Nemeis Altamirano BIOPROCESOS
CONTENIDO GENERALIDADES • Diseño de un fermentador • Modos de operar los Biorectores y tipos de fermentación
FERMENTACIÓN FED BATCH • • • • •
Tipos de bioreactores Perfiles Reactores biológicos ¿Cómo se opera? ¿Por qué utilizar una fermentación F-Batch?
VENTAJAS USOS
CLASIFICACION • Incremental • Volumen fijo
BALANCES • Obtencion de ecuaciones para biomasa, Sustrato y producto • Influencia sobre la velocidad específica de crecimiento
TIPOS DE ALIMENTACION PARAMETROS QUE EMPIEZAN O TERMINAN LA ALIMENTACION Y PARAN LA FERMENTACION
CONOCIMIENTOS PREVIOS
Modos de operar los Bioreactores y tipos de fermentaciones Los bioreactores (también conocidos como fermentadores)
son usados para el crecimiento de las células. El reactor esta diseñado para satisfacer las necesidades de las células, como:
Condiciones nutricionales Condiciones ambientales
FERMENTACION FED-BATCH Es un modo de operación donde uno a más (en algunos casos todos) nutrientes son adicionados al reactor durante el cultivo. La velocidad de adición de la alimentación puede ser función del tiempo, pero el medio que contiene los metabolitos es retirado una vez finalizada cada corrida (no hay salida continua).
Tipos de Bioreactores
Reactores Biológicos. ♠ En tanda o Lote (batch). ♦ Con agitación. ♦ Sin agitación. ♠ Lote alimentado (Fed-batch). ♦ Incremental. ♦ Volumen Fijo. ♠ Continuo.
♦ Semicontinuo.
PERFILES Cultivo Fed-Batch
Cultivo Batch
Cultivo Continuo
¿ Cómo se opera ? El proceso de producción comienza como si fuera un
cultivo tipo batch.
En un proceso fed-batch, la fermentación empieza con
un volumen, concentración de microorganismos y sustrato determinados y, a medida que transcurre el proceso de fermentación, el substrato se añade poco a poco, hasta que se consigue llenar el bioreactor.
Debido a esto el volumen de caldo aumenta VR = f(t) y todas las variables se ven afectadas en el tiempo x,s,p. Definición de variable
♦ Cantidad de: X = x*V S = s*V P = p*V
¿ Por qué utilizar una fermentación tipo FED-BATCH ? El tipo de cultivo fed batch, está entre el cultivo tipo batch y continuo;
aquí se busca :
Alargar la fase exponencial de Producción de biomasa para Aumentar la cantidad de la Misma.
Prevenir o reducir la inhibición por sustrato asociada al Crecimiento controlando la Adición de nutrientes
Grafica de alargamiento de μ
Ventajas Se añaden nutrientes, aditivos o medio fresco para :
Poder utilizar sustratos que inhibirían la producción a conc. elevadas. Mejorar el rendimiento en biomasa.
Producción de metabolitos típicos de fase estacionaria F.estacionaria y así controlar moo. y sus productos).
Reducir la viscosidad del polisacáridos extracelulares).
Elegir el momento adecuado para inducir la producción (cambiar el tipo de sustrato que se mete y elegir cuándo).
Evitar problemas de contaminación o estabilidad genética que se dan en cultivo continuo.
(se prolonga la
medio de fermentación (en la producción de
Utilidades Inhibición del crecimiento por sustrato Al existir una alta concentración de sustrato se puede producir inhibición del crecimiento. Efecto de la glucosa, metanol, ac. acético, compuestos Aromáticos.
Alta concentración Si se desea una alto concentración de células se necesita una alta concentración de sustrato, se puede producir inhibición por sustrato. Se necesita una forma de alimentación que no genere inhibición.
Utilidades
Represión Catabólica
Los microorganismos tienden a metabolizar las fuentes de carbono más rápido y no generan otras enzimas que se utilizaría para degradar otras fuentes, entonces con este tipo de alimentación se mantiene la tasa de crecimiento pero con la producción de la enzima de interés.
Mutantes auxotróficas
Los microorganismos que requieren de un nutriente que no son capaces de sintetizar, si tienen exceso de este nutriente se tiene un abundante crecimiento sin acumulación del metabolito deseado, luego se requiere alimentar este nutriente a bajas tasas.
Utilidades
Productos No-Asociados al crecimiento
Los moos. rápidamente utilizan F. de carbono para su crecimiento y luego sintetizan otros metabolitos, generalmente en la etapa declinatoria o estacionaria, esta etapas son muy cortas, para prolongarlas y mantener una alta actividad de síntesis y a los moos. “semi-hambrientos”, la F. de carbono y/o precursores son alimentados a velocidades. controladas. Control On-Off de expresión de algún gen:
Cuando un promotor de un gen foráneo es encadenado en un plásmido regulable su expresión puede ser controlada por la adición de algún compuesto (gen inducido) o puede reprimirse. Se pueden adicionar algún compuesto como cloramfenicol en pequeñas dosis o mantener el nivel de nutrientes muy bajo.
Clasificación
Incremental
FERMENTACION FED-BATCH
Volumen Fijo
Cultivo Fed-Batch Volumen Fijo
El sustrato limitante es alimentado sin diluir al cultivo.
El volumen del cultivo puede ser mantenido practicamente constante, por alimentar al S-L en forma .
Fed-Batch Volumen Fijo
Cultivo F-Batch Cíclico para sistemas de volumen fijo
Salida periódica de una porción de cultivo, y uso de cultivo residual como un punto de comienzo.
Una vez que la fermentación alcanze condiciones que no puedan ya ser mantenidas, el cultivo es removido y la biomasa es diluída al volumen original con agua estéril o medio conteniendo S-L.
Cultivo Fed-Batch Incremental
El volumen cambia con a lo largo del tiempo de la fermentación, debido al sustrato alimentado. Las concentraciones del sustrato de la alimentación es igual o mayor a la
concentración que había en el fermentador al comienzo del proceso.
El modo de cambio de este volumen, es dependiente de los requerimentos, limitaciones y objetivos del operador. Tambien puede ser llamado: proceso de F-Batch Repetido, cultivo F-Batch ciclico, proceso F-Batch simple.
Fed-Batch incremental Un Cultivo Fed-Batch cíclico tiene una ventaja adicional:
• La fase productiva de una proceso puede ser extendida bajo
condiciones controladas. • El control periódico en la µ suministra una oportunidad de
optimizar la síntesis de producto, particularmente si el P de interes es secundario (produc. en fase de desaceleración).
Fed-Batch incremental
La alimentación puede ser sumunistrada de acuerdo a una de las siguientes opciones:
1)
El mismo medio usado en el modo Batch es añadido
2)
Una solución del sustrato limitante a la misma concentración tal que en el inicio del medio es añadido
3)
Una solución muy concentrada del S-L es añadidad a una velocidad más lenta que en 1), 2), 3)
Forma de operación
Incremental
Existen 2 Etapas:
1a ETAPA: 2a ETAPA:
Finaliza con V = V0 y
X = X0
Donde se comienza una alimentación F(t) hasta V = Vf
Balance Global Velocidad de acumulación
d(VCi) dt
dV = F dt
=
=
Velocidad de entrada
(F1Cil)
-
-
Velocidad de salida
(F1Ci)
+
+
Velocidad de formación
(Vrfi)
Velocidad de consumo
-
(Vrci)
-
El caudal de salida F2 es nulo, por lo que V aumentará en el tiempo, en función del caudal de entrada
Balance para biomasa dX FX1 Fs X f V .rx V . x V dt
dX V .rx V dt
y
rx X
Balance para sustrato dS V FS0 FS f V .rs dt
dS V FS0 V .rs dt Y si sustituimos rs por
Pero como la velocidad de crecimiento está controlada por la alimentación, entonces en todo momento S = 0, y dS por lo tanto V 0 dt
rx 1 .rx YX / S YX / S
Entonces la ecuación de balance queda:
y recordemos que rx
0 FS 0
1 YX / S
dX dt
dX .V dt
Resolviendo y haciendo separación de variables:
FS0
1 YX / S
dX .V dt
FS0 dX V 1 dt YX / S dX FS0 YX / S V dt Integrando
FS Y .dt XV 0
X /S
FS0 YX / S .t X 0V0 XV Donde X0 y V0 representan la concentración de biomasa y de Volumen al inicio de kla fermentación.
Obteniendo la ecuación para Sustrato:
dS V FS0 V .rs dt
0 FS 0 V .
Donde:
rs
X YX / S
X Yx / s
FS0 V .
X Yx / s
VX FS0 Yx / s
Velocidad específica de crecimiento:
1 dXV XV dt
El valor de μ varia permanentemente en cultivo BATCH. Reemplazando términos ya conocidos anteriormente :
YX / S FS1 X 0V0 Yx / s FS1t
Balance de producto.
Tipos de alimentación Exponencial
F K1e t
Lineal
F F0 gt
Pseudo - estacionaria
F F0
Alimentación exponencial.
max S
No es constante
Ks S
Suposiciones:
La alimentación es estéril:
X1 0
Balance para Biomasa
dX dx FX 1 Fs X f V .rx V . x V dt dt dXV dx FX 1 Fs X f XV ( XV ) dt dt Cantidad de biomasa creció
t
X f X 0 .e X 0 X g Cantidad de biomasa inicial
X g X 0 . et 1
Por otra parte se supone que todo lo que se alimenta al fermentador es consumido por la producción de biomasa
X g V .S1.YX
S
Donde V = volumen adicionado
Igualando ecuaciones:
Si Kv es la constante de Volumnen:
X0 Kv S0 .YX
Calculando F:
Kv
S
F
X0 dV e t dt S0 .YX S
X 0 1 e t S0 .YX
K v 1 e t
S
F .K v .e
t
FLUJO EXPONENCIAL
Alimentación lineal. Si se supone un flujo tipo:
Del balance global:
dV F V dt
t
t
Fdt F
0
0
0
F F0 gt
gt dt
Estado Pseudo o Casi- estacionario. Se produce cuando se tiene una alta concentración de biomasa y se mantiene el sustrato a un nivel muy bajo. Esta situación se obtiene cuando se tiene un batch con alta densidad de biomasa, con lo cual se tendrá el sustrato casi completamente agotado, en este momento se comienza a alimentar el medio con un flujo constante.
La concentración de biomasa alta y casi constante.
Parámetros que empiezan o terminan la alimentación y paran la fermentación Fed.Batch El tiempo al cual la alimentación debe de empezar y terminar, así como el criterio para detener una fermentación Fed-batch es muy dependiente de la cinética específica del cultivo y del interés del operador.
Por ejemplo, en le procesos e sustrato limitante, la alimentación debe de empezar inmediatamente después de que el sustrato es consumido de la fase batch, si las circunstancia fuera distintas, el proceso sería difícil de controlar.
El criterio más común para comenzar la alimentación es el consumo de sustrato, el cual puede ser medido por una múltiples de técnicas, de ensayos de enzimas específicas, HPLC.
Criterio para detener la fermentación: Producción baja o lenta debido a muerte celular Concentración de metabolitos inadeacuada Por formación de sub-productos a niveles significativos Por incremeno de la viscosidad, que demanda mas O2, convirtiendose el oxígeno en un factor limitante.
Conocimientos previos antes de comenzar Fed-batch Antes de empezar el proceso Fed-Batch, una fermentación batch deberá de implementarse, y el operador obtendría el siguiente conocimiento: Las mejores condiciones tal como temperatura, luz, agitación, pH, medio de crecimiento, etc.
Necesidades específicas de precursores, inducidos o otros factores de mejora Las diferentes fases de crecimiento y consumo (sustrato) y componentes producidos (productos de interés y sub-productos) La relación entre la biomasa y formación de productos (asociados o no asociados al crecimiento.
