Fundamentos de Genética Aplicada

ÍNDICE Tema 1. Introducción. Concepto de ADN recombinante. Aplicaciones.

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Tema 2. Restricción y modificación del ADN. Enzimas de restricción. Tipos y utilización.

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Tema 3. Otras enzimas utilizadas en la producción de moléculas de ADN recombinante. Enzimas de degradación. Enzimas de polimerización. Enzimas de modificación. Marcaje de moléculas de ADN. Producción de ADN recombinante.

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Tema 4. Amplificación enzimática de fragmentos de ADN y ARN. Reacción en cadena de la polimerasa. Componentes y parámetros de la reacción. PCR de ARN.

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Tema 5. Vectores de clonación en bacterias. Clonación. Tipos y características de los vectores de clonación. Plásmidos. Vectores basados en el genoma del fago λ. Cósmidos. BACs. YACs.

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Tema 6. Clonación en bacterias. Concepto de genoteca. Construcción de genotecas de ADN genómico y de ADN copia. Representatividad de una genoteca.

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Tema 7. Rastreo de genotecas. Detección e identificación de clones individuales. Detección directa por complementación. Detección indirecta por hibridación de ácidos nucleicos. Vectores de expresión y detección por métodos inmunoquímicos.

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Tema 8. Caracterización estructural de moléculas de ADN recombinante. Mapas de restricción. Secuenciación de ácidos nucleicos. Hibridación de ácidos nucleicos en filtro. Localización del fragmento clonado en el genoma. Determinación del número de copias de una secuencia en el genoma.

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Tema 9. Caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante. Caracterización funcional in vitro. Caracterización funcional in vivo. Introducción de genes en células eucariotas: métodos, vectores, sistemas de selección.

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Tema 10. Mutagénesis in vitro. Genética reversa y tipos de mutagénesis. Mutagénesis aleatoria por deleción, inserción y sustitución. Mutagénesis dirigida. Inactivación de genes endógenos.

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Tema 11. Aplicaciones en genética humana. Aplicaciones al diagnóstico clínico. Terapia génica. Medicina forense. Proyectos genoma.

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Tema 12. Aplicaciones en biología animal y vegetal. Obtención de plantas transgénicas. Clonación animal. Transgénesis en animales.

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Fundamentos de Genética Aplicada

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Introducción

Hasta hace poco tiempo el ADN era una molécula que presentaba amplias dificultades para su análisis bioquímico. Su gran longitud y monotonía hacían que la secuencia de nucleótidos pudiese sólo ser estudiada mediante mecanismos indirectos. Para esto se recurría a la determinación de la secuencia de las proteínas o del ARN. A partir de los años 70 se desarrollaron las herramientas de la ingeniería genética, o lo que se ha denominado técnicas del ADN recombinante. Hoy en día se pueden separar regiones determinadas del ADN, obtenerlas en grandes cantidades y determinar su secuencia de nucleótidos. También es posible alterar un gen y transferirlo a células en cultivo o a la línea germinal de animales, donde el gen modificado se incorpora como parte funcional y permanente del genoma.

Concepto de ADN recombinante El ADN recombinante es una molécula de ADN formada por la unión de dos moléculas de diferente origen. Generalmente se aplica este nombre a moléculas producidas por la unión in vitro de ADN proveniente de dos organismos diferentes que no se encuentran juntos. Normalmente se trata de ADN cromosómico que se une a un vector, comúnmente un plásmido bacteriano. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo conllevando a la modificación de rasgos existentes o a la expresión de nuevos rasgos. Son necesarias herramientas que linearicen los vectores y que corten el ADN cromosómico, es decir, se necesitan enzimas que tienen como sustrato el ADN. Después de obtenerse el ADN recombinante debe multiplicarse, para ello, se introduce en una bacteria, que se dividirá formando un clon en el que cada célula tendrá una copia del plásmido recombinante.

Aplicaciones     

Industria farmacéutica y química: se usan bacterias para producir sustancias de interés para el hombre, como por ejemplo insulina. Industria alimentaria: se usan bacterias para producir colorantes alimenticios. Biorremediación: por ejemplo, degradación bacteriana de hidrocarburos. Agricultura y ganadería: producción de plantas y animales transgénicos. Medicina: técnicas de diagnostico molecular y terapia génica.

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2 Alberto Fonte Polo

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Restricción y modificación del ADN

En las técnicas de ingeniería genética se necesita fragmentar, modificar y multiplicar las moléculas de ADN, y para ello se utilizan enzimas de diferentes tipos:  Enzimas nucleasas.  Enzimas de modificación.  Enzimas de polimerización. Además se utilizan procedimientos químicos y físicos para fragmentar el ADN. Como método químico cabe destacar la hidrólisis del ADN por pH ácido. Los ultrasonidos y el cizallamiento son métodos físicos que fragmentan el ADN. Aunque a diferencia de los métodos enzimáticos, los procedimientos químicos y físicos son inespecíficos.

Enzimas de restricción Las nucleasas son enzimas que producen la rotura de los enlaces fosfodiéster de la cadena polinucleotídica de los ácidos nucleicos. Tipos de nucleasas:  Exonucleasas: escinden el último nucleótido del extremo 5' o 3' de un polinucleótido. Pueden degradar por completo un ácido nucleico lineal.  Endonucleasas: cortan los enlaces fosfodiéster situados en el interior de los polinucleótidos. Estas enzimas no requieren un extremo libre, por lo que pueden cortar ácidos nucleicos circulares. Las nucleasas pueden ser enzimas inespecíficas, es decir, que cortan el ácido nucleico independientemente del nucleótido que haya. Pero también existen endonucleasas (de restricción) que sólo cortan cuando reconocen una determinada secuencia nucleotídica. Las enzimas de restricción (o restrictasas) pueden reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción, o en un sitio no muy lejano a éste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restricción cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. Existen tres tipos de enzimas de restricción (I, II, y III), forman parte de sistemas de restricción-modificación, estos sistemas hacen la función del sistema inmune en las bacterias. Cada enzima de restricción reconoce una diana, que también es reconocida por la enzima de modificación. Las enzimas de modificación son metiltransferasas que añaden grupos metilo a los nucleótidos de las dianas de restricción. Las restrictasas sólo reconocen la diana cuando ésta no está metilada. Cuando el ADN doble metilado en la diana de restricción se replica, se originan dos moléculas de ADN hemimetiladas, es decir, que sólo tienen metilados los nucleótidos de una cadena. En este caso las metiltransferasas metilan la cadena de nueva síntesis. En el caso de que un fago infecte a la bacteria, el ADN que introducirá no estará metilado, y por lo tanto será reconocido por las enzimas de restricción y será degradado. Por otro lado,


existen fagos que no poseen dianas de restricción en su material genético, estos virus son por lo tanto resistentes a la acción de las enzimas de restricción. Se han descubierto más de 2.500 sistemas de restricción diferentes, y hay aproximadamente 300 enzimas de restricción comercializadas. El nombre de cada enzima de restricción está asignado según el origen bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas enzimas consiste en: 1. Tres letras que corresponden al nombre científico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2. La cepa, si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli). 3. En números romanos, un número para distinguir si hay más de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restricción. De esta manera, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se debe a: Nomenclatura E co R I

Ejemplo Escherichia coli RY13 La primera enzima identificada

Corresponde a: Género de la bacteria Especie de la bacteria Cepa de la bacteria Orden de identificación de la enzima

Tipos y utilización Tipos de enzimas de restricción: 

Tipo I: estas restrictasas reconocen dianas largas (de 16 nucleótidos). Al reconocer la secuencia específica de ADN (no metilado) corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. Corta las dos hebras en puntos cercanos entre sí, poco específicos, a unos 1.000 pares de bases aproximadamente después de la diana. Deja extremos cohesivos.



Tipo III: el sitio de reconocimiento es más corto. Corta las dos hebras en puntos distantes entre sí, es por lo tanto un corte desplazado y deja extremos cohesivos. El punto de corte se sitúa a 24-26 pares de bases de la diana de restricción.



Tipo II: estas son las enzimas de restricción que comúnmente se usan en el laboratorio. Las enzimas de restricción de tipo II más frecuentes reconocen dianas de 4-6 pares de bases, pero existen otras menos frecuentes que reconocen dianas de 8, 10 o 12 pb. Cortan las dos hebras en puntos muy específicos, dentro de la secuencia de reconocimiento. Las dianas pueden ser secuencias fijas de nucleótidos, o pueden ser flexibles como por ejemplo: 5'GGNNCC 3'CCNNGG

5'GGPyrPyrCC 3'CCPurPurGG

5'GGPurPurCC 3'CCPyrPyrGG

N representa cualquier base, Pyr representa una base pirimidínica y Pur una base púrica.

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4 Alberto Fonte Polo En cualquier caso, las dianas son siempre secuencias palindrómicas, esto es, secuencias de nucleótidos que son idénticas a su cadena complementaria cuando cada una es leída en la misma dirección química. 5'-GTATAC-3' |||||| 3'-CATATG-5' Secuencia de reconocimiento palindrómica

El corte puede generar extremos romos o extremos protuberantes, según la enzima.  Extremos romos: la enzima corta las dos hebras en el mismo punto. 5'---CAG 3'---GTC

CTG---3' GAC---5'

 Extremos protuberantes: cuando el corte ocurre en puntos distintos en cada hebra. Pueden ser extremos protuberantes 5' o 3', según esté la región simplexa en el extremo 5' o en el 3' respectivamente. 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5'

5'---CTTAA G---3' 3'---G AATTC---5'

Extremos protuberantes 5’

Extremos protuberantes 3’

Los extremos protuberantes son cohesivos, es decir, pueden volver a ligarse si se restablecen los puentes de hidrógeno entres las bases nitrogenadas. Dos sistemas de restricción distintos pueden ser isoesquizómeros cuando ambos reconocen la misma diana de restricción o dianas muy parecidas, pero producen los mismos extremos cohesivos. Cuando se pretende obtener un alto grado de fragmentamiento del ADN se emplean enzimas de corte frecuente, que son aquellas enzimas que reconocen dianas de pocos pares de bases. Puesto que, una secuencia corta de nucleótidos aparecerá con más frecuencia en la molécula de ADN que una secuencia con muchos pares de bases. Pero las dianas de restricción no están distribuidas uniformemente en el ADN, sino que puede haber tramos con dianas muy próximas, y otros tramos que por azar casi no presenten dianas. Por ello, mediante estas técnicas no se puede obtener fragmentos de ADN del mismo tamaño.


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Otras enzimas utilizadas en la producción de moléculas de ADN recombinante

Enzimas de degradación Las enzimas de degradación que se usan en el laboratorio son nucleasas (exonucleasas y endonucleasas), son enzimas que catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiéster. Es necesario valorar la enzima para determinar la concentración adecuada de enzima que hay que utilizar, ya que un exceso podría conllevar la degradación total del ADN que se esté estudiando. Las principales enzimas son: Exo λ: se trata de una enzima sintetizada por Escherichia coli cuando está infectada por el fago λ. Es una exonucleasa que degrada el ADN en dirección 5'→3', lo que da lugar a moléculas con extremos protuberantes 3'. Exo III de E. coli: es una exonucleasa presente en E. coli que degrada en sentido 3'→5', por lo que produce extremos protuberantes 5'. Actúa sobre moléculas de ADN intactas y también sobre sustratos mellados, es decir, sobre moléculas de ADN que presentan un espacio donde falta un enlace covalente, y por lo tanto tienen un extremo 3' sobre el que puede actuar la enzima.

Exo VII de E. coli: enzima exonucleasa que utiliza moléculas simplexas como sustrato, es capaz de reconocer ambos extremos. Degrada el ADN simplexo en dirección 3'→5' y 5'→3', por lo tanto produce moléculas progresivamente más cortas. También es capaz de reconocer ADN semisimplexo, pero en tal caso sólo degradaría la parte simplexa de la molécula.

Bal 31: es una enzima nucleasa que tiene actividad exonucleásica 3'→5' y origina extremos protuberantes 5'. También actúa como endonucleasa realizando cortes en el interior de la molécula de ADN. En el laboratorio esta enzima se usa para mutagenizar el ADN, ya que produce la deleción de los genes, esto es útil para determinar la parte codificante de dicho gen. Dependiendo del tiempo que esté actuando la enzima los fragmentos estarán más o menos delecionados. S1: enzima endonucleasa que corta extremos protuberantes en ambos sentidos.

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6 Alberto Fonte Polo ADNasa I de E. coli: esta enzima puede actuar como endonucleasa tanto de cadena simple como de cadena doble. Si se trabaja con un tampón con Mg2+ la enzima corta solamente una de las dos cadenas, introduce mellas en la molécula de ADN. Pero ante la presencia de Mn2+ corta las dos cadenas en el mismo punto. En cualquier caso, siempre actúa sobre ADN duplexo.

ARNasas: son enzimas endonucleasas que actúan sobre ARN monocatenario. Hay varios tipos:  ARNasa A: rompe enlaces entre una pirimidina y otra base cualquiera.  ARNasa T: rompe enlaces entre una guanina y otro nucleótido.  ARNasa H: rompe sustratos híbridos ADN-ARN, por lo tanto, origina moléculas de ADN monocatenarias.

Enzimas de polimerización Son las ADN polimerasas y las ARN polimerasas. La mayoría de las enzimas de polimerización necesitan un molde para poder copiar, el molde puede ser una molécula de ADN o de ARN. Por ejemplo, las ADN polimerasas dependientes de ADN utilizan un molde de ADN, y las ADN polimerasas dependientes de ARN utilizan un molde de ARN. Además, estas enzimas también necesitan una cadena que proporcione un extremo 3' OH libre para formar el enlace fosfodiéster, esta cadena actúa como cebador o primer. También se requieren los desoxirribonucleótidos trifosfato correspondientes para la síntesis de la nueva hebra. ADN polimerasa I de E. coli: participa en la replicación del cromosoma bacteriano corrigiendo los errores producidos. In vitro esta enzima tiene actividad polimerásica 5'→3', actividad exonucleásica 3'→5' (actividad correctora de pruebas) y actividad exonucleásica 5'→3'. La actividad correctora de pruebas permite a la enzima eliminar los nucleótidos mal apareados del extremo 3' de la cadena, y de este modo puede corregir sus propios errores. Y mediante la actividad polimerasa 5'→3' puede rellenar los huecos con los nucleótidos correspondientes. Al tratar la ADN polimerasa I con una proteasa específica se obtienen dos fragmentos de distinto tamaño. El polipéptido de mayor tamaño mantiene las actividades polimerásica 5'→3' y exonucleásica 3'→5', se denomina fragmento Klenow. Es útil para la investigación porque la actividad exonucleasa 5'→3' puede interferir en algunas aplicaciones experimentales al acortar los extremos 5' de las moléculas de ADN. El gen que codifica para el fragmento Klenow ha sido mutagenizado y se ha podido obtener un fragmento con actividad polimerasa 5'→3' solamente.


ADN polimerasa del fago T7: esta enzima aparece en E. coli cuando está infectada por el fago T7. En presencia de la enzima de E. coli tiorredoxina se une fuertemente al ADN molde y no se separa fácilmente, de este modo se pueden sintetizar fragmentos muy largos de ADN con poca cantidad de enzima. También se han introducido mutaciones en el gen que codifica para esta ADN polimerasa, y así se ha conseguido la enzima sequenasa que posee sólo la actividad polimerásica 5'→3'. Ésta ha sido la enzima utilizada hasta hace poco para la secuenciación del ADN. Taq polimerasa: es una enzima que resiste altas temperaturas, ha sido asilada de Thermus aquaticus, una bacteria termófila que vive en las proximidades de las fuentes de agua caliente. La Taq polimerasa es ampliamente utilizada por sus propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR. En la reacción en cadena de la polimerasa se separan las cadenas de la doble hélice del ADN mediante desnaturalización térmica a temperaturas en torno a los 95°C, por lo que no pueden emplearse las ADN polimerasas ordinarias. Pero la Taq polimerasa tiene una temperatura óptima de funcionamiento de 72°C, y su termoestabilidad es tal que su vida media a 95°C es de 40 minutos, lo que la hace idónea para este tipo de procesos. Se trata de una ADN polimerasa que no tiene actividad exonucleásica 3'→5', por lo que no corrige los errores que comete. Pfu: es una ADN polimerasa que posee actividad correctora de pruebas, ha sido obtenida de la arquea hipertermófila Pyrococcus furiosus. Es también usada en las técnicas de PCR. ADN polimerasa ARN dependiente, también denominada transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa: es una enzima de tipo ADN polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando como molde ARN monocatenario. Esta enzima es específica de los retrovirus, un tipo de virus que presentan un genoma de ARN monocatenario y se replican de manera inusual a través de una forma intermedia de ADN bicatenario. La transcriptasa inversa actúa del siguiente modo: a partir de la molécula de ARN se sintetiza una cadena de ADN, ambas moléculas permanecen unidas formando un híbrido ADN-ARN. Esta enzima, además de poseer la actividad polimerasa 5'→3', actúa también como endonucleasa ARNasa H, por lo que puede romper la molécula de ARN para dar lugar a ADN simplexo. A partir del cual puede formarse ADN duplexo, denominado ADNc (copia o complementario). In vivo la retrotranscriptasa utiliza como cebador el ADN de la célula huésped, pero in vitro se pueden usar varios tipos de cebadores: 1. El ARNm de las células eucariotas presenta una cola poli-A en el extremo 3', en este caso se utilizan cebadores de timina. Para ello se sintetiza un oligonucleótido de aproximadamente 20 timinas, que actuará como primer al proporcionar el extremo 3' sobre el que actuará la polimerasa. 2. Si el ARN no posee cola de poliadenilato, se usa un conjunto de cebadores de 4 o 6 nucleótidos con todas las combinaciones posibles. Al menos alguno de los oligonucleótidos reconocerá alguna secuencia complementaria en el ARN y podrá actuar como cebador. 3. En el caso de que se conozca la secuencia nucleotídica del ARN se puede sintetizar un cebador específico.

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8 Alberto Fonte Polo ARN polimerasas: son un conjunto de enzimas capaces de polimerizar los ribonucleótidos para sintetizar ARN a partir de una secuencia de ADN que sirve como molde, es decir, las ARN polimerasas son dependientes de ADN. In vivo estas enzimas realizan la transcripción del ADN, y para ello deben reconocer unas regiones promotoras situadas al comienzo del gen. In vitro, hay que incorporar estas regiones promotoras al vector, para que la enzima se pueda unir a la cadena de ADN. Hay que tener en cuenta que cada enzima reconoce un promotor específico. Las ARN polimerasas que se suelen utilizar son las de los fagos T7, T3 y SP6 de E. coli. Enzimas “polimerasas” que no requieren molde:  Desoxirribonucleotidil transferasa terminal: es una enzima que sintetiza cadenas de ADN sin la necesidad de un molde, y por lo tanto añade nucleótidos de forma aleatoria. Requiere extremos 3' OH simplexos para poder polimerizar. Dependiendo de los dNTPs que se añadan, la enzima creará una secuencia de nucleótidos u otra.  Poli A polimerasa: esta enzima añade nucleótidos de adenina en el extremo 3' de moléculas de ARN simplexo. No necesita cadena patrón o molde, pues sólo añade adenina. En condiciones naturales es la enzima de poliadenilación que añade la cola poli-A en el ARN mensajero de los eucariotas.

Enzimas de modificación Las enzimas de modificación alteran los extremos de las moléculas, normalmente, de ADN. Las principales son: Ligasa: es una enzima que forma enlaces covalentes entre el extremo 5' de una cadena polinucleotídica y el extremo 3' de otra cadena adyacente. Ésta es probablemente la enzima más usada en ingeniería genética.

Fosfatasa: enzima que elimina grupos fosfato del extremo 5', y origina por lo tanto moléculas con grupos –OH en todos los extremos (en los 5' y en los 3'). De este modo se evita que moléculas fragmentadas puedan unirse de nuevo, ya que la ligasa no reconoce los extremos 5' OH. Nucleotidil quinasa: enzima que añade grupos fosfato en los extremos de moléculas desfosforiladas en el extremo 5'.


Marcaje de moléculas de ADN Una de las aplicaciones de las enzimas que anteriormente se han estudiado es el marcaje de las moléculas de ADN. Se realiza incorporando a la molécula de ADN un fluorocromo, es decir, un componente que hace que la molécula sea fluorescente, un átomo radioactivo como el 32P o el 33P, o un hapteno, que es la parte de un antígeno que por sí sola no dispara respuesta inmune, pero sí posee especificidad. De este modo se puede realizar el seguimiento de los procesos en los que está implicada dicha molécula de ADN. Se distinguen dos tipos principales de marcaje, según quede marcada toda la molécula o sólo se marquen los extremos: Marcaje global: se usa para marcar fragmentos de más de 1.000 pares de bases de longitud, existen dos técnicas diferentes: 

Nick translation (traslación de mellas): se emplea una enzima ADNasa que rompe en el interior de la molécula de ADN, se hace en presencia de Mg2+, en este caso sólo corta una de las dos cadenas en puntos aleatorios e introduce mellas. A continuación se usa la ADN polimerasa I de E. coli, sólo se requieren las actividades polimerasa 5'→3' y exonucleasa 5'→3'. La enzima se introduce en la mella, y mediante la actividad exonucleásica 5'→3' elimina los nucleótidos del extremo 5' y mediante la actividad polimerásica añade nucleótidos en el extremo 3' libre, es decir, ocurre un traslado de la mella. Además se necesitan dNTPs, se añaden nucleótidos fríos, es decir, sin marcar, y nucleótidos calientes o marcados, normalmente en una proporción de 1:4. Así, el ADN de nueva síntesis quedará marcado.

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Random priming (cebado al azar): como en el caso anterior se parte de ADN duplexo, pero se aumenta la temperatura hasta los 94ºC para generar cadenas simples por desnaturalización. En este caso la enzima que se emplea es el fragmento de Klenow modificado (sólo con actividad polimerasa 5'→3'). Es necesario añadir cebadores que proporcionen el extremo 3' OH, los cebadores son secuencias simplexas cortas de seis nucleótidos (oligonucleótidos hexámeros). Hay que añadir una mezcla de cebadores con todas las combinaciones posibles de seis nucleótidos, alguno de ellos reconocerá una secuencia complementaria y se unirá en algún punto de las dos cadenas. Al igual que en la técnica anterior se añaden desoxirribonucleótidos trifosfato, algunos de ellos marcados.

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10 Alberto Fonte Polo Marcaje en los extremos: se usa para marcar fragmentos de ADN muy pequeños, de entre 100 y 200 pares de bases. 

Marcaje del extremo 5': se emplea una fosfatasa para eliminar el grupo fosfato de los extremos 5'. Después, se añaden nucleótidos, normalmente dATP, que tienen marcado con 32P el grupo fosfato en posición γ (el más externo). La enzima nucleotidil quinasa añadirá el grupo fosfato marcado a los extremos 5' OH.

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Marcaje del extremo 3': se usa la enzima exo λ, que con su actividad exonucleásica 5'→3' elimina los nucleótidos de los extremos 5' dejando extremos protuberantes 3'. Se añaden nucleótidos fríos y calientes (en menor proporción) y la desoxirribonucleotidil transferasa terminal los incorporará a los extremos 3' de la molécula de ADN, de este modo se genera una cola marcada.

Producción de ADN recombinante Para generar ADN recombinante se requiere un vector de clonación, generalmente un plásmido bacteriano, y un fragmento de ADN. En primer lugar, hay que cortar el plásmido para obtener una molécula de ADN lineal, para ello se usa una enzima de restricción que deja extremos romos. En segundo lugar, se tratan ambas moléculas de ADN por separado con la enzima exo λ. Se generarán moléculas con extremos protuberantes 3'. Después se usa la desoxirribonucleotidil transferasa terminal para que añada una cola de nucleótidos en los extremos 3'. En cada preparación se añadirá un tipo de nucleótido diferente pero complementario, por ejemplo, si a la preparación del plásmido se le añade guanina, al ADN cromosómico se le añadirá citosina. Posteriormente se reúnen sendas preparaciones y en un alto porcentaje ambas moléculas de ADN se unirán formando una molécula recombinante.

Por último, se necesita que una ADN polimerasa rellene los huecos que quedan en la molécula con nucleótidos complementarios, y que una ligasa una los fragmentos para que la molécula quede sellada.


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Amplificación enzimática de fragmentos de ADN y ARN

Reacción en cadena de la polimerasa La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1985 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, en teoría, basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN, su utilidad reside en que, tras la amplificación resulta mucho más fácil estudiar e identificar el ADN. Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas que se usaban (fragmento Klenow) se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 ºC en las fases de desnaturalización del ADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, actualmente se emplean ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos, generalmente arqueas, adaptados a vivir a esas temperaturas, por ejemplo: Thermus aquaticus (polimerasa Taq) y Pyrococcus furiosus (Pfu). Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante un aparato llamado termociclador, que permite grandes cambios de temperatura en pocos segundos. Para realizar la técnica se necesitan:  ADN polimerasa termorresistente, la más común es la Taq polimerasa.  ADN molde, que contiene la región que se va a amplificar, debe estar desnaturalizado.  Cebadores (o primers), son cadenas simplexas de oligonucleótidos complementarias a una región de las dos hebras del ADN. Estas secuencias son reconocidas por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.  Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizar un nuevo ADN.  Una solución tampón que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Se usan tampones de Tris-HCl con un pH en torno a 7,5.  Cationes magnesio (Mg2+), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), que actúan como cofactores de la polimerasa. In vivo el origen de replicación marca el inicio de la síntesis de ADN, y la molécula molde sólo es leída una vez, mientras que in vitro el inicio de la síntesis de ADN está marcado por los cebadores, y ocurren varias rondas de replicación. In vivo los cebadores son secuencias de ARN, mientras que in vitro son oligonucleótidos de ADN.

Componentes y parámetros de la reacción El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 35 o 36 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos, este proceso tiene lugar en dos horas aproximadamente. De este modo, a partir de una sola molécula de ADN se pueden llegar a conseguir 68×109 copias idénticas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de la enzima y de los cebadores empleados.

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12 Alberto Fonte Polo Las etapas de un ciclo de replicación son las siguientes:  Desnaturalización: el primer paso consiste en desnaturalizar el ADN, es decir, en separar las dos hebras de las cuales está constituido. In vivo las hebras de ADN se separan por acción de las enzimas topoisomerasas que rompen los puentes de hidrógeno. Pero in vitro el ADN se desnaturaliza por calentamiento a 94-95ºC.  Hibridación: el segundo paso de la PCR es la unión del cebador a la región complementaria de la molécula de ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50ºC aproximadamente, permitiendo así la hibridación. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.  Polimerización: fase de alargamiento o de síntesis. La ADN polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTPs complementarios en dirección 5'→3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTPs con el grupo 3'-OH del cebador. La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está en 72°C.


Las moléculas de ADN obtenidas tras el tercer ciclo son de dos tipos: producto corto y producto largo. El producto corto tiene una longitud perfectamente definida por los extremos 5' de los cebadores y contiene exactamente la secuencia que se desea amplificar. El producto largo es el que incorpora las cadenas de ADN originales de la muestra y cuyos extremos 3' no están definidos. Con cada nuevo ciclo se incrementa el número de moléculas de ADN delimitadas por los cebadores.

En la PCR hay una amplificación exponencial:

En la reacción en cadena de la polimerasa se parte, normalmente, de una cantidad de ADN de 50 ng, pero actualmente se puede amplificar incluso una sola molécula de 3,3 pg. Y usualmente se trabaja con ADN no deteriorado, pero se ha llegado a amplificar ADN de herbarios antiguos e incluso de fósiles. Para llevar a cabo la PCR se añaden dNTPs en exceso y cebadores en exceso. Cuando la reacción se acaba no es por falta de dNTPs o cebadores, sino porque la ADN polimerasa se ha soltado de la cadena.

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14 Alberto Fonte Polo Normalmente la Taq polimerasa usa moldes de 100 pb – 2 kb, por encima de 2 kb la enzima en muy poco procesiva. La Taq polimerasa tiene actividad polimerásica 5'→3' y exonucleásica 5'→3', pero no tiene actividad exonucleasa 3'→5', y por ello no puede corregir sus propios errores, y tiene una alta tasa de error (10–4, es decir, comete un error cada 10.000 bases incorporadas). Hay que tener en cuenta que estos errores son acumulativos. La Pfu polimerasa es más lenta, pero posee actividad correctora de pruebas, y por lo tanto tiene menor tasa de error. Los cebadores usados en PCR tienen un tamaño que va desde 15 hasta 30 pares de bases, aunque lo más normal es que tengan un tamaño de 20-24 pb. Tienen que ser secuencias totalmente específicas de la secuencia que se quiere amplificar. Normalmente tienen una composición de guanina-citosina del 50% aproximadamente. La temperatura de hibridación está determinada por la composición de nucleótidos del primer, si la cantidad de G-C es elevada la temperatura de hibridación será alta, 50-60ºC (55ºC Tª óptima). Pero si hay más cantidad de A-T se requerirá menor temperatura de hibridación, y el cebador complementará regiones inespecíficas del ADN. Al sintetizar los cebadores hay que evitar que haya tramos que contengan bases (3-4) repetidas, para que no se formen apareamientos incorrectos. Además, el cebador no debe tener secuencias complementarias, pues se podrían formar bucles, y tampoco deben existir secuencias complementarias entre un cebador y otro, para que no se formen dímeros. Es necesario conocer las secuencias nucleotídicas laterales a la región que se quiere copiar del ADN molde, para poder sintetizar los cebadores complementarios. Si se desconocen estas secuencias hay que recurrir a otros métodos:  Si se conoce la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ADN que se pretende replicar, se puede predecir la secuencia nucleotídica de dicho ADN. Pero hay que tener en cuenta que el código genético es degenerado, y que un mismo aminoácido puede estar codificado por más de un triplete. Por ello, se elabora una mezcla (oligonucleótido degenerado) de todos los posibles cebadores, según la secuencia aminoacídica.  Si se conocen secuencias homólogas al ADN que se quiere amplificar se pueden sintetizar los cebadores específicos. Por ejemplo, conociendo el gen de la insulina de rata se pueden diseñar cebadores para el gen de la insulina humana, puesto que son genes homólogos. Normalmente se trabaja con genes de varias especies distintas, y se buscan las regiones más conservadas como posibles promotores. También se puede elaborar una mezcla de oligonucleótidos con variaciones en la tercera base de los codones.

PCR de ARN La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR del inglés reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de la PCR, en la que una hebra de ARN es retrotranscrita en ADN complementario (ADNc) usando una enzima denominada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en un PCR tradicional. En este proceso se parte de una población de ARNm que se extrae de una preparación de tejido o de un cultivo celular, la reacción será distinta según se quiera amplificar toda la población de ARNm, o por el contrario, sólo un tipo concreto de ARNm. En cualquier caso, la reacción comienza siempre del mismo modo: se añade un oligonucleótido poli-T de 20 o


24 nucleótidos que actuará como cebador, este poli-T complementa con la cola poli-A del ARNm y proporcionará el extremo 3' OH.

La enzima retrotranscriptasa sintetizará una cadena de ADN a partir de la cadena de ARN, y posteriormente, usando su actividad endonucleasa H degradará la cadena de ARN. La transcriptasa inversa actúa a una temperatura de 37ºC. La reacción puede continuar de dos modo distintos:  En el caso de que se quiera amplificar todas las moléculas de ARNm sin distinción, se usará la desoxirribonucleotidil transferasa terminal, esta enzima sintetiza cadenas de ADN sin molde. Si se añaden, por ejemplo, desoxirribonucleótidos trifosfato de guanina la enzima añadirá una cola poli-G en el extremo 3' del ADN. A partir de este punto se procede con una reacción PCR normal. Se añade la enzima Taq polimerasa, una mezcla de dNTPs y dos cebadores de 20-25 nucleótidos: un oligonucleótido poli-C y un oligonucleótido poli-T, que complementarán con las regiones poli-G y poli-A del ADN.  Si se quiere amplificar sólo un tipo de ARNm producido por un gen concreto, es necesario conocer la secuencia nucleotídica del ARNm, y en consecuencia la del ADN, para poder diseñar los cebadores específicos. Se añaden los dNTPs, la Taq polimerasa y los dos primers específicos para que tenga lugar la reacción en cadena de la polimerasa estándar.

La reacción RT-PCR es útil para buscar genes concretos, y probar su expresión en ciertos tejidos.

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Vectores de clonación en bacterias

Clonación Un clon es un conjunto de células genéticamente idénticas, que proceden de un mismo progenitor por división celular. El proceso de clonación de genes implica la construcción de moléculas de ADN recombinante, en estas moléculas se incluye el gen, o fragmento de ADN, a clonar. La molécula de ADN recombinante es posteriormente introducida en células hospedadoras, para que se replique usando las enzimas de la célula, de modo que todas las células descendientes poseerán, al menos, una copia de la molécula recombinante. La obtención de las moléculas de ADN recombinante es un proceso que se realiza in vitro, pero la replicación en el interior de la célula hospedadora es un proceso totalmente in vivo. Las células hospedadoras son normalmente células bacterianas, aunque ocasionalmente también puede transferirse el ADN recombinante a células eucariotas, esto ocurre, sobre todo, cuando se quiere estudiar la expresión de genes eucariotas. La bacteria E. coli es la más usada para este fin. Se trabaja siempre con cepas modificadas genéticamente, a las que se les ha eliminado el sistema de restricción-modificación, para, de este modo, invalidar los sistemas que tiene la bacteria para evitar la intromisión de ADN extraño. Una molécula de ADN recombinante se compone de:  ADN exógeno (o pasajero): es el gen, o fragmento de ADN, que se quiere clonar. Éste puede tener distintos orígenes: – Puede proceder de un genoma fragmentado. – Puede ser un fragmento específico de ADN, amplificado mediante PCR. – Puede ser ADNc (copia) procedente de ARNm. – O puede ser ADN simplexo, que deberá pasarse a duplexo para clonarlo.  ADN vector: molécula que porta el fragmento de ADN exógeno. Se clasifican en: – Vectores de clonación: aquellos que permiten mantener el ADN exógeno en la célula hospedadora. – Vectores de expresión: permiten transcribir y traducir la información genética dentro de la célula hospedadora.

Tipos y características de los vectores de clonación Los distintos tipos de vectores de clonación difieren en la especificidad de la célula huésped, el tamaño de los insertos que pueden transportar y en características como el número de copias que producen y el número y tipo de genes marcadores que contienen.  Plásmidos: fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas. Portan fragmentos pequeños de ADN pasajero, de entre 0,1 y 8 kb (kilobases). Algunos plásmidos usados como vectores son: pBR322, pUC18, pBluescript…


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Vectores λ de inserción: son vectores basados en el genoma del fago lambda, que pueden portar fragmentos de ADN de 0,1–8 kb. Vectores λ de sustitución o de reemplazamiento: son también vectores basados en el genoma del fago λ, pero pueden portar fragmento mayores (8–23 kb). Cósmidos: son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Pueden transportar entre 20 y 45 kb de ADN insertado. BAC (bacterial artificial chromosome): es un cromosoma artificial bacteriano que puede transportar insertos de 300 kb a 1,5 Mb (megabases). YAC (yeast artificial chromosome): son cromosomas artificiales de levadura, permiten clonar grandes trozos de ADN, de 2–3 Mb de tamaño. Al ser fragmentos tan grandes, muy frecuentemente se producen alteraciones de la molécula de ADN.

Características generales de los vectores de clonación:  El ADN no esencial debe ser mantenido al mínimo. Para que estos vectores se reproduzcan eficazmente en las bacterias es necesario que tengan el tamaño más pequeño posible.  Tienen que ser moléculas autorreplicativas, y por lo tanto, deben tener su propio origen de replicación.  Deben poseer genes marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.  Deben tener un sitio de clonación, es decir, un sitio que permita introducir el ADN pasajero. Estos sitios son dianas de restricción, puede haber una sola diana que sea reconocida por una sola enzima, o varias dianas reconocidas por varias enzimas de restricción. Pero, cada diana de restricción debe estar presente sólo una vez en el vector, ya que si no, éste se fragmentaría.

Plásmidos Características de los plásmidos naturales:  Son moléculas circulares de ADN duplexo de tamaños muy variables, desde 1 kb hasta 8 kb.  Son moléculas de ADN extracromosómico que portan información adicional, no esencial, para la bacteria. En muchas ocasiones las bacterias con plásmidos presentan algún tipo de ventaja respecto de las que no tienen.  Son moléculas autorreplicativas, tienen un origen de replicación (ORI). Se sirven de las enzimas de la célula bacteriana para replicarse, pero contienen genes reguladores de la replicación, si éstos son muy estrictos la bacteria sólo tendrá dos o tres copias del plásmido, pero si los genes reguladores de la transcripción son relajados puede haber hasta 800 copias del plásmido.  Pueden transferirse por conjugación de una bacteria a otra, puesto que poseen ORI genes tra (transferencia) y genes mob (movilidad). Éstos no están presentes en los plásmidos usados como vectores, Genes reguladores pues no interesa que se transfieran de tra de la replicación una célula a otra. mob Plásmido

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18 Alberto Fonte Polo En el caso de los plásmidos usados como vectores, sólo es necesario que posean el origen de replicación. Y tienen genes reguladores relajados, para conseguir el mayor número de copias posible. Los plásmidos vectores que se usan en el laboratorio son totalmente artificiales, no existen en la naturaleza. Se les ha incluido genes marcadores procedentes de genomas bacterianos, y fragmentos de ADN artificiales con dianas de restricción. Plásmido pBR322: es el primer plásmido utilizado en biotecnología, fue diseñado en 1977 por Bolívar y Rodríguez (de ahí su nombre pBR). A este plásmido se le han añadido dos genes marcadores: un gen de resistencia a la ampicilina (ampr) y otro de resistencia a la tetraciclina (tetr); y tres dianas de restricción: EcoRI, PstI y BamHI. La inserción de ADN foráneo puede hacerse en cualquiera de las tres secuencias.

La diana PstI se encuentra inserta en el gen que confiere resistencia a ampicilina, y la diana BamHI está dentro del gen de resistencia a la tetraciclina. Por ejemplo, si la enzima PstI reconoce la diana PstI cortará el plásmido por ese punto, e introducirá el ADN exógeno interrumpiendo e invalidado el gen ampr. Por lo tanto, esta bacteria no podrá crecer en un medio con el antibiótico ampicilina, pero sí en un medio con tetraciclina. Si el ADN exógeno se introduce en la diana BamHI la bacteria será sensible a la tetraciclina y resistente a la ampicilina. Pero si el ADN exógeno se introduce en la diana EcoRI, la bacteria presentará resistencia a los dos antibióticos. De este modo puede distinguirse entre bacterias sin plásmido, con plásmido salvaje, o con plásmido recombinante, y además se puede saber el lugar donde se ha insertado el ADN pasajero. Plásmidos pUC (plasmid of University of California, plásmido de la Universidad de California): son un conjunto de plásmidos (por ej. pUC18, pUC19) muy utilizados como vectores, ya que presentan unas características que son muy beneficiosas:  Son pequeños, de modo que pueden transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de 8 a 10 kb).  Tienen un origen de replicación y pueden producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula (tienen control relajado de la replicación).  Se han modificado para que presenten muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker o sitio de clonación múltiple (MCS: multiple cloning site).


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Permiten la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contienen un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco.

El plásmido pBluescript es un vector comercializado de la serie pUC. Está formado por una molécula circular de ADN duplexo, de tamaño inferior a 3 kb, que comprende: 1. Un fragmento lacZ + polylinker + 2 promotores: el fragmento del gen lacZ procede del operón lactosa de E. coli, y contiene el minigen de la β-galactosidasa (también contiene el promotor lac). En el extremo 5' terminal de este fragmento lacZ se ha introducido el polylinker. El polylinker es rico en sitios de restricción únicos, es importante que las dianas de restricción estén presentes sólo una vez en el plásmido, pues si no, se fragmentaría la molécula, y lo que se pretende es linealizarla. Los promotores T3 y T7 también interrumpen el gen lacZ, se sitúan flanqueando el polylinker. Estas regiones promotoras proceden del fago T3 y T7 respectivamente, y son reconocidas por las enzimas ARN polimerasas de dichos fagos. 2. Un origen de replicación del fago M13 o F1: estos bacteriófagos son similares al fago ΦX174 de E. coli, su material genético es una molécula de ADN circular simplexo, pero cuando infecta a la bacteria se convierte en ADN circular duplexo, y por medio del mecanismo del circulo rodante se originan moléculas simplexas nuevamente. Esta región f1 origin se emplea cuando se quiere replicar un ADN en forma de monohebra. No obstante, la replicación sólo se puede hacer por coinfección con un virus auxiliar (helper) que aporte los genes que codifican las enzimas necesarias para la replicación. Este procedimiento ha sido muy utilizado para secuenciar el ADN, puesto que para esta tarea debe pasarse de ADN duplexo a ADN simplexo. 3. Un gen de resistencia a la ampicilina: este gen permite, gracias al cultivo en presencia de ampicilina, seleccionar todas las bacterias que han incorporado Bluescript, ya sea con o sin el inserto. (La selección de los Bluescripts recombinantes se realiza según si la β-galactosidasa que se obtiene es, o no, funcional). 4. Una secuencia origen de replicación (ColE1 ori): esta secuencia permite la multiplicación del plásmido en E. coli.

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20 Alberto Fonte Polo El gen lacZ del operón lactosa codifica la LacZ 5′ 3′ enzima β-galactosidasa, que cataliza la reacción de hidrólisis de la lactosa en glucosa más COOH galactosa. Esta enzima debe estar en forma NH2 tetramérica para ser efectiva. Para que se produzca la tetramerización de la βminigen β-galactosidasa galactosidasa se requiere la información del minigen (fragmento de la región 5' de lacZ), que codifica los 149 aminoácidos del extremo N-terminal del péptido. Los restantes aminoácidos constituyen un monómero de βgalactosidasa. El plásmido pBluescript contiene el minigen de β-galactosidasa con capacidad de tetramerizar. Este plásmido se introduce en cepas modificadas de E. coli que contienen un gen lacZ defectivo que sólo codifica los monómeros de la β-galactosidasa. De este modo, ocurre una complementación: el péptido que codifica el minigen hace que los cuatro monómeros se ensamblen para formar la β-galactosidasa funcional.

El gen lacZ está reprimido de forma natural, y sólo se traduce en presencia de un inductor, el galactósido IPTG. In vivo, la lactosa es la molécula inductora. IPTG induce por desactivación de la represión la síntesis de la β-galactosidasa. La presencia de la enzima β-galactosidasa se detecta añadiendo al cultivo celular un sustrato de ésta, denominado X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido). X-Gal es un β-galactósido que, al igual que la lactosa, puede ser hidrolizado por la β-galactosidasa. La ventaja de este sustrato es que su hidrólisis libera, además de galactosa, una sustancia X (5-bromo-4-cloro-3-hidroxi-indol) coloreada en azul.


Pero, cuando se inserta una molécula de ADN pasajero dentro del plásmido no se forma el tetrámero β-galactosidasa. Y esto es porque el ADN se introduce dentro del minigen, y la proteína que se genera no tiene la capacidad de tetramerizar. Al no producirse βgalactosidasa funcional X-Gal no se metaboliza y no cambia a color azul. En resumen, en presencia de ampicilina sólo sobreviven las bacterias transformadas. Aquellas colonias de color blanco corresponden a bacterias con plásmido recombinante, mientras que las colonias de color azul corresponden a bacterias con plásmido pBluescript salvaje, es decir, sin inserto de ADN foráneo.

Vectores basados en el genoma del fago λ El bacteriófago lambda es un virus que infecta a la bacteria Escherichia coli. Se trata de un virus complejo de ADN lineal bicatenario. Los extremos de su material genético son cohesivos y complementarios (extremos cos) y ello hace que tras la infección su genoma se circularice, comportándose, en caso de seguir un ciclo lisogénico, como un plásmido y aprovechando las enzimas recombinantes de la bacteria para integrarse en el genoma de ésta. El fago no tiene por qué integrarse, y de hecho es más habitual que se comporte como un virus de ciclo lítico.  En el ciclo lisogénico, el virus se inserta en un punto concreto del genoma de la bacteria. En este estado, el virus se replica cuando lo hace la bacteria, pasando su genoma a las réplicas de E. coli.  El ciclo lítico es la forma más habitual de actuación del virus al infectar la célula, y también es la vía que sigue al final del ciclo lisogénico. En ella se producen partículas virales que son liberadas al medio una vez que la bacteria hospedadora es lisada, matando a la célula en el proceso. El virus replica su genoma circular empezando por un punto de éste, y desenrollando sólo una de las dos hebras. El resultado es un genoma lineal muy largo, consistente en una gran cantidad de repeticiones del genoma original de forma seguida, lo que se conoce como concatámero (o concatémero). La enzima terminasa es una endonucleasa que corta el concatámero mediante sucesivos cortes en escalera (en las regiones cos). El virus también sintetiza las proteínas de su cápside, y se ensambla en el citoplasma de la bacteria. Dentro de la cápside sólo cabe, prácticamente, el genoma de un virus. Finalmente, la célula es lisada, liberando los viriones al medio.

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22 Alberto Fonte Polo El genoma del fago lambda se ha cartografiado y secuenciado completamente. Para ser utilizado como vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar calvas. Antes de introducir el ADN exógeno hay que eliminar partes no útiles del genoma del virus, para, de este modo, dejar espacio, pues en la cápside sólo hay hueco para 50 kb, y el genoma del virus tiene 48.502 pb. Las regiones prescindibles corresponden a los genes que controlan el ciclo lisogénico.

Regiones prescindibles del genoma del fago λ

Dependiendo de la cantidad de ADN vírico que se elimine, para insertar el ADN pasajero, existen dos tipos de vectores: vectores de inserción y vectores de sustitución. En los vectores de inserción se ha eliminado sólo una parte de los genes que controlan la lisogenia. Los vectores de inserción sólo presentan un sitio de restricción, donde se introduce el inserto. Sirven para la clonación de pequeños fragmentos (hasta 8 kb).

Por ejemplo, el vector de inserción λgt10 presenta sólo la diana de restricción EcoRI, que está situada en el gen cI que codifica el represor λ, éste impide el ciclo lítico. Esto hace que la inserción de ADN extraño en este sitio inactive el gen cI. El represor no se sintetiza y el ciclo del virus orienta hacia la vía lítica. En cambio, si el gen cI está activo el fago entra en ciclo lisogénico. El vector λgt11 utiliza como sistema de selección el gen lacZ del operón lactosa.


En los vectores de sustitución (o de reemplazamiento) se sustituye toda la región prescindible del genoma del fago por el ADN de interés. De este modo se pueden insertar moléculas exógenas de mayor tamaño (de hasta 20-25 kb). Los vectores de sustitución tienen dos sitios de restricción que flanquean el segmento de ADN que es sustituido por el ADN que se va a clonar. Al tratar el genoma del fago con una enzima de restricción se obtendrán tres fragmentos: brazo izquierdo, brazo derecho y región stuffer (región prescindible).

En el ADN stuffer se han introducido varias dianas de restricción para poder fragmentarlo en pequeños trozos que, por centrifugación, pueden separarse fácilmente de los fragmentos de ADN mayores. El ADN pasajero ocupará el lugar del ADN stuffer, aunque también pueden ligarse los dos brazos sin incorporar el ADN exógeno. Por eso, es necesario seleccionar las moléculas recombinantes. Los vectores λ recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago λ, y se pasan a un césped bacteriano. Se debe añadir la cantidad adecuada de fagos, para que cada célula huésped bacteriana sea infectada por uno sólo de estos virus. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman múltiples copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Cada fago infectará una célula, se replicará y la lisará. A continuación, la descendencia de viriones infectará y, en consecuencia, lisará las bacterias adyacentes al lugar de la primera célula infectada, creando entonces una región clara o calva en el campo bacteriano opaco. Los fagos contenidos en cada calva, o placa, de lisis pueden recogerse para ser analizados.

Proceso de empaquetamiento in vitro

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24 Alberto Fonte Polo Para conseguir cápsides víricas vacías se usan cepas mutantes del fago λ. Una cepa formará colas pero no cápsides, debido a una mutación, otra cepa no produce colas pero sí cápsides. Cuando se reúnen las colas, las cápsides y el ADN recombinante ocurre el empaquetamiento in vitro de éste. Los vectores λ tienen extremos cohesivos 5', esto hace que se forme un concatémero de vectores, algunos de ellos tendrán inserta la región de ADN exógeno y otros no. Junto al extracto de empaquetamiento (proteínas fágicas) se añade la enzima terminasa, que corta e individualiza cada molécula. Dentro de la cápside sólo se introducen moléculas de ADN de 50 kb aproximadamente, por lo tanto, las moléculas brazo izquierdo–brazo derecho no forman partículas infectivas, pues al tener un tamaño menor no entran en la cápside. Todos los virus que se formen contienen en la cápside moléculas del tipo brazo izquierdo–ADN exógeno–brazo derecho porque son las que tienen el tamaño adecuado. De este modo se ha conseguido seleccionar las moléculas recombinantes.

Cósmidos Los cósmidos son vectores de clonación que permiten la introducción de insertos de ADN de hasta 45 kb. Realmente un cósmido consiste en un plásmido al cual se le han adicionado unos segmentos del genoma de un bacteriófago como el fago λ, por lo tanto, presenta características intermedias entre los plásmidos y los vectores λ de reemplazamiento. Un cósmido contiene:  Del plásmido, el origen de replicación y genes marcadores de resistencia a antibióticos, esto depende del tipo de plásmido del cual derive y, por tanto, puede contener más segmentos como por ejemplo el gen lacZ (que permite la selección blanco/azul de las colonias) u orígenes de replicación para fagos como el M13 (que permiten la obtención de ADN simplexo, usado para aplicaciones como la secuenciación del inserto).  Del fago λ, los extremos cos, extremos complementarios del genoma del fago y que se emplean para la recircularización del mismo. Estos vectores facilitan el trabajo porque permiten el empaquetamiento in vitro, gracias a los extremos cos, de los cósmidos en las partículas fágicas λ. Los fagos empaquetados se usarán para infectar cepas de E. coli, consiguiendo un plásmido en la bacteria, ya que el cósmido se recirculariza, al entrar a ésta, gracias a los extremos cos. Uno de los cósmidos más usados es el SuperCos, contiene: – Dos sitios cos, entre los cuales se sitúa la diana de restricción Xba I. – Un origen de replicación (ori). – Un sitio de clonaje múltiple (MCS), es un polylinker que no interrumpe ningún gen marcador, incluye la diana de restricción BamH I. – Dos genes marcadores: uno de resistencia a ampicilina y otro de resistencia a neomicina. – SV40 ori: origen de replicación del virus animal SV40, usado para replicar el vector cuando se introduce en células animales.


Para producir cósmidos recombinantes, en primer lugar, se usa la enzima de restricción BamHI para cortar el vector y linealizarlo. Después, se emplea la enzima fosfatasa alcalina que hidroliza los grupos P de los extremos 5' y los transforma en extremos 5' OH y, de este modo, se evita que el plásmido se circularice de nuevo.

Posteriormente se inserta el ADN exógeno, previamente cortado con la restrictasa Sau3AI. La enzima Sau3AI genera extremos compatibles con la enzima BamHI, es decir, son enzimas isoesquizómeras. Para ello, se hace una digestión parcial del ADN que se quiere introducir en el cósmido. En una digestión parcial las condiciones de la reacción impiden que sean reconocidas todas las dianas, y ocurren menos cortes de los que se esperarían en condiciones normales. Como resultado se obtienen fragmentos de ADN de un tamaño mayor. Se usa la enzima Sau3AI en lugar de la enzima BamHI, porque la primera reconoce una diana de sólo 4 pares de bases, y la segunda tiene una diana de 6 pares de bases. Es decir, si se cortara el ADN usando una diana de 6 pb los fragmentos que se obtendrían serían demasiado grandes, ya que esta diana aparece con menos frecuencia que una de 4 pb. La ADN ligasa une los extremos 3'-OH sólo con los 5'-P, y no con los 5'-OH, por eso queda una mella entre el ADN exógeno y el ADN del cósmido. Hay que recordar que los extremos que ha dejado la enzima BamHI en el cósmido tienen grupos –OH en el extremo 3' y en el 5', debido a la acción de la fosfatasa.

En segundo lugar, se digiere el cósmido con la enzima de restricción XbaI, que corta el vector entre las regiones cos. Los cósmidos linealizados pueden unirse, por los extremos cos, y formar un concatámero.

Por último, se añaden los extractos de empaquetamiento del fago λ junto con la enzima terminasa, para empaquetar in vitro el cósmido con el ADN que se quiere clonar. Del mismo modo que ocurría con los vectores de sustitución, dentro de las cápsides sólo se empaquetan las moléculas que tienen ADN recombinante, pues son las que tienen el tamaño adecuado. Estos fagos no entran en ciclo lítico (tampoco en ciclo lisogénico), puesto que, los únicos genes que hay en el cósmido procedentes del genoma del fago λ son los extremos cos. Y por lo tanto, no producen la lisis de las bacterias que infectan, ni se reproducen dentro de éstas. El fago sólo se utiliza para introducir el cósmido, que se comporta como un plásmido, en el interior de las bacterias, este proceso se denomina transducción. Las colonias de bacterias que contienen en su interior ADN recombinante, se seleccionan gracias a que el cósmido lleva genes de resistencia a antibióticos.

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BACs El cromosoma artificial bacteriano, o BAC (bacterial artificial chromosome), es un vector usado para clonar fragmentos de ADN de 300 kb de tamaño medio. Se distinguen dos tipos:  Los BACs propiamente dichos, están basados en el plásmido factor-F (factor de fertilidad) encontrado de modo natural en la bacteria Escherichia coli. Este factor es un episoma que puede integrarse en el cromosoma bacteriano y es responsable de la conjugación bacteriana.  Los PACs (P1-derived artificial chromosome), son cromosomas artificiales bacterianos derivados del fago P1, alojan menos cantidad de ADN pasajero que los BACs. Un PAC típico consta de: – Dos secuencias pac, son secuencias repetidas protuberantes que permiten el empaquetamiento in vitro. – Dos secuencias lox que intervienen en la circularización del vector. – Un origen de replicación (ori). – Un gen marcador de resistencia a la canamicina (kanr). – Un gen marcador sac implicado en el metabolismo de la sacarosa, que está interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS).

De forma natural el bacteriófago P1 sólo presenta un sitio lox, pero en el PAC se han insertado dos regiones lox. En el interior de E. coli, la enzima recombinasa reconoce los sitios lox y produce la circularización del ADN situado entre éstos. Para la selección de las moléculas PAC recombinantes se usan cepas de E. coli sac–, es decir, cepas que no pueden crecer en presencia de sacarosa. Esto es debido a que en el metabolismo de la sacarosa se produce un levano, que resulta tóxico para estas bacterias. Dentro del gen sac se encuentra un polylinker con dianas de restricción. Cuando se introduce una molécula de ADN recombinante el gen sac queda interrumpido, las bacterias no sintetizan el levano tóxico y pueden crecer con normalidad. Pero aquellas bacterias que no poseen vectores recombinantes mueren, puesto que, el gen sac se expresa con normalidad y se produce el compuesto tóxico. Para el empaquetamiento in vitro de los PACs se usan extractos de empaquetamiento del fago P1 y enzima pacasa. La pacasa reconoce los extremos pac y permite el empaquetamiento del vector en las partículas fágicas. Dentro de la cápside del fago el vector se encuentra en forma lineal, pero cuando se introduce en la bacteria, ésta sintetiza recombinasa, y se circulariza la molécula. Un BAC propiamente dicho incorpora insertos, normalmente, de 300 kb, pero se ha conseguido clonar fragmentos de hasta 1 Mb. Presenta genes procedentes del plásmido F: – oriS: origen de replicación. – rep: control de la replicación del plásmido. – parA, parB, parC: genes implicados en el mantenimiento de un número bajo de copias (1 o 2) del plásmido en la bacteria.


Además, tiene otros genes que no proceden del factor-F: – cmr: gen de resistencia al cloranfenicol. – Minigen lacZ con un polylinker (MCS) en su interior. Se usa para el ensayo de alfacomplementación, del mismo modo que ocurre en el plásmido pBluescript. A ambos lados del minigen lacZ hay una diana de restricción de la enzima NotI, esta restrictasa se usa para desinsertar el ADN pasajero. – lox: sitio reconocido por la enzima recombinasa, permite linealizar el vector. Procedimiento de clonación: en primer lugar, se corta el vector con BamHI para linealizarlo, y se añade fosfatasa alcalina para desfosforilar los extremos 5' del vector, y evitar autoligación. Después, se hace una digestión parcial del ADN que se quiere clonar con la enzima Sau3A, la cual genera extremos compatibles a los de la enzima BamHI, y se lleva a cabo la reacción de ligación de ambas moléculas de ADN. Para la transformación de las bacterias se emplea la electroporación. Este método consiste en la aplicación de un campo eléctrico que produce poros transitorios en la membrana citoplasmática de la bacteria, a través de los cuales puede introducirse el BAC. La selección de los clones se hace en un medio con cloranfenicol, con IPTG y con X-gal. Las bacterias que resisten el antibiótico son las que han incorporado el BAC, las colonias que presentan color azul son aquellas cuyo vector no tiene ADN exógeno, y las colonias blancas tienen BACs recombinantes.

YACs El cromosoma artificial de levaduras o YAC (yeast artificial chromosome) es el vector de clonación de mayor capacidad (hasta 2 Mb). Es un vector que pretende imitar las características de un cromosoma normal de una levadura, portando un centrómero y telómeros terminales. Esto permite clonar en levaduras grandes secuencias de ADN, al comportarse como un cromosoma propio de este microorganismo eucariota. Son utilizados en construcción de genotecas genómicas, sin embargo, son más inestables que otros vectores como los BACs, que han acabado imponiéndose. Un problema que presentan los YACs es que el ADN que se inserta puede proceder de dos regiones distintas del genoma. Los YACs contienen características de bacterias: – Origen de replicación (ori) de tipo plasmídico. – Gen marcador de resistencia a ampicilina (ampr). Y características de levaduras: – Secuencia de replicación de levaduras (SRA). – Genes marcadores de selección: un gen TRP relacionado con el metabolismo del triptófano, y un gen URA relacionado con el metabolismo del uracilo. – Gen marcador de inserción sup, relacionado con el metabolismo de la adenina, interrumpido con un sitio de clonaje múltiple (MCS). Este gen identifica las células de levadura que incorporan el vector, ya que las células huésped que expresan

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normalmente el gen sup muestran un color rojizo (sup+), mientras que las que presentan ADN recombinante adquieren un color blanquecino (sup–). Centrómero (CEN), permite la segregación durante la división celular. Dos secuencias teloméricas (TEL), procedentes de un ciliado del género Tetrahymena, pero que funcionan con las levaduras. Entre estas dos secuencias se sitúa una diana de restricción para la enzima BamHI.

Procedimiento de clonación: se digiere el vector y el ADN que se quiere clonar con la misma restrictasa, o con restrictasas isoesquizómeras, para que ocurra el ligamiento entre ambas moléculas. Para que el vector se comporte como un cromosoma más de la levadura hay que linealizarlo, mediante el uso de la enzima de restricción que reconoce la diana que se encuentra entre las regiones TEL, dejando, de este modo, funcionales las secuencias teloméricas. Los YACs se introducen en el interior de levaduras para que ocurra la clonación del ADN recombinante, pero también se pueden introducir en bacterias, pues poseen un origen de replicación de procariotas.


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Clonación en bacterias

Concepto de genoteca Una genoteca (genomic library en inglés) es un conjunto de clones en los que está contenido el genoma de un organismo. La construcción de una genoteca implica: aislar el genoma completo de la célula (obtención de ADN genómico), fraccionar el genoma en fragmentos de un tamaño apropiado, clonar cada fragmento en un vector, e introducir cada molécula recombinante en una célula hospedadora. Las genotecas se usan para aislar y estudiar genes, o secuencias genómicas. Cuando se quiere clonar un fragmento de ADN previamente amplificado mediante PCR no se construye una genoteca, ya que se parte de una muestra pura. Existen dos tipos de genotecas según contengan ADN genómico o ADNc:  Genoteca genómica: contiene el genoma de un organismo. Se emplea para aislar un gen determinado completo (con intrones y exones, en el caso de eucariotas) o para clonar regiones reguladoras que no se transcriben (por ejemplo, promotores).  Genoteca de ADN copia: está constituida por ADN copia, sintetizado, por acción de la transcriptasa inversa, a partir de los ARNm expresados en una célula, tejido u organismo. Esta genoteca es útil cuando se quiere clonar un gen procesado, para ser expresado directamente a ARN. Cuando se quiere expresar un gen eucariota en bacterias, éste debe estar procesado, ya que las enzimas procarióticas no reconocen las regiones intrónicas. Parámetros de una genoteca:  Tamaño de la genoteca, es decir, el número de clones que constituye una genoteca.  Tamaño medio de los insertos, condiciona el tamaño global de la genoteca.  Representatividad, cuanto mayor sea la probabilidad de encontrar un clon determinado más representativa será la genoteca. Hay que tener en cuenta que, la clonación es un proceso aleatorio, puede haber fragmentos del genoma que, por azar, estén más representados en la genoteca, y otros que no lo estén en absoluto. Lo importante es que todos los fragmentos estén presente en al menos un vector, pero existen ciertas regiones del genoma, con secuencias repetitivas, que son difíciles de clonar, pues presentan gran capacidad para alterarse. Para que una librería genómica sea representativa, el número de clones debe ser superior al número de fragmentos generados.

Construcción de genotecas de ADN genómico y de ADN copia Construcción de genotecas genómicas: el número de clones componentes debe ser, en la práctica, suficiente para abarcar todo el genoma, incluyendo tanto el ADN codificante como el no codificante. La preparación del ADN de partida se realiza por escisión del genoma con enzimas de restricción bajo condiciones de rotura parcial, es decir, que no

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30 Alberto Fonte Polo permitan la actuación exhaustiva de la enzima sobre todos los sitios de restricción presentes en el ADN. La rotura se produce en cada molécula aleatoriamente sobre el conjunto de sitios de restricción, de forma que aparecen un número menor de fragmentos, y estos son de mayor tamaño, respecto a lo teóricamente posible, y diferentes de una a otra molécula.

Construcción de genotecas de ADN complementario: a diferencia del caso anterior, las genotecas de ADNc representan exclusivamente a la parte codificante del genoma. La clonación del ADN copia está basada en la acción de la transcriptasa inversa, una ADN polimerasa dependiente de ARN derivada de retrovirus, que puede sintetizar una cadena de ADNc complementaria de un molde de ARN. La retrotranscriptasa requiere un cebador para iniciar la síntesis de ADN, tal como un oligonucleótido constituido por timidinas (oligo-dT); este fragmento se une a la cola poli-A en el extremo 3' de las moléculas de ARNm y proporciona un cebador que es ampliado por la transcriptasa inversa para la síntesis de una copia complementaria. Después se elimina el ARNm, y la cadena única de ADNc se usa como plantilla para la ADN polimerasa, y se origina una molécula de doble cadena.


A las moléculas de ADNc de doble cadena, se le añaden en ambos extremos unas moléculas cortas de ADN, denominadas adaptadores (o ligadores). Los adaptadores presentan en su interior una diana de restricción, y cuando se digiere el ADNc con la enzima de restricción específica se generan extremos cohesivos. Pero, la diana de los adaptadores también puede estar presente dentro de la molécula de ADNc original, en este caso la molécula se fragmentaria al hacer la digestión con la enzima de restricción. Para evitar esto, hay que metilar el ADNc antes de ligar los adaptadores, ya que cuando una diana está metilada no es reconocida por la enzima. Por último, las moléculas de ADNc con los extremos cohesivos se pueden ligar a un vector apropiado para crear una genoteca representativa de todos los transcritos originales de ARNm que se encuentran en la célula o en el tejido original.

Representatividad de una genoteca A partir del tamaño del genoma completo y del tamaño medio de los insertos se puede calcular el número mínimo de clones necesario para que la genoteca represente al genoma completo. Sin embargo, el carácter aleatorio de la preparación de fragmentos y del proceso de clonación hace que, para tener certeza de que una genoteca contiene cualquier región del genoma, se requiera en la práctica un número de clones muy superior al teórico. Para calcular el número de clones mínimo para que una genoteca sea representativa se utiliza la siguiente fórmula: N=

ln 1–P ln 1– 1 n

N: número de clones; P: probabilidad de que un clon en la genoteca tenga una secuencia determinada; n: número de fragmentos distintos que se pueden generar, depende del tamaño del genoma y del tamaño medio del inserto. n=

tamaño medio del inserto (pb) tamaño del genoma (pb)

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32 Alberto Fonte Polo Por ejemplo: el tamaño del genoma humano es de aproximadamente 3∙109 pb, si se quieren hacer insertos de alrededor de 20∙103 pb, ¿qué cantidad de clones hay que usar para trabajar con una probabilidad del 95%, y para una probabilidad del 99%? Se pueden generar 1,5∙105 fragmentos distintos (3∙109 pb 2∙104 pb). Si todos los fragmentos se clonaran se obtendrían 1,5∙105 clones, pero como el proceso es aleatorio hay que trabajar con un número de clones mayor: P = 95%

N=

ln 1–0,95 = 450.000 clones ln 1– 1 1,5∙105

P = 99%

N=

ln 1–0,99 = 690.000 clones ln 1– 1 1,5∙105


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Rastreo de genotecas

Detección e identificación de clones individuales El rastreo de genotecas incluye una serie de procedimientos que permiten detectar, de entre los centenares de miles de clones que componen una genoteca, aquel clon que es portador de la secuencia de interés. Las estrategias que se pueden llevar a cabo para el rastreo de las genotecas dependerán del conocimiento previo, que posea el investigador, de la secuencia de interés. Pueden darse dos situaciones:  Que se conozca la secuencia de nucleótidos que componen el fragmento de ADN buscado, es decir, que se conozca su estructura.  O que se conozca el producto de expresión (proteína) del fragmento, esto es, que se conozca su función. Algunos de los métodos usados para la identificación de clones recombinantes de interés en una genoteca son: la hibridación de ADN usando alguna sonda marcada, y el rastreo inmunológico (uso de anticuerpos frente al producto de interés).

Detección directa por complementación El método más usado, cuando se conoce la estructura del fragmento de interés, es la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda específica. Su fundamento estriba en la posibilidad de formación de ADN de cadena doble entre cadenas sencillas del ADN a sondear y cadenas sencillas de ADN marcado (ADN sonda). Una sonda es un fragmento de ácido nucleico que se usa para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. Existen varios tipos fundamentales de sondas de ácidos nucleicos: ADN genómico, ADN copia, ARN o un oligonucleótido sintético. La sonda se puede marcar de varias maneras, mediante nick translation, random priming, o por PCR. Ahora bien, ¿cuál es la fuente de la sonda? Lógicamente, el usar una sonda de ADN determinada se justifica porque sepamos o sospechemos que dicho ADN puede tener parecido con el ADN que estamos buscando en la genoteca. Los principales orígenes de las sondas moleculares son los siguientes:  Una secuencia de ADN procedente de otro organismo y de la que tenemos indicios de que puede tener parecido con lo que estamos buscando. A este tipo de sondas se las suele denominar como sondas heterólogas.  Una sonda sintética elaborada a partir de la información disponible sobre la secuencia de aminoácidos de la proteína correspondiente al gen que estamos buscando. Con esta información, y teniendo en cuenta que el código genético es degenerado, podemos sintetizar todos los posibles oligonucleótidos sinónimos que codificarían dicha porción de proteína. Marcando esa mezcla de oligonucleótidos, los podemos usar como sonda para localizar el gen en una genoteca. Pero, de entre todos los oligonucleótidos, sólo unos pocos serán homólogos a la secuencia de

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34 Alberto Fonte Polo interés, y por lo tanto, habrá una señal de hibridación muy débil. Por otro lado, hay que tener en cuenta que puede haber falsos positivos cuando algunos de los oligonucleótidos hibriden con regiones del ADN que no son las buscadas. El procedimiento para el rastreo por hibridación de ADN es el siguiente: las genotecas se construyen en placas de Petri con medio de cultivo selectivo. Las miles de colonias de una genoteca se replican a filtros de nylon o de nitrocelulosa, las colonias se fijan a la membrana de nylon mediante alta temperatura (80ºC) o por luz ultravioleta. Posteriormente se usa una solución alcalina (NaOH) para lisar las bacterias y desnaturalizar el ADN recombinante. El ADN sonda se desnaturaliza también para convertirlo a cadenas sencillas. Y se mezcla el ADN sonda desnaturalizado y marcado con los filtros que contienen el ADN de la genoteca (igualmente desnaturalizado), esta reacción se realiza a una temperatura (6065ºC) adecuada para que la sonda se una a la región especifica, pero no renaturalicen ambas cadenas. Si el ADN sonda tiene cierto grado de homología con el ADN de alguno de los clones, se emparejará con dicho ADN para generar doble hélice. Después, hay que lavar la muestra a alta temperatura para eliminar el exceso de sonda, y para eliminar las sondas que se hayan unido en regiones inespecíficas. Finalmente revelamos el resultado, el procedimiento de detección dependerá del tipo de marcaje realizado. En la película fotográfica de autorradiografía, encontraremos unas manchas peculiares correspondientes a las colonias que hayan dado la hibridación con la sonda. Con esta información vamos a las placas matrices donde están las colonias originales de células vivas, y recuperamos los clones, que podemos seguir estudiando.

Detección indirecta por hibridación de ácidos nucleicos Cuando no se dispone de una sonda específica se puede recurrir a la hibridación diferencial o a la hibridación sustractiva de ácidos nucleicos. Hibridación diferencial: este método permite la detección de clones que se expresan abundantemente en un tejido, y muy poco, o nada, en otro tejido diferente. Se extrae el ARNm de cada uno de los tejidos, y se retrotranscribe a ADNc de doble cadena, mediante la transcriptasa inversa. Parte del ADNc del tejido 1 se marca y se usa como sonda, y parte


se usa para construir una genoteca; mientras que el ADNc del tejido 2 se marca y se usa todo como sonda. A continuación, se hacen dos réplicas a membrana de la placa de Petri que contiene la genoteca.

Cada placa replicada se pone a hibridar con el ADNc marcado: una placa con el ADNc del tejido 1 y otra con el ADNc del tejido 2. Finalmente, se obtienen dos placas de autorradiografía que pueden comparase. Los clones que hibridan sólo con la sonda 1 y no con la 2 son portadores de genes que se expresan sólo en el tejido 1, y no se expresan (o lo hacen muy poco) en el tejido 2. Y los clones que hibridan en ambas placas son portadores de genes que se expresan en ambos tejidos. Teóricamente, en la placa que se ha añadido el ADNc sonda del tejido 1 debería observarse hibridación en todos los clones, ya que ambas moléculas de ADN (de la sonda y de la genoteca) proceden del mismo tejido. Pero, hay que tener en cuenta que el ADN copia procede del ARNm, por lo tanto, dependiendo del nivel de expresión de cada gen en dicho tejido, habrá más o menos copias de ADNc. Y en las placas de autorradiografía sólo se observa la hibridación cuando la cantidad de ADNc sonda que ha hibridado es alta. Hibridación sustractiva: mediante este método se pueden detectar clones que se expresan poco en un tejido, pero que no se expresan nada en otro. Como en el caso anterior, se extrae el ARNm de dos tejidos distintos. El ARNm del tejido 1 se retrotranscribe a ADNc simplexo, y se pone a hibridar con el ARNm del tejido 2. La solución de hibridación contendrá tres tipos de moléculas distintas:  Moléculas de ARNm del tejido 2 que no hibridan con el ADNc del tejido 1. Representa los genes que se expresan sólo en el tejido 2.

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36 Alberto Fonte Polo  Moléculas de ADNc del tejido 1 que no han encontrado secuencias homólogas en el ARNm del tejido 2. Son los genes exclusivos del tejido 1.  Moléculas híbridas de ADN-ARN. Son los genes que se expresan en ambos tejidos. La mezcla de las tres moléculas se hace pasar por una columna de hidroxiapatito, que retiene las moléculas duplexas. Se recoge la fracción eluida de la columna, que contiene las moléculas simplexas (ADNc 1 y ARNm 2), y se pone en presencia de una ADN polimerasa y de nucleótidos (dNTPs). La enzima ADN polimerasa no usará como sustrato el ARNm, sólo trabajará con el ADNc del tejido 1, el cual pasará a ser ADNc de doble cadena. Éste será usado para construir una genoteca enriquecida con clones que se expresan poco en el tejido 1 y nada en el tejido 2.

Vectores de expresión y detección por métodos inmunoquímicos Para el rastreo mediante métodos inmunológicos es necesario construir genotecas obtenidas con vectores de expresión. Los vectores de expresión son vectores de clonación que permiten la expresión del inserto. Por lo tanto, tienen que permitir la transcripción y traducción del ADN exógeno. Estos vectores presentan las siguientes características:  Un origen de replicación (ori).  Un gen marcador.






   

Un promotor que permita la transcripción del ADN insertado. Esta región promotora está situada aguas arriba (región 5') del gen, y es reconocida por la maquinaria de replicación. El promotor tiene que ser fuerte, es decir, tiene que permitir una elevada expresión del gen, el 50% de la proteína total celular debe ser la codificada por el inserto; y también tiene que ser inducible, es decir, debe permitir el control del momento de la expresión mediante inductores y/o represores. Un sitio de unión al ribosoma (RBS) situado a continuación del promotor. Es una región que se transcribe pero que no se traduce, y permite la traducción eficaz del fragmento clonado. Las regiones no traducidas de los genes se denominan UTR (del inglés untranslated region), en este caso se dice que es una región 5'-UTR. Existen dos tipos: o Secuencia Shine-Dalgarno: se usa para expresar fragmentos de ADN procarióticos. Se trata de una secuencia consenso situada unos nucleótidos antes del codón de inicio de la traducción, que es complementaria a una zona de la región 3' del ARN ribosomal 16S. o Secuencia Kozak: se usa cuando se quiere expresar fragmentos eucarióticos. Permite la unión del mensajero al ribosoma. Un sitio de inicio de la traducción, en eucariotas el codón de inicio más empleado es AUG. Un sitio de clonación múltiple (MCS), o polylinker, con dianas de restricción únicas. Una señal de terminación que interviene en la finalización de la transcripción, y que permite la liberación del ARN mensajero. Antes y después del MCS, se suelen insertar unos genes que codifican para proteínas de fusión. Las proteínas de fusión aparecen normalmente en la región C- y N-terminal de la proteína diana, están en fase con ella, y no debe haber codones de paro entre ambas. Las proteínas de fusión tienen distintas funciones: aumentan la expresión, mejoran la solubilidad, favorecen la purificación, y ayudan a la localización de la proteína de interés. Por ejemplo, el gen ompF produce una proteína de membrana externa en E. coli, y se incluye como proteína de fusión en algunos vectores. Este gen presenta un promotor propio y una región RBS. Seguidamente al gen ompF se encuentra el ADN insertado, y a continuación de éste se encuentra, por ejemplo, el gen lacZ, que permite localizar los clones recombinantes. Cuando se expresan estos genes se obtiene una proteína trihíbrida, formada por la proteína ompF, la proteína diana, y la enzima β-galactosidasa. El producto del gen ompF hace que la proteína trihíbrida se localice en la membrana citoplasmática de la bacteria hospedadora, y la actividad β-galactosidasa hace que las colonias portadoras de ADN recombinante aparezcan de color azul si se les añade X-Gal.

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38 Alberto Fonte Polo 

Siempre que se incluyen proteínas de fusión en el vector, se añaden también sitios de reconocimiento de proteasas entre los genes que codifican para las proteínas de fusión y el sitio de clonación múltiple. De este modo, es posible aislar de forma específica la proteína diana de las proteínas de fusión.

Si no disponemos de una sonda de ADN, y si el gen que estamos buscando en la genoteca se expresa hasta nivel de proteína, podemos recurrir al rastreo inmunoquímico (siempre y cuando contemos con anticuerpos frente a la proteína en cuestión). Para buscar en la genoteca aquellos clones portadores de la proteína recombinante, se procede del siguiente modo: se hacen réplicas de todas las colonias de la genoteca a membranas de nylon o nitrocelulosa, y se fijan las bacterias a la membrana. Después, las colonias de réplica se lisan, para dejar expuestas las proteínas producidas por estos clones. El filtro con las proteínas se trata con un anticuerpo específico que reconoce la proteína que estamos buscando (anticuerpo primario, que no está marcado). Y se lava la muestra para quitar los productos en exceso y no unidos. A continuación, se trata el filtro con un segundo anticuerpo. Este anticuerpo secundario está marcado y reconoce al anticuerpo primario, de modo que varias moléculas de anticuerpo secundario se unirán a cada molécula de anticuerpo primario, así se amplifica la señal. El resultado es que en la placa autorradiográfica aparecerá una señal que se corresponde con aquel clon que ha expresado la proteína recombinante, proteína que es el producto de expresión del ADN pasajero insertado en el vector de expresión.


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Caracterización estructural de moléculas de ADN recombinante

Mapas de restricción Un mapa de restricción es un mapa físico que muestra las posiciones relativas de las dianas, de un conjunto de enzimas de restricción, contenidas en una secuencia de ADN. Las distancias entre las dianas de corte se indican en pares de bases. Antes de construir el mapa de restricción hay que estimar el tamaño del fragmento clonado. Estimación del tamaño del fragmento clonado en la molécula de ADN recombinante: en primer lugar, mediante la técnica conocida como miniprep, se extrae del cultivo bacteriano el ADN de naturaleza plasmídica. Una vez aislado el ADN recombinante se procede a separar el inserto del vector, para lo cual hay dos métodos: 1. Digestión con la enzima de restricción usada en la clonación. 2. Amplificación del inserto por PCR, usando los cebadores adyacentes al sitio de clonación múltiple (MCS). Por ejemplo, en el plásmido pBluescript se usan los primers T3 y T7. En segundo lugar, se realiza una electroforesis en gel de agarosa. A pHs cercanos a la neutralidad, el ADN está cargado negativamente y migra del cátodo al ánodo con una movilidad que depende de su tamaño. Normalmente, los fragmentos lineares de ADN cortos migran a través del gel más rápidamente que los fragmentos largos. La tasa de migración depende del tamaño de los fragmentos lineares y del gradiente de voltaje que se establece entre los electrodos. Los productos de la Patrón E.R. PCR digestión con la enzima de restricción se cargan en un – pocillo del gel, para separarlos y poderlos visualizarlos. Se observarán dos bandas, una se corresponde con el Vector ADN vector y otra con el ADN pasajero. En el caso del ADN amplificado por PCR se observa una sola banda Inserto (ADN pasajero). Los tamaños de los fragmentos que han corrido en el gel, se determinan mediante comparación con los tamaños de fragmentos conocidos + (los patrones) situados en otra calle del gel.

Construcción de un mapa de restricción: para construir el mapa hay que separar el inserto del vector, para ello, se corta el gel de agarosa con un bisturí y se extrae la banda del ADN exógeno. Después, el inserto purificado se digiere con diferentes enzimas de restricción:

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40 Alberto Fonte Polo  Digestión con la enzima de restricción A.  Digestión con la enzima de restricción B.  Doble digestión con las enzimas de restricción A y B. Los distintos fragmentos de ADN generados se separan por electroforesis. Los fragmentos se organizan en forma de mapa, comparando los tamaños de fragmentos en las calles donde se cortó con una sola enzima (digestiones simples) con los de las calles donde se cortó con dos enzimas (digestiones dobles). El tamaño de cada molécula de ADN se estima comparándolo con las bandas de ADN patrón de tamaño conocido.

Por ejemplo, la digestión de un determinado fragmento de ADN de 3300 pares de bases, da lugar a los fragmentos que se muestran a continuación: Patrón Inserto A

B

A+B

Enzima de restricción A

B

A+B

Tamaño de los fragmentos generados (pb) 1500 1000 800 1700 900 700 1500 900 600 200 100

Posteriormente, se extraen del gel de agarosa los fragmentos obtenidos por la digestión con la enzima A, y se digieren con la enzima B, y viceversa. En este caso es obtienen los siguientes fragmentos: 1500 pb 1000 pb 800 pb

B B B

1500 pb 900 pb + 100 pb 600 pb + 200 pb

1700 pb 900 pb 700 pb

A A A

1500 pb + 200 pb 900 pb 600 pb + 100 pb


Se observa que, cada fragmento producido por la digestión del fragmento original A con la enzima B también se encuentra en una de las digestiones dobles en las que el fragmento original B se ha cortado con la enzima A. Estos datos permiten colocar las dianas de corte y elaborar un mapa inequívoco. La clave del mapeo de restricción es el uso de fragmentos solapados. Los fragmentos que son digeridos sólo por una de las dos enzimas se corresponden con los extremos de la molécula de ADN exógeno, en este ejemplo serían los fragmentos de 1500 pb y de 900 pb. Estos fragmentos se buscan en la doble digestión y se ordenan. Cuando el fragmento de 1700 pb se digiere con la enzima A se obtienen dos fragmentos, uno de 200 pb y otro de 1500 pb, el fragmento 1500 se dispone en un extremo y a continuación de éste está el fragmento 200. Del mismo modo se puede determinar que el fragmento de 100 pb está contiguo al fragmento de 900 pb. Y por lo tanto el fragmento de 600 pb está entre el 200 pb y el 100 pb. El mapa de restricción resultante sería el siguiente: 800

1500

B 600

A

A

1000

100

A

200

1500

B

A

900 A+B

A

1700

700

900 B

B

B

Éste es el método usado para hacer mapas de dianas (de 6 nucleótidos) de enzimas de corte poco frecuente, pero no sirve si se quieren hacer mapas de restricción que muestren las dianas (de 4 nucleótidos) de enzimas que cortan más frecuentemente el ADN. Por ejemplo, asumiendo que en un ADN de gran longitud las dianas quedan distribuidas aleatoriamente, cuanto más corta sea la secuencia del sitio de restricción, más probabilidad habrá de encontrarla por puro azar, es decir, mayor será la frecuencia de reconocimiento. Esto hará que se generen fragmentos de ADN más pequeños, y por lo tanto, será muy poco probable que dentro de éstos haya una diana para una segunda enzima de restricción. En estos casos hay que recurrir a otras estrategias. Se usa una enzima fosfatasa para desfosforilar los extremos 5' P de la molécula de ADN que se pretende mapear. Se añade ATP marcado, y la enzima nucleotidil quinasa regenerará los grupos fosfato en los extremos 5', generándose una molécula de ADN marcada en sus extremos. A continuación, se corta la molécula con una enzima de restricción que genere grandes fragmentos, y mediante electroforesis se aísla el fragmento de mayor tamaño. Si se usara la enzima B del ejemplo, el fragmento que se seleccionaría sería el de 1700 pb, como es un fragmento de uno de los extremos presenta marcaje en 5' P. Este fragmento se digiere parcialmente con una enzima de restricción de corte frecuente, bajo condiciones de rotura parcial que no permiten que la enzima corte todas las dianas presentes en el ADN. Y se obtiene una colección de fragmentos solapantes de diferentes tamaños, según la diana que haya sido cortada en cada uno.

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42 Alberto Fonte Polo Estos fragmentos se separan mediante electroforesis y se detecta el marcaje del extremo 5' en una placa de autorradiografía, de este modo se puede conocer la posición de las dianas en el ADN. Hay que tener en cuenta que los fragmentos de digestión internos no pueden ser detectados, ya que no presentan marcaje. Utilidades de los mapas de restricción:  Se usan para localizar dianas de enzimas de restricción, para un posterior análisis genómico o una subclonación.  Sirven para ordenar clones solapantes, en la construcción de genotecas genómicas.

Secuenciación de ácidos nucleicos El análisis más detallado de la estructura del ADN consiste en averiguar la secuencia de nucleótidos. Los métodos más utilizados son el de secuenciación automática y el método enzimático de terminación de cadena de Sanger, también conocido como método didesoxi. Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger: para obtener la secuencia de bases nitrogenadas de un segmento de ADN por este método, se necesitan los siguientes compuestos:  El ADN molde o segmento de ADN que se desea secuenciar. Para poder secuenciar un segmento de ADN, previamente se necesita tener gran cantidad de ese fragmento, y por tanto, hay que clonarlo en un vector apropiado. Además, debe estar en estado de hélice sencilla.  Una enzima que replique el ADN, normalmente la ADN Polimerasa I del bacteriófago T4. Ésta emplea como molde ADN de hélice sencilla y siguiendo las reglas de complementariedad de bases va añadiendo nucleótidos a partir de un cebador.  Un cebador, que suele ser un oligonucleótido corto de alrededor de 20 bases de longitud necesario para que la ADN polimerasa I comience a añadir nucleótidos por el extremo 3' OH. Este cebador debe poseer una secuencia de bases complementaria a la del fragmento de ADN que se desea secuenciar. Debido a que la secuencia de nucleótidos del segmento que se quiere secuenciar es desconocida, se emplea un primer con secuencia complementaria al vector empleado para clonar el fragmento de ADN, además, este cebador procede de una región del vector muy cercana al punto de inserción del ADN problema cuya secuencia se conoce. El primer utilizado suele marcarse radiactivamente.  Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP). A veces en vez de marcar radiactivamente el cebador, se marca radiactivamente uno de los cuatro nucleótidos trifosfato en cada reacción.  Por último, se necesitan nucleótidos didesoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP). Los nucleótidos didesoxi son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa. Estos nucleótidos pueden incorporarse a la cadena de ADN naciente, pero no es posible que se una a ellos ningún otro nucleótido por el extremo 3'. Por tanto, una vez incorporado un nucleótido didesoxi se termina la síntesis de la cadena de ADN. En primer lugar, deben realizarse en cuatro tubos diferentes, cuatro mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y


dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido didesoxi, por ejemplo ddATP, a una concentración baja. El nucleótido didesoxi utilizado (ddATP en este ejemplo) competirá con su homólogo (dATP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. Por este sistema, en cada mezcla de reacción se producen una serie de moléculas de ADN de nueva síntesis de diferente longitud que terminan todas en el mismo nucleótido y marcadas todas radiactivamente por el extremo 5' (todas contienen en el extremo 5' el cebador utilizado).

Los fragmentos de ADN de nueva síntesis obtenidos en cada mezcla de reacción se separan por tamaños mediante electroforesis en geles verticales de acrilamida, muy finos y de gran longitud, que permiten distinguir fragmentos de ADN que se diferencian en un sólo nucleótido. Los productos de cada una de las cuatro mezclas de reacción se insertan en cuatro calles o carriles diferentes del gel. Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de autorradiografía. La aparición de una banda en una posición concreta de la autorradiografía en una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de la secuencia del ADN de nueva síntesis (complementario al ADN molde) está la base correspondiente al nucleótido didesoxi utilizado en la mezcla de reacción correspondiente.

Teniendo en cuenta que el ADN de nueva síntesis crece en la dirección 5'→3', si comenzamos a leer el gel por los fragmentos de menor tamaño (extremo 5') y avanzamos

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44 Alberto Fonte Polo aumentando el tamaño de los fragmentos (hacia 3'), obtendremos la secuencia del ADN de nueva síntesis en la dirección 5'→3'. Método automático de secuenciación: la principal diferencia entre el método enzimático de terminación de cadena y el método automático de secuenciación radica, en primer lugar, en el tipo de marcaje. En el método automático en vez de radiactividad se utiliza fluorescencia y lo habitual es realizar cuatro mezclas de reacción, cada una con un didesoxinucleótido trifosfato (ddNTP) marcado con un fluorocromo distinto. Este sistema permite automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo las moléculas de ADN de nueva síntesis producto de las cuatro mezclas de reacción. La segunda diferencia radica en el sistema de detección de los fragmentos de ADN. La detección del tipo de fluorescencia correspondiente a cada reacción se lleva a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, de manera que los fragmentos de ADN de menor tamaño que ya han sido detectados se dejan escapar del gel, permitiendo este sistema aumentar el número de nucleótidos que se pueden determinar en cada electroforesis y, por consiguiente, en cada secuenciación.

Hibridación de ácidos nucleicos en filtro El Southern-blot es un método, desarrollado por el biólogo inglés Edwin Southern, que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico, mediante el uso de electroforesis en gel y de hibridación utilizando sondas específicas.


Para analizar una muestra de ADN genómico, éste debe ser previamente fragmentado, utilizando enzimas de restricción. Los fragmentos obtenidos se separan, de mayor a menor tamaño, mediante una electroforesis en gel de agarosa. Cuando se digiere una molécula de ADN recombinante (menor número de dianas) y se carga en un gel, se resuelve en bandas discretas, pero en el caso del ADN genómico (más dianas) no se observan bandas definidas, sino todo un rastro de fragmentos de ADN de distintos tamaños.

Patrón ADNr ADNg

Una vez terminada la electroforesis y sin teñir el gel, los fragmentos de ADN se traspasan a una membrana de nylon. Para ello, se dispone el gel boca abajo sobre un papel que está en contacto con una solución desnaturalizante, y por encima del gel se coloca la membrana de nylon. El líquido asciende por capilaridad, y el ADN es arrastrado desde el gel hasta la membrana, donde queda retenido.

A continuación, se fija el ADN por medio de luz ultravioleta o mediante calor. El filtro se incuba con una sonda marcada, específica para la secuencia que se desea identificar. Esta sonda es una secuencia de ácido nucleico que reconocerá a la secuencia de ADN inmovilizada en el filtro, a través del reconocimiento de secuencias complementarias de ácidos nucleicos. De este modo, en la placa de autorradiografía se detectan aquellos fragmentos del ADN genómico que son homólogos a la sonda empleada.

Si en lugar de transferir ADN a la membrana se transfiere ARN, la técnica se denomina Northern blot, se usa en ensayos de expresión de fragmentos. La detección de proteínas, en una muestra de un tejido homogeneizado o extracto, es denominada Western blot.

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46 Alberto Fonte Polo Aplicaciones del Southern:  Obtención de RFLPs desde genomas de especies próximas, para buscar diferencias estructurales entre genomas próximos que presentan mutaciones en dianas de enzimas de restricción.  Elaboración de mapas genéticos.  Determinación del número de copias de un fragmento en el genoma. El término RFLP (del inglés restriction fragment length polymorphism, es decir, polimorfismo para la longitud de un fragmento de restricción) se refiere a secuencias específicas de nucleótidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción y que varían entre individuos. Las secuencias de restricción presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposición diferentes en el ADN de diferentes individuos de una población, por lo que se dice que la población es polimórfica para estos fragmentos de restricción. Una forma de detectar dicho polimorfismo es mediante Southern-blot. Para ello, se digiere el ADN genómico de dos especies con una enzima de restricción y luego se hibrida la mezcla de fragmentos resultante con una sonda marcada que hibrida en la zona de la diana que muestra polimorfismo. 1

2

Especie 2 Especie 1 Sonda

La especie 1 muestra en el Southern blot una única banda (el fragmento acotado por dos dianas de restricción para la enzima empleada), la especie 2 muestra dos bandas, pues la sonda complementa con una secuencia en ambos fragmentos.

Localización del fragmento clonado en el genoma Se pretende asignar el fragmento clonado a un locus particular. Los genomas eucariotas están fragmentados en cromosomas, por lo tanto, hay que asignar el fragmento a un cromosoma particular. Un mapa cromosómico representa el orden lineal de los genes en un cromosoma. El conjunto de mapas cromosómicos constituye el mapa genómico del organismo. Existen dos variantes fundamentales de mapas:  Los mapas genéticos o de ligamiento, definidos mediante unidades de frecuencia de recombinación. Para construir los mapas genéticos es necesario analizar la descendencia de un cruzamiento particular. Se basa en que la probabilidad de recombinación entre dos genes es menor cuanto menor es la distancia entre ellos.  Los mapas físicos, en los que las distancias entre loci se expresan en pares de bases, como ocurre, por ejemplo, en los mapas de restricción. Los mapas físicos se obtienen ordenando fragmentos clonados. El mapa físico más completo es la secuencia total de nucleótidos que conforman el genoma del organismo.


Los mapas genéticos son la única forma de localizar genes en especies con genomas no secuenciados. Y son el paso previo a la secuenciación del genoma. Para hacer un mapa genético es necesario que existan, al menos, dos alelos distintos que den lugar a un fenotipo distinto. La forma de análisis de los fenotipos depende del conocimiento del gen y de las herramientas de las que dispongamos. Ejemplo: La anemia falciforme es una enfermedad autosómica recesiva con una alta prevalencia en determinadas regiones geográficas. Los pacientes afectados por esta patología presentan en homocigosis la sustitución de una glutamina por una valina en el tercer aminoácido de la βglobina. Dicha mutación se corresponde con el cambio de una adenina por una timina en el codón 6 de dicho gen, que al mismo tiempo altera la diana de restricción para la enzima MstII. Esto da lugar a la existencia de RFLPs para el gen de la β-globina, entre individuos sanos y enfermos.

Aprovechando esta circunstancia se ha diseñado un método muy sencillo para detectar la mutación. Dicha diana se pierde con la mutación que causa anemia falciforme. Flanqueando a esta diana existen dos dianas para la misma enzima: una a 1,2 kb y otra a 0,2 kb de distancia. La digestión del ADN genómico de un individuo con la enzima MstII, dará lugar a miles de fragmentos entre los cuales estarán los correspondientes al locus de la βglobina. Podemos ahora separar todos los fragmentos según su tamaño en un gel de agarosa y transferir el resultado a un filtro de nitrocelulosa por la técnica de Southern. Utilizando una sonda complementaria al fragmento de 1,2 kb, podremos detectar aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria a la sonda. Si un individuo es homocigoto para el alelo normal de la β-globina, el único fragmento que será detectado por la sonda será el de 1,2 kb. Si el individuo es portador del alelo de anemia falciforme detectaremos dos fragmentos: el de 1,2 kb y el de 1,4 kb, uno proveniente del cromosoma que tiene la secuencia normal (con diana) y el otro proveniente del cromosoma con la secuencia de la anemia falciforme (sin diana). Finalmente, en un individuo homocigoto para la anemia falciforme sólo detectaremos el fragmento de 1,4 kb.

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Determinación del número de copias de una secuencia en el genoma La mayor parte de los genes son de copia única, pero hay secuencias de más de una copia, repetidas en tándem o dispersas. La determinación del número de copias de una secuencia de ADN en el genoma depende de las regiones adyacentes al fragmento insertado. Si las regiones adyacentes a las diferentes copias, del fragmento clonado, en el genoma son distintas, se determina el número de copias por RFLPs. Para ello, se digiere el ADN genómico con una enzima de restricción, se hace una electroforesis en gel de agarosa y se realiza un Southern Blot. Por ejemplo, si hay dos copias del fragmento clonado en el genoma, y las regiones adyacentes al inserto son distintas, las dianas para la restrictasa usada en la digestión estarán en distinta posición en cada una de las copias. Por lo tanto, al hibridar el fragmento clonado con la membrana de nylon, y después del revelado autorradiográfico, se observarán dos bandas que corresponden a las dos copias del fragmento en el genoma. E.R. A

E.R. A ADN + E.R. A

Sonda marcada

Copia 1 en la región X del genoma E.R. A

E.R. A

Copia 2 en la región Y del genoma Gel de electroforesis Membrana de nylon

Autorradiografía

Si, por el contrario, las regiones adyacentes al fragmento clonado son iguales, se observará una sola banda en la película de autorradiografía, y no se puede saber el número de copias. Por lo tanto, hay que recurrir a los ensayos de Dot-Blot. E.R. A

E.R. A ADN + E.R. A

Copia 1 en la región X del genoma E.R. A

Sonda marcada

E.R. A

Copia 2 en la región Y del genoma Gel de electroforesis Membrana de nylon

Autorradiografía

El dot blot consiste en colocar, sobre una membrana, una serie de diluciones de ADN en forma de pequeños círculos o puntos, para su posterior hibridación con la sonda. En este caso, se hacen diluciones del ADN genómico y diluciones del fragmento clonado, y se hibridan ambos conjuntos de diluciones con el inserto marcado. Se revela el resultado, y se buscan las diluciones que coincidan en intensidad de señal.


Diluciones de ADNg

Diluciones de ADN clonado

Sabiendo el tamaño del genoma y el tamaño del inserto, se puede estimar el número de copias del ADN clonado que hay en el genoma. Por ejemplo: el tamaño del genoma es de 3,3∙109 pb, y el inserto mide 3∙103 pb. Y en el dot blot se ha visto que, la intensidad de la dilución de 10 µg de ADN genómico coincide con la dilución de 10 ng del inserto. Sabiendo que en un picogramo de ADN hay 109 pares de bases, ¿cuántas copias del fragmento clonado hay en el genoma? Moléculas de inserto en 10 ng: 10 ng = 104 pg = 1013 pb 1013 / 3∙103 = 3,3∙109 insertos Número de genomas en 10 µg: 10 µg = 107 pg = 1016 pb 1016 / 3, 3∙109 = 3∙106 genomas 3,3∙109 = 1.100 copias del fragmento clonado en el genoma 3∙106

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Caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante

Para conocer la función del fragmento de ADN clonado hay que estudiar los productos que codifica (ARN y proteínas), y saber en qué circunstancias celulares se expresan, es decir, en que tipo celular y en qué momento del desarrollo. En la caracterización funcional de moléculas de ADN recombinante se hacen estudios a dos niveles:  Análisis funcional in vitro: se trabaja con el fragmento clonado.  Análisis funcional in vivo: hay que introducir el fragmento clonado en células (bacterias o células eucariotas) o en organismos (transgénicos) para que se exprese. Las herramientas de estudio serán distintas según se haya clonado un gen o un promotor.

Caracterización funcional in vitro Si el fragmento clonado es un gen: Si se ha clonado un gen, o un fragmento génico, éste puede ser usado para saber en qué tipo celular y en qué estadio celular se está expresando. El Northern-blot y la RT-PCR son las técnicas usadas para este fin.

Tejido C

Tejido B

–

Tejido A

El Northern-blot es una técnica de detección de moléculas de ácido ribonucleico de una secuencia dada dentro de una mezcla compleja (por ejemplo, un ARN mensajero para un péptido dado en una extracción de ARN total). Para ello, se extrae el ARN de los distintos tejidos, se digiere con una enzima de restricción, y se somete a una electroforesis en gel a fin de separar los fragmentos en base a su tamaño. Tras esto, se transfiere por capilaridad el contenido del gel, ya resuelto, a una membrana en la cual se efectúa la hibridación de una sonda (el fragmento clonado) marcada radiactiva o químicamente. La señal de hibridación que se observa por autorradiografía indica el tejido donde se ha expresado el fragmento de ADN clonado, el momento de expresión, y la intensidad con la que lo hace. Patrón



Sonda marcada

+ Gel de electroforesis

Membrana de nylon

Película radiográfica




La RT-PCR es un procedimiento rápido y cuantitativo para el análisis del nivel de expresión de genes. Esta técnica utiliza la capacidad de la transcriptasa reversa (RT) de convertir el ARN en ADNc de una sola hebra y la acopla con la amplificación por PCR de tipos específicos de moléculas de ADNc presentes en la reacción de RT. Los ADNc que se producen durante la reacción de la retrotranscriptasa representan una ventana en el patrón de genes que están siendo expresados en el momento en que el ARN fue aislado. El ARN celular total se extrae de tejidos, o de células, y se utiliza como plantilla para la transcriptasa inversa. Una pequeña alícuota de la reacción de RT se agrega entonces a una reacción PCR que contiene los primers específicos de las secuencias que uno desea amplificar, que se han diseñado gracias a que se conoce la secuencia de bases del fragmento clonado. Los productos del RT-PCR pueden entonces ser visualizados en un gel de agarosa, de este modo, se demuestra que el gen clonado se está expresando en el tejido en cuestión.

Si el fragmento clonado es un promotor: El promotor de un gen es la región de ADN que controla la iniciación de la transcripción de dicho gen a ARN. El promotor forma parte de la región reguladora del gen, es decir, no tiene una función codificante y no se transcribe, pero es necesario para el inicio de la transcripción. Dicha región -el promotor- se encuentra aguas arriba (extremo 5') del gen, y es el lugar donde se une la ARN polimerasa, y en eucariotas, además, los factores transcripcionales. Los promotores tienen secuencias de nucleótidos definidas (secuencias consenso) como, por ejemplo, la caja TATA que aparece en los promotores eucariotas. Para demostrar que en el fragmento de ADN clonado hay motivos de unión a proteína (factores transcripcionales), se emplean dos técnicas: la huella de la DNasa y los geles de retardo. 

Geles de retardo: se basan en que la migración de un fragmento de ADN sobre un gel de electroforesis es más lenta (está “retardada”) si el fragmento está unido a una proteína. En una primera etapa, el fragmento de ADN en estudio (marcado) se incuba con las proteínas (los factores transcripcionales) y después se realiza una electroforesis. Como en realidad hay muy pocas proteínas reguladoras, sólo un escaso porcentaje de ADN será retardado. En el caso de que exista interacción ADN-proteínas, se observa una banda débil encima de la banda de ADN principal. Es necesario hacer un ensayo control, para Fragmento clonado asegurarse de que no se trata de uniones + extracto nuclear inespecíficas, realizando una electroforesis Control del fragmento de ADN en ausencia de las – proteínas. Lo más habitual es utilizar un Banda extracto completo de proteínas nucleares, retardada entre las cuales se incluyen los factores transcripcionales. O pueden emplearse diferentes fracciones proteicas purificadas a + partir del extracto nuclear.

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Huella de la DNasa: esta técnica permite localizar de forma precisa la región de ADN donde se unen las proteínas. Se basa en la capacidad de la enzima DNasa de hacer cortes, al azar, en la molécula de ADN. La interacción de una proteína con un ADN protege a este último de los ataques de la DNasa. Se realizan dos ensayos en paralelo, en uno se digiere el fragmento clonado (marcado) con la DNasa, éste servirá de control; y por otro lado, el fragmento clonado se pone en presencia del extracto nuclear, y seguidamente se realiza la digestión con la DNasa. Las condiciones de digestión de la DNasa se han adecuado para que sólo se produzca un corte por molécula. Las roturas se producen al azar y esto hace que, estadísticamente, aparezcan todas las bases de la secuencia de ADN en el gel. El ADN incubado con la DNasa en ausencia de proteínas dará lugar, sobre el gel de electroforesis, a toda una serie de bandas que corresponderán a los diferentes fragmentos de ADN. Por el contrario, si en el ADN, después de una incubación con proteínas, ciertas regiones quedan protegidas del ataque enzimático, aparecerá en el gel una zona desprovista de bandas. La proteína deja su “huella” sobre el ADN. Es posible conocer exactamente la localización sobre el ADN de la zona protegida, donde hay, por tanto, interacción con los factores de transcripción.

Sin embargo, aunque se ha demostrado que el fragmento de ADN tiene regiones de unión a proteínas, no se sabe si esa región corresponde a un promotor. Es necesario recurrir a la caracterización funcional in vivo, para lo cual, hay que introducir el fragmento de ADN clonado en una célula hospedadora.

Caracterización funcional in vivo El fragmento clonado se expresa en células, que pueden ser bacterias o células eucariotas, o en organismos transgénicos.


La expresión de genes eucariotas en células bacterianas, normalmente en Escherichia coli, es útil en experimentación básica:  Para obtener ARN que luego puede ser usado como sonda.  Para obtener proteínas y caracterizarlas funcional y estructuralmente.  Para obtener anticuerpos contra un producto génico específico, y usarlos en ensayos inmunológicos. También se utiliza en ensayos biotecnológicos, ya que las bacterias pueden usarse como “fábricas de proteínas”, es decir, es posible usar el poder reproductivo de las bacterias para expresar grandes cantidades de proteínas de interés terapéutico o industrial. Para que el fragmento de ADN se exprese en el interior de las células debe estar incluido en un vector de expresión, que cuente con los motivos necesarios para que el inserto se traduzca y se exprese como proteína. La expresión del fragmento clonado en E. coli conlleva algunos problemas:  Expresar genes eucariotas en células procariotas da problemas de estabilidad, esto hace que la productividad sea menor.  En ocasiones, las proteínas sintetizadas forman cuerpos de inclusión, y para romperlos hay que recurrir a tratamientos muy agresivos.  Otras veces, la proteína producida no es funcional, ya que no han ocurrido las modificaciones postraduccionales (glicosilaciones, metilaciones, formación de puentes disulfuro…) necesarias para que la proteína adquiera su conformación nativa, puesto que E. coli carece de las enzimas precisas. En estos casos, cuando no es posible expresar convenientemente el fragmento clonado en bacterias, hay que recurrir a la expresión en células eucariotas.

Introducción de genes en células eucariotas: métodos, vectores, sistemas de selección La introducción de material genético externo en células eucariotas se conoce con el nombre de transfección. Por el contrario, la introducción de ADN exógeno en células procariotas se conoce como transformación. El término transformación también se usa para referirse al paso de una célula normal a una célula cancerígena. Para la transfección se usan, normalmente, células de levadura. Aunque también es común el uso de células de mamífero, en este caso se recurre a líneas celulares inmortales procedentes de células tumorales. Existen dos tipos de transfección: transitoria y estable.  Para la mayoría de aplicaciones de la transfección, es suficiente que el gen transfectado se exprese transitoriamente. Como el ADN introducido en la transfección normalmente no se inserta en el genoma nuclear, el ADN exógeno se expresa durante 4 o 5 días, pero no se transmite a la descendencia.  Cuando se desea que el gen transfectado permanezca en el genoma de la célula y de su progenie, se debe efectuar una transfección estable. Hay varios métodos para introducir ADN en una célula eucariota:  Para la transfección en células de levadura se emplea el método de permeabilización de la membrana con sales de litio y con polietilenglicol, y seguidamente, se da un choque térmico.

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La coprecipitación con fosfato cálcico se usa en levaduras, células animales y protoplastos. El ADN se pone en presencia de cloruro de calcio (CaCl2) y ácido fosfórico (H3PO4). Los iones fosfato cargados negativamente se combinan con los cationes calcio y, de este modo, se forma un precipitado de ADN y fosfato cálcico [ADN–Ca3(PO4)2]. Esta suspensión se añade a las células que se quieren transfectar, éstas toman parte del precipitado por endocitosis, y junto con él, el ADN. Con este método, del 90% de las células transfectadas sólo el 4% integran el fragmento de ADN en su genoma. Otro método es la electroporación, consiste en un aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática celular causado por un campo eléctrico aplicado externamente. Cuando el voltaje (2-4 kV) que atraviesa una membrana plasmática excede su rigidez dieléctrica se forman poros. Si la fuerza del campo eléctrico aplicado y/o la duración de la exposición al mismo es la adecuada, los poros formados por el pulso eléctrico se sellan tras un corto periodo de tiempo, durante el cual la molécula de ADN tiene la oportunidad de entrar a la célula. Sin embargo, una exposición excesiva de células vivas a campos eléctricos puede causar apoptosis y/o necrosis, procesos que provocan la muerte celular. Por este método, sólo sobreviven el 60-90% de las células, aunque el rendimiento es de 20-30 células transfectadas de cada 105 supervivientes. Un método muy eficiente es la inclusión del ADN en liposomas, pequeños cuerpos formados por una membrana en cierto modo similar a la membrana plasmática de la célula y que puede fusionarse con la misma, liberando el ADN al interior celular. Los liposomas se forman por la interacción entre las cargas negativas del ADN, y las cargas positivas de los lípidos catiónicos que envuelven a éste. La tasa de transfección de este método es similar a la de la electroporación. Otra técnica de transfección es el bombardeo con microesferas de metal (bolas de oro o tungsteno de una micra de diámetro) recubiertas de ADN. Las microesferas son proyectadas, con una pistola génica, a enorme velocidad sobre las células que deben modificarse. Estas bolas se retrasarán progresivamente cruzando las distintas capas celulares. Algunas de las células alcanzadas integrarán espontáneamente los genes en su genoma. La microinyección resulta ser una técnica muy efectiva, aunque laboriosa. Consiste en la introducción mecánica de las moléculas de ADN en el interior de la célula, utilizando para ello una microaguja. La microinyección es normalmente realizada bajo un microscopio óptico llamado micromanipulador. Es el método que se emplea en la introducción del ADN recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos. Mediante infección viral también se consigue introducir el ADN en el núcleo de la célula eucariota, usando un virus como vector. En este caso, la técnica es denominada transducción, y se dice que las células se transducen.

Para seleccionar aquellas células eucariotas que han incluido el gen de interés se usan genes marcadores. Se entiende por marcadores aquellas secuencias que se incluyen en el vector y permiten detectar las células que han sido transfectadas. Existen dos tipos de genes marcadores:  Genes de selección: confieren una ventaja proliferativa a las células transfectadas. Pueden ser, a su vez, de dos tipos: o Genes de resistencia a antibióticos: los más usados son los genes puro, neo e higro, que confieren resistencia a puromicina, neomicina e higromicina, respectivamente.




o Genes implicados en el metabolismo de las bases nitrogenadas: son genes que participan en la síntesis de novo de las bases, o bien, genes que permiten el reciclado de las mismas. Dentro de los genes que permiten el reciclado de las bases nitrogenadas, caben destacar los siguientes:  tk+: gen de la timidina quinasa, participa en el reciclado de los nucleótidos de timina, fosforilándolos. Las células eucariotas que van a ser transfectadas deben ser tk–, en presencia de aminopterina las células tk– mueren. La aminopterina inhibe la síntesis de novo de bases nitrogenadas. Sólo aquellas células que han incorporado un vector con el gen marcador tk+ son capaces de vivir en un medio con aminopterina, de este modo, se pueden detectar las células transfectadas.  hprt+: gen de la hipoxantina fosforribosil transferasa, interviene en el reciclado de la guanina. Como en el caso anterior, para la selección de las células transfectadas se usan células que carecen del gen hprt. Si se las pone en un medio con aminopterina, solamente sobrevivirán las células recombinantes porque tienen la hipoxantina fosforribosil transferasa necesaria para el reciclado de las bases.  tkhs+: gen de la timidina quinasa de herpes simple, permite la selección negativa de las células que lo poseen. Las células que son transfectadas con el gen tkhs+ mueren en presencia de ganciclovir, un análogo de la guanina. El ganciclovir es fosforilado por el gen tkhs+, y se incorpora en el ADN durante la replicación, en lugar de la guanina, causando la muerte celular. Genes señal: estos genes marcadores confieren a la célula una característica distintiva visible, como por ejemplo, un color diferencial. o Genes señal usados en transfección estable:  GFP: gen de la proteína fluorescente verde, obtenido de la medusa Aequorea victoria. Es una proteína muy poco tóxica y estable, absorbe luz azul y emite luz de color verde cuando es iluminada con luz de 395 nm de longitud de onda.  lacZ: gen que codifica para la enzima β–galactosidasa, que en presencia de X-Gal, colorea a las células de azul. o Genes señal usados en transfección transitoria:  Gen de la β–glucuronidasa: en presencia de X-Glu origina un producto de color azul.  Gen de la luciferasa: la luciferasa es una enzima presente en las luciérnagas, que cataliza la degradación de la luciferina a un producto final liberando luz (fotones). Mediante un luminómetro se puede detectar este fugaz destello de luz amarilla.  CAT: gen de la cloranfenicol acetil transferasa, esta enzima acetila el cloranfenicol, y el cloranfenicol acetilado migra de forma diferente en cromatografía.

Vectores de transfección: existen distintos mecanismos vectoriales de transfección celular:  Transfección de ADN lineal con el inserto y otra molécula de ADN con el gen marcador, que se añade a la célula eucariota diana, y se integra en el genoma de ésta, al azar, y en un número de copias variable.  Plásmidos mixtos: son construcciones a partir de plásmidos de bacterias, a los que se les añade los motivos de expresión necesarios para la replicación en el interior de

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

células eucariotas; tales como un origen de replicación eucariota, un sitio de unión al ribosoma, un promotor, etc. Estos plásmidos se mantiene en bacterias, y son posteriormente transfectados a células eucariotas. Vectores virales: se aprovecha el mecanismo de infección viral para transducir células eucariotas. Se usan siempre virus defectivos, es decir, carentes de parte del genoma vírico original, y por lo tanto, no son capaces de replicarse de forma autónoma.

Mecanismo general de transfección vírica usando virus defectivos: 1. Construcción del vector viral. Se elimina el mayor número posible de genes y secuencias del genoma viral, para que pueda captar el ADN exógeno. 2. Empaquetamiento del vector viral, mediante células empaquetadoras o mediante empaquetamiento in vitro, para formar partículas virales infectivas. Las células empaquetadoras son células eucariotas que poseen los genes que han sido eliminados del genoma viral, y aportan, por tanto, la composición proteica que necesitan los virus para su funcionalidad. 3. Infección de las células eucariotas diana. Gen foráneo

Partículas virales Proteína de interés

Vector viral

Células empaquetadoras

Células diana

Algunos vectores virales usados en transfección:  Vectores derivados de SV40: el SV40 es un virus pequeño de ADN circular de doble cadena, hallado tanto en monos como en humanos, y está implicado en algunos tipos de cáncer. Parte del genoma de este virus se usa para construir un vector viral mixto. Promotor temprano neo

R

MCS

Promotor tardío

PBR322 Ori SV40

Es necesario recurrir al uso de células empaquetadoras, estas células son portadoras de los genes para los que es defectivo el vector, o en otros casos, estas células son cotransfectadas con virus auxiliares. De cualquier modo, dentro de las células empaquetadoras se van a producir partículas recombinantes, con el vector portador del gen clonado que se pretende expresar en las células diana. Estos virus, defectivos pero con capacidad infectiva, se usan para transfectar células de una línea celular de mono africano, con el fin de producir grandes cantidades de la proteína de interés.




Vectores derivados de retrovirus: los retrovirus son virus de ARN lineal. Los vectores retrovirales pueden incluir insertos de hasta 8 Kb, e integran el ADN de interés en el genoma de la célula diana. Sin embargo, únicamente sirven para infectar células que se encuentran en división. Además, la tasa de transfección es pequeña y se obtienen pocas partículas virales. En el proceso de infección el genoma del retrovirus es retrotranscrito, mediante la transcriptasa inversa, en el citoplasma a ADNc, que es trasladado al núcleo, donde se integra en el genoma de la célula hospedadora en forma de provirus. En cada extremo del genoma del provirus hay dos regiones largas y repetidas LTR (Long Terminal Repeats), que incluyen secuencias promotoras, de integración y de empaquetamiento. Entre los dos LTR se sitúan los genes virales gag, pol y env que codifican para proteínas estructurales del virus: proteínas de la matriz, enzima polimerasa (retrotranscriptasa) y proteínas de la cubierta del virus, respectivamente. LTR

gag

pol

env

LTR

El vector retroviral se obtiene después de sustituir los genes gag, pol y env, por el ADN de interés; no obstante, este vector contendrá los LTR virales, además de un gen de resistencia a antibiótico y un sitio de clonación, donde se inserta el ADN de interés, con un promotor para que se exprese. Promotor

neoR

LTR



MCS Vector retroviral

LTR

Es necesaria la transfección del vector a células empaquetadoras, éstas tiene incorporados los genes retrovirales gag, pol y env en el genoma. Sólo cuando entren en contacto los genes retrovirales de las células empaquetadoras y las regiones LTR, necesarias para la encapsidación del virus, presentes en el vector, será cuando se producirán los retrovirus recombinantes que contiene el gen de interés. En el medio extracelular se acumularán las partículas virales defectivas (carecen de los genes gag, pol y env), que serán capaces de transducir las células eucariotas diana y conseguir así que estas células contengan y expresen el gen de interés. En las células diana no ocurre la complementación, y por lo tanto, en el interior de estas células no se forman nuevas partículas virales. Vectores derivados de adenovirus: los adenovirus son virus de ADN duplexo lineal, son más grandes y complejos que los retrovirus, causan infecciones respiratorias benignas en humanos. Los vectores adenovirales son defectivos, y es necesario recurrir a células empaquetadoras. Se pueden llegar a insertar en ellos hasta 7,5 Kb de ADN exógeno. La gran ventaja de usar un adenovirus como vector es la alta eficacia de transfección, así como una producción de grandes títulos. Infecta tanto células en división como quiescentes. Entre los principales inconvenientes encontramos que el genoma vírico no llega a integrarse en la célula, de modo que los genes de interés se expresan sólo transitoriamente. Además se ha visto que, en terapia génica in vivo, los adenovirus producen respuesta inmune celular e inflamatoria en los organismos tratados con estos vectores.

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

Vectores derivados de adenoasociados: son parvovirus, contienen ADN simplexo como material genético, y requieren la coinfección con un adenovirus para multiplicarse. Son vectores que combinan las ventajas de los retrovirales y los adenovirales. Su capacidad de integrar ADN exógeno es pequeña, sólo de 5 Kb. Las principales ventajas son que los virus adenoasociados integran su ADN en el genoma de la célula diana. Además, pueden infectar tanto a células en división como a las que no lo están (muy útil en experimentos in vivo). El riesgo de una respuesta inmune está minimizado ya que no producen proteínas víricas. La desventaja de estos vectores es que para producir partículas virales es necesaria la cotransfección de las células empaquetadoras con un adenovirus o un herpesvirus. Para separar las partículas virales deseadas de los virus auxiliares que se producen en las células empaquetadoras, se hace una centrifugación en gradiente de densidad. Vectores derivados de herpesvirus: los herpesvirus son una familia de virus de animales poco conocida, cuyo genoma se compone de ADN bicatenario y lineal. Infectan de forma específica a las neuronas, tanto a células quiescentes como en división. No se integran en el genoma, por lo tanto, el gen transfectado se expresa transitoriamente. La gran ventaja de estos vectores es el gran tamaño de su ADN, que les permite aceptar grandes fragmentos genómicos, incluso genes con sus propias regiones reguladoras.

En resumen, ¿para qué clonar en células eucariotas?: 1. Análisis de función génica y regulación: para demostrar que el promotor clonado funciona in vivo en la célula. Se hacen ensayos de expresión transitoria, que permiten conocer en qué célula se expresa el gen que es regulado por dicho promotor, y en qué condiciones induce la expresión. Para lo cual, se clona la secuencia reguladora (posible promotor) junto con un gen señal, por ejemplo el gen GFP de la proteína fluorescente verde. Luego, se transfecta a células donde se sospeche que puede expresarse el gen regulado por el supuesto promotor. Si las células adquieren coloración verde, significa que se expresa el gen GFP junto con el promotor, ya que en estas células se está expresando el gen regulado por el promotor clonado. En cambio, si las células no cambian de color quiere decir que no hay factores que permitan la transcripción del gen, debido a que ese tipo celular no es el adecuado, o no se ha inducido correctamente. 2. Producción de proteínas de interés a nivel industrial: es un proceso lento y costoso, y presenta importantes limitaciones. La integración del gen de interés, en el genoma, es rara y aleatoria. Tampoco se puede controlar el número de copias del inserto que se integran. La mayor parte del genoma no se expresa, y si el gen se inserta en una de estas regiones no se expresará, pues no hay promotores. Y si se integran muchas copias en una misma región del genoma puede haber efectos de dosis, e inhibirse la expresión del gen.


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Mutagénesis in vitro

Genética reversa y tipos de mutagénesis La genética reversa, o genética inversa, es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento concreto de ADN clonado y/o secuenciado investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación. El gen mutagenizado in vitro se introduce en el organismo y se observa el fenotipo que produce, para poder dilucidar la función de dicho gen. En cambio, la genética clásica busca situar y clonar un determinado gen de interés partiendo de individuos cuyo fenotipo es llamativo (generalmente mutantes). Para lo cual, se producen mutaciones in vivo que conducen a fenotipos mutantes estables y heredables. Estos fenotipos son analizados para llegar a conocer, como en el caso anterior, la función de los genes que intervienen en la expresión de dichos caracteres fenotípicos. En genética se denomina mutagénesis a la producción de mutaciones sobre ADN, clonado o no. De realizarse in vitro, dicha alteración puede realizarse al azar (mutagénesis aleatoria), sobre cualquier secuencia, o bien de forma dirigida (mutagénesis dirigida) sobre una secuencia conocida y en la posición de interés. En el caso de realizarse in vivo, sobre organismos y no sobre ADN clonado, se realiza a gran escala y sin conocimiento de secuencia, empleando para ello sustancias denominadas mutágenos. Para mutagenizar un fragmento de ADN clonado hay que conocer su secuencia, o al menos tener un mapa de restricción detallado.

Mutagénesis aleatoria por deleción, inserción y sustitución La mutagénesis aleatoria es una técnica que se utiliza en los laboratorios de investigación para introducir cambio al azar en una secuencia de ADN. Las mutaciones que se generan pueden ser por deleción, inserción y sustitución; y se pueden tratar de bases simples o de agrupaciones de muchos nucleótidos. Mutagénesis por deleción: Se emplean dos enzimas de restricción distintas para digerir el fragmento clonado que está incluido en el vector. El vector con el inserto delecionado se separa del otro fragmento mediante electroforesis en gel de agarosa. El vector (con parte del inserto) corresponde a la banda que menos ha migrado, y el fragmento cortado del gen clonado corresponde a la banda que más ha corrido en el gel. Se extrae el vector del gel y se pone en presencia de ADN ligasa para que se circularice de nuevo, generándose un vector que porta un gen clonado que ha perdido parte de su secuencia. Hay que tener en cuenta que, si las restrictasas empleadas dejan extremos cohesivos no compatibles hay que usar la polimerasa T4 en ausencia de dNTPs para que genere extremos romos, después se usará la ADN ligasa para ligar el vector. Pero, si en lugar de emplear dos enzimas de restricción sólo se usa una, ésta tendrá que generar siempre extremos cohesivos. Luego, se usará otra enzima para dejar los extremos romos, y después la ligasa recircularizará el vector. En este caso se produce la deleción de un número de bases menor.

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E.R. 1

E.R. 2

Gel de agarosa

Vector con el gen delecionado

ADN ligasa

Usando sólo una enzima de restricción se consigue la deleción de un fragmento menor CGAAGC

CGAA GC

CG

GC

TTCG

GC

CG

GC GCTTCG

Mutagénesis por inserción: Se digiere el vector con una enzima de restricción que cortará el gen clonado, dejando extremos cohesivos. Se añade una ADN polimerasa que rellene los huecos, y se generan extremos romos, después, una ligasa recirculariza el vector. Finalmente, el vector con el gen mutado se introduce en una bacteria, y se compara la proteína mutante que se produce con la proteína del gen normal. E.R. Vector con el gen mutado por inserción

CGAAGC

GCTTCG

CGAA GC GC

CGAA AAGC GCTT TTCG

TTCG

Otra opción para obtener mutantes por inserción es digerir el vector de ADN recombinante con una ADNasa (que corta el ADN al azar), se hace en condiciones restrictivas para que sólo ocurra un corte por molécula. De modo que, se obtiene una colección de fragmentos de ADN, dependiendo de donde se haya producido el corte. Después, se añade un oligonucleótido sintético en los extremos de las moléculas generadas. En presencia de la enzima ADN ligasa se recircularizan las moléculas de vector. Cada molécula de ADN recombinante presenta una mutación, por inserción de un oligonucleótido, en una región distinta. Gracias a que el oligonucleótido sintetizado in vitro incluye una diana de restricción en su interior, es posible mapear el sitio de restricción y conocer en qué región se ha introducido la mutación.


1

2

3

4

4

1

1

2

3

2

4

3

1

2

2

3

4

1

4

3

3

4

1

2

2

3

1

4

Mutagénesis por sustitución en vectores de cadena simple: Mediante agentes químicos y/o enzimáticos se consigue mutagenizar el ADN clonado, mediante la sustitución puntual de una base por otra distinta. Por ejemplo, el bisulfito sódico (NaHSO3) es un agente químico que desamina la citosina y la transforma en uracilo. Para estos experimentos se utiliza un vector de cadena simple, habitualmente la serie M13 de vectores de bacteriófagos recombinantes. El bacteriófago M13 contiene ADN circular de cadena sencilla (forma replicativa) que se replica a ADN de cadena doble dentro de las células infectadas, por el mecanismo del círculo rodante. Si se trata el vector M13 monohebra con bisulfito sódico se consigue que las citosinas se transformen en uracilos. Estos uracilos pueden aparear con un oligonucleótido adecuado, el cual sirve de cebador para sintetizar la cadena de ADN complementaria. De este modo, se generan moléculas de vector que incluyen una mutación. AAA CCC

UUU

AAA

UUU

NaHSO3 M13 C

U NH2

Del mismo modo, pueden usarse análogos de bases como el 5-bromouracilo (5BU), que en su forma ceto, es análogo a la timina y, por ello, se aparea con la adenina; mientras que en su forma enol (es decir, en su forma tautomérica), es análogo de la citosina y se aparea con la guanina. Cuando el vector M13 de cadena sencilla se replica a ADN duplexo en presencia de 5-bromouracilo, éste se incorpora en el ADN en lugar de la timina. Si el 5-bromouracilo se tautomeriza a la forma enol, después de dos rondas de replicación, se produce una transición A–T → G–C.

A

5BU A

5BU* A

5BU* G T A

5BU* G C G T A T A

Mutagénesis por sustitución en vectores de cadena doble: El vector de doble cadena, se digiere con una enzima de restricción en presencia de bromuro de etidio (BrEt). El bromuro de etidio es un agente intercalante usado comúnmente como marcador de ácidos nucleicos para procesos como la electroforesis en

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62 Alberto Fonte Polo gel de agarosa. Además, en presencia de bromuro de etidio la restrictasa corta sólo en una de las dos cadenas, es decir, produce mellas en la molécula de ADN. Si después se trata la preparación con una exonucleasa se consigue extender la mella, por ejemplo con la exonucleasa III de E. coli que elimina nucleótidos uno por uno desde el extremo 3'–OH. Seguidamente, se añade un agente mutágeno, como por ejemplo el bisulfito sódico, que produce mutaciones por sustitución de la citosina por uracilo. Después, una ADN polimerasa añade nucleótidos en sentido 5'→3', y rellena el hueco. Por último, una ligasa sellará el vector mutagenizado. AAA

3' CCC

E.R.

CCC

Exo III

CCC

NaHSO3

UUU

ADN Pol

UUU

BrEt

Mutagénesis dirigida Un enfoque muy empleado en la mutagénesis in vitro es la mutagénesis dirigida. Utilizando este método, podemos generar mutaciones en cualquier posición de un gen de secuencia conocida. A partir de la secuencia, se sintetizan químicamente segmentos cortos de ADN denominados oligonucleótidos, correspondientes a cualquier sitio escogido del gen, al que pueden unirse mediante la hibridación entre cadenas sencillas de ADN. Una de las aplicaciones de la mutagénesis dirigida es el estudio de la relación estructurafunción de una proteína. Las mutaciones se introducen en un punto muy concreto del correspondiente ADN clonado. Se induce la expresión de la proteína y después se comparan las propiedades de la forma salvaje y de la forma mutante. Mutagénesis dirigida usando un oligonucleótido mutado y un vector monohebra: El gen de interés se inserta en un vector de ADN de cadena sencilla, como el fago M13. Se diseña un oligonucleótido portador de la mutación deseada y se permite que hibride con la región complementaria del ADN clonado. El oligonucleótido actúa como cebador para la síntesis in vitro de la cadena complementaria insertada en el vector M13. La mutación que deseamos generar se programa en la secuencia del cebador sintético. A pesar de que las bases mutadas están mal emparejadas, la hibridación del oligonucleótido sintético con el ADN complementario se produce si se realiza a baja temperatura y con concentraciones elevadas de sal.


Una vez que la ADN polimerasa completa la síntesis in vitro, se deja replicar el ADN de M13 en E. coli, obteniéndose así un gran número de fagos portadores de la mutación deseada. Para distinguir entre los fagos mutantes y los silvestres es necesario hacer una selección restrictiva. Por ejemplo, se puede utilizar el oligonucleótido marcado como sonda. A temperatura baja, la base mal emparejada no impide que el cebador hibride con ambos tipos de fagos; sin embargo a temperatura elevada, el cebador sólo hibridará con el fago mutante. Mutagénesis dirigida por inserción de un cassette: Otra forma de mutagénesis dirigida es la sustitución de un fragmento de doble cadena por un oligonucleótido sintético (denominado cassette) que incluya el cambio. Este método permite introducir más mutaciones que otros métodos como el de PCR. Se usan dos enzimas de restricción distintas que van a hacer una digestión parcial, cortando el gen clonado, pero no el vector en el que está incluido. Después de cortar el vector con las dos enzimas de restricción se obtiene un plásmido abierto, que se separa del fragmento del gen clonado mediante electroforesis en gel de agarosa. Se extrae el vector del gel, y se inserta el fragmento de ADN sintetizado in vitro en el vector linearizado. El oligonucleótido sintético (que lleva incorporada la mutación) tiene extremos complementarios a los generados en el vector digerido con las dos enzimas de restricción, de este modo se consigue el ligamiento entre ambas moléculas de ADN. Fragmento de ADN sintético que contiene el cambio deseado

Gen clonado E.R. 1

ADN ligasa Plásmido con el gen mutado

E.R. 2 Plásmido de ADN recombinante

Gel de agarosa

Mutagénesis dirigida por PCR: Es posible sintetizar oligonucleótidos con mutaciones, que pueden ser usados como cebadores en reacciones de amplificación por PCR, lo que permite el enriquecimiento en el gen mutante por el propio proceso de amplificación. En una primera ronda de PCR, se utiliza un cebador portador de la mutación deseada. El producto de esta reacción se emplea como cebador en una segunda ronda de PCR, cuyo producto es el alelo mutante. Se puede también añadir secuencias útiles, que contengan por ejemplo uno o más sitios de restricción, a los extremos 5' de los fragmentos amplificados. Los cambios no se pueden introducir en el lado 3' de los oligonucleótidos elegidos para realizar la PCR, porque al no hibridar correctamente no produciría el cebado de la cadena.

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Inactivación de genes endógenos La inactivación de genes en el organismo nos da información sobre la función de dichos genes. Se pueden inactivar genes por recombinación homóloga, o usando moléculas de ARN o ADN antisentido. Inactivación de genes por recombinación homóloga: Cuando se transfecta un cultivo celular con una molécula de ADN determinada, ésta se integra, al azar, en cualquier punto del genoma por recombinación heteróloga. Pero, mediante recombinación homóloga se puede obtener una inserción precisa (gene targeting) y no aleatoria. Es decir, es posible reemplazar una secuencia por una secuencia homóloga que diferirá de la original porque procede de otra especie o porque presenta una mutación. La recombinación homóloga es más frecuente en plásmidos y en levaduras (ocurre en una de cada 106 células transfectadas) que en eucariotas superiores. Pero, puesto que la recombinación homóloga ocurre muy excepcionalmente, es necesario recurrir a sistemas para favorecer la selección de las células transfectadas. Se pueden distinguir dos sistemas de enriquecimiento de células transfectadas por recombinación homóloga:  Sistemas de selección positiva: dentro del gen clonado, se introduce un gen de resistencia al antibiótico neomicina (neoR) sin promotor. Lo más probable es que el fragmento de ADN clonado se integre en el genoma en cualquier punto al azar, y por lo tanto, al no integrarse en una zona con el promotor adecuado no se expresará el gen neo. Pero, si el fragmento clonado se integra en la región homóloga del genoma, con el promotor del gen original, el gen neo se podrá expresar. Por lo tanto, en presencia del antibiótico sólo sobrevivirán las células transfectadas en las que se ha producido recombinación homóloga.



Sistemas de doble selección positiva-negativa: en este caso, se incluye el gen de resistencia a neomicina con promotor en el interior del gen clonado, y el gen de la timidina quinasa viral del herpes simple (tkhs+), también con su promotor, en un extremo del gen clonado. Gracias a estos dos genes, se puede proceder a una doble selección:  Positiva: cultivando las células en presencia de neomicina. Las células que no han incorporado el gen neo, es decir, que no han incorporado el gen clonado, son destruidas.


 Negativa: cultivando las células en presencia de ganciclovir. El ganciclovir es un análogo de la guanina que puede ser incorporado en un ADN en proceso de síntesis siempre que sea fosforilado previamente por la proteína tk del virus del herpes, y después di y trifosforilado por enzimas celulares. Una vez en forma de trifosfato, bloquea la replicación y produce la muerte celular. El ganciclovir destruye todas las células en las que se expresa el gen tkhs, es decir, todas las que han incorporado al azar toda la construcción. Las células en las que se produce el intercambio del gen normal por el gen clonado no incorporan el gen tkhs (ya que sólo recombina la región cuyos extremos son exactamente homólogos) y son, por tanto, resistentes al ganciclovir. En resumen, se seleccionan las células que son doblemente resistentes a la neomicina y al ganciclovir, es decir, las que contienen el gen neo y que no contienen el gen tk. Son las células en las que se ha producido la recombinación homóloga: el gen original ha sido reemplazado por el gen exógeno. Las células que no han integrado el gen exógeno o que lo han integrado al azar en su genoma son destruidas.

La recombinación homóloga puede emplearse para inactivar un gen. Es una estrategia de estudio de la función precisa de un gen ya que se pueden conocer y evaluar las consecuencias anatómicas o fisiológicas debidas a la ausencia de la proteína codificada por este gen. Esta técnica es particularmente útil en mamíferos para estudiar la función de los genes de los que no existen mutantes espontáneos. Se usa para obtener ratones knock-out, son ratones modificados por ingeniería genética para que uno o más de sus genes estén inactivados mediante una técnica llamada gene knockout. Inactivando el gen y estudiando las diferencias que presenta el ratón afectado, los investigadores pueden inferir la probable función de ese gen. El ratón es el organismo modelo más próximo a los seres humanos en el que esta técnica se puede realizar con facilidad. Existen algunas variaciones sobre el procedimiento para producir ratones knockout, siendo el siguiente el ejemplo más habitual: 1. Se aísla el gen que se desea sustituir a partir de una genoteca de ratón. Posteriormente se diseña una nueva secuencia de ADN muy parecida al gen original, salvo que está cambiada lo suficiente para hacerla inoperante. Normalmente también se incluye en la nueva secuencia genes marcadores (p.ej. gen neoR y gen de la timidina quinasa del herpesvirus), que los ratones normales no

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2.

3.

4.

5.

poseen y que les confieren resistencia a ciertos agentes tóxicos. Las oportunidades de un suceso de recombinación con éxito son relativamente bajas, de modo que la mayoría de las células alteradas tienen cambiado sólo uno de ambos cromosomas. se dice que son heterocigotos. A partir de un blastocisto de ratón (un embrión muy temprano que está formado por una masa esférica de células indiferenciadas rodeada de células extraembrionarias) se aíslan las células madre; después se cultivan in vitro. Como ejemplo, tomaremos una célula madre de un ratón blanco. Las células madre del paso 2 se combinan con la nueva secuencia del paso 1. Esto se realiza mediante electroporación (empleando un pulso eléctrico para transferir ADN a través de la membrana celular). Algunas de las células madre electroporadas incorporarán la nueva secuencia en el lugar en el que el gen antiguo estaba en su cromosoma, es decir, ocurre recombinación homóloga. La razón por la que tiene lugar este proceso es que ambas secuencias, la vieja y la nueva, son muy similares. Utilizando los genes marcadores del paso 1, se puede aislar rápidamente las células que han incorporado la nueva secuencia, mediante el proceso de doble selección positiva-negativa con neomicina y ganciclovir. Las células madre del paso 3 se insertan en un blastocisto de ratón. En este caso utilizamos blastocistos de ratón pardo. Estos blastocistos se implantan en el útero de una madre adoptiva (denominada pseudopreñada, pues fue apareada previamente con un macho estéril), para llevar a término la gestación. Los blastocistos contienen dos tipos de células madre: las originales (ratón gris) y las modificadas (ratón blanco). El ratón neonato será por tanto una quimera genética: parte del cuerpo provendrá de las células madre originales y parte de las células modificadas. El pelaje también mostrará zonas blancas sobre pardo. Los ratones neonatos sólo serán útiles si la secuencia ha sido incorporada a la línea germinal. Estos ratones se cruzan con otros del tipo blanco para obtener una progenie completamente blanca. Estos ratones aún contienen una copia funcional del gen y tienen que someterse a cruzamiento endógamo para producir un ratón que no lleve ninguna copia funcional del gen original (es decir, que sea homocigótico para ese alelo).


Inactivación de genes por ARN o ADN antisentido: Moléculas que hibridan con ARN mensajeros específicos pueden inactivar genes selectivamente. Los oligodesoxinucleótidos antisentido son los instrumentos más utilizados para alterar la transcripción del ARNm. Éstas son secuencias nucleótidas cortas, sintetizadas como complementos inversos exactos del ARNm diana, con el cual hibridan. El dúplex resultante interferirá en la traducción ribosómica y tendrá como diana de destrucción al ARNm. Vector de expresión recombinante transfectado en la célula

Gen normal

5'

Promotor T3 ARN polimerasa del fago T3

3'

ARNm funcional Transcripción del gen de la cadena de ADN complementaria (cadena antisentido)

El ARN antisentido hibrida con el ARN con sentido bloqueando la traducción del ARNm 5' 3'

3' 5'

3'

5'

ARNm antisentido Producción de ARN antisentido. Se inserta un gen, o una parte del mismo, en un vector mediante clonación direccional en el lado 3' de un promotor y con orientación inversa a la normalmente presente en la célula de origen. La transfección de este ADN recombinante en la célula paterna que lleva el gen normal, da lugar a la transcripción de ARN a partir del ADN con polaridad inversa (ARN antisentido), junto con un tránscrito de ARNm de la celular normal (ARN con sentido). Los dos ARN complementarios antiparalelos se pueden hibridar dentro de la célula bloqueando la expresión (traducción) del tránscrito de ARNm normal.

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68 Alberto Fonte Polo La inhibición de la expresión genética puede obtenerse en el ámbito de la transcripción o en el de la traducción. La inhibición de la expresión de los genes al nivel de la traducción suele conllevar interferencia con el ARNm. El mensaje antisentido puede ser ADN o ARN, y puede ser introducido en la célula diana o expresado in situ desde un vector vírico o un plásmido transfectado. Mediante complementación inversa, el mensaje antisentido se hibridará con el ARNm diana y el dúplex resultante convertirá el mensaje ARNm en ilegible por el complejo ribosómico. Ciertas enfermedades podrían ser tratadas con estas moléculas, por ejemplo, se ha conseguido en células tumorales revertir el fenotipo tumoral a célula normal. También, inyectando oligonucleótidos complementarios adyacentes al inicio de la traducción (AUG) se consigue bloquear la expresión.


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Aplicaciones en genética humana

Aplicaciones al diagnóstico clínico Las técnicas de ingeniería genética se pueden aplicar en la medicina para determinar el agente infeccioso, o para localizar el desorden genético, responsable de una enfermedad. Existen varios tipos de metodologías básicas aplicadas al diagnóstico de enfermedades:  Basadas en técnicas de hibridación de ácidos nucleicos: en este caso, lo que se requiere es una copia física del gen, que va a actuar como sonda. En el caso de una infección, serán secuencias únicas del agente infeccioso y que no sean comunes; mientras que en el caso de un desorden, es el gen causante del trastorno genético.  Basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): no es preciso la presencia de sondas, pero si es necesario conocer la secuencia nucleotídica de los cebadores empleados.  Basadas en técnicas de secuenciación.

Detección de agentes infecciosos por hibridación: Se emplea la técnica de Dot-Blot. Para este análisis se requieren sondas de regiones genómicas de los microorganismos infecciosos, y ADN del cultivo de muestra del paciente infectado. El ADN del paciente se inmoviliza en forma de puntos (dot) en una membrana. Luego, se añade la sonda marcada de cada patógeno. Se deja incubar y, tras el revelado, si da positivo, es que la enfermedad del paciente es causada por el patógeno en cuestión. También se puede inmovilizar el ADN del patógeno en la membrana e hibridarla con el ADN muestra del paciente.

Diagnóstico de enfermedades genéticas por hibridación: Si el gen clonado muestra polimorfismo entre los alelos que determinan fenotipo normal y fenotipo enfermo, se puede poner de manifiesto la enfermedad por medio de los RFLPs (polimorfismo para la longitud de fragmentos de restricción). Por ejemplo, en el caso de la anemia falciforme se emplea el gen de la β–globina para el análisis de esta enfermedad. En este gen existen dianas para las enzimas de restricción MstII y DdeI. Mientras que, en el gen mutado (responsable de la patología) estas dianas se han perdido. Si se digiere el ADN de la muestra del paciente, con la enzima de restricción MstII, se realiza un Southern Blot y se hibrida con la sonda del gen de la β–globina, se observan dos bandas en los pacientes sanos, y una sola banda en los pacientes con anemia falciforme.

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----GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAG----

β-globina normal

Enfermo

Diana para MstII Normal

Diana para DdeI

Se pierden las dianas para las enzimas

----GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAG----

β-globina alterada

Para diagnosticar la anemia falciforme también se puede utilizar un marcador ligado. En este caso, se estudia el polimorfismo de longitud del fragmento de restricción HpaI adyacente al gen de la β–globina.

Diagnóstico de enfermedades infecciosas por PCR: Se requiere el diseño de oligonucleótidos que amplifiquen regiones específicas del patógeno. Se extrae ADN de sangre, vello coriónico o de una gota de saliva del paciente, y se utiliza en una reacción de PCR con los oligonucleótidos específicos del patógeno (que servirán de cebadores en la reacción de PCR).

La detección de una infección viral activa (por ejemplo, infección por HIV) requiere análisis de RT-PCR. Diagnóstico de enfermedades genéticas por PCR: Por ejemplo, se estudiará el caso de la hemofilia A. Se trata de una enfermedad hereditaria, caracterizada por una deficiencia en el factor VIII de coagulación, resultando sangrados


anormales de los pacientes. La enfermedad está causada por un rasgo recesivo ubicado en el segmento diferencial del cromosoma X. Debido a que el gen defectuoso está localizado en el cromosoma X, la enfermedad es mucho más común en los varones.

Localización y organización genómica del gen FVIII

El gen del factor VIII consta de 26 exones. En el intrón 22 hay dos genes (F8A y F8B), y el primero tiene dos copias altamente homólogas en la región telomérica distal a 400 Kb del gen FVIII.

Mecanismo de formación de la inversión del intrón 22 del gen FVIII

En la meiosis masculina en ausencia del cromosoma homólogo pueden ocurrir recombinaciones desiguales entre el gen F8A intrónico y sus homólogos teloméricos, y se produce una inversión, responsable del déficit de factor VIII. En las personas en las que ha ocurrido la inversión se observa una banda más pequeña que en las personas sanas.

Estrategia de PCR de fragmentos largos para la detección de la inversión del intrón 22

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72 Alberto Fonte Polo Diagnóstico genético preimplantatorio (DGP): El diagnóstico genético preimplantatorio, o preimplantacional, es el estudio del ADN de embriones humanos para seleccionar los que cumplen determinadas características y/o eliminar los que portan algún tipo de defecto congénito. Esta técnica nos permite examinar genéticamente embriones obtenidos a través de fecundación in vitro, para establecer un diagnóstico de salud genética en el embrión antes de ser transferido al útero materno. Situaciones susceptibles de DGP:  En la selección de sexo para evitar enfermedades hereditarias ligadas a los cromosomas sexuales (p. ej. hemofilia).  En casos de enfermedades monogénicas (p. ej. fibrosis quística, distrofia muscular de Duchenne).  En casos de mujeres de edad avanzada con mayor riesgo de embarazos con Síndrome de Down.  En casos de parejas con múltiples abortos como consecuencia de alteraciones cromosómicas de sus embriones.  Cuando los padres presentan alteraciones cromosómicas en sus cariotipos. La técnica consiste en extraer por aspiración una de las 8 células del embrión de tres días de desarrollo, cuando estas son pluripotenciales. Una vez realizada la biopsia, el embrión se devuelve al incubador del laboratorio y se mantiene en el cultivo in vitro con las condiciones adecuadas para que siga su normal desarrollo hasta el momento de la transferencia al útero. La localización de anormalidades cromosómicas en el embrión se hace por FISH o por PCR (48 horas). La hibridación fluorescente in situ (FISH) utiliza moléculas fluorescentes para localizar genes o fragmentos de ADN. Al quinto día los embriones diagnosticados como normales son transferidos al útero de la paciente.

Embrión con trisomía 21. El núcleo se ha hibridado con sondas para los cromosomas 13 (verde) y 21 (rojo), y tiene claramente tres señales rojas.

Terapia génica La caracterización a nivel génico y proteico de un gran número de desórdenes hereditarios ha abierto la posibilidad de que estos defectos puedan ser corregidos a nivel molecular. La terapia génica consiste en la inserción de una copia funcional normal de un gen defectivo, o ausente en el genoma de un individuo, en las células de los tejidos del individuo con el objetivo de restaurar la función normal del tejido y así eliminar los síntomas de la enfermedad.


Puede implicar modificaciones genéticas de las células del paciente (terapia génica in vivo) o la modificación de las células cultivadas que son posteriormente reintroducidas en el paciente (terapia génica ex vivo). 

In vivo: en este caso, al individuo se le hace llegar ADN modificado por varios métodos, como la suministración en aerosoles para transfectar células respiratorias, inyecciones o el bombardeo.



Ex vivo: está en fase experimental y consiste en corregir las células para modificar al individuo enfermo. Para ello, se hace un cultivo in vitro de las células del paciente y se las modifica por vectores virales del tipo retrovirus que poseen el gen normal. Con ello, se tienen células enfermas y células sanas, siendo estas últimas las que se aplican en el paciente para que se vuelva un individuo sano.

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74 Alberto Fonte Polo La inmunodeficiencia severa combinada fue la primera enfermedad en la que se usó la terapia génica. Las personas afectadas por el síndrome de la inmunodeficiencia severa combinada no tienen un sistema inmunitario funcional y normalmente mueren de infecciones leves. Se debe a un defecto en el gen que codifica la enzima adenosina desaminasa (ADA). Debido a la ausencia de la enzima adenosina desaminasa se acumulan adenosina y 2’adenosin trifosfato en la sangre, que destruyen los linfocitos T.

En este caso, la terapia génica comienza con el aislamiento de células T. Estas células, que forman parte del sistema inmunitario, se mezclan con el vector retrovírico que lleva una copia del gen ADA normal insertada. Luego, se usa un virus que infecta muchas de las células T, y una copia normal del gen ADA se inserta en el genoma de algunas de ellas. Después de mezclar estas células con el vector y de producirse la infección, las células T se cultivan en el laboratorio y se analizan para asegurar que el gen ADA transferido se está expresando. El último paso de esta terapia génica es la inyección de millones de estas células T, genéticamente modificadas, en el torrente sanguíneo del paciente. Algunas de estas células T emigrarán hasta la médula ósea, y empezarán a dividirse y a producir ADA.

Para desórdenes en los que la mutación provoca una ganancia de función dominante, la adición de la copia del gen normal no resulta ventajosa. En estos casos la corrección de la anomalía implica la sustitución del gen endógeno (todavía ineficiente en la práctica). Por ello, se recurre a métodos que utilizan ácidos nucleicos para inhibir la expresión génica: ARN antisentido. Esto tiene importantes aplicaciones en la terapia del cáncer. Utilizando ARN antisentido se ha conseguido la inhibición de oncogenes. Consiste en bloquear la expresión del oncogén mediante moléculas de ADN y ARN antisentido, que impiden que el ARN sea traducido a proteínas, que el ADN sea traducido a ARN o que la expresión del oncogén salga de la célula.


Para revertir tumores también se usan sistemas asesino-suicidas condicionales. Se requieren vectores retrovirales con el gen tkhs+ (timidina quinasa viral del herpes simple), de modo que, las células tumorales transfectadas morirán en presencia de ganciclovir.

Las células T específicas de tumor (de pulmón, en este caso) son recubiertas con vectores retrovirales en su superficie, además estas células se rodean con glucosaminoglucanos heparán sulfato (HSG), que protegen el vector del reconocimiento inmunológico. Las células T transformadas se inyectan, en ratones portadores de tumor, directamente al pulmón. En el tumor pulmonar, las enzimas –producidas por las células tumorales y por las células T después de la activación por el antígeno tumoral– digieren la cubierta de HSG y el vector es liberado. El vector transfecta las células tumorales y expresa su transgén (por ejemplo, el gen de la timidina quinasa viral del herpes simple). La administración de ganciclovir resulta en la destrucción de los tumores que expresan la timidina quinasa. Iniciando una respuesta inflamatoria que resulta en la activación adicional de las células T específicas de tumor, causando la muerte de las células tumorales restantes. Estas células T también dan lugar a células memoria y proporcionan una protección contra la reexposición con las células tumorales.

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Medicina forense Aunque los individuos de la misma especie comparten el mismo genoma básico, existen diferencias entre genomas individuales basadas en unas secuencias muy polimórficas (hipervariables) para las que existen muchos alelos distintos. Estas secuencias pueden ser de dos tipos, minisatélite y microsatélite. Las técnicas de DNA fingerprinting (huella genética) ponen de manifiesto estas diferencias entre individuos. Análisis de minisatélites: Los minisatélites son secuencias repetidas en tándem (10-100 kb) que se encuentran en distintas posiciones en el genoma (multilocus). El número de unidades repetidas por locus es variable entre individuos. El análisis consiste en hacer un Southern-blot y usar sondas específicas para detectar los VNTR (repeticiones en tándem de número variable). En primer lugar el ADN que se va a analizar debe cortarse en fragmentos de diferentes tamaños usando enzimas de restricción, los fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel. Y después se añade la sonda específica marcada. Este proceso termina generando un patrón de bandas de ADN característico de cada individuo, ya que los VNTRs son únicos para cada persona.

En otras ocasiones la sonda utilizada permite identificar una única región genómica (unilocus) hipervariable.

Sonda multilocus

Sonda unilocus


Análisis de microsatélites: Los microsatélites son secuencias repetidas menores de 200 pb con unidades de repetición muy cortas (1-4 pb) que se amplifican desde el ADN de los individuos por la técnica de PCR. Al contrario que en el caso anterior, los análisis de microsatélites son técnicas unilocus, dado que se analiza, cada vez, un único locus. El principio de la variabilidad es el mismo que el de minisatélites, pero las secuencias flanqueantes son iguales en toda la población, por lo que se busca manifestar el polimorfismo por amplificación y determinar su tamaño. Para este cometido, se diseñan oligonucleótidos con las secuencias flanqueantes (que serán los cebadores de la PCR y estarán marcados con fluorocromos) y se realiza una PCR. Tras esto, se introducen en un carril de un gel de electroforesis. Al final, se revela o se tiñe el gel y se observan los resultados.

Las pruebas de paternidad genética se basan en comparar el ADN nuclear entre un niño y su presunto padre, para aprobar o desaprobar la relación de parentesco. El ser humano al tener reproducción sexual hereda un alelo de la madre y otro del padre, por lo tanto, un hijo debe tener para cada locus un alelo que provenga del padre. Esta prueba se realiza comparando entre 13 y 19 locus del genoma del hijo, del presunto padre y de la madre, en regiones que son muy variables para cada individuo llamadas STR (short tandem repeat).

Proyectos genoma Los proyectos genoma incluyen toda una serie de iniciativas internacionales apoyadas por numerosos grupos de investigación que trabajan coordinadamente en la obtención de la secuencia completa del genoma de una especie. Diversos consorcios públicos han conseguido hasta la fecha la secuenciación de numerosos genomas procariotas, mitocondriales y eucariotas.

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78 Alberto Fonte Polo Especie Tamaño del genoma (Mb) Número de genes 12 5.800 Saccharomyces cerevisiae 180 13.700 Drosophila melanogaster 97 19.000 Caenorhabditis elegans 125 25.500 Arabidopsis thaliana 3.000 27.000 Homo sapiens Contenido en genes y tamaño del genoma de varios organismos

El Proyecto Genoma Humano (PGH) es un proyecto internacional de investigación científica con el objetivo fundamental de determinar la secuencia de pares de bases que componen el ADN e identificar y cartografiar los aproximadamente 25.000 genes del genoma humano desde un punto de vista físico y funcional. La principal justificación del PGH fue la promesa de avances importantes en medicina. El Proyecto constituía el programa de investigación más ambicioso llevado a cabo nunca en la biología: obtener el mapa de la secuencia genética completa del ser humano. Tal empresa sería realizada por el llamado Consorcio Público Internacional, una entidad formada por veinte laboratorios públicos de investigación de Estados Unidos, Reino Unido, Francia, Alemania, Japón y China. El Consorcio Público contaba inicialmente para desarrollar el Proyecto Genoma con 3.000 millones de dólares. El consorcio fue liderado inicialmente por el científico James Watson (codescubridor de la doble hélice). El objetivo principal era determinar la secuencia completa del ser humano leyendo los 3.000 millones de bases químicas de la cadena de ADN. La metodología que se utilizaría, la secuenciación clon a clon, era una aproximación laboriosa pero segura. La estrategia clon a clon de secuenciación consistía en fragmentar el genoma en pedazos de unos 150.000 pares de bases. A partir de mapas genéticos elaborados previamente se sitúan los fragmentos en las regiones del genoma. Los fragmentos se vuelven a cortar, hasta 500 pb, y se superponen. Los fragmentos solapantes que maximizan la longitud de superposición se secuencian. Por último se ensambla la secuencia a través de las superposiciones sucesivas obtenidas en la etapa previa.

Ocho años más tarde del inicio del Proyecto, en 1998, apareció en escena una empresa privada: Celera Genomics y a su cabeza Craig J. Venter. Venter lanzó el reto de obtener la secuencia del genoma humano en un tiempo récord, antes que el Consorcio Público. Utilizando para ello la estrategia de secuenciación del perdigonazo, o Shotgun, que está basada en la fuerza bruta que supone disponer de una gran capacidad de secuenciación y de cómputo informático. Se fragmenta al azar todo el genoma en pedazos que serán


secuenciados varias veces y posteriormente ensamblados por potentísimos ordenadores hasta obtener la secuencia borrador de todo el genoma. Al reto de Venter el Consorcio Público reacciono doblando el presupuesto destinado a los principales centros de secuenciación. Paralelamente se iniciaron y terminaron distintos proyectos de secuenciación de organismos completos, los denominados organismos modelos como el genoma de la bacteria Escherichia coli, o determinados eucariotas como la levadura Saccaromyces cerevisiae, el gusano Caenorhabditis elegans, o Ensamblaje de las secuencias por ordenador la mosca del vinagre Drosophila melanogaster entre otros. Debido a la amplia colaboración internacional, a los avances en el campo de la genómica, así como los avances en la tecnología computacional, un borrador inicial del genoma fue terminado en el año 2001, finalmente el genoma completo fue presentado en abril del 2003, dos años antes de lo esperado. Características principales del genoma humano:  Nuestro genoma contiene un número de genes bastante menor a lo esperado, entre 25.000 y 30.000 genes. Este es un número ligeramente superior al del gusano C. elegans e incluso menor que el del genoma del arroz. Esta aparente paradoja indica que son las interacciones entre los productos génicos, más que el número de genes per se, lo que explicaría la complejidad morfológica y funcional.  El genoma humano tiene más de 3.000 millones de nucleótidos, pero sólo un 3% codifica proteínas, el resto, la inmensa mayoría, parece no tener función.  El 50% de este ADN no codificante son secuencias repetitivas que derivan de elementos transponibles.  Los genes no se distribuyen uniformemente por los cromosomas.  El número de intrones en los genes humanos varía desde 0 (en los genes de las histonas) hasta 234 (el gen de la titina).  Cada persona comparte un 99,9% del mismo código genético con el resto de los seres humanos.  La principal fuente de variabilidad en el genoma humano se corresponde a 3 millones de bases de la secuencia. Las variaciones entre dos personas en un sólo nucleótido se conocen como SNPs (single nucleotide polimorphisms), en estas variaciones se centra la mayor parte de los estudios. Aplicaciones del conocimiento de la secuencia del genoma humano:  Técnicas de identificación forense.  Técnicas de diagnóstico de enfermedades: incluso mucho antes de que se manifiesten. Ya hay unos 11.000 genes identificados relacionados con enfermedades.  Diagnóstico Genético Preimplantacional.  Terapias génicas.

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Aplicaciones en biología animal y vegetal

Un organismo transgénico es aquel que ha sido modificado mediante la adición de genes exógenos para conferirle nuevas propiedades. Se conoce como transgénesis al proceso de transferir genes en un organismo. La transgénesis se usa actualmente para hacer plantas y animales transgénicos.

Obtención de plantas transgénicas La mejora genéticas de las plantas ha sido una tarea lenta y difícil, pero la tecnología del ADN recombinante promete cambios revolucionarios. Hoy en día es posible utilizar técnicas genéticas in vitro para modificar un ADN vegetal y, a continuación, transformar las células vegetales con ADN libre mediante: electroporación, por el método del disparador de partículas, o utilizando vectores procedentes de Agrobacterium tumefaciens. Es posible utilizar técnicas de cultivo de tejidos vegetales para seleccionar clones de células vegetales que hayan sido genéticamente alteradas utilizando técnicas in vitro y, a continuación, mediante tratamientos adecuados, inducir estos cultivos celulares a que produzcan plantas complejas que puedan propagarse de forma vegetativa o por semillas.


La bacteria fitopatógena gram-negativa de dicotiledóneas Agrobacterium tumefaciens contienen un gran plásmido, plásmido Ti, que es responsable de su virulencia. El plásmido contiene genes que movilizan el ADN para transferirlo a la planta. El segmento de ADN del plásmido Ti que se transfiere a la planta recibe el nombre de T-DNA. Las secuencias de los extremos del T-DNA son esenciales para la transferencia y el ADN que se va a transferir debe estar entre estos extremos. Se sustituye la región del plásmido que produce el tumor, o agalla de la corona, por el gen de interés.

Se ha construido un tipo de vector que se utiliza para transferir genes a plantas y se denomina vector binario. Este vector contiene dos extremos del T-DNA a cada lado del sitio que utiliza para la clonación, así como algún gen marcador de resistencia a antibióticos que puede utilizarse en plantas. También contiene un origen de replicación que puede replicarse tanto en Agrobacterium tumefaciens como en Escherichia coli, así como otro marcador de resistencia a los antibióticos que se expresa en la bacteria. El ADN que debe clonarse se inserta en el vector, que a continuación se transforma en Escherichia coli. Acto seguido se transfiere a Agrobacterium tumefaciens.

Este vector de clonación no contiene los genes necesarios para transferir el T-DNA a una planta, por lo que la bacteria Agrobacterium tumefaciens en la que se trasfiera debe contener el otro miembro del sistema del vector binario. Este otro plásmido contiene la región de virulencia (vir) de un plásmido Ti, pero está “desarmado”. Aunque puede dirigir la transferencia de ADN en una planta, ya no tiene genes que provoquen una enfermedad. Este plásmido desarmado, D-Ti, proporcionará todos los genes necesarios para transferir el T-DNA desde el vector de clonación. El ADN clonado y el

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82 Alberto Fonte Polo marcador de resistencia a la kanamicina del vector pueden movilizarse mediante el plásmido D-Ti y transferirse a una célula vegetal. Tras la recombinación con un cromosoma del hospedador, el ADN foráneo puede expresarse y conferir así nuevas propiedades a la planta. Muchos genes no se expresan de manera eficaz en las plantas, a menos que se clonen en un vector de expresión que contenga un promotor vegetal. El uso de Agrobacterium tumefaciens ha permitido la creación de varias plantas transgénicas. Bien es verdad que se han obtenido más éxitos con plantas herbáceas (dicotiledóneas) tales como el tomate, la patata, el tabaco, la soja, la alfalfa y el algodón, pero Agrobacterium tumefaciens también se ha utilizado con dicotiledóneas leñosas como pueden ser el nogal o el manzano. Los cultivos de plantas transgénicas de la familia de las gramíneas (monocotiledóneas) han sido más difíciles de generar utilizando Agrobacterium tumefaciens, pero parece que puede conseguirse buenos resultados con otros métodos de introducción del ADN, como es inyección balística del ADN. Las técnicas de biobalística emplean microesferas de oro o tungsteno, que se recubren del ADN con el gen deseado, y se disparan a gran velocidad con una pistola, o cañón, de genes. Las células en la línea directa del proyectil pueden morir, pero a su alrededor muchas células captan el ADN sin daños. Después, se induce la regeneración de la planta adulta a partir de los protoplastos o de las células tratadas. Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema. Sirve para plantas que son más difíciles de cultivarse sus tejidos (cereales, leguminosas), aunque tiene el inconveniente de que el ADN puede insertarse en copias, y puede ser inestable. El bombardeo de microproyectiles presenta el mayor potencial para la transformación de cereales. Por medio de esta técnica se han obtenido plantas transgénicas en monocotiledóneas como maíz, arroz, trigo, avena y caña de azúcar. Aplicaciones de la biotecnología vegetal:  Resistencia a herbicidas: se han desarrollado plantas transgénicas a partir de genes de bacterias resistentes a herbicida. Así cuando se pulveriza un cultivo con herbicidas sólo mueren las malas hierbas y no las plantas cultivadas.  Resistencia a plagas y a enfermedades: por ejemplo, se utiliza el gen de la proteína tóxica de Bacillus thuringiensis. Esta bacteria produce una proteína cristalina, llamada toxina Bt, que es tóxica para las larvas de las polillas y de las mariposas.  Mejoras de las propiedades nutritivas.  Resistencia a sequía y frío (estrés abiótico).  Otras aplicaciones: producción de variedades coloreadas, plantas transgénicas productoras de vacunas, etc…

Planta sensible

Partes de la planta se ponen en contacto con las bacterias en medio de cultivo

Las células que incorporan el plásmido crecen en un medio especial o selectivo Planta resistente A partir de las células transformadas se obtienen plantas adultas


Clonación animal ¿Qué entendemos por clonación animal? La obtención de uno o de varios individuos, bien sea a partir de una célula (diferenciada o indiferenciada), o simplemente, a partir de un núcleo. De modo que, los individuos clonados son idénticos o casi idénticos al original. El principio de la clonación está en la obtención de organismos idénticos genéticamente, y por tanto morfológica y fisiológicamente, como lo son dos gemelos univitelinos. Se pueden utilizar dos métodos para conseguir clones de animales:  Disgregación de células embrionarias: se basa en el mismo principio por el que nacen gemelos de forma natural. Se pueden separar las células de un embrión en diferentes estados de desarrollo, desde el estado de 2 células hasta el estado de mórula. Cada célula separada puede funcionar como un zigoto que puede desarrollarse para dar un individuo completo.  Transferencia nuclear: se toman células embrionarias en fase de mórula o blástula, obtenidas por disgregación, se cultivan in vitro, y después se transfieren a ovocitos a los que se les ha quitado el núcleo. Se provoca la fusión de las dos células animales de modo que el núcleo de la célula embrionaria quede en el interior del ovocito, pudiendo éste empezar a funcionar como un zigoto. Cuanto más diferenciadas estén las células donantes de material genético, más difícil es conseguir la reprogramación de dicho material genético para que pueda iniciar la diferenciación de la célula receptora. Actualmente es posible obtener clones de células totalmente diferenciadas de un animal adulto que actúan como donantes de su material genético, como ocurrió en el caso de la famosa oveja Dolly.

La eficiencia de clonación a partir de un animal adulto es muy baja, lo que limita su aplicación en la industria agropecuaria.

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84 Alberto Fonte Polo Aplicaciones de la clonación animal:  Mejoramiento genético.  Conservación de especies silvestres en peligro de extinción.  Producción de animales transgénicos: o Productores de fármacos por sangre, leche u orina (p. ej. factor de coagulación IX humano). o Producción de órganos de cerdo para xenotransplantes. o Producción de animales resistentes a enfermedades.

Transgénesis en animales Generalmente, en animales, el ADN extraño, llamado transgén, se introduce en zigotos, y los embriones que hayan integrado el ADN exógeno en su genoma, previamente a la primera división, producirán un organismo transgénico; de modo que el transgén pasará a las siguientes generaciones a través de la línea germinal (gametos). La transgénesis puede efectuarse siguiendo dos estrategias distintas:  Transgénesis por microinyección de cigotos: en la primera fase, se aíslan un número grande de óvulos fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un tratamiento hormonal para provocar una superovulación. La fertilización puede hacerse in vitro o in vivo. En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, y se introduce una solución que contiene ADN. En la tercera fase, estos óvulos son reimplantados en hembras que actuarán como nodrizas permitiendo la gestación hasta término. Por último, tras el destete de los recién nacidos, éstos se chequean, para ver si ha ocurrido la incorporación del transgén.  Transgénesis por manipulación de células embrionarias: una estrategia más poderosa para la transgénesis implica la introducción de ADN extraño en células embrionarias totipotentes (células ES) o células embrionarias madres (células EM). Estas células se toman del interior de la blástula en desarrollo y se pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se conseguirá que las células no se diferencien, y se mantiene su estado embrionario. El ADN extraño se introduce en las células ES, posteriormente las células transfectadas son reintroducidas en una blástula y ésta reimplantada en una hembra. Con esta técnica los neonatos son quimeras, es decir, tienen células de origen distinto, parte con el material genético original y parte transfectadas; pero mediante el cruce de éstas con aquellas quimeras que hayan incorporado el transgén en su línea germinal se consiguen animales transgénicos.

Fundamentos de Genética Aplicada

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