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ÍNDICE
INTRO NT RODU DUCC CCIIÓN......... ÓN ................. ................ ............... ............... ................ ................ ................ ............... ............... ................ .................. ................. ............... ................ ................ ................ ............... ............... ......... �. COMPETENCIAS A DE DESARROLLAR… SARROLLAR……………………………………………… ……………………………………………………...3 ………...3 MEDIDAS DE SEGURIDAD
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INSTRUCTIVO PARA ELABORAR REPORTES �������������������������������������������������������������������� � PRÁCTICA PRÁCTICA NO. 1 Inmovilización de células ……………………………………………………………………………………………………...5 PRÁCTICA NO. 2 Organización de laboratorio de cultivo de células y tejidos…………….………………………………………………………………………………10 PRÁCTICA NO. 3 Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia …………………………………..…………………………………………………....12 PRÁCTICA NO. 4 Inducción de callos …………………………………………………... …………………………………………………...16 16
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Anexos.- Formulación de medios…………………………………………………………… 19
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INTRODUCCIÓN El cultivo de células y tejidos es un área de especialidad metodológica que surge en el siglo XIX como una estrategia para el estudio del comportamiento de las células libres de las variaciones que ocurren en el organismo. Se ha convertido en una herramienta útil tanto en investigación como en producción de sistemas biotecnológicos. Es un área de continua expansión y aplicación en la ingeniería ingeniería en biotecnología por lo que forma parte del área de especialidad del programa de la ingenería en biotecnología. El presente manual de prácticas tiene como objetivo guiar al estudiante de IBT en la revisión de aspectos prácticos de laboratorio del programa de Cultivo de Células y Tejidos. Con este fin, aborda la revisión práctica de temas abordados en el aula para que mediante un desarrollo metodológico, el estudiante sea capaz de revisar los conceptos teóricos de forma analítica y crítica.
COMPETENCIAS A DESARROLLAR “El estudiante de forma analítica, con compromiso y responsabilidad: Inmoviliza células a partir de un cultivo celular Implementa condiciones para el desarrollo de callos y diferenciación Propaga y germina semillas in vitro Prepara medios de cultivo para propagación vegetal • • • •
MEDIDAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO En todo momento el estudiante seguirá el reglamento general del laboratorio, seguirá las instrucciones del profesor y del responsable del laboratorio. Se deberá presentar con bata en todas las prácticas así como guantes y cubrebocas en las prácticas que así lo especifiquen. De tener cabello largo, deberá recogerlo y contenerlo antes de entrar al laboratorio. No se permite el uso de dispositivos electrónicos en las cercanías del área de trabajo ni en las bolsas de las batas. Leer instrucciones de uso y manejo de los reactivos a usar.
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INSTRUCTIVO PARA LA ELABORACIÓN DE REPORTES Los reportes se elaboraran como reporte científico bajo la siguiente rúbrica CONTENIDO
SUFICIENTE
DEFICIENTE
INSUFICIENTE
VALOR MÁXIMO
Introducción
Contiene revisión de conceptos teóricos que refuerzan los aspectos de la práctica. Además, usa una redacción clara concisa y sintetizada sin caer en plagio. Además Usa adecuadamente las referencias. Declara el objetivo de la práctica Metodología adecuada a las modificaciones que se hacen en la práctica de acuerdo a los cambios que se dan. Bien redactada a forma de metodología sin usar enumeración. Usa apoyos gráficos para la presentación de resultados o bien tablas. Todos los apoyos están debidamente rotulados. Todos los cálculos se incluyen de forma clara y concisa. Son objetivos Se discuten los resultados obtenidos con fundamentos teóricos actuales. Además, se hace una revisión suficiente de la bibliografía para respaldar los resultados reportados. Solo se limita a discutir resultados de forma objetiva y clara. Son de acuerdo al objetivo de la práctica. Correcta redacción de una conclusión sin repetir resultados.
Contiene revisión de conceptos teóricos de forma general, no refuerzan los aspectos de la práctica. O bien, usa redacción deficiente. Evita el plagio. Además Usa adecuadamente las referencias. Omite el objetivo de la práctica Metodología copiada de la práctica sin incluir modificaciones o anotaciones que se realizaron durante la práctica. Bien redactada a forma de metodología sin enumeración Se presentan resultados de forma desordenada, sin coherencia. Presenta redacción deficiente. Incluye uso de gráficos o tablas bien rotulados. Son objetivos
Contiene revisión de conceptos teóricos de forma general, no refuerzan los aspectos de la práctica. Presenta usa redacción deficiente. Cae en plagio. Uso de referencias inadecuado. Omite el objetivo de la práctica
10%
Enumeración de la metodología de la práctica dada.
10%
Se presentan resultados de forma desordenada, sin coherencia y con mala redacción .No incluye uso de gráficos o tablas bien rotulados o comete abuso de su uso. Son subjetivos
30%
Se discuten los resultados obtenidos con fundamentos teóricos actuales. S e hace una revisión insuficiente de la bibliografía para respaldar los resultados reportados. Repite resultados pero de forma objetiva y clara.
No se discuten los resultados obtenidos con fundamentos teóricos actuales. Carece de una revisión bibliografía para respaldar los resultados reportados. Repite resultados y además es subjetiva carece de buena redacción.
30%
Repite resultados. Carece de redacción adecuada para una conclusión pero es objetiva
Es subjetiva, repite resultados. Carece de redacción adecuada para una conclusión
20%
Metodología
Resultados
Discusión
conclusiones
Referencias
Cuestionario
La falta de referencias se penalizará con 10% La falta de la contestación del cuestionario se penalizará con 10%
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS PRÁCTICA No. 1
INMOVILIZACIÓN DE CÉLULAS
SUSTENTO TEÓRICO Las células inmovilizadas inmovilizadas se encuentran localizados en cierta cierta región definida del del espacio, su característica es que son capaces de retener su actividad metabólica y catalítica así como en lo posible, su viabilidad. Una de las ventajas es que pueden ser usados de modo repetido y continuo. La inmovilización de de células o enzimas tiene numerosas numerosas aplicaciones en biotecnología, biomedicina, farmacología (producción (producción de antibióticos), producción producción de bebidas y alimentos (producción de cerveza, exopolisacárido), agricultura y ganadería (producción de esperma para mejoramiento animal), biorremediación (decoloración de colorantes textiles, remoción de metales pesados), etc. Existen distintos métodos de inmovilización: a)Adsorción: No daña las células, pero como la fuerza de unión es baja, se produce elusión de las células, lo cual produce pérdidas importantes de células en los procesos continuos. continuos. b) Uniones iónicas: los soportes son intercambiadores iónicos, es una una metodología sencilla, pero cambios en el pH o la concentración de sales, sales, puede separar las células del del soporte. c)Uniones covalentes: covalentes: uniones son más fuertes, hay que modificar proteínas de las células o regiones de de la enzima. Hay que que verificar que no haya pérdida de la actividad catalítica. Es más costoso. d) Entrecruzamiento: Entrecruzamiento: entre aminoácidos de la proteína y agentes polimerizantes como como el glutaraldehído. f) Encapsulación Encapsulación Microencapsulación Microencapsulación en polímeros: polímeros: se se rodean células o enzimas físicamente en geles microcápsulas o polímeros fibrosos como la celulosa. Los geles son polímeros entrecruzados insolubles insolubles en agua, agua, como la poliacrilamida. poliacrilamida. En el caso caso de las microcápsulas, las células o enzimas se rodean de una membrana semipermeable del polímero. OBJETIVO �
Obtener esferas con levadura inmovilizadas en alginato y/o agar.
COMPETENCIAS A DESARROLLAR El estudiante cultiva e inmoviliza células eucariotas en dos soportes. Además, de forma analítica y objetiva, justifica el uso de soportes evaluados.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA MATERIAL Jeringa estéril. 2 cajas petri 4 vasos de precipitados 250ml 1 vaso de 100ml 1 matraz de 500ml Imanes para agitación Tubos para centrifuga
EQUIPO Campana de flujo laminar Incubadora con agitación orbital Incubadora Centrifuga Parrillas de calentamiento y agitación
REACTIVOS Medio de cultivo de activación de levadura: Extracto de levadura, peptona, glucosa 50ml Solución acuosoa de NaCl al 0.85% (p/v) 50 ml Solución acuosa CaCl2 1M (p/V) 100ml amortiguador de fosfatos 0.1N, pH 5.5 50 ml solución de agar 1.2% (p/v) (Será preparada por por el equipo) Aceite vegetal �
Alginato de sodio Agar
PROCEDIMIENTO ANTES DE INMOVILIZACIÓN: A) PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 1. Preparar medio para crecimiento de levadura 150 ml Medio para levadura: Extracto de levadura 10g/L, peptona 20g/L, glucosa 20g/L 2. Preparar 50 ml solución de agar 1.2% (p/v) Al usar mantener a 50°C Esterilizar y mantener estéril.
B) OBTENCIÓN DE BIOMASA BIOMASA A PARTIR DE LEVADURA LEVADURA SECA (DIA 1) NOTA: Todo trabajo con la levadura se realizará en la campana de flujo laminar Disolver la levadura 3g en 20 ml de medio de cultivo estéril para activación en condiciones asépticas, transferir la disolución al matraz de cultivo conteniendo medio de cultivo de activación. Colocar en agitación rotacional a 200rpm 30°C por 36 horas Evaluar por resiembra en caja y al microscopio posibilidad de contaminación En caso de existir contaminación, aislar la levadura en repeticiones y diluciones. Seguir cinética de crecimiento cada 6-8 horas por D.O.600nm para detener crecimiento en fase estacionaria (idealmente entrando a fase estacionaria) Centrifugar el medio de cultivo 8000 rpm a 4°C por 5 minutos, para obtener el pellet a inmovilizar. Obtener 2 porciones de 100 g de células en pastilla húmeda para realizar las 2 inmovilizaciones.
Preparación de 2 cajas medio sólido para preservación de levadura seca INMOVILIZACIÓN (DIA 2)
Preparación alginato: 1. Disolver 3 g de alginato de sodio en 100ml de medio. Agitar hasta que el alginato se haya disuelto completamente. La solución final contiene 3% de alginato en peso. �
2. NOTA: La solución de alginato de sodio se prepara mejor agregando el polvo al líquido en agitación para evitar la formación de aglomerados. Puede requerir agitación prolongada para lograr una disolución completa. Después de que se ha disuelto, dejar la solución sin agitación por 30 minutos para eliminar burbujas de aire que hayan quedado atrapadas. Resuspender las células en la solución solución de alginato preparada previamente. previamente. Permitir escapar las burbujas de aire. Medir D.O. 600nm NOTA: Debido a que el crecimiento celular puede romper el lecho, las células deberían idealmente haber entrado en fase estacionaria. La relación de peso seco a peso húmedo es aproximadamente de 4 para la mayoría de las células, en caso de usar células secas. 3. Gotear la mezcla de alginato-levadura al ginato-levadura desde una altura de 20 cm en una solución entrecruzadora de 300ml 300ml ( añadiendo CaCl2 a una concentración 0.05M 0.05M de en el medio de crecimiento). La solución entrecruzadora debe mantenerse en agitación continua con agitador magnético. magnético. La formación de gel puede puede realizarse a temperatura ambiente tan pronto como las gotas entran en contacto con la solución de calcio. Se desean pequeñas esferas de alginato para minimizar la resistencia a transferencia de masa. Se pueden lograr 2mm de diámetro con ayuda a yuda de una jeringa y aguja. Las esferas se endurecen preferencialmente entre 1 y 2 horas. (Alternativamente se pueden enfriar en baño de y hielo 30 minutos) 4. Medir D.O. 600nm en la solución sobrante. 5. Lavar las esferas con solución de entrecruzamiento de calcio. 6. Construcción de reactor de células inmovilizadas con un matraz de 500 ml (Práctica de E.E. ingeniería de reactores bioquímicos)
Inmovilización agar 1. Mezclar la otra mitad de levaduras en 50ml de NaCl 2 con 50ml de una solución estéril de agar al 1.2% manteniendo a 50°C 2. Medir D.O. 600nm 3. Mezclar con 50ml de aceite vegetal en una una mezcla 25% (p/p) 4. Agitar para la obtención de esferas 5. Enfriar en un baño de hielo a 0°C 6. Filtrar las esferas y lavar con amortiguador de acetatos 0.1N pH= 5.5 7. Medir D.O. 600nm en filtrado. 8. Almacenar esferas en el mismo buffer.
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CUESTIONARIO BIBLIOGRAFÍA Nagashima, M., Azuma, M., and Noguchi, S., Technology developments in biomass alcohol production in Japan: continuous alcohol production with immobilized microbial cells, Ann. N.Y. Acad. Sci.,413, 457, 1983. Nam Sun Wang. Department of Chemical & Biomolecular Engineering University of Maryland. POTTER, Norman N. La ciencia de los alimentos. Ed. Harla, México. (1978). Pág. 359-376. JAGNOW, G. Y David W.Biotecnología: inducción inducción con experimentos modelos. Ed. Acribia, Zaragoza-España (1991).
NOTA AL EQUIPO: EQUIPO: Es altamente altamente recomendable iniciar la preparación preparación de auxinas y citoquininas como descrito en ANEXO II. Se puede realizar fuera del laboratorio.
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS PRÁCTICA No. 2
ORGANIZACION DE LABORATORIO DE CULTIVO DE CÉLULAS Y TEJIDOS
SUSTENTO TEÓRICO El cultivo celular es una herramienta útil tanto en investigación como en producción de sistemas biotecnológicos ya que facilita el análisis de propiedades y procesos biológicos que no están accesibles a nivel de un organismo intacto. El éxito en el mantenimiento de células en cultivo, sea primaria o inmortalizada, requiere del conocimiento y prácticas de consideraciones técnicas esenciales. Existen cuatro requerimientos básicos para el éxito del cultivo de células. La primera necesidad es un equipo que facilite el cultivo de forma propia y establecida. El nivel de bicontención requerida es dependiente del tipo de cultivo de células y el riesgo de contaminación de estas así como la transmisión de agentes infecciosos. Por ejemplo, las células de primates, líneas celulares humanas, líneas celulares contaminadas con mycoplasma y células humanas no probadas, requieren un nivel de contención mínimo de 2. El Segundo requerimiento es la práctica de la técnica de esterilidad. Antes de iniciar cualquier trabajo, una cabina de seguridad debería encenderse al menos 15 minutos para purgar el aire contaminado. Todas las superficies deben estar sin contaminación y se debe poner especial atención en que todo que entre en contacto con las células haya sido esterilizado. Una tercer necesidad es el uso de suplementos y reactivos controlados de calidad y apropiados; para la mayoría de los protocolos y usos, es aceptable el grado reactivo así como plásticos para uso de cultivo de célula apropiado. Esto asegura tanto la adherencia como el crecimiento y el mantenimiento del grado de esterilidad requerido. Por último se requiere conocimiento y prácica en las técnicas de cultivo c ultivo de las células de interés. OBJETIVOS 1. Conocer los requerimientos de de un laboratorio, instalaciones, áreas, equipos, equipos, materiales y suministros necesarios o indispensables indispensables para la realización de actividades del cultivo in vitro de tejidos vegetales. ��
2. Conocer los requerimientos de de un laboratorio, instalaciones, áreas, equipos, equipos, materiales y suministros necesarios o indispensables indispensables para la realización de actividades del cultivo in vitro de tejidos animales. 3. Diseñar Diseñar las áreas necesarias necesarias para los procedimientos procedimientos que que permitan la elaboración elaboración de medios de cultivo, el aislamiento y cultivo in vitro de células, tejidos y órganos vegetales, así como su incubación. incubación. 4. Conocer como ejemplo las normas de cada área de trabajo de un laboratorio de cultivo de células y tejidos
COMPETENCIAS A DESARROLLAR El estudiante diseñará un laboratorio de cultivos de células y tejidos en tres niveles: enseñanza, uno de investigación y un laboratorio comercial.
DESCRIPCIÓN DE LA PRÁCTICA MATERIAL A los alumnos investigaran en medios electrónicos, libros revistas científicas, las necesidades y requerimientos de laboratorios de enseñanza, investigación y de tipo comercial.
PROCEDIMIENTO Los alumnos realizarán investigación bibliográfica sobre las áreas de un laboratorio de cultivo de células y tejidos, necesidades, requerimientos, equipos básicos e instalaciones. i nstalaciones. Los alumnos justificarán su uso y aplicación, así como el manejo y precauciones dentro del laboratorio En base a lo investigado, diseñarán un laboratorio de cultivo de células y tejidos.
CUESTIONARIO
BIBLIOGRAFÍA �������� ����� ��� ������ ���� ����� ���� ������� ��������� � �� �������� ������� �� ��������� ������� ������ ���
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS (EXPERIENCIA EDUCATIVA) PRÁCTICA No. 3
Germinación de semillas de diversas especies en condiciones de asepsia SUSTENTO TEÓRICO INTRODUCCION
Las semillas proceden de los primordios o rudimentos seminales de la flor, una vez fecundadas y maduras. Su función es la de dar lugar a un nuevo individuo, perpetuando perpetuando y multiplicando la especies a la que pertenece. La semilla consta esencialmente de un embrión (formado por un eje embrionario y uno, dos o varios cotiledones), una provisión de reservas nutritivas , que pueden almacenarse en un tejido especializado (albumen o endospermo) o en el propio embrión, y una cubierta seminal que recubre y protege a ambos. Las semillas son la unidad de reproducción sexual de las plantas y tienen la función de multiplicar y perpetuar la especie a la que pertenecen. Además, es uno de los elementos e lementos más eficaces para que la especie se disperse, tanto en el tiempo como en el espacio. Para que la semilla cumpla con su objetivo es necesario que el embrión se transforme en una plántula, que sea capaz de valerse por si misma y, finalmente convertirse en una planta adulta. Todo ello comprende una serie de procesos metabólicos y morfogenéticos cuyo resultado final es la germinación de las semillas (Pére Garcia et al, 1998). Se conocen identificados 4 requerimientos abióticos básicos necesarios para la germinación: 1. Agua, que contribuye con el potencial hídrico del ambiente y de la semilla. Se considera considera el factor determinante para la germinación. 2. Oxígeno, en forma gaseosa o disuelto disuelto en agua. 3. Temperatura, específica para cada especie. 4. Luz, se considera un promotor de la germinación. Existen factores que afectan la germinación los cuales, se pueden dividir en dos grupos: Factores internos o intrínsecos: son aquellos propios de la semilla como madurez y viabilidad Factores externos o extrínsecos: son aquellos que dependen del ambiente como agua, temperatura y gases. En el proceso de germinación, se pueden distinguir distinguir tres fases como son (Azcón-Bieto y Talón 1993): a) Fase de hidratación Se refiere a la absorción de agua por parte de los tejidos que conforman a la semilla. Este incremento va ligado a un incremento proporcional en la actividad a ctividad respiratoria b) Fase de germinación ��
Se producen transformaciones metabólicas necesarias para el desarrollo de la plántula. La absorción de agua se reduce al máximo. c) Fase de crecimiento Última fase que se asocia con la emergencia de radícula la cual es visible. La absorción de agua vuelve a aumentar así como la actividad respiratoria.
OBJETIVO • Inducir la germinación de semillas de diferentes especies vegetales para la obtención de plántulas libres de hongos y bacterias.
COMPETENCIAS A DESARROLLAR El estudiante inducirá la germinación de semillas de diferentes especies vegetales.
MATERIAL BIOLÓGICO Semillas de jitomate, lechuga, zanahoria MATERIAL DE LABORATORIO 2 matraz Erlenmeyer de 500 mL 2 vaso de precipitados de 100 o 250 ml 1 piseta de 250 mL 1 agitador de vidrio rollo de papel aluminio 4 cajas de Petri rollo de algodón 1esponja 10 Frascos tipo “Gerber” con tapa de polietileno o Tubos de ensaye 2.5 x 30 cm Masking-tape 2 Espátulas o cucharas de acero inoxidable
EQUIPO Campana de flujo laminar Autoclave Potenciómetro Balanza analítica REACTIVOS ��
Etanol al 70% HCl 1.0 N NaOH 1.0 N H2SO4 3.0 M NaClO 1% Extran 2%
PROCEDIMIENTO DESARROLLO EXPERIMENTAL: Esterilizar previamente por equipo: • 2 vasos de precipitado de 250 mL • 1L de agua destilada • 2 espátulas Medios de cultivo
PROCEDIMIENTO: Preparación del medio de cultivo: 1. Según el número de equipos y las especies vegetales a utilizar, preparar medio de cultivo semisólido de Knop o MS según la formulación indicada en el Anexo 1. El pH deberá ajustarse con NaOH 1.0 N antes de adicionar el agar a los medios (Medio Knop a pH de 5.5 y Medio MS a pH. Preparar medio de cultivo en cantidad suficiente para 10 frascos o 10 tubos. 2. Fundir el agar en calor y verter 20 mL en cada frasco (tipo “Gerber”) o 15 mL en cada tubo, cubrir con tapa de plástico o doble tapa de papel aluminio y sujetar con ligas o Masking-tape, esterilizar en autoclave a 121°C y 15 psi de presión durante 15 min. Desinfección de semillas: El siguiente protocolo puede ser utilizado para semillas de zanahoria, jitomate y lechuga. a. Colocar las semillas en 10 ml agua con extrán al 2% (o detergente) durante 30-40 minutos, mantener en agitación (manual o con un agitador magnético). b. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar elim inar el detergente. A partir de este paso trabajar en la campana de flujo flujo laminar. Utilizar la espátula estéril estéril para retener las semillas. c. Sumergir las semillas en una 50 ml de solución de etanol al 70% por 30 segundos (exactos). d. Enjuagar tres veces con agua estéril para eliminar elim inar el etanol. e. Transferir las semillas a un vaso estéril y sumergirlas en 50 ml de solución de hipoclorito de sodio al 1% de cloro libre durante 10 min. ��
f. Lavar las semillas cinco veces con agua estéril e stéril para eliminar el hipoclorito de sodio y decantar, ayudándose con la espátula estéril. e stéril.
Siembra e incubación de las semillas g. Del vaso de precipitados, tomar una a una las semillas y colocarlas en los tubos o frascos que contengan medio de Knop o MS con la ayuda de una espátula estéril. h. Colocar 3-5 semillas en cada tubo o frasco, f rasco, procurando que queden separadas y en contacto con el medio de cultivo. i. Colocar los recipientes con las semillas en un cuarto de cultivo en oscuridad a una temperatura de incubación de entre 24 a 26 ºC. Observar cada semana las semillas. Separar los tubos o frascos contaminados y anotar si se trata de contaminación bacteriana o fúngica. Los frascos o tubos contaminados deberán esterilizarse a la brevedad. k. A la aparición del coleóptilo, c oleóptilo, exponer los tubos al fotoperíodo natural hasta que la plántula alcance una altura aproximada de 8-10 cm (dependiendo de la especie).
CUESTIONARIO 1. ¿Qué pasa si las semillas se dejan más tiempo en etanol? 2. ¿Por qué las semillas de B. hemisphaerica son tratadas con H2SO4? 3. ¿Qué es el coleóptilo? 4. ¿Por qué algunas semillas requieren de la obscuridad para germinar? ¿Qué tipo ti po de tratamiento luminoso requieren algunas semillas para poder germinar?
INCLUIR EN RESULTADOS Y DISCUSIÓN LOS SIGUIENTES PUNTOS: El tiempo de germinación de las semillas El % de germinación. Por única ocasión, una comparación de estos resultados con los demás equipos. Discutir a detalle el papel que juega cada una de la soluciones en el proceso de desinfección.
BIBLIOGRAFÍA Pérez García, F. y Martínez-Laborde, J.B.(1994). "Introducción a la Fisiología Vegetal". Ediciones Mundi-Prensa Azcón-Bieto J. y Talón M.,1993. Fisiología y Bioquímica Vegetal Interamericana/McGrawHill Interamericana/McGrawHill Kieran, P.M., Mac Loughlin P.F., Malone D.M. (1997). Plant cell suspension Biotechnology. 59, 39-52. cultures: some engineering considerations . Journal of Biotechnology. Murashige T and Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15(3): 473-497.
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS (EXPERIENCIA EDUCATIVA) PRÁCTICA No. 4
INDUCCIÓN DE CALLOS
SUSTENTO TEÓRICO Una de las características centrales de las células vegetales es su alta plasticidad para realizar diferenciación celular. Las plantas generan masas celulares desorganizadas, como tumores o callos, en respuesta a algún estrés como heridas o infecciones patógenas. La formación de callos en árboles caídos se ha estudiado desde hace más de 200 años, acuñándose el término “callus” para la formación de acumulaciones celulares asociadas con heridas. Actualmente, se usa la misma palabra para la asociación de masas celulares que de forma colectiva se le conoce como callos. Estos pueden ser producidos a partir de una célula diferenciada que tenga la capacidad de regenerar a una planta completa; muchos de las células de los callos son totipotenciales. Bajo ciertas condiciones, las células de los callos también sufren embriogénesis somática, un proceso en el cual los embriones son generados a partir de células somáticas adultas. Es debido a esto que al menos algunas formas de formación de callos, involucran desdiferenciación celular. Sin embargo, se sabe que los callos son muy diversos y pueden existir varios subgrupos basados en sus características macroscópicas. OBJETIVO: Conocer e implementar técnicas de desinfección en inducción de callos OBJETIVOS ESPECÍFICOS: Inducir desdiferenciación tisular en explantos provenientes de tejidos tej idos vegetales Acelerar el crecimiento de plantas usando medios suplementados con fitohormonas
COMPETENCIAS A DESARROLLAR El estudiante inducirá desdiferenciación tisular de explantes de tejidos vegetales.
MATERIAL bisturí, pinzas, mecheros, frascos, placas de vidrio, gasa, algodón, papel alumnio, papel craft, vinilpel, cinta de enmascarar, probetas, matraces, pipetas, guantes, tapabocas, gorro, material vegetal (frijol verde, zanahoria, planta aromática a elección). ��
EQUIPO balanza, potenciómetro, agitador magnético, cámara de flujo laminar, incubadora REACTIVOS Auxinas o Ácido 2-4-diclorofenoxiacético 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D), (2,4-D), citoquininas: kinetina o 6-benzilaminopurina (BA) (stock: 1mg/ml en HCl 0.5N; se usa a 1mg/L), hipoclorito de sodio 2%, alcohol industrial, etanol 70%, agar, sacarosa, medios de cultivo, Medio MS Tween 80 (Esterilizar 1ml por grupo) Agua destilada estéril (Suficiente para lavados
PROCEDIMIENTO 1. Preparación del medio de cultivo Preparar medio en condiciones estériles 15psi 121°C 20 minutos a) Medio para para Inducción de callos Preparar 60ml de MS suplementado con sacarosa 3%, vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento Control: 60ml de MS enriquecido con las condiciones auxina: citoquinina 2:1 b) Medio de crecimiento Preparar 60ml de MS enriquecido con sacarosa 3%, vitaminas, agar (0.8%) y sin reguladores de crecimiento (medio control) y 60 ml de medio control enriquecido con relación auxina:citoquinina 1:2
2.- Desinfección Lavar el material vegetal con agua y jabón, sumergir en 50 ml de etanol al 70%, 2 min. Sumergir posteriormente en 50ml de hipoclorito de sodio (2%, 15 min) con 2 gotas de Tween 80. Posteriormente, Posteriormente, eliminar el desinfectante desinfectante mediante 3 lavados lavados consecutivos con agua destilada estéril (5min cada uno). Transferir a cada medio en condiciones estériles de temperatura 25°C y fotoperiodos de 16h. 3.- Práctica Revisar los cultivos una vez por semana, anotar los avances que presenten, callos, contaminaciones, organogénesis, organogénesis, aumento en longitud o tamaño. Justificar los procesos que se llevan a cabo en comparación con los controles
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BIBLIOGRAFÍA
Momoko Ikeuchi, Keiko Sugimoto, and Akira Iwas The Plant Cell, Vol. 225: 5: 3159–3173, September 2013 Neely, D. (1979). Tree wounds and wound closure. J. Arboriculture 5:135–140.
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ANEXO I FORMULACIÓN DE MEDIOS Medio de Knop Reactivo
mg/L
MgSO4.7H2O
200
KNO3
200
KH2PO4
200
Ca(NO3)2*4H2O
800
Agar
8000
pH
5.5
Medio de Murashige y Skoog (1962) Macronutrientes
Concentración mg/L solución
Volumen del stock por L de medio
NH4NO3
1650
100 ml
KNO3
1900
CaCl2.H2O
440
MgSO4.2H2O
370
KH2PO4
170
NaH2PO4.H2O
85
Micronutrientes
Concentración final mg/L
KI
0.83
H3BO3
6.20
MnSO4.4H2O
22.3 ��
ZnSO4.4H2O
8.6
Na2MoO4.*2H2O
0.25
CuSO4 5H2O
0.025
CoCl2.6H20
0.025
Na2EDTA.2H2O
37.2
FeSO4.7H2O
27.8
Vitaminas (mg/L) Inositol 100 Nicotínico 0,5 HCl-Piridoxina 0,5 Glicina 2 HCl-Tiamina 0.1
volumen de la solución stock por L de medio 10 ml
Sacarosa 30g/L Agar 8 g/L pH 5.8
Elaboración de soluciones stock del medio Murashige y Skoog Stock de macronutrientes: 10X Macronutriente
g/L stock
NH4NO3
16.5
KNO3
19
CaCl2.H2O
440
MgSO4.2H2O
3.70
KH2PO4
1.70
NaH2PO4.H2O
0.85
volumen a usar 100 ml
Micronutrientes Micronutrientes
mg/100 mlL stock 10 ml ��
KI
83
H3BO3
620
MnSO4.4H2O
2230
ZnSO4.4H2O
860
Na2MoO4.*2H2O
25
CuSO4 5H2O
2.5
CoCl2.6H20
2.5
Laboratorio preparar: stock Stock de Fe-EDTA: El hierro se añade quelado en el siguiente stock: Disolver 3.7g de EDTA disódico en 900ml de agua destilada. Se obtendrá una solución clara a 15 min a Tamb Añadir 2.8g de sulfato ferroso heptahidratado. Se obtendrá un color amarillo claro Aforar a 1L y almacen en una botella ambar para proteger de la luz Usar 10ml de la solución para cada L de medio
Stock de vitaminas: usar 10ml de la solución stock para 1L de medio
Vitamina Inositol o mioinositol Nicotínico HCl-Piridoxina Glicina HCl-Tiamina
(mg/100ml) 1000 5 5 20 1
El stock de vitaminas se esterilizará por filtración y se añadirá en condiciones asépticas al medio estéril.
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ANEXO II PREPARACIÓN DE EXTRACTO DE AUXINAS y CITOQUININAS Material: 100g lentejas 500ml de agua destilada 1 vaso de precipitados 1L Mortero Procedimiento 1.-Desinfectar las semillas con extran. 2.-Colocar los 100g de lenteja en un vaso de precipitados y agregar 500ml de agua destilada 3.- Tapar con papel aluminio e incubar a temperatura ambiente una noche (16h minimo) 4.- Escurrir el agua y almacenar (1ª peparación de auxinas) a uxinas) 5.- Colocar las lentejas en papel filtro y almacenar hasta que desarrollen aproximadamente 3 cm. De raíz. 6.- Cortar las raíces desechando el resto. 7.- Triturar las raíces e incubar en agua durante 1 día en un lugar oscuro. 8.- Escurrir el agua y mezclar con la 1ª preparación de auxinas.
Stock de reguladores de crecimiento El stock se puede hacer a 1mg/ml . Las auxinas se pueden disolver en una cantidad de etanol al 95%, KOH o NaOH 1M. Una vez disueltas se añade agua destilada lentamente para evitar precipitación. Ácido abcisico se puede disolver en NaOH 1N y las giberelinas en etanol al 95%
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HOJA FINAL DEL MANUAL
Este manual de prácticas de laboratorio fue recopilado y elaborado por Dra. Patricia Pavón Orozco, Orozco, para la Experiencia Experiencia Educativa de Cultivo de Células y Tejidos que se imparte a los alumnos alumnos de la Facultad de Ciencias Ciencias Químicas de la Universidad Veracruzana, Campus Coatzacoalcos. Coatzacoalcos, Ver., Febrero 2016.
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