total de proteína soluble en la pineal. LaHIOMT se encuentra altamente concentrada en la pineal de aves y mamíferos; algunas pequeñas cantidades se han podido hallar en la retina de rata. La HIOMT en anfibios, peces y réptiles se ha localizado también en el ojo y cerebro, además del cuerpo pineal (Axelrod, 1974). Lasustanciaqueactúa
Leyenda: C: adenil-ciclasa; NAT: N-acetil-transferasa; PC: protein-cinasa dependiente de AMPc; PCC: protein-cinasa C; Gs: proteína G estimulatoria; PLC: fosfolipasa C; DG: diacilglicerol; NA: noradrenalina; IP: inositol-fosfato; VIP: péptido intestinal vasoactivo; R: receptores
Figura No. 4 Mecanismos detransducción deseñales intracelulares parala síntesis de lamelatonina
como donadora de metilos en este paso de la reacción es la S-adenosil metionina (SAM). Una vez producida la melatonina en el pinealocito, rápidamente escapa a la circulación sanguínea. No se ha descrito a la fecha ningún mecanismo activo para explicar el eflujo de la hormona desde la glándula. La molécula es altamente liposoluble por lo cual, el mecanismo de difusión simple es suficiente para explicar su descarga a partir del pinealocito.
(1).- Melatonina en los fluidos corporales Una vez liberada la melatonina al torrente sanguíneo, la misma se distribuye ampliamente por todos los tejidos corporales. Los niveles óptimos se alcanzan desde luego en el plasma sanguíneo . En el plasma los niveles de la hormona reflejan el ritmo de producción de la misma en la glándula pineal., exhibiendo un típico patrón circadiano, esto es, incrementos nocturnos de los niveles y descenso de los mismos en horas diurnas. En mamíferos vertebrados, las concentraciones de melatonina varían entre 0,1 nM y 1 nM. En líquido cefalorraquídeo (LCR) , se ha descrito que los niveles de melatonina exhiben de igual manera, un ritmo nada diferente al encontrado en el plasma. Determinaciones efectuadas en humanos, han demostrado que los niveles de melatonina son de rutina mayores en plasma que en líquido cerebroespinal. En saliva , los niveles diurnos de melatonina en humanos son equiparables a los del plasma; en comparación, los valores nocturnos fueron de casi 1/ 3 menores de aquellos presentes en plasma. Los valores más representativos indican
concentraciones de 0,5 a 0,9 pmol/ h en el día y de 1,0 a 2,4 pmol/ h en la noche. Como dato interesante, en reportes efectuados por Wurtman y colaboradores se vio que los niveles de melatonina séricos en mujeres eran mayores, justo antes y durante el período menstrual (Wurtman , 1977) En el líquido folicular ovárico , se ha descrito que el mismo concentra cantidades importantes de la melatonina, sobre todo en los folículos preovulatorios. Las concentraciones promedio de la hormona en líquido folicular son de 36,5 ± 4,8 pg/ml, valores mucho mayores que los hallados en plasma de mujeres voluntarias, cuyas muestras se tomaron a la misma hora (10 ± 1,4 pg/ml). La Tabla I presenta los valores más representativos de melatonina en los principales fluidos corporales.
Tabla I Valores mediosde melatonina (MLT) en fluidos corporales humanos Líquido
Valores deMLT en el día Valores deMLT en la noche
Plasma(pg/ml)
12 – 135 (44)
45-200(225)
Orina(ng/4h)
1-12(6)
4-40(25)
LCR (pg/ ml)
1-60 (39)
-
Entreparentésis, valoresmedios. Tomado deAlonso-Solis(1992)
b.- Producciónde melatoninaen otrostejidos La síntesis de melatonina está más ampliamente distribuida en el organismo delos mamíferos delo quesepensaba anteriormente. La lista de células productoras y almacenadoras de melatonina, indican que la hormona tiene una posición única entre todas las demás hormonas del sistema neuroendocrino, siendo hallada en prácticamente todos los sistemas orgánicos. Tomando en cuenta la cantidad de células productoras de melatonina en el cuerpo, el amplio espectro de actividades biológicas de la misma y especialmente, su propiedad universal de reguladora de ritmos biológicos, se pudiera hipotetizar que la melatonina extrapineal pudiera jugar un papel clave como molécula mediadora de las señales paracrinas, para la coordinación local de relaciones intercelulares. De hecho, y como dato adicional que apoyaría tal hipótesis se tiene que en muchas de las células vecinas en distintos tejidos donde la melatonina ha sido detectada, se han caracterizado receptores de alta afinidad por la hormona. Esta propiedad parece ser la distinción principal entre la melatonina extrapineal y laproducida en la glándula. Uno de los principales sitios de producción de melatonina extrapineal lo constituye sin duda alguna el intestino delgado. Análisis matemáticos han demostrado que el número total de células enterocromafines (EC) presentes en el intestino, es significativamente mayor que el número posible de células secretoras de la hormona en la pineal (Kventoy, 1999). Se ha evidenciado que el tracto gastrointestinal de aves y mamíferos contiene al menos, 400 veces más melatonina que la misma glándula pineal. Para algunos
investigadores, estos datos y el hecho que las células EC dan cuenta del 95% de toda la serotonina endógena, el precursor principal de la melatonina, sugiere que las células EC son la principal fuente de melatonina en humanos y tejidos animales (Kventoy, 1999) Estudios posteriores han demostrado que la retina ocular y los órganos ciliares e iris, incluyendo órganos orbitales accesorios como la glándula Harderiana y lacrimales extraorbitales, cuentan con la maquinaria sintética necesaria para la síntesis de melatonina. En adición a ello, algunas células sanguíneas han sido evaluadas y tienen la posibilidad de producir melatonina (Reiter, 1991)
c.-Regulación neurofarmacológica dela síntesis demelatonina El incremento nocturno en la producción de la melatonina en la pineal está bajo el control de la inervación simpática de la glándula. El ritmo de secreción de melatonina por el pinealocito, se estima que es iniciado por la actividad neuronal presente en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo (NSQ). Así, lesiones de este núcleo previenen el incremento nocturno en laactividad de laenzimaNAT pineal (Wurtmann, 1965) Las proyecciones caudales del NSQ pudieran incluir una sinapsis en el núcleo paraventricular, y por lo tanto, una conexión monosináptica con la columna celular intermediolateral del cordón medular torácico superior (Bittman, 1984). Estas neuronas simpáticas preganglionares dan lugar a
fibras las cuales abandonan la médula espinal por la raíz ventral y pasan al tronco simpático para hacer sinapsis sobre cuerpos celulares cuyos axones terminan eventualmente en la pineal. Durante el día, la actividad neural dentro de las fibras simpáticas que inervan la pineal está deprimida por la influencia lumínica, información ésta que es transferida al NSQ del hipotálamo. Para detalles delainervación, ver Figura No. 5 Una pregunta que ha fascinado a los investigadores de este campo por muchos años, es ¿cómo puede actuar la oscuridad en el proceso de estimulación de la glá ndula pineal para producir la melatonina y la luz tener el efecto contrario? Para la década delos sesenta se plantearon 3 posibilidades, (Wurtman, 1963): a) Que la luz penetrara directamente a través del cráneo y actuará directamente sobre la glándula pineal. Ganong y sus colaboradores de la Universidad de Berkeley en California, demostraron que cantidades significativas de luz pueden penetrar el cráneo de vertebrados inferiores.
Melatonina secretada
Glándula Pineal
Hi otálamo
Hi ófisis ervio ó tico
Luz Médula Es inal ervio sim ático ost- an lionar Gan lio cervical su erior
ervio simpático pre-gangli onar Hormona Luteinizante
Ovario
FiguraNo. 5 Esquemadela inervación de la glándula pineal y un ejemplo de su acción anivel endocrino (tomado de Wurtman, Scient. Am., 1975)
Esta hipótesis fue luego desechada al comprobarse que ratas ciegas perdían por completo la capacidad de responder a la luz con cambios en la actividad de la enzima HIOMT; así se postuló que la retina debía ser la receptora de las ondas lumínicas. b) La segunda posibilidad que se había planteado era que la luz alterara el nivel de hormona circulante, afectando quizás la glándula pituitaria y que ésta hormona, secundariamente afectase la actividad enzimática en la misma glándula pineal. Esta hipótesis se descartó también ya que la remoción quirúrgica de la pituitaria y los ovarios no interferían con la respuesta de la HIOMT a la luz. c) La tercera posibilidad y la más aceptable es que, la información lumínica es transmitida a la pineal por vía nerviosa. Se comprobó luego que la sección de las terminaciones simpáticas, o la extirpación del ganglio cervical superior, alteraban la formación inducida por la luz de la melatonina. El incremento en la actividad de la NAT (de casi 30 veces) en horas de la noche, pudiera ser explicado por la liberación reducida de noradrenalina durante el día, causando así una supersensibilidad al neurotransmisor descargado con mayor concentración al inicio de la fase de oscuridad. Otros hallazgos notables han sido que, la luz tiene la capacidad de influenciar en la formación de la enzima 5-hidroxi-triptófano decarboxilasa que induce la formación de serotonina a nivel pineal, más no en otros órganos. En contraste a la HIOMT, la actividad de la decarboxilasa se
incrementa cuando ratas experimentales son mantenidas bajo iluminación constante y decrece con la oscuridad (Axelrod, 1963) Es en la noche, justamente cuando la actividad de la glándula pineal es máxima, cuando el cuerpo físico y la mente se restauran y se estabilizan de los efectos de la actividad diaria y el estrés cotidiano. En este período, la actividad nerviosa parasimpática se incrementa, la musculatura se relaja, las frecuencias cardiaca y respiratoria se reducen, el metabolismo general se minimiza, mientras que la hormona del crecimiento en plasma aumenta (Romijn, 1978). La actividad endocrina de la pineal es reflejada por el nivel de metabolitos de indolamina presentes en plasma y orina. Esta premisa es apoyada por los siguientes hechos: a) El neurotransmisor pinealotrópico, la noradrenalina, cuya liberación está aumentada en la noche, estimula simultáneamente la síntesis y liberación de indolaminaspineales. b) La elevada tasa de recambio del metabolismo de indolaminas pineales en la noche, se refleja por un nivel de melatonina elevado en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo, con un pico elevado en la excreción urinaria del metabolito 5-hidroxi-indolacético. c) En lanoche laactividad de la pineal es máxima. d) La concentración de melatonina y serotonina se ha encontrado que es mayor en la pineal que en otros tejidos cerebrales.
e) La tasa de flujo sanguíneo por gramo de tejido pineal, excede aquella de muchos otros órganos endocrinos, igualando al de la neurohipófisis y sólo sobrepasado por los riñones. Se ha considerado como muy importante el tener presente los dos componentes del ritmo de secreción de melatonina, es decir, la duración del tiempo que permanece elevada la melatonina en plasma (a) y la amplitud del ritmo de secreción (b), tal como se presenta acontinuación: b
a La duración de la concentración de melatonina elevada en plasma es proporcional además, a la duración del período de oscuridad diario. Considerando que bajo condiciones naturales la relación luz/ oscuridad cambia sobre la base de una relación diaria y mensual, el mensaje que la pineal envía al organismo debe variar diariamente y estacionalmente. En muchas especies de animales, los altos niveles de melatonina son mantenidos por sólo un breve período durante la noche, mientras que en otros, virtualmente todo el período de oscuridad se halla asociado con niveles circulantes elevados de la hormona. En períodos como el invierno, cuando las noches son más largas, la duración de la concentración de melatonina elevadaestá también prolongada (Reiter, 1991)
d.-Distribución y metabolismo de la melatonina Una vez que la hormona es liberada de los pinealocitos a la circulación sanguínea mediante difusión simple gracias a su alta liposolubilidad, difunde con rapidez y se distribuye hacia otros líquidos y tejidos corporales. Cantidades apreciables y detectables pueden ser cuantificadas en líquido cefalorraquídeo, líquido ocular (cámara anterior del ojo), saliva, líquido folicular ovárico, líquido seminal, leche materna y líquido amniótico. La melatonina tiene la capacidad de atravesar la placenta a partir de lo cual proveeinformación fotoperiódicaal feto (Rowe, 2002) La melatonina circulante en plasma viaja en parte unida a la albúmina (60-70%) y el resto en forma libre. La vida media de la melatonina en la circulación sanguínea es de aproximadamente 15-20 minutos. La mayor parte de la hormona es inactivada en el hígado mediante su conversión a 6hidroxi-melatonina la cual es excretada por la orina en forma de compuestos sulfatados (75%) o glucurónidos (5%). Otra parte de la melatonina (15%) es transformada en el tejido cerebral a compuestos derivados de la kinurenamina, y sólo apenas un 5% o menos, se excreta en forma libre por la orina. Los metabolitos urinarios de la melatonina exhiben también un ritmo circadiano que asemeja con el de la melatonina en plasma (AlonsoSolis, 1992). El promedio de excreción de metabolitos de la hormona por vía urinaria varía considerablemente entre los individuos, oscilando entre 030 ng/ 8 h, pero es muy consistente día a día. Entre un 60 y 70% del total excretado por día, se realiza entre las 11 pm y la 6 am. (Wurtman, 1977) y (Fourtillan, 2001)
Entre los metabolitos derivados de la melatonina se encuentran diversos compuestos indólicos. El grupo 5-metoxi de la molécula no es retenido necesariamente en ellos. La melatonina incluso, puede ser reconvertida en su precursor, N-acetilserotonina en especies como aves y mamíferos, incluyendo al hombre. Esta última ruta parece predominar a nivel de la retina que posee mayores cantidades de N-acetilserotonina que de melatonina (Allen, 1991). Mejor documentado se encuentra el efecto de los indoles 5-metoxilados, en particular la 5-metoxi-triptamina. Esta se puede producir por las siguientes vías: 1) O-metilación de la serotonina debido a la acción de la enzima HIOMT, el cual ocurre en retina, pineal y glándula Harderiana de roedores; 2) vía de O-metil-transferasas inespecíficas localizadas en tejidos vegetales (Banerjee, 1973); 3) a partir de la melatonina por medio de laenzimaaril-acilamidasa(Beck, 1981) La 5-metoxi-triptamina es rápidamente degradada en la glándula pineal a 5-metoxi-triptofol mediante la acción de la Mono Amino Oxidasa (MAO) (Galzin, 1986). En varias clases de mamíferos y otras especies de vertebrados el 5-metoxi-triptofol está presente en la pineal, retina y glándula Harderiana. Presenta alta hidrofobicidad. Se han descrito influencias antigonadales de este metabolito, incluyendo efectos sobre células de Leydig (Hardeland, 1993). Tiene la capacidad también de hacer disminuir la temperatura corporal en ratas. El metabolito es degradado rápidamente a ácido-5-metoxi-indolacético que se excreta por la orina. Otro metabolito de interés derivado a partir de la 5-metoxi-triptamina es el N-N-Dimetil-5-metoxi-triptamina que es formado por vía de la N-
metil-transferasa; la molécula es poco hidrofóbica. Es de mucho interés en el área psicopatológica y está presente además en concentraciones importantes en numerosas plantas tropicales alucinógenas (Hardeland, 1993). La ruta sintética para formar el compuesto mencionado se cree, comienza con la N-metilación de la serotonina dando lugar a la bufotenina, que luego es O-metilada por la HIOMT (Banerjee, 1973). Se ha considerado a esta sustancia como un potente ligando serotoninérgico. El metabolismo de las indolaminas 5-metoxiladas no está restringida sólo a modificaciones de sus residuos laterales. La cadena alifática en especial puede sufrir también ciclación. Pueden presentarse en este caso dos posibilidades: una, es la formación de un segundo anillo de 5 átomos de carbono, apareciendo simultáneamente con hidroxilación y saturación del doble enlace en posición 2-3. Esto origina el isómero cíclico de la 2-hidroximelatonina. Esta sustancia se ha aislado en orina de ratas y humanos (Hardeland, 1993). La segunda opción de ciclación es mediante la incorporación de un átomo de carbono adicional, formándose las ßcarbolinas. Estas sustancias son halladas en todos los tejidos que producen melatonina. Su generación metabólica bajo condiciones fisiológicas es aún incierta. Poseen efectos psicomiméticos relacionados con la interferencia de dos importantes mecanismos neurobiológicos: unión a receptores benzodiazepínicos y modulación de la afinidad del sitio de unión de la imipramina relacionado al transportador de serotonina (Haefely, 1985). Las ß-carbolinas se ha visto que influencian la secreción de hormonas a nivel de pituitaria, en especial, la prolactina.
Una de las principales ß-carbolinas metoxiladas detectadas es la Pinolina (6-metoxi-1,2,3,4-tetrahidro- ß-carbolina = 5-metoxi-triptolina). Los sitios de unión de este metabolito se han detectado densamente en la pineal, también en otras regiones del cerebro y áreas de corteza y médula adrenal (Hardeland, 1993) Otra importante vía del metabolismo de la melatonina conduce a la formación de kinuraminas sustituidas, formadas por clivaje del anillo pirrólico de la melatonina. La reacción puede ser catalizada por la indolamina-2,3-dioxigenasa, una hemoenzima que requiere de aniones superóxido como sustrato (Vanecek, 1998). El primer metabolito que se forma por el clivaje del anillo pirrólico es el N1-acetil-N 2-formil-5-metoxikinuramina (AFMK), que luego por acción de la arilamina formamidasa la convierte en N1-acetil-5-metoxi-kinuramina (AMK). Ambas sustancias han sido caracterizadas en el cerebro, en mayor proporción en glándula pineal.
e.-Regulación dela síntesis de melatonina Se han descrito elementos fisiológicos que participan bien sea, en la estimulación o en la inhibición de la síntesis de la hormona. Se describirán a continuación algunos de los principales elementos investigados a la fecha y su influencia en la síntesis de melatonina. .-N oradrenalina : como ya hasido señalado anteriormente, el efecto del inicio de la oscuridad en mamíferos conduce ala liberación de noradrenalina a partir de las terminaciones nerviosas simpáticas provenientes del ganglio cervical superior. La noradrenalina activa receptores ß1 y estimula la
actividad adenilato-ciclasa con la consecuente producción de AMPc. Este proceso estimula la síntesis de melatonina. .-GABA : lo que se ha podido describir acerca del efecto del ácido gamma amino-butírico sobre el metabolismo de las indolaminas pineales es variada entre las distintas especies de mamíferos. Estimulación o carencia de este efecto puede observarse en ratas, mientras que en pineal de bovinos, el GABA inhibe la estimulación de la enzima NAT inducida por norepinefrina (Ebels, 1986) -Taurina : este aminoácido sulfurado presente también en la pineal estimula la actividad de la enzima NAT (Wheler, 1979). Sin embargo, en combinación con la noradrenalina, su efecto es menor. Se ha evidenciado que los niveles de taurina alcanzan un máximo en las primeras horas luego del amanecer, y que la misma compite con la noradrenalina, haciéndola un candidato interesante para la regulación de la biosíntesis de melatonina; no está claro el mecanismo de acción del aminoácido. .-S-adenosil-L -metionina : esta sustancia es una donadora natural de grupos metilo y es efectiva sólo si el grupo amino está libre. Este grupo amino puede reaccionar sin embargo, con el fosfato de piridoxal y perder así, su capacidad donadora de metilos, la cual es indispensable para la síntesis de melatonina. Del otro lado, el fosfato de piridoxal es necesario para los procesos dedescarboxilación (Ebels, 1986) .-S-adenosil-homocisteína : este compuesto es formado cuando la Sadenosil-L-metionina ha servido de donador de grupos metilo, y puede
unirse a la enzima HIOMT inactivándola. Recuérdese que esta enzima es clave para la biosíntesis de la melatonina. .-Pteridinas : estas sustancias son muy sensibles a la luz y juegan un rol muy importante en los procesos metabólicos en mamíferos. En estas especies, tres mono-oxigenasas de aminoácidos aromáticos como lo son la fenilalanina hidroxilasa, la tirosina hidroxilasa y la triptófano hidroxilasa, requieren de pteridina reducida como cofactor para su funcionamiento. La 6-L-Eritrotetrahidro-Biopterina (BH 4) es el cofactor natural para las tres enzimas citadas arriba. Las tres hidroxilasas juegan un papel crucial en la biosíntesis de las aminas biógenas tales como, catecolaminas y dopamina, y la serotonina-hidroxi-indolamina a partir de aminoácidos aromáticos. Así, el BH4 es esencial para la síntesis de melatonina y otros metoxi-indoles en la pineal (Ebels, 1986)
D.-ESTRUCTURA Y PROPIEDADES FISICOQUIMICAS DE LA MELATONINA La hormona melatonina, 5-metoxi-N-acetil-triptamina es una sustancia perteneciente al grupo de las indolaminas de coloración amarillo pálida, muy sensible a la luz, cuya estructura básica está conformada por un anillo pirrólico con un grupo metilo en la posición 5 del grupo indol y un grupo acetilo presente en la molécula. El grupo N-acetilo representa la porción de la molécula que previene la unión o binding sustancial de la misma a receptores de serotonina. También protege este grupo de la degradación de la hormona por la enzima Monoamino-Oxidasa (MAO), una característica que la distingue de su análogo, 5-metoxi-triptamina. Adicionalmente, el grupo acetilo participa en la ciclación de los residuos alifáticos (Hardeland, 1993) Ver detalles en la Figura No. 6 En la Tabla II se resumen las principales propiedades fisicoquímicas de la melatonina.
Estructura tridimensional
Estructura planar FiguraNo. 6 Estructuraquímica de la melatonina
TABLA II PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LA MELATONINA ___________________________________________________________ Fórmula Química: -N-[2-(5-metoxi-1H-indol-3-yl) etil] Acetamida Fórmula Estructural: C13H16N2O2
Peso Molecular: 232,27 g/ mol
Composición: Carbono: 67,22%; Oxígeno: 13,78%; Nitrógeno: 12,06%; Hidrógeno: 6,94% Espectro de Absorción y Emisión: la melatonina absorbe luz solamente en la región UV del espectro con una máxima absorción a ~278 nm. El espectro de fluorescencia es muy fuerte en la región cercana a la UV con un máximo de emisión a~340 nm Punto de fusión: 116-118°C Solubilidad: en agua: 0,1 mg/ ml; en etanol: 8 mg/ ml Almacenamiento: = 0°C o menor Secristaliza a partir de solución de benceno: mp: 116 a119°C Densidad: 1,269 g/ cc medido por método de flotación en solución acuosa de cloruro de calcio. Estructura Molecular: La distancia C-C en el anillo bencénico es de 1,402 A°, mientras la distancia C-C y C-N en el anillo pirrólico es de 1,405 A° y 1,394 A° respectivamente. La parte indólica de la melatonina es planar, siendo el promedio de desviación de los átomos apartir del plano 0,011 A°
E.-RECEPTORES CELULARES DE MELATONINA La respuesta celular a la acción de la melatonina requiere que el mensaje sea decodificado. Para ello, las células cuentan con los receptores específicos para esta hormona. Gracias al desarrollo de modernas técnicas para la caracterización cuantitativa de receptores, agentes farmacológicos selectivos y ligandos como la 2-(125I) Iodomelatonina, se ha logrado avanzar significativamente en el estudio de los receptores celulares de la melatonina. Se ha evidenciado que los efectos de la melatonina son mediados a través de receptores específicos de alta afinidad. El patrón de distribución de estos receptores varía de especie a especie. En los vertebrados no mamíferos por ejemplo, la distribución de los mismos es muy abundante, a diferencia de los mamíferos la cual es discreta o baja (Vanecek, 1998) y (Laitinen, 1990). El grupo 5-metoxi y la cadena N-acetilo lateral son fundamentales para el binding de alta afinidad al receptor, ya que derivados de la melatonina que carecen de estos grupos son menos afines al receptor. La densidad de receptores no sólo varía con las especies y su localización, sino en diversos tejidos está influenciado también por el fotoperíodo, régimen de iluminación y status endocrino del individuo (etapa de desarrollo) (Vanecek, 1998). Ver Figura No. 7 En los mamíferos, los receptores de alta afinidad por melatonina están presentes en la pars tuberalis de la pituitaria y en núcleo supraquiasmático del hipotálamo. Este patrón dedistribución puedeser
Melatonina
TM: Dominios trans-membrana
Enverde: molécula demelatonina
Figura No. 7 Representación tridimensional dela unión de la melatonina a su receptor (TomadodeBalík, Physiol. Rev., 2004)
hallado también, pero en menor grado en área pre-óptica medial, hipotálamo anterior, núcleos dorsomedial y ventromedial hipotalámicos, núcleos talámico anteroventral y paraventricular, hipocampo, área postrema, cortezas cerebral y cerebelar y retina. En retina el binding de Iodomelatonina se evidencia mayormente en la capa plexiforme interna, cuyas células contienen importantes conexiones simpáticas. También ha sido descrita su existencia en las arterias del círculo de Willis y arteria caudal de distintos mamíferos (Vanecek, 1998) Hasta el presente y gracias al desarrollo de estudios de autorradiografía y biología molecular (clonamiento), se han caracterizado 3 subtipos de receptores de melatonina, perteneciendo a una subfamilia de receptores con 7 dominios trans-membrana, conectados por 3 asas extracelulares y 3 intracelulares, acoplados a proteína G inhibitoria sensible a toxina pertussis presentes en la membrana plasmática celular. Los dominios transmembrana V, VI y VII se ha sugerido están envueltos en interacciones específicas entre el receptor y el ligando. Los subtipos de receptores de melatonina humanos muestran una homología del 60% a nivel de aminoácidos y distintos perfiles farmacológicos de unión de agonistas y antagonistas (Dubocovich, 2000) y(Balík, 2004) La nomenclatura y clasificación para los receptores de melatonina utilizados en este trabajo son las adoptadas por la Unión Internacional de Farmacología (IUP) en 1998 (Dubocovich, 1998). De acuerdo al mismo, los receptores de melatonina se denominan con la letra MT, utilizando la denominación en minúscula, (mt), para aquellos receptores de los cuales
sólo la estructura molecular se conoce.; la denominación en mayúscula se reserva para aquellos receptores con una caracterización farmacológica y funcional bien definidas en un tejido en particular, así como su estructura molecular. La denominación en mayúsculas e itálicas (M T ) se utiliza para receptores caracterizados farmacológicamente a nivel tisular, pero a los cuales no se les conoce la estructura molecular. En la Tabla III se presenta la más reciente nomenclatura y la caracterización de los receptores demelatonina descritos alaactualidad. Los subtipos mt1 y mt2 parecen estar ampliamente expresados en los tejidos antes nombrados y ser los más importantes desde el punto de vista funcional. Hay variaciones circadianas en la densidad de receptores de melatonina por ejemplo, en la pars tuberalis lo cual está directamente regulado por las variaciones diarias de la propia hormona. En retina se ha encontrado que el receptor mt2 está envuelto en la inhibición de la liberación de dopamina. En la glándula pituitaria anterior, la melatonina a través de sus receptores, transduce el efecto del fotoperíodo actuando a nivel de dos tipos de células secretorias: lactotrofas que secretan prolactina y gonadotrofas que producen la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del folículo (FSH). La activación de receptores en la pars distalis, conduce a la inhibición de la liberación de gonadotropinas controlado por GnRH. Este efecto se ha observado notoriamente en células gonadotropas neonatales; ello coincide con la expresión temprana de receptores de melatonina de alta densidad y su gradual declinación en la pituitaria durante el desarrollo (Balík, 2004)
TABLA III CLASIFICACION DE RECEPTORES DE MELATONINA Nomenclatura
mt1
mt2
M T 3
Otros nombres
Mel1a, ML1A
Mel1b, ML1B
ML2
Afinidad (K D)
45pM
140 pM
0.3-2 nM
Acoplamiento
G i/o
G i/o
-
Radioligandos
3
3
2-iodo-(125I) MLT
2-iodo-(125I) MLT
Agonistas selectivos
H-MLT
-
2-iodo-(125I) MLT
H-MLT
IIK7
N-acetilserotonina 5MCA-NAT
Antagonistasselectivos
-
4P-PDOT
Prazosin
DH97, K185
Gene/ cromosoma
MTNR1A/ 4q35.1
MTNR1B/ 11q21-22
-
Estructura-7TM
h350 P48039,
h362 P49286, m121 U57554
-
M353Q61184, r156 P49218 r120P49287
Localizaciones Especies
-
Retina, NSQ hipotálamo Retina, cerebro
Melanóforos
Cerebelo
hipocampo
cerebro, retina
Mamíferos, Aves
Mamíferos
Peces, aves, anfibios
]indol-11-il)etamina; * 5MCA-NAT: 5Nomenclatura: * IIK/ 7: N-butanoil-2(2-metoxi-6H-isoindol [2,1-a metoxi-carbonilamino-N-acetil-triptamina; * 4P-PDOT: 4-fenil-2-propioamido tetralina; * DH97:2-bencilN-pentanoil-triptamina; * K185:N-butanoil-2-(5,6,7-trihidro-11-metoxibenxo[3,4]cicloheptano[2,1-a ]indol13-il)etamina.
Está bien documentado que los principales efectos de los receptores de melatonina a nivel celular son mediados por la inhibición de la actividad de la adenilato ciclasa, conduciendo a una disminución de los niveles de AMPc e inhibición de los procesos celulares regulados por este mensajero intracelular. En las células que expresan por ejemplo, receptores de mt1 la inhibición de la adenilciclasa, está ocasionalmente acompañada de una facilitación simultánea de la actividad de la fosfolipasa C, que origina a su vez, diacilglicerol e inositol-trifosfato. La activación de receptores tipo mt 2 también da lugar a inhibición de la actividad guanilato ciclasa, pero el grado al cual se produce esta inhibición aún se desconoce (Balík, 2004) Ver la Figura No. 8 que ilustra el efecto de la activación de receptores de melatonina en células gonadótrofas neonatales, y su acción inhibitoria sobre la liberación de LH y FSH.
Receptor de Melatonina
Despolarización
Leyenda: AC, adenil-ciclasa; CNGC, canal activado por nucleótidos cíclicos; GnRH REC: receptor de GnRH; SERCA, ATPasa de Calcio de Retículo Endoplasmático Liso; VSSC, canal de sodio sensible a voltaje; VSCC, canal de calcio sensible a voltaje; InsP3: inositol-tri-fosfato; PLC: fosfolipasa C; Kca: canal de potasio sensible a calcio Efecto inhibitorio Efecto Estimulatorio
Figura No. 8 Modelo propuesto deacción inhibitoria dela melatonina sobre células gonadótrofas neonatales de ratas
F.- ACCIONES DE LA MELATONINA EN CELULAS Y TEJIDOS CORPORALES .1.- A nivel cerebral. A causa de su alta solubilidad en lípidos y agua, la melatonina es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, penetrar a las neuronas y células gliales y distribuirse con facilidad entre los componentes subcelulares. En cerebro el efecto de la hormona pudiera ser mediado por distintos mecanismos, bien sea a través del control de la homeostasis del calcio y sus mecanismos de señalización intracelular, a través de sus efectos sobre el estado se alerta y sueño, o a través de su influencia sobre la actividad de aminoácidos excitatorios o inhibitorios. Algunos efectos centrales pudieran ser mediados por su interacción con receptores específicos o sitios de unión expresados en ciertas regiones cerebrales, y otros pudieran resultar de interacciones, no mediadas por receptores, con cierta clase de neuronas o células gliales (Huethe, 1996). En lo que respecta a este último efecto, es decir, no mediados por receptores existe una tendencia significativa de considerar a la melatonina como potente agente antioxidante celular, acción ésta que protegería al tejido cerebral de la acción de los radicales libres generados en diversos procesos patológicos (Iacovitti, 1997). Ya que éste es uno de los objetivos fundamentales de este trabajo de investigación, más adelante se hará referencia y en detalle, acerca del papel de la melatonina como antioxidante celular. .-Efectos Metabólicos: luego de la administración de la melatonina se pueden evidenciar diversos cambios en la actividad metabólica cerebral. Se
ha detectado un incremento de casi dos veces en los niveles de GABA en el hipotálamo y corteza cerebral (luego de inyectar a conejos adultos vía intraperitoneal, 50 µg/ kg. peso); hecho curioso es que, a dosis de 250 µg/ kg. peso la concentración de GABA decae (Antón-Tay, 1974) Los niveles de serotonina también son modificados por la acción de la hormona; la serotonina tiende a aumentar en cerebro de ratas adultas una hora después de la administración de 500 µg/ kg. peso de melatonina. Luego de 30 minutos de la inyección, los niveles de serotonina decayeron en un 14% en corteza cerebral, pero con importantes incrementos en el hipotálamo. Los niveles permanecieron elevados luego de 180 minutos en cerebro medial, disminuyendo los valores en hipotálamo y corteza hasta estabilizarse (Antón-Tay , 1974) Melatonina a dosis de 200 µg/ kg. peso suministrados a ratas causó un incremento notable, de casi seis veces sus valores normales, en la actividad de la enzima piridoxal-fosfokinasa que cataliza la formación de fosfato de piridoxal, grupo prostético muy importante de la enzima Laminoácido decarboxilasa, que a su vez, sintetiza la formación de serotonina cerebral. Lo mismo se describe para la enzima ácido glutámico decarboxilasa que cataliza la síntesis de GABA. .- Efectos Electrofisiológicos: estudios electroencefalográficos y de comportamiento de individuos, han indicado que la administración de melatonina, en este caso, a gatos y pollos resulta en una desincronización electroencefalográfica y del sueño. En sujetos voluntarios humanos,
suministrándol nistrándole es mel mela atoni tonina na a dosis dosis de 1,25 µg/kg. µg/ kg. peso, peso, se observaron observaron cambios bios tal tales como, como, ligera desi desincro ncroni niza zaci ción ón y desa desactiva ctivaci ción ón electroence ctroencefalográf ográfica y de del sueño en los sig siguie uientes 30 minutos. Moni Monitor tore eo electroence ctroencefalográf ográfico en la las siguie siguientes dos horas, horas, mostró un increm incremento en la apari parici ción ón de ondas ondas al alfa de gran am ampli plitud. Muchos Muchos sujetos lue lueg go de del ensayo, manif nifestaron ron sensación ción de qui quie etud, paz paz y tra tranquil nquilidad dad (Antón-T ntón-Tay, 1974)
2.- A nive nivel de dell Sistema Inmunol unológico. Hay evidencias que refieren que la melatoni tonina na posee efecto efectoss esti estim mula ulantes ntes sobr sobre este sistem sistema a, aunque aunque hay car carencia ncia de infor nform mación ción en cuanto cuanto a los me mecani canism smos de acción cción a este este nive nivel. En ratones ratones inyectados ctados con melatonina tonina por sei seis días vía vía intra ntraperi periton tone eal, se encontr ncontró ó que hay hay estim stimula ulación ción en la producci producción ón de anticue nticuerrpos, incr incre emento en el número de cél célula ulas for form madora doras de pla placas cas en el bazo y antagonism onismo de la inmunosupre unosupresión sión induci nducida por corticoe corticoeste steroi roides des (Pi (Pierpaolirpaoli-Regelson, 1996). Asim Asimiismo, a ratas pinea pinealectom ctomizadas y a las cual cuales se les suministr nistró ó melatoni tonina na exógena, na, se evide videnci nció ó un incr incre emento en la la unida unidad d for form madora dora de coloni colonia as de macróf crófagos en médula dula ódea (Huethe, uethe, 1996). 1996). Otr Otro o ef efecto muy muy interesante y conoci conocido do desde desde hace hace cuatro tro décadas, das, es la la habil habilidad dad de la la melatonina para suprimir el crecimiento de tumores y la reproducción de cél célula ulas neopl neoplá ásica sicas, s, incl inclusi usive ve en humanos (Ebel (Ebelss, 1986), (Ma (Maestroni, stroni, 19 1999) y (Bi (Bindoni ndoni y Raff Raffaele, 1968) 1968) obser observar varon una elevada vada activi ctivida dad d mitóti tótica ca en adenohipóf denohipófiisis sis de ratas luego uego de pinea pinealectom ctomía. Tr Tres años después después,, esto estoss mismos autor autore es describi scribie eron ron una rela relación ción im importante portante entre ntre pine pinea al y la activida ctividad mi mitótica tótica en otros otros te tejidos corpor corpora ales. Otr Otra as evi evide denci ncia as
experim xperimentale ntales indi indica can n que, que, la la adici dición ón de melatoni tonina na a medios dios de culti cultivo vo inhibe nhibe el cre crecim cimiento de cél célula ulas cancerosas ncerosas mamarias de huma humanos MC MCF-7; tambié bién se ha descr descriito que la horm hormona retrasa el cicl ciclo o celula celular, re regulando adem demás, la acción cción de fa factore ctores de cre crecim cimiento sobre sobre éstas stas cél célula ulas (Ga (Garcí rcía, 1998). La L a melatoni tonina na también bién tie tiene acción cción re regula gulator toria sobre sobre la enzim enzima 5lipo-oxigenasa, en el sentido de su inhibición. Esta enzima está restringida su prese presencia a gra granulo nulocit citos, os, monoci onocitos/ macrófa crófagos, ma mastocitos stocitos y linfoci nfocitos tos B. Esta acción cción envuel nvuelve la pre prese senci ncia a de un receptor nucle nuclear de la hormona (Re (Reiter, 19 1997) y (Xi (Xian-T n-Tan, 19 1999)
3.- A nive nivel endocrino ndocrino y sistemas decontrol y retroalimentación. ntación. pieel : la melatoni .- M elanóforos de la pi tonina na tie tiene la propi propie edad dad única única de concentr concentra ar los me melanófor nóforos os derma dermales de anfi nfibios bios,, réptil ptiles y peces, como como un mecanism nismo de adaptaci ptación ón a disti distintas ntas intensidade intensidades de luz o ililumi uminaci nación ón ambie biental. ntal. Esta acción cción la realiza gr gracia cias a su su propi propie edad dad de agre agrega gar rápida rápidam mente los gránulos nulos pigm pigmenta ntarios que conti contie enen a la melanina, nina, en zona zo nass perinucl perinucle eares cel celula ulares, lo lo cual cual se tra traduce en un embla blanqueci nquecim miento de la pie piel del del anim nimal. Este E ste movim ovimiento nto del melanosom nosoma es causa causa de los cam cambios bios en en la la arquitectura rquitectura del cito citoe esqueleto del del melanófor nóforo, o, envol envolvi vie endo la fosfori osforillación/ ción/ desfosf desfosfori orillación ción de de proteínas proteínas específi cíficas. cas. La La dispersi dispersión ón de los gránulos nulos de me melanina nina parece se ser media diada por cine cinesi sina nas, s, AT ATPasa depe dependi ndie ente de microtúbul crotúbulos os y dine dineiina la cual cual es la la responsable sponsable de la agrega gregación. ción. El efecto lo ej ejerce la melatoni tonina na,, actuando actuando vía vía de recepto receptorres de alta afinida nidad, d, lo lo cual cual se tra traduce lueg uego en en una inhibi nhibici ción ón del del conteni contenido do de AMPc inducido por la hormona estimulante del melanocito (MSH).
Después de la exposici xposición ón a la la luz, la concentración concentración de melatoni tonina decae, resultando en la dispersión de los gránulos pigmentarios y oscurecimiento de la piel. El significado fisiológico de los cambios pig pigmentari ntarios os parece parece envolve nvolverr la la protecció protección n de los tej tejidos prof profundos de la pel peligrosa rosa radi radia ación ción sola solar. Este ef efecto no se ha reportado reportado en en mamíferos (Va (Vanecek, 1998) .- Retina: la la regulación de la sensibilidad visual ocurre a diferentes nive nivelles depe dependi ndie endo de la la intensi ntensidad dad de la ililuminaci nación ón ambie biental. Uno Uno de los efe efectos ctos más prominentes prominentes de la melatoni tonina na es sobre sobre el movim ovimiento fotom otomecáni cánico, co, esto es, la la elongación ción de conos y contracció contracción n de bastone bastones, s, que ocurr ocurre en re retinas tinas de verte vertebra brados no mamíferos com como una adapt dapta ación ción a una dism disminución nución en en la la intensi ntensidad dad de la iluminaci nación. ón. El E l efecto opue opuesto sto en en respuesta spuesta a una inte ntensa ilumi uminación nación,, oc ocurr urre y es media diada por la dopa dopamina. La liberaci beración ón de la dopam dopamina en la la retina retina es ma mayor en horas horas del día día y dism disminuye en hora horas nocturna nocturnas. s. La La melatoni tonina na suprim suprime la liber beración ción de dopamina en re retina tina provo provoca cada da por la luz. Un hecho bie bien interes interesa ante es que, la mel mela atoni tonina na se se produce dentr dentro o de la misma retina tina.. Los Los recept receptor ore es de la melatoni tonina na a nive nivell de retina retina se localizan ocalizan a nive nivell de la capa capa ple plexif xiform orme inte nterna, na, justo justo donde donde se se encuentra ncuentran la las conexiones conexiones entr ntre las cél célula ulas amacrinas nas product productor ora as de dopamina y las cél célula ulas ga ganglionare nglionares. s. Así Así,, la la horm hormona regul gula la canti cantida dad d de luz que llega al fotorr otorre ecepto ceptor, r, contro controllando el movi movim miento de gránul ránulos de melanosoma nosomas dentr dentro o del del epiteli pitelio o pig pigmentari ntario o re retina tinall. La melatoni tonina na se ha demostr ostrado ta tambié bién que altera la la acti ctivida vidad d el eléctri éctrica de
este epitelio retiniano en mamíferos, y en el control de la sensibilidad de las células horizontales ala luz (Vanecek, 1998) .- A juste y Sincronización de Ritmos Biológicos : como ya fue mencionado, la melatonina está involucrada en la sincronización de los ritmos circadianos. Este efecto es más notable en aves, peces y reptiles, donde la glándula pineal es parte integrante del sistema circadiano. De esta manera, en estos animales el ritmo de síntesis de melatonina es controlado por un marcapasos interno (pacemaker) y continua aún después de aislamiento completo de la pineal in vitro . Aún más, en estas especies sus pinealocitos son sensibles a la luz y es el ciclo luz-oscuridad la que ajusta o sincroniza directamente el ritmo de síntesis de la hormona (Bardasano-Rubio, 1978) En los mamíferos, los ritmos persisten en animales sujetos a pinealectomía sin ninguna interferencia importante. En humanos, el retraso o adelanto en la fase del ritmo de 24 horas ha sido descrito después de la administración matinal o nocturna de melatonina. Así, la melatonina puede causar un desajuste o desvío en la fase de los ritmos de sueño/ vigilia, temperatura corporal y aparición de la melatonina pineal en plasma (Vanecek, 1998) .- V asos Sanguíneos : el primer reporte que se tiene sobre la acción de la melatonina sobre un vaso sanguíneo, proviene de la potenciación de la acción constrictora mediada por noradrenalina en la arteria caudal en cerebro de rata (Viswanathan, 1990). Ahora se comprobado el efecto sobre la contracción de la arteria caudal, sobre la base del descubrimiento de
receptores mt1 de alta afinidad en la capa de músculo liso de las arterias cerebrales anterior y caudal. Este efecto de la hormona es dependiente de la edad del sujeto. En vasos sanguíneos asilados de ratas muy jóvenes (5 semanas de edad), la melatonina por sí misma causa una fuerte vasoconstricción. En ratas adultas, la melatonina no mostró efectos de vasoconstricción directa, pero en presencia de noradrenalina la melatonina produjo un efecto constrictor pequeño y variable, adicional al de la catecolamina (Stokkan, 2004) Otro efecto interesante de la melatonina a nivel de vasos sanguíneos, es su acción inhibidora de la enzima óxido nítrico sintetasa (NOS), productora de óxido nítrico, por vía de un mecanismo que envuelve su unión a la calmodulina (Pozo, 1994)
4.- Otras acciones. A causa de su gran liposolubilidad, la melatonina no tiene problemas en atravesar las membranas celulares de todas las células del organismo para así ejercer su acción, incluso en compartimientos subcelulares incluyendo al núcleo. La melatonina tiene también la propiedad de ligarse a la calmodulina, proteína que liga fuertemente al ion calcio y que está envuelta en la regulación de los niveles de calcio libre intracelular. La melatonina pudiera de esta manera estimular la síntesis de novo de calmodulina, incrementando la captación de calcio e inhibir la fosfodiesterasa dependiente de calcio. Estas acciones sobre el calcio y su homeostasis, pudieran tener consecuencias directas sobre la actividad y respuestas de
otros segundos mensajeros (AMPc, GMPc), sobre la fosforilación proteica y la expresión génica (Huether, 1996) De esta forma, la melatonina se ha propuesto como un interesante modulador de la señalización mediada por segundos mensajeros intracelulares. Conociendo ahora la estructura, las propiedades fisicoquímicas, los sitios de producción y acción de la melatonina, así como sus sitios de unión, se procederá a partir de las siguientes páginas, a describir en detalle el objetivo fundamental de este trabajo, el cual es la caracterización de las propiedades bioquímicas de la melatonina, que la han llevado a proponer como molécula antioxidante celular.
III.- MELATONINA COMO ANTIOXIDANTE CELULAR
A unque
bien conocida por sus efectos hormonales, sincronizadora
de ritmos biológicos, inductora del sueño, estimuladora del sistema inmunológico, entre otras funciones, la melatonina ha sido propuesta como una molécula que puede funcionar como antioxidante celular. A este respecto las controversias han surgido y las mismas continúan. En 1991, tres investigadores rumanos (Ianas, Olnescu y Badescu) publicaron sus manuscritos en donde señalaban que la hormona melatonina tenía acciones antioxidantes. Ellos generaban radicales libres usando una combinación de luminol y H2O2 y usaron quimioluminiscencia como un índice de la producción de radicales libres derivados del oxígeno. Mediante este sistema, la melatonina fue reportada que ejercía su efecto removedor de radicales libres cuando la concentración de melatonina excedíaa 0,25 mM. (Reiter, 1997) Posteriormente en 1993, (Tan y colaboradores, 1993) aportaron nuevos datos experimentales acerca del papel de la melatonina como antioxidante, esta vez usando otro sistema de ensayo. Aquí, radicales hidroxilo (?OH) fueron generados durante la exposición de H2O2 a luz ultravioleta a 254 nm, utilizando como asociador de radicales libres el DMPO (5,5-dimetil-pirrolina-N-óxido); la molécula resultante, ? OHDMPO fue identificada mediante HPLC usando detección electroquímica y
espectroscopia de resonancia de spin electrónica. Con este sistema, la melatonina fue comparada con otros removedores (scavengers) de radicales libres, tales como glutation (GSH) y manitol. Curvas dosis respuesta revelaron que la concentración requerida para neutralizar 50% (IC50) de los radicales libres generados fue de 21 µM para la melatonina, 123 µM para el GSH y de 283 µM para el manitol. Esto sin duda indicaba que la melatonina era un removedor de radicales libres, más efectivo que los dos anteriores. Estudios posteriores de radiólisis por pulsos y métodos químicos adicionales, demostraron que la melatonina neutralizaba radicales ? OH con un alto grado de eficiencia. La tasa constante para la remoción de radicales ?
OH por melatonina seha calculado en 2,7 x 1010 M-1. S1
Poeggeler y colaboradores en 1994, demostraron también que la melatonina, basado en su pérdida de fluorescencia, es rápidamente oxidada en presencia de ? OH. Los autores utilizaron una solución de H2O2 y FeSO4 para generar ? OH; el hierro en su estado ferroso (Fe++) por su parte, no fue capaz de oxidar en forma eficiente a la melatonina; tampoco lo fue por el H2O2. Cuando la riboflavina fue adicionada a la solución de H2O2, el agregado de melatonina condujo a una rápida oxidación de la misma. Todos estos resultados tomados en conjunto, permitieron a los investigadores señalar que, por lo menos in vitro , la melatonina tiene la capacidad de neutralizar en forma eficiente a oxidantes altamente reactivos mediante la donación de electrones (Poeggeler, 1994)
Pieri y su equipo de trabajo en el mismo año 94, compararon la actividad removedora de la melatonina de radicales peróxido (ROO? ) con la del trolox (una forma hidrosoluble de vitamina E), vitamina C y GSH (glutatión reducido). Utilizaron ß-ficoeritrina como indicador fluorescente y el 2-2´-azo-bis-dihidrocloruro - (2 amidopropano) como iniciador de radicales ROO?. Encontraron que la melatonina fue más eficiente como removedor de radicales libres que el trolox, la vitamina C y el GSH (melatonina>trolox>vitamina C>GSH). En base a tales resultados, plantearon que la melatonina, dado que era dos veces mejor removedor de radicales libres que el trolox, podía neutralizar cuatro ROO? por molécula de melatonina (Pieri, 1994) En 1995 Scaiano, usó la excitación mediante láser para iniciar el clivaje de la molécula peróxido de di-ter -butilo en dos radicales ter -butóxilo (ButO? ); la melatonina una vez más, fue capaz de neutralizar a estos radicales generando radicales indolil a partir de la hormona. La tasa constante para la interacción de la melatonina con el radical ter -butóxilo fue calculado en 3,4 x 107 M-1 S-1 (Scaiano, 1995). En ese momento, dada la alta reactividad de la melatonina con los radicales libres se apoyó la idea que la hormonaeraun “excelente antioxidante in vivo” . Aún más, en ese mismo año el equipo de Poeggeler investigó las propiedades antioxidantes de la melatonina comparada de nuevo con el trolox, la vitamina C y GSH utilizando el agente capturador de radicales libres 2,2´-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfúrico (ABTS). Se evidenció que la melatonina actuaba sinérgisticamente con los antioxidantes
tiólicos y fenólicos en neutralizar el ABTS cuando éste era incubado con H2O2 y FeSO4. Se comprobó además que, la melatonina actuaba mediante la donación de electrones y en conjunto con los antioxidantes bloqueantes de la cadena de acción de los radicales libres, para neutralizar el ABTS. Se infirió de una vez que in vivo, donde la melatonina coexiste con tales tipos de antioxidantes naturales, la misma pudiera interactuar cooperativamente en los mecanismos de defensa antioxidantes celulares (Poeggeler, 1995) y (Reiter, 1997) En 1996 Marshall y colaboradores, utilizando ensayos in vitro , establecieron que la melatonina era una excelente removedora de radicales triclorometilperóxilo (CCl 3O2? ); encontraron también que aunque la hormona reaccionaba con el ácido hipocloroso HOCl), lo hacía en forma lenta. Señalaron además que, la melatonina no removía radicales anión superóxido (O2? ) en formadirecta (Marshall, 1996) Posterior aestos trabajos, se realizaron muchos otros que postulaban a la melatonina como poderoso agente antioxidante celular directo e indirecto, que tenía la propiedad removedora de radicales libres tanto in vitro como in vivo . A la luz de tales hallazgos, surgieron numerosas críticas (y con evidencias experimentales) de que, la melatonina no podía ser considerada como un agente antioxidante celular. Estos investigadores que han refutado las afirmaciones primeras, han mencionado que casi todas las moléculas orgánicas, en especial las aromáticas (y la melatonina lo es), reaccionan con los radicales ? OH, así que está propiedad de la melatonina no “la hacía algo especial”. Era lanaturaleza mismade la hormona.
Respecto a si es más eficiente que las vitaminas E o C como antioxidante, otro grupo de investigadores re-examinaron las evidencias y concluyeron con variados grados de aseveración que, la melatonina no atrapaba directamente radicales peróxilo o alcóxilo y por ende, no es un antioxidante de la misma clase que la vitamina E. Esta conclusión la apoyaron en que, su estructura carece de un enlace débil O-H o N-H capaz de donar átomos de hidrógeno a un radical libre. Otros autores con postura más radical, han afirmado que la melatonina no es un removedor de radicales libres, menos pudiera ser considerado un antioxidante celular. Dadas estas circunstancias controversiales, a la importancia que cobra cada día la hormona melatonina en sus diversos aspectos funcionales y a que el autor del presente trabajo ha llevado por varios años, líneas de investigación en el estudio del campo de los radicales libres y en el papel funcional de la melatonina como hormona, es que se realizó la presente investigación, haciendo una exhaustiva revisión de la literatura acerca de los mecanismos de acción bioquímicos de la melatonina, y con los trabajos experimentales realizados contribuir con un poco de luz a la solución de la controversia planteada.
A.-Papel de los radicales libres en el proceso de salud y enfermedad Los radicales libres, moléculas altamente reactivas con los diversos componentes y sustratos celulares, han sido involucrados en un importante número de patologías que afectan a los seres humanos, entre ellas afecciones del sistema nervioso (enfermedades de parkinson y de Alzheimer), trastornos cardiovasculares (cardiopatías isquémicas), aparición de neoplasias, diabetes mellitus, lesiones dermatológicas, daño a la estructura del ADN, procesos de isquemia-reperfusión tisular, enfisema pulmonar y otras afecciones respiratorias, intoxicación por distintas drogas y tóxicos, lesiones oculares (catarata), en el mismo proceso de envejecimiento celular, entre tantas afecciones que hoy día aquejan no sólo al hombre, sino a numerosos animales de la escala evolutiva (Tiskow, 1996) y (de Zwart, 1999) El organismo cuenta con un importante grupo de sustancias que se han denominado antioxidantes celulares, que nos protegen de la acción nociva de los radicales libres. Estos antioxidantes pueden ser clasificados en enzimáticos (caso de la superóxido dismutasa, la catalasa o la glutation peroxidasa) o no enzimáticos (como las vitaminas C y E, el glutatión reducido, entre otros) y los mismos ejercen su acción neutralizando o removiendo estos radicales generados a partir de moléculas de oxígeno, la mismade la cual depende toda la vida aerobia en el planeta.
Dado que no es el objetivo principal de este trabajo entrar en la descripción detallada del mecanismo de acción de los radicales libres, se refiere al distinguido lector al Anexo No. 1 donde encontrará en detalle la bioquímica de estos compuestos y la acción de las sustancias antioxidantes, así como la descripción del proceso de peroxidación lipídica, uno de los principales mecanismos de daño que sufre la célula al ser atacada por las especies radicales derivadas del oxígeno molecular.
B.- ¿Por qué la melatonina como antioxidantecelular? Según la deducción de varios investigadores y con las evidencias experimentales correspondientes, la melatonina ya existía en los antiguos organismos dinoflagelados (Gonyaulax polyedra ) y en al menos dos especies de bacterias. G. polyedra evolucionó hace unos 2,5 millones de años atrás, cuando existían elevadas concentraciones de oxígeno en la atmósfera terrestre. Es posible que la melatonina en estos organismos inferiores, haya aparecido y evolucionado como un agente protector contra el daño causado por el oxígeno y los radicales libres derivados, y que las funciones adicionales como hormona hayan surgido a lo largo de la evolución de las especies. En bacterias y dinoflagelados, los niveles de melatonina son elevados en la noche y bajos en el día; ahora, si la melatonina evolucionó como un agente antioxidante el hecho de por qué la producción de esta indolamina es mayor en la noche, requiere de profundas investigaciones. Hay que recordar que los niveles de producción de radicales libres son mayores en el día, debido a la presencia de la luz solar y los rayos ultravioleta, el estrés, la actividad en general y el mismo metabolismo
bioquímico. Esta regla tampoco se aplica aanimales de actividad nocturna como las ratas (Poeggeler, 1991), (Manchester, 1995), (Tilden, 1997) y (Reiter, 1997) Un hecho importante de la acción de la melatonina como agente neutralizador o removedor de radicales libres es que, no requiere de la presencia de un receptor. Esta acción implica una función muy especial de la hormona en cada célula y tejido del organismo, puesto que este indol tiene una gran permeabilidad a través de las membranas celulares debido a su alta liposolubilidad. Se pueden derivar de los estudios analizados que las propiedades antioxidantes de lamelatonina tiene 2 implicaciones: a) La melatonina es capaz de proteger a las células del estrés oxidativo causado por los radicales libres. Hay suficientes evidencias para confirmarlo. Es cinco veces más potente que el mismo glutatión, pero in vivo , la melatonina es mucho menos abundante en las células y tejidos que los otros antioxidantes naturales conocidos (vitaminaE o C). b) Si la melatonina actúa como removedor de radicales libres in vivo , en cada célula del cuerpo, debería esperarse que la hormona al mismo tiempo interfiera con todos los mecanismos o procesos que conducen a la generación de los radicales libres, esto es, síntesis de prostaglandinas, formación de radicales a partir del óxido nítrico, en la cadena respiratoria mitocondrial, entre otros.
Y he aquí, la primera gran controversia surgida. ¿Puede la melatonina a las concentraciones fisiológicas existentes en el organismo, ser relevante en términos de su capacidad antioxidante, o sólo los niveles farmacológicos empleados hasta ahora en los ensayos experimentales, ofrecer un grado de protección eficiente contra la acción delos radicaleslibres? Algunos autores que apoyan la hipótesis que la melatonina si se comporta como un antioxidante celular, postulan que la misma pudiera actuar mediante un sistema o mecanismo de amplificación, tales como la estimulación por la melatonina de la expresión aumentada de otros sistemas antioxidantes, o que la melatonina actúe como una especie de “gatillo” para la inducción de un amplio complejo de sistemas de defensa celulares contra la acción de los radicales libres (Huether, 1996) y (Reiter, 2001) Un grupo de investigadores se apoyan en el hecho que la melatonina está presente en concentraciones muy importantes a nivel intestinal; en estos órganos se produce en las células enterocromafines y luego liberada al lumen intestinal, y en forma especial cuando su síntesis está aumentada (por un aumento de su precursor el triptófano) también es liberada a la circulación portal y luego penetra la circulación general. No está muy clara aún la presencia de estas grandes cantidades de melatonina en el intestino, pero se ha propuesto que debe jugar un rol crucial como antioxidante endógeno, protegiendo a los intestinos contra la acción de los radicales libres, caso de intoxicaciones, procesos inflamatorios locales o irritaciones locales (Huether, 1992) y (Huether, 1993)
Otros hallazgos experimentales han apoyado la hipótesis propuesta de la acción de la melatonina como antioxidante celular, justamente por su acción en patologías donde está bien definida la acción de los radicales libres. En ratas, el daño hepático inducido por el carcinógeno safrol, se reduce con la administración de melatonina (Tan, 1993). Un efecto similar ha sido observado en linfocitos humanos sometidos a la acción de radiación ionizante in vitro (Vijayalaxmi, 1995). La melatonina se ha descrito, reduce la incidencia de cataratas formadas en ratas recién nacidas después de la administración de drogas que agotan el glutatión celular, y atenúa el nivel de peroxidación lipídica en ratas tratadas con el herbicida paraquat (Huether, 1996). Asimismo, el grado de estrés oxidativo después de la administración de lipopolisacárido bacterial, una potente endotoxina que causa extenso daño tisular, se ve atenuado por el suministro exógeno de melatonina (Sewerynek, 1996) Sin dudas, la propuesta acción antioxidativa de la melatonina merece una discusión a fondo, con un basamento científico contundente que permita esclarecer la controversial situación. Para comprender mejor el razonamiento que apoyan las evidencias a favor y en contra de que la melatonina es un antioxidante celular, hay que abrir un espacio para presentar una explicación acerca de las características y acciones de un antioxidante celular. La oxidación de cualquier compuesto orgánico por el oxígeno molecular (peroxidación lipídica si es un lípido la molécula atacada) comienza por una reacción de iniciación donde se forma un compuesto
radical libre, altamente reactivo, con un electrón desapareado en su orbital más externo, luego de lo cual esta reacción puede propagarse formando otras especies radicales o finalizar gracias a la acción o la presencia de un antioxidante (Halliwell – Gutteridge, 1990) y (Antunes, 1999). Para detalles referirse al Anexo 1, donde encontrará una descripción detallada del mecanismo de la peroxidación lipídica. Los antioxidantes retardan o neutralizan la acción de los radicales libres. Se han dividido a los antioxidantes, en base a su mecanismo bioquímico de acción, en dos grandes grupos según (Ingold, 1968): a) Antioxidantes Preventivos , que reducen la tasa de iniciación de las reacciones por radicales libres. De este tipo hay varias subclases de antioxidantes, según su mecanismo de acción. a.1) Descomponedores de peróxidos, que estequiométrica o catalíticamente descomponen moléculas de hidroperóxidos a productos no radicales, previniendo así la formación de nuevas fuentes de generación de radicales libres queinicien nuevas reacciones
a.2) Desactivadores de iones metálicos, los cuales actúan quelando un electrón de metales redox-reactivos (caso del hierro y el cobre), retardando la capacidad del metal de catalizar la formación de moléculas de hidroperóxidos.
b) Antioxidantes interruptores de la cadena de reacción , que pueden capturar una de las moléculas de la cadena portadora de los radicales para producir productos que no propagarán la reacción o si la continúan lo hagan con baja eficiencia. Estos deben su actividad generalmente a su capacidad de reducir radicales peróxilo a compuestos más estables. Los más efectivos de este grupo son los compuestos fenólicos y las diarilaminas, en particular aquellos con enlaces O-H y N-H relativamente débiles:
ROO? + ArOH
ROOH + ArO?
ROO? +Ar2NH
ROOH + Ar2N?
Antunes en su trabajo de investigación enfatiza que, muchos antioxidantes interruptores de la cadena de reacción deben esta propiedad a su capacidad de atrapar los radicales alquil-peróxilos, que son muy poco reactivos. El hecho que algún compuesto en particular reaccione con radicales libres muy reactivos como el ?OH (hidróxilo), RO? (alcóxilo) o Cl3COO? (triclorometilperóxilo), no significa que la molécula sea un antioxidante del tipo que interrumpa la cadena de reacción (Antunes, 1999). La mayoría de moléculas orgánicas reaccionan muy rápidamente con el radical ? OH y casi también de forma rápida con los radicales RO? y Cl3COO? . La característica esencial de un antioxidante que interrumpe la cadena de reacción es que, debe donar su átomo lábil de hidrógeno a los
radicales alcoxi-peróxilos, mucho más rápido (= 100) de lo que el ROO? puede reaccionar con sus sustratos orgánicos, y que el radical formado no sea capaz de continuar la reacción de auto-oxidación. ¿Qué otras caracterí sticas se pueden agregar a las ya descritas para postular que una molé cula sea un antioxidante relevantein vivo?
Las pruebas que se han efectuado para examinar la posibilidad de que un compuesto dado actúe como antioxidante in vivo en forma directa, pueden claramente demostrar que una acción de este tipo sea improbable. En forma alternativa, pudiera demostrar que una acción antioxidante sea factible en base a que el compuesto muestre una acción protectora a concentraciones fisiológicas, es decir, en el rango presente in vivo . ¿Cómo se puede probar entonces que un compuesto en particular actúa como un antioxidante in vivo?
Las evidencias que se tienen hasta el presente apoyan el papel antioxidante de un compuesto in vivo , siempre que satisfaga estos 2 planteamientos: a) ¿Es el compuesto depletado o agotado bajo condiciones de estrés oxidativo? Esto pudiera no suceder. La vitamina E y ciertos flavonoides pueden ser reciclados por la presencia de ácido ascórbico. b) Si un antioxidante remueve radicales libres, ¿es el antioxidante degradado a productos cuya concentración puede ser medida y demuestra así, un aumento bajo condiciones de estrés oxidativo?
Otros dos puntos, con frecuencia olvidados, deben ser tomados siempre en cuenta a la hora de valorar o catalogar la actividad antioxidante de unamoléculadada: .-Una sustancia debería ser verificada experimentalmente siempre en las concentraciones a la que se haya disponible in vivo.
.-A l ensayar molé culas antioxidantes en particular, se deberí an utilizar radicales libres . biológicamente relevantes Como corolario a los planteamientos efectuados, 4 preguntas son fundamentales de responder cuando se evalúa una sustancia como antioxidante celular: 1.- ¿Sobre qué sustancia actúa para ejercer su papel protector antioxidante? ¿El antioxidante alcanza eseblanco in vivo ? 2.- ¿Cómo protege? Acaso, remueve radicales libres, previene su formación o actúa reparando el daño causado. 3.- Si el antioxidante propuesto actúa en la remoción de radicales libres, ¿pueden los productos derivados del antioxidante por sí mismo, causar daño celular? 4.- ¿Puede el antioxidante causar daño en otros sistemas biológicos? Se deben plantear siempre estudios toxicológicos.
C.- ¿Qué características bioquímicas de la melatonina han permitido postular a esta molécula como antioxidante celular? Los hallazgos hasta ahora presentados sugieren que la hormona remueve y detoxifica selectivamente oxidantes altamente reactivos por lo menos in vitro , donando un electrón a estos compuestos electrofílicos. El radical catión indolil formado a partir de la reacción de transferencia de un electrón y oxidación parcial de la indolamina, es entonces rápidamente convertida a kinuramina en presencia del radical anión superóxido. Como se aprecia, los estudios han sido efectuados la gran mayoría de ellos in vitro , lo que a juicio de muchos autores no hace de la melatonina una candidata ideal para ser postulada como antioxidante celular. Una ventaja de la melatonina sobre otros compuestos antioxidantes como la vitamina C, es que la misma tiene la capacidad de atravesar las membranas celulares con mucha facilidad (liposuble) y muestra además, cierta solubilidad acuosa, propiedad que no posee la vitamina E. Siendo una molécula anfifílica, la melatonina puede proteger contra el daño inducido por radicales libres, limitando los mismos a nivel de membrana celular, proteínas citosólicas y el propio ADN nuclear. Otro punto de interés que se ha descrito con la melatonina, es que ella puede ser reciclada tanto por el ácido ascórbico como por el ácido úrico. Esto refuerza una de las interrogantes arriba planteadas: su eficiencia (Reiter, 2000) y(Reiter, 2001)
Ya se ha mencionado en varias oportunidades que, la melatonina tiene la capacidad de remover radicales libres del tipo ? OH con un alto grado de eficiencia. También se ha evidenciado que es capaz de neutralizar una variedad de compuestos intermediarios derivados de los radicales, reduciendo así la destrucción macromolecular. La melatonina puede neutralizar moléculas de H2O2, de oxígeno singlete (1O2), de óxido nítrico (NO? ), aniones peroxinitritos (ONOO?) y sus metabolitos. Adicionalmente, se ha identificado que la melatonina actúa en forma sinérgica con otros antioxidantes en la destoxificación de radicales libres. Esto apoya la idea que la hormona pudiera actuar como un removedor directo e indirecto de radicales libres (Yi-Zang, 1998) y (Reiter, 2000) En 1998 se identificó un producto intermediario de la interacción de la melatonina con dos radicales hidrófilos: la 3-OH-melatonina cíclica. La misma puede ser detectada en orina y su concentración varía circadianamente y con el status oxidativo del organismo. Se ha considerado así que, la 3-OH-melatonina (3-OHM) en orina puede ser considerado como un biomarcador de la generación de radicales .OH in vivo, y pudiera ser un indicador clínico útil del status oxidante de un individuo en presencia de enfermedades relacionadas con la producción de radicales libres (Tan, 1998) Otra evidencia general a favor de la melatonina es que, por lo menos a dosis farmacológicas empleadas en los ensayos, la hormona tiene la capacidad de incrementar los niveles de ARNm o las actividades de las
principales enzimas antioxidantes (superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa). Otros datos apoyan el hecho que, el incremento nocturno de la hormona está correlacionado con un aumento en los niveles de enzimas antioxidativas. La importancia relativa de estas acciones indirectas de la melatonina están sujetas hoy día aintensainvestigación (Reiter, 2000)
D.- Acciones protectoras de la melatonina en su papel de antioxidantea nivel de órganos y tejidos corporales. 1.- Sistema nervioso central. Este sistema en particular es muy susceptible a daño tisular por una variedad amplia de agentes biológicos. Este hecho se complica aún más debido a que las neuronas no regeneran o tienen poca capacidad de hacerlo in vivo , conduciendo a lo largo de la vida a una significativa pérdida en el número de las mismas. Esta reducción en el número neuronal y en las interconexiones sinápticas, eventualmente compromete el funcionamiento integral del sistema nervioso. De todos los órganos y sistemas, éste es uno de los más susceptibles al ataque causado por los radicales libres; las razones para ello son diversas. El cerebro, aunque constituye sólo un 2% del peso corporal total en el humano, consume una gran cantidad de oxígeno inhalado (un 20%). Dado que los subproductos derivados del oxígeno son tóxicos, no es sorprendente que el tejido neural pueda ser dañado a una relativa mayor tasa que otros órganos. El cerebro también posee regiones con altas concentraciones de hierro y vitamina C, además de importantes cantidades de ácidos grasos poli-insaturados que son proclives a la peroxidación.
(Halliwell – Guterridge, 1990) Considerando lo anterior, se debería esperar que el cerebro contase con un complemento adicional de antioxidantes; pero este no parece ser el caso, y más bien tiene una baja capacidad para resistir agresiones oxidativas. Un hecho interesante es que se ha descrito poca o ninguna reactividad directa de la melatonina con el H2O2. Las dos enzimas implicadas en la remoción de H2O2 son la catalasa y la glutatión peroxidasa. La actividad catalasa dentro del cerebro se considera tiene mínima influencia como mecanismo antioxidante a causa de su baja actividad tisular. La glutatión peroxidasa, la cual requiere de selenio como cofactor, juegaun rol antioxidante muy importante a causa de que remueve moléculas de H2O2 cuando oxida glutatión reducido (GSH) a su forma GSSG (Reiter, 1998). Las pruebas son claras en el sentido que la actividad de la glutatión peroxidasa es estimulada por la melatonina administrada exógenamente, no sólo en cerebro sino en otros órganos. La actividad glutatión reductasa también es estimulada por melatonina, lo que permite regenerar GSH. De igual forma, la enzima glucosa 6-fosfato dehidrogenasa se ve estimulada por la acción de la melatonina. De esta forma, la hormona estimula la actividad de tres enzimas que intervienen en la remoción de H2O2 de las células convirtiendo la molécula en productos menos tóxicos, protegiendo las células neuronales del daño oxidativo (Reiter, 1998) y (Reiter, 2001) La melatonina también es efectiva en reducir los niveles de peroxidación lipídica cerebral. Un agente que con frecuencia se ha utilizado para inducir la peroxidación de ácidos grasos poli-insaturados en cerebro, es
el kainato (ácido kainico). Esta sustancia es un análogo no degradable del aminoácido excitatorio glutamato, muy tóxico a ciertas estructuras neurales, tales como hipocampo y corteza frontal. Estudios recientes han puntualizado que la melatonina reduce el daño inducido por el kainato en el ADN de células piramidales del hipocampo. Igual efecto se observa cuando homogenizados de rebanadas de corteza cerebral son incubadas con kainato; en este caso, los niveles de malondialdehído y 4-hidroxialquenales (4-HDA), productos de la lipo-peroxidación, se incrementaron drásticamente, pero en presencia de melatonina (0,1 a 4 mM), y de manera dosis-dependiente, se redujeron los niveles de estos subproductos en regiones como corteza cerebral, hipocampo, cuerpo estriado (Reiter, 1997) El estudio más complejo realizado acerca del uso potencial de la melatonina como antioxidante en la Enfermedad de Parkinson, proviene de Miller y colaboradores. La pérdida de neuronas dopaminérgicas nigroestriadas que ocurre en esta patología, envuelve la acción de los radicales libres citotóxicos, derivados de la auto-oxidación de la dopamina, como la dopamina-3,4-dihidro-fenetilamina. Utilizando la capacidad de absorbancia de radicales libres derivados del oxígeno, Miller halló que la melatonina contrarresta el incremento en la oxidación de la proteína fluorescente ß-ficoeritrina, inducida por la acción de la dopamina o su precursor L-Dopa (3,4-hidroxifenilalanina). La disminución de la oxidación de la ß-ficoeritrina fue tomada como evidencia clara que la melatonina es capaz de remover radicales libres generados durante la auto-oxidación de la
dopamina, y que la hormona puede ser un agente protector contra la degeneración celular dopaminérgica(Miller, 1996) La retina ocular de vertebrados posee una alta tasa de consumo de oxígeno, unas 7 veces más que cualquier otro tejido. Este elevado consumo y el alto número de mitocondrias presentes en las células retinianas, pueden conducir en un momento dado a la producción de cantidades importantes de radicales libres; además, las membranas celulares de fotorreceptores, células fundamentales de la retina, son ricas en ácidos grasos poliinsaturados y la exposición de este tejido a la luz comúnmente conduce a su foto-oxidación. Estas características de la retina la hacen muy vulnerable al daño por auto-oxidación. Aunque la retina posee mecanismos de defensa antioxidantes en cantidades importantes, en relación a otros tejidos, cualquier desbalance de éstos puede, y de hecho ocurre con el envejecimiento, afectar severamente al tejido y causar lesiones a veces irreversibles. Hay que recordar también que la retina es otro de los tejidos que produce cantidades importantes de melatonina. Cuando se utilizaron homogenizados de retina de ratas albinas, las cuales se incubaron a 37°C, un aumento progresivo en las concentraciones de MDA y 4-HDA fue observado. Al adicionar melatonina a la mezcla de reacción (0,1 a 2 mM), el aumento en los niveles de peróxidos lipídicos fue significativamente disminuido en una forma dependiente de la concentración de la hormona. Los autores propusieron que la melatonina actuaba removiendo radicales libres o regenerando biomoléculas deficientes en electrones, donándoles un electrón a los mismos (Dun-Chen, 1995)
Por otro lado, en ratas recién nacidas tratadas con 1-Butionina-S-RSulfoximina (BSO), un inhibidor de la producción de glutatión, el suministro de melatonina previno la formación de cataratas oculares, demostrándose que la melatonina tiene la capacidad de reducir el daño por estrés oxidativo protegiendo no sólo a los lípidos, sino también a las proteínas (Dun-Chen, 1995)
2.-Sistema gastrointestinal. En vesícula biliar, la melatonina funciona como inhibidor en la producción de cálculos biliares, proceso que inclusive se piensa es mediado por radicales libres (Shiesh, 2000). Otros interesantes estudios han demostrado los efectos protectores de la melatonina sobre la toxicidad oxidativa sobre el hígado. Hay experimentos muy claros que involucran a los radicales libres en el daño que se produce al tejido hepático en situaciones de isquemia-reperfusión. Este tipo de lesión se ve disminuido cuando el tejido es previamente perfundido con melatonina (Sewrynek, 1996). En un modelo experimental utilizando ratas, a las cuales se les indujo isquemia por 40 minutos, seguido de 60 minutos de reperfusión, marcados cambios oxidativos fueron observados en el tejido, incluyendo niveles elevados de malondialdehído (MDA) y 4-HDA, incrementada infiltración de leucocitos, disminución de los niveles de glutatión reducido y aumentados de glutatión oxidado, con disminución de la actividad de la enzima glutatión reductasa. Para cada uno de los parámetros señalados, los cambios fueron contrarrestados significativamente por la inyección de melatonina (10 mg/ kg. peso), unos 15
minutos previos a la isquemia, y otra dosis al momento de reperfundir el tejido (Sewrynek, 1996) A nivel de intestino grueso, al inducir colitis en ratones por el suministro de sulfato de sodio-dextrano (SSD) disuelta en el agua de beber, la inyección diaria de melatonina redujo la severidad de las lesiones inflamatorias del colon, evaluada por la presencia de diarrea, sangre oculta en heces y lesiones de la mucosa intestinal. El SSD induce el sobrecrecimiento de Escherichia coli en intestino, lo cual produce el lipopolisacárido bacteriano, la endotoxina causante de las lesiones (Pentney, 1995). Otros ensayos han demostrado que la melatonina estimula la actividad de la enzima glucosa 6-fosfato-dehidrogenasa hepática en ratones, incrementando la biodisponibilidad de NADPH y la conversión de GSSG a GSH mediante la glutatión reductasa(Pierrefiche, 1995) En el aparte anterior, ya se describió que el intestino delgado produce concentraciones importantes de melatonina, lo cual ha sido indicativo de la probable acción antioxidante deesta hormona aesenivel. Otros estudios han demostrado que la melatonina minimiza los efectos diabéticos causados por aloxano a nivel de páncreas endocrino. Al compararla con el conocido antioxidante hidroxitolueno butilado (BHT), se evidenció que éste tenía mayor propiedad antioxidante que la melatonina. Es posible en este caso, que la hormona combine una actividad antioxidante intrínseca in vivo con aquella de su metabolito hepático, la 6-OH-melatonina. Esto último basado en la hipótesis de que la vida media corta de la
melatonina en el organismo, después de su administración intraperitoneal (20 a 30 minutos), se corresponde al período de latencia observado entre la inyección de la hormona y la de aloxano (Pierrefiche, 1993)
3.-Piel. En trabajos recientes utilizando un test para verificar la capacidad de la melatonina para modificar la respuesta eritematosa de la piel humana expuesta a exposición a luz ultravioleta (UV), Bangha y su equipo reportaron una reducción en el grado de enrojecimiento (estimado por cromometría e inspección visual) en aquellos sujetos quienes utilizaron melatonina aplicada tópicamente en un gel no coloidal. Las concentraciones utilizadas de melatonina fueron de 0.05, 0.1 y 0.5 %. Los autores proponen una acción removedora de radicales libres generados por acción de la luz UV a nivel de piel (Bangha, 1996) 4.- Otras acciones antioxidantes a nivel celular. Relativamente se tienen pocos datos acerca de la acción protectora de la melatonina a proteínas celulares, las cuales son susceptibles de daño oxidativo. Experimentos efectuados tanto in vivo como in vitro , han demostrado que las proteínas son protegidas de la acción de los radicales libres cuando en el ensayo se encuentra presente la melatonina. Esto es compatible con la noción que la hormona también previene la disminución en las actividades de enzimas antioxidativas en los casos de estrés oxidativo (Reiter, 2000) Autores como (Tan, 1993) reportan protección al ADN nuclear por parte de la melatonina, cuando se administra a los animales experimentales
carcinógenos tipo safrol. La fragmentación del ADN inducida con lipopolisacárido bacterial (LPS), se reduce al ser suministrada la melatonina en dosis farmacológicas, indicado por el recuento de células sanguíneas periféricas y médula ósea. Se ha descrito que el daño oxidativo a alguna base en el ADN nuclear es usualmente transferido a la guanina, puesto que su potencial de oxidación es relativamente bajo en relación a las otras bases del ADN. La melatonina es capaz de reparar el radical guanosina formado (G? ), presumiblemente vía de la transferencia de un electrón y con un alto grado de eficiencia. Se ha propuesto que la melatonina actuaría como molécula reparadora del ADN en horas nocturnas, cuando sus niveles son más altos, y cuando las concentraciones nucleares de la hormona son mayores referentes a los niveles hallados en sangre u otros compartimientos subcelulares (Prior, 1995) y(Reiter, 2000) Otros estudios muy interesantes, han mostrado que la adición de FeCl3, ADP y NaDPH decrecen la fluidez de la membrana microsomal en hígado de ratas, cuantificado por el índice de polarización y de anisotropía, e incremento en los niveles de MDA y 4-HDA. Existe una relación inversa entre fluidez de membrana y los parámetros de polarización y anisotropía. La pre-incubación de microsomas hepáticos con melatonina a la concentración de 300 µM o superior, incrementó significativamente la fluidez de esta membrana subcelular y redujo los niveles de MDA y 4-HDA en comparación a las muestras que no contenían la hormona pineal. A concentraciones de 3 mM de melatonina se previno por completo la rigidez
de la membrana. De esta manera, la melatonina se ha postulado ejerce un efecto estabilizante sobre lamembrana celular (Poeggeler, 1994) Otras investigaciones utilizando tamoxifeno, una droga antiestrogénica utilizada en el tratamiento del cáncer de mama, en combinación con la melatonina (150-200 µM), fueron capaces de reducir los niveles de peroxidación lipídica y la rigidez de la membrana celular inducida por especies radicales libres, en microsomas hepáticos de ratas SpragueDawley. El modo se acción que se propuso para la melatonina es que, aumentaría la actividad o respuesta del tamoxifeno, previniendo la rigidez de la membrana. Hecho importante que se comprobó también es que, cuando microsomas hepáticos fueron pre-incubados con la melatonina en ausencia de agentes inductores de estrés oxidativo, aún a elevadas concentraciones de la hormona, no alteró la fluidez de la membrana en forma significativa. El tamoxifeno se ha reportado, causa disminución en la fluidez en liposomas, presumiblemente duplicando el efecto rigidificante del colesterol. Esto también apoya la idea que, la adición de la hormona a la solución con tamoxifeno retornó la fluidez de la membrana a los niveles basales, quizás los óptimos para este tipo de membrana (García, 1997) y (García, 1998)
Con las evidencias presentadas, los investigadores que han propuesto que la melatonina puede actuar como un agente antioxidante celular, y los que critican tal punto de vista, se apoyan sobre la baseque: .-L a melatonina es má s un antioxidante de tipo preventivo, de la subclase
. Por lo menos, los datos experimentales in vitro desactivadora de metales iónicos apuntan a que es cierto lo anterior para sistemas homogéneos y dispersiones lipídicas-acuosas heterogéneas. Es probable que la melatonina forme un enlace coordinado simple con el ion metálico; este enlace lo haría con el átomo de hidrógeno del anillo nitrogenado de la melatonina. Por ello, algunos autores la han considerado un antioxidante de menor potencia que del tipo preventivo, queladores de metales iónicos (Antunes, 1999) .-Se ha reportado tambié n que la melatonina pudiera actuar en forma sinergí stica , tales como la vitamina C, con otros compuestos atrapadores de radicales libres vitamina E y glutatión en un sistema que tenga un alto contenido de H2O2 y Fe+2. Los antioxidantes que funcionan por el mismo mecanismo de remoción de radicales libres, tienen un efecto aditivo simple cuando son usados en conjunto en un sistema determinado. Una verdadera acción sinérgica entre dos antioxidantes requeriría que ellos funcionen por distintos mecanismos, lo cual explicaría que la melatonina no clasifique como atrapador de radicales libres en este sistema. Se propone más bien que se comporte como un retardador de los sistemas de auto-oxidación en presencia de iones metálicos.
.-Otros autores han propuesto que es improbable que esta supuesta acción retardadora de los sistemas de auto-oxidación, envuelva la transferencia de electrones desde la melatonina a los radicales peróxilo a causa de que el proceso de retardación fue observado, no sólo en dispersiones acuosas de lípidos (donde es favorecido el proceso), sino también en soluciones homogéneas (donde es más bien desfavorecido) (Antunes, 1999) .-Es la opinión de la mayoría de investigadores que propugnan que la melatonina no puede ser considerada un antioxidante celular que, las concentraciones de melatonina utilizadas en todos los estudios sobre propiedades antioxidantes son farmacológicas, mucho más elevadas que las halladas en el plasma sanguíneo y cualquier otro tejido (Maestroni, 1996) y (Antunes, 1999) .-Estudios bioquímicos realizados con los precursores de la melatonina, esto es, triptófano y serotonina, así como un número importante de sus derivados oxidativos, han establecido que poseen una importante actividad antioxidativa, algunos más que la propia melatonina. Esta actividad esta basada en la estructura indólica de las moléculas, las cuales también atrapan radicales libres, dando lugar a estructuras con resonancia estabilizada sobre el anillo pirrólico y no ocasionando éstos, efectos dañinos a nivel celular. Concluyen los autores que la melatonina no pareciera ser un antioxidante de relevancia en comparación con la actividad mayor que presenta su precursor indólico la serotonina, o el principal metabolito hepático la 6-OH-melatonina, cuyas estructuras difieren de la
hormona por sólo un grupo hidróxilo en la posición seis. La 6-OHmelatonina puede transferir con mayor facilidad el hidrógeno fenóxilo de su estructura. Otros autores exponen el hecho que el grupo hidróxilo fenólico estaría intra-molecularmente ligado al grupo 5-metoxi, y los fenoles con tales enlaces de hidrógeno tienen aumentadas las entalpías de disociación del enlace O-H y así, reducidas las reactividades hacia los compuestos radicales libres. Es de interés señalar que, aquellas estructuras que poseen grupos hidróxilos en su conformación química, incrementan su propiedad antioxidante en forma significativa, mientras la deshidrogenación produce el efecto opuesto (Pierrefiche, 1993) y (Fowler, 2003) .-Se ha mencionado que la melatonina no posee dentro de su estructura, un enlace débil O-H o N-H capaz de donar un átomo de hidrógeno a un radical lipídico tipo peróxilo. .-Muchos autores objetan que la melatonina pueda ser una molécula removedora o atrapadora de radicales libres, pero la química brinda sorpresas todos los días y la melatonina pudiera ser considerada próximamente como un nuevo tipo de antioxidante, no clasificado dentro de los esquemas bioquímicos actuales.
Con la intención de contribuir al esclarecimiento de las controversias surgidas respecto al papel antioxidante de la melatonina, el autor del presente trabajo ha querido exponer en el mismo, resultados experimentales que ha obtenido a lo largo de varios meses de estudio acerca del papel de la melatonina como posible agente protector contra la acción de los radicales libres generados en condiciones patológicas o experimentales. En primer lugar, se presentarán los resultados obtenidos en una serie de ensayos realizados en el Decanato de Medicina de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado” de Barquisimeto a principios del año 2004, estudiando el posible papel protector de la melatonina contra la acción de radicales libres generados en la diabetes mellitus. Posteriormente, se expondrán los resultados obtenidos en una serie de experimentos realizados en el Laboratorio de Bioenergética Celular del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas en Altos de Pipe, a finales del año 2004 utilizando como modelo biológico glóbulos rojos irradiados con luz ultravioleta, en los cuales se valoró el efecto protector de la melatonina.
E.- Evaluación del estrés oxidativo en ratas con diabetes mellitus tipo I inducida por estreptozotocina: posible papel protector de la melatonina
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Reportes efectuados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 1999, han establecido que la diabetes mellitus es una de las enfermedades metabólicas crónicas de mayor tendencia de aparición de nuevos casos clínicos en los seres humanos, con una prevalencia actual de 5 a 10% entre la población mundial, y a juicio de un grupo notable de investigadores proponen que en la misma, los radicales libres derivados del oxígeno juegan un papel crucial como subproductos nocivos a los tejidos afectados. Dadala importancia de lo señalado anteriormente, se propuso como objetivo central el analizar el papel que juegan estas moléculas como agentes inductores del estrés oxidativo evaluando además, el posible papel protector que pudiera jugar la hormona melatonina como agente antioxidante. Los objetivos específicos planteados fueron los siguientes: .-Evaluación de algunos parámetros fisiológicos como peso corporal y volumen excretado deorina en 24 horas en ratas con diabetes mellitus tipo I .-Evaluación de los niveles deglicemia en ratas con diabetes mellitus tipo I. .-Determinación de niveles de peroxidación lipídica en rebanadas de corteza de riñones de ratacon diabetes mellitus tipo I.
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Trabajo experimental desarrollado por el autor en la Unidad de Investigación en Fisiología. Decanato de Medicina de la UCLA. Barquisimeto. 2004
.-Identificación del posible efecto protector de la melatonina como agente antioxidante en este tipo de afección. En la diabetes mellitus, la hiperglicemia constituye la principal manifestación de enfermedad y está implicada en la aparición de las diversas complicaciones que se presentan asociadas con la misma, entre ellas, un grupo heterogéneo de disfunciones clínicas que afectan el sistema nervioso, el sistema cardiovascular, el riñón, la retina, el cristalino del ojo y la propia piel. Los seres humanos diabéticos tienen 25 veces mayor probabilidad de contraer ceguera, 20 veces más riesgo de amputaciones y de 6 a 10 veces más riesgo de padecer enfermedades de las arterias coronarias que los sujetos sanos. Esta situación de desequilibrio comienza en una etapa temprana de la enfermedad, tal como se ha demostrado en varios estudios. Estos desequilibrios por lo general comienzan con trastornos bioquímicos a nivel celular. En los recientes estudios de las causas implicadas en la aparición de la diabetes mellitus y la aparición de sus complicaciones, se ha demostrado que altos valores de glucosa en sangre conducen a la aparición del estrés oxidativo. Las teorías que vinculan el estrés oxidativo con la diabetes mellitus plantean que la hiperglicemia per se es esencial en el desarrollo de las complicaciones derivadas de esta enfermedad. Una de tales teorías se fundamenta en el hecho de que la glucosa en solución acuosa es capaz de autooxidarse a ciertos compuestos llamados enedioles, en presencia de metales de transición como el hierro (Fe+3) reduciéndolo a (Fe+2), a través
de la denominada Reacción de Fenton, y descompone el peróxido de hidrógeno (H 2O2) generando el radical libre inestable hidróxilo (OH? ), que poseealto poder oxidante (Clapes, 2001), (Nuñez, 2001) y(Kiersztan, 2004) Por otro lado, los productos finales de la glicosilación de proteínas (PFG) también generan radicales libres de oxígeno y éstos, con su elevado poder oxidante afectan las membranas celulares y lipoproteínas circulantes, las cuales contienen productos de peroxidación altamente dañinos a las células. Estos productos de la glicosilación de proteínas aumentan el estrés oxidativo, afectando funciones biológicas de suma importancia, necesarias para mantener la integridad de los tejidos vascular, nervioso, renal, entre otros (Nuñe, 2001). El estrés oxidativo pudiera ser una vía común que relacione los mecanismos fisiopatológicos en apariencia diversos, pero que convergen en la explicación del papel que desempeña el incremento en los radicales libres y los productos de la peroxidación lipídica en la explicación de la fisiopatología dela diabetes mellitus y sus complicaciones. Para el desarrollo de la investigación se seleccionaron por azar simple, un total de 24 ratas adultas blancas, hembras, de la cepa Sprague-Dawley, suministradas por el Bioterio Central de la Universidad Centroccidental “Lisandro Alvarado”, las cuales fueron divididas en dos grandes grupos (cada sub-grupo conformado por 6 animales) (n=6): Grupo Control :
.-Animales Control (C) (n=6) .-Animales Control inyectados con melatonina (C+M) (n=6)
Grupo Experimental :
.-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I sin suministro demelatonina(D-M) (n=6) .-Animales Experimentales con diabetes mellitus tipo I con suministro de melatonina(D+M) (n=6) Los animales una vez recibidos del Bioterio Central, fueron colocados en forma individual en jaulas metabólicas (los cuatro subgrupos), en el Bioterio que funciona en las instalaciones del Decanato de Medicina, y dejados los mismos por una semana para su adaptación a las condiciones ambientales de este lugar; recibieron alimentación y aguaad libitum. A la semana, todos los animales fueron pesados para obtener los pesos corporales iniciales de referencia y medidos los volúmenes de orina excretados en 24 horas. De igual manera, se les tomó una muestra de sangre (obtenida de la punta de la cola de cada rata) para medirles los niveles de glucosa basal, como índice de referencia. Al décimo día, a los animales de los grupos Control (C+M) y Experimentales (diabetes mellitus con suministro de melatonina) (D+M), se les comenzó a suministrar vía intraperitoneal (cavidad abdominal), una dosis de 4 mg/animal de la hormona melatonina (suministrada por la empresa Sigma Chemical) diluida en solución fisiológica, hasta el final de los ensayos experimentales. A partir del día once, a los doce animales que se les induciría diabetes mellitus tipo I (grupos D-M y D+M), se les inyectó vía intra-peritoneal, una dosis de 40 mg/ Kg peso corporal de la droga Streptozotocina (proporcionada por
Sigma Chemical) por 5 día días consecuti consecutivos vos para inducir inducir la la di diabetes betes mellitus tipo tipo I. I . Cum Cumpli plido el tra tratam tamiento con con Streptozotoci Streptozotocina na,, se tomó una nueva muestr uestra a de sa sangre ngre de las cola colas de las ratas para verif verificar car los los nivel nivele es de gli glicemia y de es esta ta manera, com comprob proba ar que la droga droga indujo ndujo la la dia diabetes en los anim nimales experim xperimenta ntales es.. Cumplidos los protocolos anteriores, a todos los animales (grupos contr control oles es y experim xperimenta ntales es)) desde desde el día día 15 se les comenzó a medir dir cada cada tre tres día días y hasta hasta el final nal de los los ensa ensayos: yos: .-Peso corporal .-V .-Volum olumen de ori orina excretado en 24 24 horas .-N .-Nivel veles de gl glucosaen sangre .-Niveles de peroxidación lipídica renal al final de los experimentos. De acue acuerdo a los re resultados obteni obtenidos dos y la apl apliicaci cación ón de los los aná anállisis estadísti stadístico coss (cá (cállculo culo de la media dia aritmética tica y la desvi desvia ación ción estándar, estándar, y par para la determinación de la significancia estadística el test de Análisis de Varianza de una vía vía –A –ANOVA-) A-) se diseña diseñaron cuadro cuadross y gráficos, ráficos, los los cuales mue muestran los re resultados sultados par para cada cada una de las dim dimensiones nsiones anal nalizadas en en el la labora borator torio, esto es, pe peso cor corpora poral, vol volum ume en de ori orina excre xcretado en en 24 hor horas y niveles niveles de glice glicem mia y de peroxida peroxidaci ción ón lilipídi pídica ca en re rebana banada dass de corteza corteza renal nal, tanto nto en las ra ratas tas contr control ole es como experi experim mentales. ntales. A continua continuación ción se prese presentan los los resultados obtenidos:
? Peso de los Ani Animales: par para la determin determina ación ción de los los pesos de los anim nimales contr controle oles y experim xperimentale ntales, se util utilizó una bal balanza especi specia al pa para pesa pesaje de anim animales de experimentación ntación (Oha (Ohaus us Instrum nstrument) Como se puede puede observar var en el Gráfi ráfico y Cuadro núme número 1 que, mientra mientras los ani anim males de los grupo gruposs control control (C) (C) y los los inyecta inyectados dos con me melatoni tonina (C+ (C+M) experi xperim mentaron ligeras varia riaciones ciones de peso peso pero, con tendencia ncia al incre ncremento del mismo, los anim nimales experim xperimentale ntales inyectados nyectados con Estreptozot streptozotoci ocina na y convertidos rtidos en en dia diabéti béticos cos tipo I, I , tra tratados tados o no con la horm hormona melatoni tonina na,, experi xperim mentaron una tende tendenci ncia a si signif nificati cativa va a disminuir su peso hasta en un 20% respecto a los animales controles. El hecho hecho que los animales contro controlles que solo solo re recibi cibie eron ron melatonina tonina incre ncreménta ntaran su peso, pudi pudiera expli xplicarse debido debido a que esta hor hormona ona es inductor nductora a del sueño, lo lo que se evide videnci ncia aba cuando cuando los ani anim males per permanecía necían en su ma mayor part parte e en re reposo, con poco poco ejercici rcicio o dentro de la jaula ula, alimentándose ad lilibbitum con la res especti pectiva va ganancia nancia de peso.
Gráfico No. 1 Parámetro Fisiológico Analizado: Peso (g)
350
Control (C)
300
Control + Melatonina (C+M)
250
Diabéticas - Melatonina (D-M)
) g ( 200 o s e 150 P
Diabéticas + Melatonina (D+M)
100 50 0
C
C+M
D-M
D+M
Grupo
Cuadro No. No. 1. Pes Pesos de los anima nimales control controles es y experime xperimentales (en gramos) Grupo Peso delos animales (g) C 276 ± 8 C +M 308± 8* D–M 264 ± 12 D+ M 258 258 ± 25 Los valor valores re repre prese sentan ntan el el promedio dio ± D.E D.E de 6 determi terminaci naciones ones (* P <0.0001 res respecto pecto a C) C)
Los animales experimentales diabéticos tipo I, tratados o no con melatonina, disminuyeron sus pesos progresiva y significativamente en referencia a los controles (P < 0.0001) desde el primer día de la inyección de la droga estreptozotocina hasta el final de la fase experimental, indicando esto que la melatonina no influyó sobre la conservación del peso de los animales diabéticos. Se debe recordar que en la diabetes mellitus el metabolismo proteico, lipídico y glucido se halla muy alterado lo que explica la pérdida significativa de peso en estos animales.
? Volumen de Orina Excretado: la disminución de los volúmenes de orina excretado en los animales controles y experimentales se realizó basándose en la medición del volumen de orina producido por cada animal en 24 horas. Nótese en el Gráfico y Cuadro número 2, quelos volúmenes deorina excretados en 24 horas por los animales diabéticos, tratados o no con melatonina, fueron significativamente superiores al de los animales controles (P< 0.002). Esto se explica por el hecho que los sujetos diabéticos presentan lo que se denomina poliuria, es decir excesiva producción y eliminación de orina, motivado a que los niveles de glucosa circulantes en sangre son muy elevados, y cuando esta glucosa pasa por los riñones para ser filtrada y reabsorbida, el exceso de glucosa es excretado por orina y debido a que por razones osmóticas la excreción excesiva de glucosa arrastra agua consigo, se produce la eliminación abundante de orina. Este aumento en la excreción de líquido coincidió con incrementos importantes
en la ingesta de líquidos por estos animales experimentales (datos no cuantificados)
? Niveles de Glicemia: como se desprende del análisis del Gráfico y Cuadro número 3, los animales diabéticos que no recibieron la hormona melatonina presentaron cifras elevadas de glucosa circulante en sangre, pero si se comparan con los animales que si recibieron la hormona, se puede apreciar que este ultimo grupo, aunque presentó cifras elevadas de glicemia, las mismas fueron significativamente menores respecto a los no tratados con melatonina (P< 0.003), lo que indica claramente que la melatonina ejerce algún efecto protector disminuyendo los niveles de glucosa en sangre en animales diabéticos. ? Niveles de Peroxidación Lipídica en rebanadas de corteza de riñones de rata controles y experimentales: Como se puede observar en la Tabla No. IV, los niveles de peroxidación lipídica, cuantificados como Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitúrico (SRAT) (ver Anexo 2 para detalles del procedimiento experimental), se incrementaron en forma significativa en aproximadamente un 25% en homogenizados totales de rebanadas de corteza riñones de ratas diabéticas no tratadas con melatonina (D-M), respecto a los riñones control (C) o los tratados con la hormona (C+M). Es de destacar que, en los homogenizados de corteza renal de ratas diabéticas y tratadas con melatonina (D+M), los niveles de peroxidación lipídica, aunque fueron un poco más elevados respecto a los controles,
Gráfico No. 2 Parámetro Fisiológico Analizado: Volumen de orina (ml)
120 ) l m ( 105
Control Control + Melatonina
a 90 n i r O 75 e 60 d n 45 e m 30 u l o 15 V
Diabéticas sin Melatonina Diabéticas con Melatonina
0 C
C+M
D-M
D+M
Grupo
Cuadro No. 2. Volúmenes de orina excretados en 24 horas de los animales controles y experimentales(en mililitros) Grupo Volúmen deOrina(ml) C 2.02 ± 0.71 C +M 2.70 ± 0.73 D–M 83± 62* D+ M 79± 60* Los valores representan el promedio ± D.E de 6determinaciones (* P < 0.002respecto a C y C+M)
Gráfico No. 3 Parámetro Bioquímico Analizado: Nivel de Glicemia (mg/dl)
) l 500 d / g m ( 400
Control Control + Melatonina
a i m300 e c i l G200 e d s 100 e l e v i N 0
Diabéticas sin Melatonina Diabéticas con Melatonina
C
C+M
D-M
D+M
Grupo
Cuadro No. 3. Niveles de Glicemia de animales controles y experimentales (mg/ dl) Grupo Nivel deGlicemia (mg/ dl) C 80 ± 6.5 C +M 76 ± 6.8 D–M 393 ± 49* D+ M 276 ± 86* Los valores representan el promedio ± D.E de6 determinaciones (* P < 0.003 respecto a C y C+M)
TABLA IV Niveles deperoxidación lipídica en rebanadas decortezade riñones de animales controles y experimentales (nmoles MDA/ mg prot.) Grupo C C +M D–M D+ M
Nivel dePeroxidación Lipídica (nmol MDA/ mg prot) 5.59 ± 0,60 4,90 ± 0.45 * 12,45 ± 2.40 £ 7,75 ± 0.36 ¥
Los valores representan el promedio ± D.E de 3determinaciones
£ P < 0.02 respecto a(C) ¥ P < 0.01 respecto a(C) * P < n.s. respecto a(C)
fuer ueron signif signifiicati cativa vam mente menore nores que los de riñone ñones de ratas dia diabética béticass no tra tratadas con la la melatoni tonina na.. En base base a los re resultados sultados obte obtenidos nidos en este tra trabaj bajo, se pudo evidenci videncia ar que la hor hormona ona melatoni tonina na suministr nistra ada a los anim animales dia diabéticos aunque unque no logró prevenir la disminución de peso y el incremento de los volúmenes urina urinarrios en los mismos, mismos, si se apreció que la melatoni tonina logró evita evitar la elevación vación drá drástica stica en los los ni nivele veles de glucosa en en sangre sangre en en anim animales que recibie recibieron ron la la hormona hormona en re referencia rencia a aquellos que no fue fuero ron n tra tratados tados con la misma (com (comparar parar re resulta sultados en el gráf gráfico y cuadr cuadro o número 3). De igual maner nera, la melatoni tonina na fue fue capa capazz de de pre preveni venirr el incre ncremento sustanci sustancia al en los los nive nivelles de pero peroxi xida daci ción ón lipídi pídica ca en ri riñones de rata di diabéti béticas cas (homog (homoge eniza nizado do de corte corteza renal) re respecto specto a las no tra tratadas con esta hormona produci producida da por la glándula pineal. En los animales control inclusive, la melatonina no tuvo efectos ctos secundari cundarios os re reflejados, bie bien sea sea en la la elevaci vación ón o en la la dism disminució nución de los niveles de peróxidos lipídicos, por lo menos a estas dosis farmacológicas cológicas util utiliza zada dass en el el presente tra trabaj bajo. De es esta ta manera, se evidenci evidencia a que la melatoni tonina na pudiera pudiera es estar tar ejerciendo un efecto protector o antioxidante en los animales que recibieron la estr estre eptozotoci ptozotocina na y se se convi convirt rtiieron ron en en dia diabéti béticos, cos, pre previni vinie endo la la elevaci vación ón sustanci sustancia al en los los niveles niveles de glucosa en en sangre sangre y aminora norando el daño daño causa causado por la oxidación de esta sustancia cuando circula en elevados niveles en el orga organism nismo. o. Hay evidenci videncia as sufi suficie cientes ntes en cuanto cuanto a que la melatoni tonina na estabi stabilliza las membra branas nas celula ulares, proteg protege e a lípidos pidos y al ADN nucle nuclear, de
form orma tal que puede se serr consi considera derada da una una molé olécula cula que tie tiene efectos ctos prote protector ctore es contra el daño daño oxida oxidativo tivo caus causa ado por los radi radica calles libres libres.. Se pla plantea así una nueva perspectiva perspectiva que deber deberá se serr consi considera derada da en el futur futuro o inme nmedia diato por los inve investi stig gadores biom biomé édicos, dicos, ta tanto para para confor conform mar estudios más contr controla olados y ri rigurosos urosos como para val valora orar una medida dida terapéuti péutica ca adicional en la clínica médica.
F.F.- Niveles de peroxidación roxidación lipí lipídi dica ca en fantasmas de glóbulos rojos rojos sometidos tidos a radiaci diación ón ultra ultraviol viole eta, tratados o no con melatonina
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Este otro estudio studio fue fue realizado zado en en la la fecha compr compre endida ndida entre ntre los mese sess de Octubre ctubre y Novi Novie embre bre del del año 2004, 2004, en la las instalaci instalaciones ones del del Laboratorio de Bioenergética Celular del Centro de Biofísica y Bioquímica del I VIC, Al Altos de Pipe, pe, me mediante diante un traba trabajjo conjunto conjunto entre entre ese laboratorio boratorio y la Unida nidad d de I nvesti nvestig gación ción en en Fi Fisiol siología del del Decana canato to de Medici dicina na de la UCLA de Barquisimeto. A l igua igual que otros otros tipos tipos de antioxi ntioxida dantes, ntes, caso caso de la vita vitamina E, se ha descr descriito que la melatoni tonina na es capaz de prot prote eger a la célula ula contr contra a posibl posible es reducciones ducciones en la la fluidez uidez de la membra brana pla plasmá smática tica celula celular y procesos procesos asocia sociados a la pero peroxi xida daci ción ón lilipídi pídica ca.. En En otras otras pal palabra bras, sería ría capa capazz de ejerce rcer efectos ctos estabi estabillizantes sobre sobre la me membra brana cel celula ular. Traba Trabajos muy interesantes ♦
Trabajo experimental realizado en el Laboratorio de Bioenergética Celular. Centro de Biofísica y Bioquímica. IVIC. Altos de Pipe. Año 2004
han han dem demostra ostrado que, que, la la melatoni tonina na debi debido do a su propi propiedad dad de liposolubi posolubillidad dad e hidr hidrosol osolubi ubillidad, dad, puede dif difundir undir a través través de la membra brana pla plasmática tica ejercie ciendo sus efectos ctos anti antioxi oxida dant nte es a ese nivel. nivel. Se han han efe efectuado ensayos donde se evide videnci ncia a que que la horm hormona tie tiene dife diferentes valore ores de movil ovilidad dad y acce ccesibilida bilidad d a lipos liposom oma as de fosf osfatidil tidilcolina colina (PC) (el fos fosffolípido olípido má más pre predomina dominante nte en la las membra branas nas celula ulares de mamíferos) eros) inme inmersos en soluciones conteniendo generadores de radicales libres, lo cual pudiera involucra nvolucrarr un consum consumo dif diferenci rencial de la melatonina tonina por los ra radica dicalles lliibre bres y productos de la peroxidación lipídica. Resultados presentados por los investi nvestiga gadore dores mue muestr stra an que, un 35% de la la melatoni tonina na (concentra (concentración ción de 30 30 µM) µM) inco incorp rpor ora ada haci hacia a liposom posomas unil unilamelares dif difunde haci hacia a la fase acuosa. cuosa. La activi ctivida dad d anti antioxi oxida dante nte tam tambié bién fue fue eval valuada uada cuando los los ra radica dicalles lilibre bres se generaron neraron en la la fase lipídi pídica ca;; para el ello, concentra concentraciones ciones varia riable bles de melatoni tonina na (10 a 250 250 µM), µM), fuer ueron incor incorpor pora adas das en 10 mM de liposom posomas de PC de soya multi ultillamelares. A concentra concentraciones ciones de 10 µM, µM, la la melatoni tonina na fue poco efectiva ctiva,, mientra ntras que a concentra concentraciones ciones de 50 50 a 250 250 µM causó causó efe efectos ctos antioxi ntioxida dantes ntes var variable bles (Li (Livre vrea, 1997) Estos stos interesa interesantes experim xperimentos ntos refl reflejan la la idea dea que la melatoni tonina na puede puede actuar como anti antioxi oxida dante nte a nivel nivel intr intra amembra branoso, reducie duciendo los los niveles de peroxidación de los fosfolípidos de la membrana, sobre todo aquel quelllos ricos ricos en en áci ácidos dos gras grasos os insa insatura turados. Es Es conocido conocido también el ef efecto de la radiación ultravioleta sobre diversos componentes celulares, entre ellos la propia propia membrana pla plasmática tica (Halliwellwell-Guterr uterriidge dge, 1989 1989).). En E n este este ensayo se util utiliza zaro ron n glóbulo glóbuloss roj rojos os humanos, para para valora orar el posibl posible e efecto
protector de la melatonina contra de la peroxidación de los lípidos de membrana de este tipo de células.
? Obtención demuestras desangre: Para la realización de estos experimentos in vitro , se obtuvieron glóbulos rojos de adultos masculinos sanos, mediante la extracción de 10 ml de sangre venosa, que fueron colocados de inmediato en un tubo de ensayo con heparina. Para la preparación de los fantasmas de glóbulos rojos se siguió el siguiente procedimiento.
? Preparación defantasmas deglóbulos rojos: Se lavó la sangre heparinizada por 3 veces con una solución de NaCl al 0,9% (140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 0°C) hasta quedar el sobrenadante transparente. Luego se centrifugó a 10.000 rpm en ultracentrifuga refrigerada por una sola vez. El plasma y la capa de glóbulos blancos eran removidos por aspiración. Los glóbulos rojos empaquetados fueron resuspendidos en una solución salina como la descrita. Se procedió a hemolizar con 9 volúmenes de una solución hipo-osmótica 17 mM TrisHCl pH: 7,5 y 0,1 mM EDTA por 10 minutos (solución de hemólisis). Posteriormente, se centrifugó y lavó a 20.000 rpm por espacio de: 20, 15, 10 y 5 minutos respectivamente hasta obtener los fantasmas de glóbulos rojos, es decir, células sin ningún contenido de hemoglobinaen su interior. Esto es, un precipitado de color crema, constituido por membranas de eritrocitos. Obtenidas estas preparaciones, eran de inmediato congeladas a unatemperatura de -70°C hastasu utilización.
? Procedimientos experimentales: Las preparaciones obtenidas de fantasmas de glóbulos rojos fueron utilizadas para ensayar la capacidad antioxidante de la melatonina, y para ello las membranas de glóbulos rojos eran sometidas a irradiación ultravioleta, con o sin la adición de la melatonina en el medio de incubación. Se empleó el método de (Kako et al ., 1988), para lo cual una alícuota de 250 µl de la suspensión de fantasmas (con una concentración de proteína entre 0,6 y 0,8 mg/ ml) fue colocada en un vial de vidrio (40 mm x 25 mm), el cual se encontraba dentro de un vaso de precipitado con hielo. A este vial se le agregaba según correspondía, 1 mM de melatonina, 30 minutos antes de la irradiación con luz ultravioleta. Las membranas eran entonces iluminadas por espacio de 30 minutos con una lámpara UV Mineralight (USA), situada a una distancia de 4 cm de la preparación, a una longitud de onda de 254 nm. El espesor de lasuspensión no eramayor de 1 mm. Una vez cumplido el anterior procedimiento, se procedía a determinar de inmediato los niveles de Sustancias Reactivas al Acido Tiobarbitúrico (SRAT) de acuerdo al método de (Feix et al ., 1991). A tubos de centrífuga se les agregaba 50 µl de hidroxitolueno butilado (BHT) (50 mM); 750 µl de ácido tricloroacético al 10% y, 250 µl de la suspensión de membranas (tratadas o no con melatonina), las cuales habían sido lavadas previamente en 10 ml de buffer fosfato 10 mM, centrifugadas a 48.000 x g y resuspendidas en 1 ml del mismo buffer. Los tubos así preparados se mantenían sobre hielo a una temperatura de 4°C, por aproximadamente 10
min. Luego se procedía a centrifugar a 1500 rpm en centrifuga clínica por 10 min. Y se tomaban después, 500 µl del sobrenadante y se colocaban en tubos de vidrio, en donde se les añadían 250 µl del reactivo de ácido tiobarbitúrico al 0,5%. De inmediato, los tubos eran colocados en un baño de agua hirviente por 15 min. Transcurrido ese tiempo, se dejaban enfriar a temperatura ambiente. Se determinaba su absorbancia a una longitud de onda de 532 nm, contra un blanco tratado de igual forma, pero que no contenía la suspensión de membranas. En cada caso, se preparaba al instante, una curva de calibración usando como estándar el 1,1-3,3tetrametoxipropano (TMP). Los resultados son expresados como nanomoles de malondialdehído por miligramo de proteína (nM MDA/ mg. prot). En todos los casos, la determinación de proteínas se realizó mediante el método de (Bradford, 1976). Los análisis estadísticos se realizaron mediante el empleo del Student t test.
? Resultadosobtenidos: Como se desprende del análisis de la Tabla No. V, la melatonina por sí sola, no tiene algún efecto sobre los niveles de peroxidación lipídica en membranas de glóbulos rojos cuando se comparan con los valores controles comparar [(C+MLT) con (C)]. Cuando los fantasmas de glóbulos rojos fueron irradiados con luz UV por 30 minutos, sin la adición previa de melatonina, los valores de SRAT se incrementaron en casi 5 veces respecto a los controles [compárese (C + UV) con (C)]
Al tratar previamente las membranas con la hormona melatonina y luego ser sometidas a irradiación con luz UV, puede notarse que los valores disminuyeron significativamente respecto a aquellas membranas que no recibieron el pre-tratamiento con melatonina, compare [(MLT +UV) con el grupo (C + UV)] Dado que, el hidroxi-tolueno-butilado (BHT) es un excelente antioxidante utilizado comúnmente in vitro , y el mismo está incluido en la solución de determinación de niveles de SRAT en este procedimiento experimental, se procedió a realizar un ensayo usando el BHT como probable antioxidante, pre-incubándolo 30 minutos antes con las membranas de glóbulos rojos, previo a la irradiación con luz UV, comparando así la efectividad de esta sustancia antioxidante con la melatonina. La concentración de BHT empleada fue 50 mM. Los resultados presentados en la TablaV muestran que el BHT efectivamente previene el incremento en los niveles de SRAT, pero hay que tener en cuenta que las dosis utilizadas fueron 50 veces superiores a las empleadas para la melatonina.
TABLA V Niveles deperoxidación lipídica en membranas deglóbulos rojos sometidas o noa radiación ultravioleta(UV), tratadaso no con melatonina (MLT) ohidroxi-tolueno-butilado (BHT) Condición
Niveles de Malondialdehído (nM MDA/ mg prot.)
(C)
0,39 ± 0,02
(C +UV)
1,84 ±0,27 ¶
(C + MLT)
0,42 ± 0,06 ¢
(MLT + UV)
0,94± 0,14&
(C + BHT)
1,10 ±0,17
(BHT + UV)
0,92± 0,01*
Datos procesados con paquete estadístico GraphPad Prism3.02for windows Los datos son expresados como la media± E.S. obtenida deuna serie de3 ensayos ¶ p < 0.005respecto a (C) & p < 0.020 respecto a (C) ¢p < 0.03 respecto a(C+ UV) * p < n.s. respecto a (C + BHT)
Es conocido que alteraciones en la estructura química de las membranas celulares, debido a la formación de enlaces covalentes cruzados entre lípidos y proteínas, o entre lípidos adyacentes, causado por el proceso de peroxidación lipídica, y la reducción en la relación de ácidos grasos insaturados/ saturados, son causas de la disminución de la fluidez de las membranas. La irradiación con luz UV es causa directa del incremento en los niveles de peroxidación lipídica detectados en los fantasmas de glóbulos rojos, con las alteraciones descritas anteriormente. La melatonina como molécula que neutraliza el proceso de peroxidación lipídica, también debe prevenir la rigidez de la membrana inducida por el estrés oxidativo. Estos resultados obtenidos con fantasmas de glóbulos rojos apoyarían la noción que, la melatonina hace más resistente la membrana al daño peroxidativo. En este caso, trabajando con un sistema biológico in vitro , esto es, fantasmas de glóbulos rojos que no poseen los mecanismos enzimáticos antioxidantes en su interior, se pudo comprobar que la melatonina, aparte que pudiera ejercer un efecto indirecto, estimulando los mecanismos de defensa antioxidantes propios de la célula, también actúa directamente estabilizando la membranacelular al nivel óptimo.
G.- Otras acciones delamelatoninaen el organismo Desde hace varios años se conoce que durante el proceso de envejecimiento celular, existe un incremento en la producción de radicales libres derivados del oxígeno, concomitante con una reducción en la actividad de las enzimas antioxidantes. Sucede también que durante el envejecimiento existe una declinación progresiva en los niveles de melatonina circulantes y alteraciones en el propio ritmo circadiano (Huether, 1996). Numerosos son los ensayos que han descrito que la melatonina suministrada exógenamente, tiene efectos inmunoestimulatorios, oncostáticos y rejuvenecedores en roedores seniles, previniendo la degeneración celular, la desdiferenciación y carcinogénesis. Asimismo, hay evidencias que postulan que la melatonina retrasa el inicio de enfermedades relacionadas con el envejecimiento (Pierpaoli-Regelson, 1996) Autores como (Sainz, 1995) han demostrado que, la apoptosis inducida y la que ocurre en forma espontánea, es retardada por el tratamiento previo con melatonina. Este grupo de trabajo encontró que la apoptosis normal en el timo de rata, estuvo reducida cuando los animales eran tratados con dosis diarias de hasta 500 µg/ kg peso en edades comprendidas entre 25 y 65 días. La adición de melatonina al medio de cultivo con timocitos (10-9 M o 10-7 M) redujo la muerte celular programada en un 20% y 35% respectivamente. Concluyeron los autores que, probablemente la melatonina en estos estudios no protegió directamente al ADN nuclear removiendo radicales libres próximos a esta estructura, sino que la hormona actuó de manera indirecta envolviendo la remoción de
radicales libres, alterando los mecanismos de señalización, los cuales inician los eventos apoptóticos (Sainz, 1995) Papolla y col. en 1997, estudiando células apoptóticas de neuroblastoma murino tipo N2a y utilizando proteína ß-amiloide (constituyente de las placas seniles en pacientes con Alzheimer) para su inducción, concluyeron que en este modelo experimental in vitro , la melatonina fue muy efectiva en reducir apoptosis en esta línea celular. Estudios muy recientes efectuados por un equipo de investigadores venezolanos de la Universidad del Zulia, han demostrado que la melatonina reduce los eventos apoptóticos y post-necróticos en riñones con falla renal aguda, de ratas tratadas con cloruro de mercurio y en los cuales el estrés oxidativo es evidente (Nava, 2000)
IV.- CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
en el presente trabajo, se encontró En los estudios realizados in vivo que la melatonina a las dosis farmacológicas empleadas, efectivamente reduce los niveles de peroxidación lipídica que se presentan a consecuencia de la generación de radicales libres derivados del oxígeno en el desarrollo de la diabetes mellitus. En los ensayos realizados in vitro , utilizando como modelo biológico membranas de glóbulos rojos, la melatonina también fue efectiva para prevenir o reducir el daño peroxidativo inducido por la radiación ultravioleta. En los reportes publicados por diversos investigadores y que fueron expuestos en el presente trabajo, más los resultados obtenidos por este autor, no deja lugar a dudas que la hormona melatonina ejerce un efecto protector contra la peroxidación de los lípidos de la membrana celular. Recuérdeseque la destrucción de los ácidos grasos poli-insaturados de los fosfolípidos integrantes de las membranas, compromete el funcionamiento celular y por ende, el normal funcionamiento de los tejidos corporales. Puesto que la melatonina es altamente liposoluble, cabe esperar que la misma difunda sin problemas a través de la membrana e inhiba el proceso peroxidativo a ese nivel.
¿Cuál sería el mecanismo bioquí mico de acción de la melatoni na?
Podrían postularse tres considerandos: La melatonina podríaactuar: a) Directamente, removiendo los radicales libres generados. b) Indirectamente, estimulando laproducción de enzimas antioxidativas. c) Ejerciendo efectos inmunomodulatorios Con respecto a la primera opción, se ha comprobado su efecto removedor o neutralizador de radicales libres; inclusive, se han efectuado estudios comparativos entre diversas sustancias y la melatonina, evidenciándose que la hormona realmente es más eficaz que otros componentes o sustratos antioxidativos para ejercer un efecto antioxidante. Una característica fundamental de la melatonina es su gran liposolubilidad e hidrosolubilidad. Un punto de debate que continúa y deberá esclarecerse prontamente, es el de las dosis empleadas de melatonina para los diversos ensayos que se han realizado a lo largo de los años incluyendo el presente trabajo. Las cantidades de melatonina que se suministran causan que los niveles sanguíneos excedan en varias veces, los niveles fisiológicos. Recuérdese que los niveles de la hormona en horas nocturnas, alcanza valores en el rango de 100-150 pg/ml en plasma; con los niveles dados en los experimentos, es probable que estos niveles plasmáticos se eleven en varias veces los fisiológicos; una gran ventaja de la melatonina, es que no
posee efectos colaterales tóxicos, por lo menos a corto plazo. Esta primera opción explicaría, las acciones como antioxidante de la melatonina en glóbulos rojos sometidos a radiación UV, neutralizando los radicales libres generados durante tal proceso. También en los estudios efectuados en ratas con diabetes mellitus inducida por la Estreptozotocina, la acción removedora de radicales libres fue evidente, aunque los experimentos deben ser ampliados y un mayor número de órganos debeser examinado. Respecto a la segunda opción, se ha demostrado que la melatonina también tiene la capacidad de estimular las defensas antioxidantes propias de la célula. Hay dos enzimas relacionadas al sistema defensivo antioxidante del organismo, que al parecer son reguladas por el ritmo circadiano endógeno impuesto por la melatonina. Estas enzimas son estimuladas por la hormona en horas nocturnas, incrementando los niveles de ARNm de superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa (Reiter, 1997). Esta opción se descarta para los ensayos efectuados in vitro con los glóbulos rojos, ya que al ser hemolizados y naturalmente carecer de núcleo, no cabe la posibilidad de estimulación de este tipo de sistemaantioxidativo. En lo referente al efecto inmuno-estimulatorio, hay resultados que dan prueba de ello; para lograr este efecto se requieren que los tratamientos sean efectuados a largo plazo. Se necesitarán mayor cantidad de ensayos para corroborar la inmuno-estimulación por la melatonina y su relación con la capacidad antioxidante del organismo (Huether, 1996)
En opinión de muchos investigadores, la melatonina debido a sus propiedades y estructura bioquímica, puede ser catalogada como un débil antioxidante in vivo , más aún con las concentraciones a las que se le encuentra en los fluidos corporales. Muchos autores la han catalogado como una molécula que puede retardar la auto-oxidación en sistemas libres de metales iónicos (Fe++, Cu++), o ser un antioxidante preventivo de la subclase desactivador de metales iónicos. También tiene la capacidad de actuar en forma sinérgica con otros antioxidantes celulares (Antunes, 1999), (Reiter, 2000) y (Hayter, 2004) El que la melatonina pueda ser clasificada como una molécula antioxidante, requerirá de muchas más investigaciones en el campo; debe quedar claro que la melatonina es una hormona producida por la glándula pineal y otros tejidos del cuerpo, diseñada para cumplir una función crucial, cual es el control y sincronización de los ritmos biológicos. El autor del presente trabajo concluye que, aún es muy temeroso proponer que la melatonina deba ser incluida como una sustancia antioxidante celular dentro de los esquemas actuales. Se necesitan más ensayos experimentales tanto in vivo como in vitro para poder obtener conclusiones más sólidas. No hay duda de la capacidad neutralizadora o removedora de radicales libres que posee la hormona; las evidencias lo demuestran, pero para que una sustancia sea catalogada como antioxidante debe cumplir y satisfacer una serie de requisitos que ya fueron presentados en detalle y con anterioridad en estemismo trabajo. Ello debe ser demostrado fehacientemente.
La melatonina tiene sus ventajas farmacológicas; posee una muy baja toxicidad aguda, es de fácil administración, es muy económica, no induce efectos colaterales indeseables, es bien tolerada en todas las edades, no se han evidenciado interacciones con otros medicamentos y no produce dependencia, lo que resulta útil y todo ello sugiere que posee un enorme potencial para ser incluida dentro de la terapia contra los radicales libres producidos en diversas patologías. Hay más interrogantes que respuestas. La atención públicase sigue centrando en los efectos benéficos reportados de la melatonina, sobre todo como retardador del envejecimiento, como sustancia anti-tumoral, para combatir el insomnio y contra muchas otras patologías, incluyendo la remoción de radicales libres. Mientras tanto, lamelatoninasesiguevendiendo sin prescripción médica y está al alcance delas personas en los estantes delos establecimientos expendedores demedicinade todo el mundo ?
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ANEXO 1 Bioquímica y Mecanismos de Accióndelos Radicales Libres Un radical libre (R? ) constituye una molécula o fragmento molecular que contiene uno o más electrones no apareados en su orbital más externo. Una molécula puede convertirse en radical libre tanto por ganancia como por pérdida de electrones, y también por fisión de enlaces homolíticos. Cuando un enlace covalente se rompe simétricamente, ambos fragmentos retienen un electrón, y por tanto, se convierten en radicales libres. El estudio de los radicales libres se ha enfocado desde el punto de vista médico y biológico, ya que las interacciones de los radicales libres con moléculas orgánicas han sido implicadas en un gran número de estados patológicos, los cuales pueden jugar un papel significante en el daño tisular (de Zwart, 1999) y (Tiskow, 1996). Los radicales libres han sido detectados por métodos como la resonancia de spin del electrón o métodos más sofisticados como el atrapamiento del spin del electrón (Spin Trapping) (Southorn, 1988) Muchos organismos requieren del oxígeno para su sobrevivencia, en donde el oxígeno es utilizado por las células para oxidar compuestos orgánicos. El oxígeno molecular (O2) actúa como elemento oxidante al aceptar hasta cuatro electrones en su orbital más externo (reducción tetravalente) para dar lugar a dos moléculas de agua: O2 + 4H+ + 4e- à 2 H2O [1] El oxígeno también puede sufrir reducción univalente, divalente o trivalente (al aceptar uno, dos o tres electrones) dando lugar ala formación de
especies activadas de oxígeno. Los productos respectivos son: radical anión superóxido (O2?), el intermediario peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidróxilo (OH ? ): eO2
à
e-
e-
e-
O2? à H2O2 à 2OH? à 2H2O [2]
Estas especies activadas tienen la particularidad de que pueden reaccionar con relativa facilidad con sustratos endógenos de las células. La reducción univalente del oxígeno fue descrita en el año de 1931 por (Haber y Willstatter, 1934). En otro orden de ideas, (Haber y Weiss, 1935) describieron que la reducción secuencial trivalente del oxígeno molecular, en combinación con un catalizador en presencia de hierro, daba lugar a la producción de intermediarios oxigenados muy reactivos que eran especies fuertemente oxidantes. La importancia biológica de este descubrimiento tuvo que esperar hasta 1969 cuando (McCord y Fridovich, 1959) identificaron una enzima, la superóxido dismutasa, que cataliza la producción de peróxido de hidrógeno (H2O2) a partir del anión superóxido (O2? ) A lo largo de la evolución, mientras las células desarrollaban los mecanismos de utilización de oxígeno, desarrollaban simultáneamente mecanismos de defensa contra la toxicidad del mismo. Un incremento o una disminución significativa del oxígeno disponible para las células, resulta en
alteraciones bioquímicas profundas, las cuales pueden culminar en daño estructural e inclusive hasta la muerte celular (Halliwell, 1987) Se han descrito numerosos mecanismos bioquímicos celulares responsables de la generación de radicales libres: 1. Las mitocondrias, peroxisomas y microsomas celulares, producen estos compuestos aunque en cantidades muy pequeñas (1 a 2 % de los radicales libres generados por las células). Las mitocondrias y sus sistemas de transporte de electrones son el sitio de mayor oxidación celular, donde se promueve la reducción tetravalente del oxígeno hasta agua (ver ecuación 1). La reducción del oxígeno hasta agua por la enzima Citocromo C Oxidasa mitocondrial envuelve una transferencia de cuatro electrones con ningún radical libre intermediario. Menos del 1 % del flujo de electrones resulta en producción de radical superóxido (Cadet, 1988) 2. La autooxidación de catecolaminas. En ciertos procesos, como la isquemia cerebral, hay liberación regional de noradrenalina y dopamina ßhidroxilasa de las terminaciones nerviosas en la zona de isquemia. Las catecolaminas son degradadas por la enzima monoamino-oxidasa (MAO), y ello envuelve un paso oxidativo con producción de un exceso de electrones. El oxígeno, sobre todo al darse el proceso de reperfusión, puedeactuar como agente aceptor de electrones yproducir algunos radicales hidróxilo y peróxido de hidrógeno (Ikeda, 1990)
3. Los neutrófilos activados poseen una enzima, la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa (NADPH oxidasa), responsable de la producción del radical anión superóxido (Weiss, 1982): NADPH
oxidasa 2O2 + NADPH ----------à 2O2? + NADP+ + H+ [3] También, los neutrófilos, poseen una mieloperoxidasa, la cual genera el radical ClO? Al reaccionar con peróxido dehidrógeno: Cl?+ H2O2 à ClO? + H2O [4] 4. El ácido araquidónico puede ser metabolizado por ciclooxigenasas o por lipooxigenasas, produciendo diversas sustancias con propiedades vasoactivas, entre ellas: prostaglandinas, trombóxano, prostaciclina, leucotrienos (Samuelson, 1983) 5. La oxidación de hipoxantina y xantina a ácido úrico catalizada por la xantina oxidasa, está acoplada a la reducción del oxígeno molecular a anión superóxido (McCord, 1985): xantina + H2O2 +2O2 à ácido úrico + 2O2? +2H + [5]
6. Otras probables fuentes de radicales libres son la radiación ionizante, como la radiación ultravioleta, productos de la reacción de drogas y toxinas con sustratos celulares, contaminantes atmosféricos, fotosensibilizadores, y productos de la combustión de materiaorgánica(Bulkley, 1983) En condiciones normales, las células cuentan con mecanismos de protección, enzimáticos y no enzimáticos, contra los radicales libres. Entre los mecanismos celulares de protección enzimáticos se cuentan: a) La enzima superóxido dismutasa (SOD). La misma se encarga de la reacción de dismutación del radical anión superóxido intracelular. La enzima, perteneciente a la familia de metaloenzimas, cataliza la conversión del anión superóxido a peróxido de hidrógeno más oxígeno a través de la siguiente reacción: SOD
O2? +O2? +2e- +2H+ -------à H2O2 + O2 [6] La superóxido dismutasa se ha encontrado en varias formas activas; una conteniendo manganeso, la cual se encuentra en la matriz mitocondrial y otra conteniendo cobre y zinc, la cual se localiza en el citoplasma (McCord 1981) b) La catalasa y la glutatión peroxidasa (GP), conforman el principal sistema intracelular de catálisisdel peróxido de hidrógeno. El mayor peligro de
la presencia de H2O2 es la producción del radical OH ., que es una especie oxidante muy reactiva e inestable. La producción de radicales OH? se realiza a través de la reacción de Haber-Weiss en presencia de un agente quelante metálico, o por intermedio de la reacción de Fenton: Fe3+ + quelante H2O2 +O2?---------------------à O2 + OH?+ OH– (Haber-Weiss) H2O2 +Fe2+ à complejo intermedio à Fe3+ +OH? +OH- (Fenton) El radical OH? Es muy inestable y reacciona con una variedad de compuestos orgánicos y con componentes diversos de las membranas biológicas. En condiciones normales, no se producen o no existen concentraciones importantes de radicales hidróxilo y no existe sistema enzimático capaz de remover cantidades excesivas de este tipo de compuesto, de allí la importanciade la catalasay laglutatión peroxidasaen la remoción del H2O2 intracelular. A bajas concentraciones de H2O2, éste es removido por la glutatión peroxidasa, en presencia de glutatión reducido (GSH) el cual es oxidado hastaglutatión oxidado (GSSG):
2 GSH + H2O2
à
GSSG + 2H2O [9]
A altas concentraciones de H2O2, la catalasa se vuelve primordial en su remoción:
2 H2O2
à
O2 + 2H2O [10]
Entre los mecanismos celulares no enzimáticos de protección contra los radicales libres, se cuentan: a) El a-tocoferol o vitaminaE, quesele ha descrito como antioxidante de la fase lipídica, ya que por ser liposoluble, se particiona con mucha facilidad hacia las membranas y transforma especies reactivas como los radicales hidróxilo o peróxilo en componentes menos reactivos. Actúa donando H+ al radical y por tanto, confinando el efecto del radical; en adición se produce una formaderadical estable de vitamina E (Halliwell-Gutteridge, 1989). b) El ácido ascórbico o vitamina C, antioxidante de fase acuosa, lacual se localiza en altas concentraciones en ciertos órganos, especialmente en el ojo (Halliwell, 1986). A este compuesto se le ha reconocido por mucho tiempo, que posee propiedades antioxidantes y protege contra daños oxidativos a aceites de origen vegetal, grasas animales, alimentos conteniendo grasas, tales como leche, pescados, margarinas, entre otros. Estas funciones de lavitamina C son mayormente derivadas de sus propiedades Redox. El compuesto actúa donando hidrogeniones al radical libre, transformandose el ácido ascórbico (AH2) en ácido dehidroascórbico (A), con la concomitante formación del
radical ascórbilo (A? – ) como intermediario, molécula que actúa como un radical libre, pero que es normalmente mantenido a unabajaconcentración en el plasma. Se ha demostrado que la vitamina C suprime la oxidación de liposomas de fosfatidilcolina de soyay membranas de fantasmas de eritrocitos en dispersiones acuosas, oxidación inducida por radicales libres. Por el contrario, se ha notado que la vitamina C no suprime en forma eficaz, como lo hace la vitamina E, radicales dentro de las regiones lipídicas de las membranas (Halliwell-Gutteridge, 1989) c) Ceruloplasmina, proteína circulante portadora de cobre, puede actuar como antioxidante extracelular (Halliwell, 1986) d) Otros: Cisteína, Manitol, Alopurinol, Tiourea, Hidroxitolueno-butilado, Desferroxamina, Dimetilsulfóxido, Dimetiltiourea, Fosfatidilcolina de soya, entre otros (Tiskow, 1996)
? El Proceso dePeroxidación Lipídica: El ataque a los fosfolípidos de membrana por los radicales libres se centra fundamentalmente en el proceso de peroxidación lipídica de los residuos de ácidos grasos de los fosfolípidos. Se considera que el proceso de peroxidación lipídica ocasiona cambios en la composición química y deterioros en la organización ultraestructural de las membranas celulares, disminuyendo la fluidez de las mismas, alterando su
permeabilidad e inactivando receptores y enzimas unidas a la membrana. (Halliwell-Guteridge, 1989), (Tiskow, 1996) El proceso de peroxidación lipídica como tal es complejo y puede entenderse como un mecanismo por el cual los lípidos insaturados reaccionan con el oxígeno para producir hidroperóxidos lipídicos: LH + O2
à
LOOH [11]
donde LH es un lípido y LOOH es el hidroperóxido resultante.
El mecanismo intrínseco de peroxidación lipídica puede describirse como sigue: la reacción es iniciada por el ataque de radicales libres, los cuales sustraen un átomo de hidrógeno de un carbono metileno en la cadena lateral deun ácido graso de un fosfolípido (ver Fig. No. 9). El átomo de hidrógeno es un radical librede por sí (puesto que tieneun electrón singletedesapareado) y su remoción deja un electrón desapareado en el átomo de carbono atacado. A este proceso descrito se le ha denominado iniciación de la peroxidación lipídica. El radical carbonilo (L? ) resultante sufre rearreglos moleculares originando un dieno conjugado, y en presencia de oxígeno molecular da lugar al radical peróxilo.
R? + LH
RH + L? (Fasede Iniciación)
El radical carbonilo resultante (L) sufrerearreglos moleculares originandoun dieno conjugado, y en presencia de oxígeno molecular da lugar al radical peróxilo (LOO):
L? + O2
LOO?
El radical peróxilo puedesustraer un átomo dehidrógeno deotramolécula vecina (LH), la cual puede ser otro ácido graso insaturado, formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo radical lipídico (L), entrando la peroxidación en una Fasede Propagación:
L? + LOOH (Fasede Propagación)
LOO? + LH
LO? +OH? (FasedeRamificación)
LOOH
Reacciones deTerminación: L? + L? LOO? +L? LOO? + LO?
P* P* P*
P + h? P + h? P + h?
FiguraNo. 9 Representación esquemática del proceso deperoxidación lipídica.
Los radicales peróxilo pueden sustraer un átomo de hidrógeno de otra molécula vecina (LH), la cual puede ser otro ácido graso poliinsaturado, formándose así un hidroperóxido (LOOH) y un nuevo radical lipídico (L? ), entrando la peroxidación lipídica en un proceso de propagación. El grado de propagación de la reacción depende de muchos factores, entre ellos, la relación lípido/ proteína en la membrana (la oportunidad de reaccionar un radical con una proteína se incrementa cuando el contenido de proteína aumenta), de la composición de ácidos grasos, concentración de oxígeno y de la presencia dentro de la membrana de antioxidantes que inhiban la propagación de la reacción. El hidroperóxido lipídico puede en adelante degradarse a una variedad de productos. Además, en presencia de metales de transición, como Fe++, Cu+, el hidroperóxido produce un radical alcóxilo (LO? ) y un radical hidróxilo (OH? ), los cuales causan la ramificación de la reacción, involucrando un mayor número de moléculas del sustrato en el proceso de peroxidación. Cuando la concentración de moléculas de sustrato se hace pequeña, los radicales libres comienzan a reaccionar entre sí, en distintas combinaciones provocando la formación de productos excitados (P*). El paso de estos productos excitados a su estado estable (P) ocurre con la emisión de cuantos de luz visible. Estas reacciones reciben el nombre de reacciones de terminación y con ellas concluyela reacción en cadena mediada por radicales libres (Halliwell-Gutterige, 1989), (deZwart, 1999)
