UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO ALTIPLANO FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA LABORATORIO LABORATORI O DE BIOQUIMICA
Enzimología Generalidades Estructura Propiedades Terminología Nomenclatura Clasificación Cofactores
Generalidades
Las rutas o vías metabólicas son un conjunto de reacci reacciones ones enzimáticas implicadas en algún propósito: síntesis o degradación de una molécula, síntesis de ATP, etc. Estas vías inician con una molécula específica y terminan con un producto. Cada paso es catalizado por una enzima específica.
El metabolismo celular es la suma de las reacciones reacci ones químicas que ocurren simultáneamente. Cada reacción es catalizada por una enzima. De modo que las enzimas intervienen en todo proceso que
Historia
Desde finales del S XVIII y principios del S XIX, la digestión de la carne por las secreciones s ecreciones del estómago y la conversión del almidón a azúcar por la saliva y extractos de plantas, ya eran conocidos. Sin embargo, el mecanismo por el cual esto ocurría no había sido identificados.
Historia
•
Otro evento evento conocido conocido desde tiempos inmemoriales era la fermentación alcohólica, alcohólica, resultado del crecimiento de levaduras y de su acción química sobre los azúcares.
En el S XIX, Louis Pasteur llegó a la conclusión que esta fermentación era catalizada por una fuerza vital contenida en las células de la levadura, llamadas fermentos , que se pensó solo funcionaban con organismos vivos. Escribió que "la " la fermentación del alcohol es un acto relacionado con la vida y la organización de las células de las levaduras, y no con la muerte
Etimología 1878 – Fiedr Fiedrich ich W. Khune Khune (1837-1900) acuña el término enzima para referirse a sustancias catalizadoras cuya presencia se sospechaba en las levaduras. gr.. ενζυμον = “en gr en”” y “zymee “zymee”” = “en “en la levadura” levadura” • No sabían cuál era la
naturaleza química de estas
sustancias. • Por otro lado, la palabra “fermento “fermento”” se refería a la
actividad química producida por organismos vivientes.
Historia 1897 – Edward. Buchner, Buchner, en la U. Humboldt de Berlín, obtiene un extracto inerte de levaduras y encontró que el azúcar era fermentado inclusive cuando no había elementos vivos en las células de las levaduras. Con esto demostraron que la fermentación podía ser hecho sin vida y que las enzimas eran fermentos inertes. En 1907 recibió el el PN de Química por sus investigaciones bioquímicas y
Historia • Habiendo demostrado que las enzimas podían
funcionar fuera de la célula viva, el próximo paso era determinar su naturaleza química. química. respecto, to, en muchos muchos de los trabajos trabajos iniaciales iniaciales se • Al respec evidenció que la actividad enzimática estaba asociada con proteínas, pero algunos científicos (como el Premio Nobel Richard Willstätter) argumentaban que las proteínas servían simplemente para el transporte de las verdaderas enzimas y que las proteínas proteínas per per se no eran capaces de realizar catálisis.
Historia • En 1926 -
James B. Summer aísla y purifica la ureasa (de frejol) y tras 20 años de esfuerzo, postuló que “todas “todas las enzimas eran proteínas”. proteínas”. La comunidad científica dudó de su hallazgo.
Northrop p y Wendell • En 1930 - John H. Northro Stanley trabajando con enzimas digestivas (pepsina, tripsina y quimotripsina) confirman que las enzimas enzimas eran proteínas, estableciéndose definitivamente la naturaleza química de las enzimas.
Historia • Hasta la década de los 50´s, se tenían aisladas y
cristalizadas 75 enzimas. • A la fecha, según la Base de
Datos de Enzimas,
disponible en: http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes
que contiene las estructuras de enzimas depositadas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), al 5 de abril del 2009, se tienen 24,235 enzimas registradas.
Definición ENZIMAS = CAT CATALIZADORES ALIZADORES ORGANICOS = BIOCATALIZADORES BIOCATALIZADORES
Las enzimas son proteínas globulares sintetizadas por los organismos vivos cuya función es aumentar la velocidad o celeridad de las reacciones químicas. Una excepción lo constituyen las ribozimas cuya naturaleza química es ácido nucleic nucleico o y no proteína proteína.. USOS DE LAS ENZIMAS (APLICACIONES): -Biotecnología
- Me Medicina
- In Industria químico farmacéutica
La enzima está conformada por 3 tipos de aminoácidos aminoáci dos (AA)
Sitio activo
¿Cómo actúan? Como cualquier otro catalizador, las enzimas actúan disminuyendo la barrera de Energía de Activación (Ea) por lo que un mayor número de moléculas alcanzan la energía de transición (el estado excitado).
Por ejemplo, la descomposición del H 2O2 a H2Oy O2 puede ocurrir: -Espontaneamente (sin catali -Espontaneamente catalizador) zador) - Con cataliz catalizador ador inorgánico inorgánico (platino (platino)) - Con biocata biocatalizado lizadorr (catalasa) (catalasa) Los valores valores de Ea son 18, 12 y 6 kcal/mol, kcal/mol, lo lo que significa significa que el platino platino acelera la reacción 20000 veces y la catalasa 270000 veces.
¿Como lo hace?
Forzando la molécula a un estado intermediario que se parece al de transición pero de menor energía. Puede reunir dos moléculas reactivas en la orientación adecuada, aumentando su reactividad Orienta partes de la molécula de forma adecuada para alcanzar la transición.
Enzyme Stabilizes Stabili zes Transition Transition State Energy change E n e r g y r e q u i r e d ( n o c a t a l y s i s )
ST
EST S
ES EP
Reaction direction
P
E n e r g y d e c r e a s e s ( u n d e r c a t a l y s i s )
Terminología enzimática - Sitio activo.activo.- Es el luga lugarr de la enzim enzima a
donde ocurre la reacción química del sustrato (S).- Es la molé molécula cula que se une - Sustrato (S).al sitio activo en donde va a ser transformada en producto. - Complejo enzima sustrato (ES).(ES).- Un Uniión temporal entre la E y el S, momento en el cual el S es convertido en producto. - Producto (P).(P).- El resu resultad ltado o de la la
Enzima
Sustrato
Sitio activo
Complejo ES
El sitio activo (o centro catalítico) ubicado en la superficie de la - Es una hendidura o bolsillo ubicado proteína y representa aprox. aprox. el 5% de d e la superficie superfi cie total. - En ella ocurren los lo s fenómenos de fijación y conver conversión sión química
del S. - Está constituido por 100 AA y tiene un diámetro de 25 A. - Tiene una topografía 3D específica y única.
Fuerzas que mantienen el complejo ES 1. Interacciones no covalentes.covalentes.- Son las las principale principaless fuerzas de unión entre la E y el S. -Interacciones electrostáti -Interacciones electrostáticas cas -Puentes de hidrógeno der wal wals s -Contactos de Van der - Int Interac eraccion ciones es hid hidrofób rofóbica icas s
2. Interacciones covalentes temporales .Entre las cadenas laterales de los AA y el S.
Meca Me cani nism smo o conc concer erta tado do de cata catalilisi sis s Carboxipeptidasa A Sitio activo
(270) Glu
(248) Tyr
3
4
COO+
N Sustrato: Cadena peptídica
H
H O-
C 2
OH
N
C
C
R
5
O1
His Zn (196)
+
COO Glu (72)
C-terminal
+Arg
(145)
Localización celular de las enzimas
Na/K ATPasa Retículo endoplasma
membrana
Glucosa 6 fosfatasa
Alfa manosidasa
Catalasa
Las enzimas ejercen su función predominantemente en el interior celular. Mas aún lo hacen en determinado organe org anelo lo de la célul célula. a.
Succinato Succ inato desh deshidroidro-
Propiedades de las enzimas 1. Son extremadamente eficientes.
2. Poseen alto grado de especificidad por sus sustratos.
Modelos que explican la especificidad enzimática - Modelo de la llave y la cerradura (de Fisher).Fisher).- El sitio activo es rígido y perfectamente complementario al S = especificidad absoluta. absoluta.
Modelos que explican la especificidad enzimática - Modelo de la adaptación inducida (de Koshland).- El sitio activo es
flexible y no complementario al S. La enzima es inducida a tomar la forma complementaria a medida que el S se se fija = especificidad relativa.. relativa
3. No sufren modificación en el proceso de reacción. 4. No cambian la Keq de la reacci reacción, ón, simplemente aumentan la velocidad para alcanzar ese equilibrio. 5. Están sujetas a regulación o control 6. Están presentes en pequeñas cantidades (nano o micromolares) 7. Son proteínas globulares generalmente de alto PM, solubles Actúan en condiciones moderadas de presión y
Mecanismo de acción Para actuar la enzima debe unirse necesariamente al S. Fases: 1. Unión de la E con el S (formación
del complejo ES) (conversión ión 2. Modificación del S (convers en P). 3. Lib Libera eració ción n del del P .
Meca Me cani nism smo o de acc acció ión n
E
+
S
E
S
E +P
Modificaciones de componentes de la reacción enzimática
Modificaciones de de los componentes de la reacción reacción enzimática
S
P
C o n c e n t r a t i o n
ES E
Nomenclatura Nombre común (no sistemática, tradicional o trivial) -
Hasta antes de 1965 el nombre no guardaba ninguna relación con la reacción que catalizaba, ni con el S. Ejemplos: pepsina, tripsina, quimotripsina,
-
Luego se nombran a las enzimas con el nombre del S sobre el cual actuaba, con el sufijo “asa “asa”” Ejemplos: ureasa, maltasa, amilasa, arginasa, catalasa
-
En algunos casos se incluye el tipo de reacción que catalizaba la enzima Ejemplos: lactato deshidrogenasa, piruvato
Nomenclatura Nombre sistemático ----- 19 196 65 UIB UIB – a través de la Comisión de Enzimas (EC) establece reglas para nombrar a las enzimas: - Toda enzima debe tener un número de clasificación de 4 dígitos y un nombre sistemático.. sistemático Ejemplo: 2.7.3.2. ATP: creatina kinasa,
Ejemplos:: Ejemplos N. Sistemático N. C o m ú n
EC 1.1.1.1. Etanol: NAD oxidorreductasa Alcohol deshidrogenasa
N. Sistemático N. C o m ú n
EC 1.1.11.6. H2O2: oxidorreductasa Catalasa
Clasificación
Clase 1: Oxidorreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción (redox) de diversos tipos.
Ared + Box
Aox + Bred
A : es el agente reductor o dador electrónico; en el curso de la reacción se oxida (pierde electrones)
B : es el agente oxidante o aceptor electrónico; en el curso de la reacción se reduce (gana electrones) Ejemplo:
EC 1.1.3.4 Glucosa : O2 oxidorreductasa Dador
Aceptor
Nomenclat. Alternat. Alternat . • Deshidrogenasas • Oxidasas • Peroxidasas • Oxigenasas • Hidroxilasas • Reductasas
Clase 2: Transferasas Transferasas Catalizan reacciones de transferencia de agrupaciones atómicas de una molécula donadora a otra aceptora.
A-X + B
A + B-X Sub-clases de transferasas 2.1.-.2.1..- Grupo Grupos s monocarbonados monocarbonados 2.2.-.2.2..- Grupo Grupos s aldehido aldehido o ceto 2.3.-.2.3..- Aciltran Aciltransferasa sferasas s 2.4.-.2.4..- Glicosiltr Glicosiltransfer ansferasas asas 2.5.-. 2.5 .-.-- Alqu Alquilil- o Ari Ariltra ltransfe nsferas rasas as 2.6.-.2.6..- Grupo Grupos s nitrogenado nitrogenados s 2.7.-.2.7..- Grupo Grupos s fosfato 2.8.-.2.8..- Grupo Grupos s sulfato
A : molécula dadora o donadora B : molécula aceptora X : grupo transferido Ejemplo:
EC 2.7.1.1. ATP: D-Hexosa fosfotransferasa fosfotransferas a Dador
Aceptor
Grupo transferido
Clase 3: Hidrolasas Catalizan reacciones Catalizan reacciones hidrolít hidrolíticas icas (ruptura de enlaces químicos) con participación del agua.
A-B + H2O
A-OH + B-H
Es difícil la utilización de nombres sistemáticos en las hidrolasas. Muchas de ellas conservan el nombre primitivo: tripsina, pepsina, papaína, etc. Ejemplo:
EC 3.4.21.4. (trupsina)
Sub-clases de hidrolasas 3.1.-. 3.1 .-.-- Este Estera rasas sas 3.2.-. 3.2 .-.-- Glu Glucosi cosidasa dasas s 3.3.-.3.3..- Eter hidro hidrolasas lasas 3.4.-. 3.4 .-.-- Pep Peptida tidasas sas 3.5.-.3.5..- Acil anhidro anhidro hidrolasas hidrolasas Etc.
Clase 4: Liasas Catalizan reacciones de adición o remoción de grupos a enlaces C=C (ruptura o formación de dobles enlaces. Catalizan la ruptura de enlaces por medios distintos a la hidrólisis. Ejemplo:
EC 4.1.1. 4.1.1.1. 1. Piruv Piruvato ato descarboxi descarboxilasa lasa
Algunas liasas
- Descarboxilasas - Al Aldo dola lasa sas s - Anhidr Anhidrasa asa carbó carbónica nica - Ade Adenila nilato to ciclasa ciclasa
Clase 5: Isomerasas Catalizan reacciones que implican cualquier tipo de isomerización, tales como, como, racemizacio racemizaciones, nes, epimerizacione epimerizaciones s e isomerizacione isomerizaciones s cistrans. Es decir, modificación interna de una molécula (sin agregarle ni quitarle grupo o átomo alguno).
Algunas isomerasas
- Epimerasas - Ra Racem cemas asas as - Mut utas asas as - Is Isome omera rasa sas s
Ejemplo:
Clase 6: Ligasas Catalizan reacciones de unión (o condensación) de dos moléculas (formación de enlaces) acoplado a la hidrólisis del d el ATP ATP o de otro compuesto de alta energía.
A + B + ATP
A-B + ADP + Pi
O bien
C + D + AT ATP Ejemplo:
EC 6.5.1.3. RNA ligasa
C-D + AMP + PPi Algunas iigasas
-Sintetasas - Car Carbox boxilas ilasas as - Tiok iokinas inasas as
http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes http://www .ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/enzymes
Clasificación de Enzimas (E.C.) El nú núme mero ro de en enzi zima mass al 14-Abril del 2009, según el Banco de Datos de Enzimas, son: E.C.1.-.-.- Oxidoreductasas. E.C.2.-.-.- Transferasas. E.C.3.-.-.- Hidrolasas. E.C.4.-.-.- Liasas. E.C.5.-.-.- Isomerasas. E.C.6.-.-.- Ligasas.
[4,207 ] [7,350] [9,183] [1,752] [1,011] [732]
Cofa fac ctor ores es en enz zimá mát tic icos os • Son sustancias no proteicas que
requieren muchas enzimas para que puedan catalizar eficientemente. Su presencia es indispensable (ingresan con los alimentos) • Generalmente, se sitúan en el
sitio activo de la enzima, en donde se fija de manera específica (en forma covalente o no).
• Entonce Entonces, s, los cofact cofactores ores actúan
modificando la estructura 3D de la enzima, la del sustrato o ambas e incrementando al máximo la interacción
Terminología
Parte
Parte no
Tipos de cofactores
Holoenzima
Apoenzima
Cofactor Tipos: 1. Inorgânicos (iones) 2. Orgánica
- Co Coen enz zim imas as - Grup Grupos os pros prostét tético icos s
Cofa fact ctor ores es in inor orga gani nico coss 1. Co Son las sustancias iónicas (cationes o aniones) de los metales. Por esta razón son nutrientes esenciales para el organismo. Se unen mediante enlaces de coordinación con las cadenas laterales de ciertos AA del sitio activo.
2. C Cof ofac acto tore ress or orgá gáni nico coss: Pueden ser A. COENZIMAS Se unen a la enzima en forma transitoria, generalmente durante la catálisis. Una misma coenzima puede actuar en numerosas reacciones enzimáticas. Los componentes esenciales de muchas coenzimas son la vitaminas (la mayoría del Complejo B)
B. GRUPOS PROSTETICOS Están unidos permanentemente a la enzima mediante enlaces covalentes. A diferencia de las coenzimas, los GP son más grandes.
Vitaminas y sus formas coenzimáticas Vitamina
Forma co coenzimática
Reacción
Tiamina (B1)
Tiamina pirofosfato (TPP)
Descarboxilación, transferencia de grupo fosfato
Riboflabina (B2)
FAD y FMN
Redox
Piridoxina (B6)
Piridoxal fosfato
Transferencia de grupos amino
Niacina
NAD y NADP
Redox
Ac. Pantoténico
CoA
Transferencia de grupos acilo
Biotina
Biocitina
Carboxilación
Ac. Fólico
THF
Transferencia de grupos de un C
Vit B12
Desoxiadenosil cobalamina, metilcobalamina
Isomerizaciones
Vit C
Hidroxilación
Isoenzimas o is isozimas Son familias de enzimas que catalizan la misma reacción reacci ón química pero con propiedades cinéticas y físico-químicas diferentes. Difieren en su estructura primaria (en algunos AA) y, y, por tanto, en los valores de sus puntos isoeléctricos (pI), por lo que su presencia de estas formas múltiples puede detectarse y separarse mediante electroforesis. Pueden estar presentes en una misma especie e incluso en una misma célula.
La isoenzi isoenzima ma más conocid conocida a es la la lactato deshidrogenasa (LDH),, presente en todos los tejidos. (LDH) Es un tetrámero con dos clases de subunidades (H y M) de 35 kd cada una. Ambas subunidades subunidades difiere difieren n significativamente en el contenido de sus AA y están codificados por genes diferentes. Presenta 5 isoenz iso enzima imass y todas todas catalizan la misma reacción.
Las 5 formas isoenzimáticas son: La isoenz isoenzima ima H4 predomin predomina a en el corazón (heart (heart ) y la M4 en el músculo esquelético (muscle (muscle). ). Las otras ot ras 3 isoz isozima imass se encu encuent entran ran presentes en los los distintos tejidos. Si bien todos catalizan la misma reacción, difieren significativamente significativament e en sus valores Km respecto a sus sustratos, así como en sus valores de Vmáx. El siguiente esquema muestra el contenido relativo relativo de la LDH en los tejidos humanos.
Zimógenos o proenzimas
Son precursores inactivos de ciertas enzimas, las que más tarde en respuesta a una señal bioquímica, se convierten en activas por hidrólisis de enlaces peptídicos. La mayoría de enzimas digestivas pertenecen a este grupo. P. ej. pepsina, tripsina y quimotripsina, que se sintetizan sinte tizan como pepsinóg pepsinógeno, eno, tripsinógeno tripsinógeno y quimotripsinógeno, respectivamente. Cuando son vertidas al TGI se convierten en sus formas activas
Son inactivos porque el sitio activo no está disponible d isponible para el sustrato ya sea por que se encuentra “sellado” por un segmento segmento peptídic peptídico o o porque los residuos residuos de fijación y catálisis no tienen la alineación apropiada. El rompimiento de uno o más enlaces produce nuevas interaccioness de los grupos R lo que produce una nueva interaccione conformación de la proteína. Se sintetizan en forma inactiva con la finalidad de proteger a la célula (u órgano órgano)) que lo produce. Si se sintetizaría en su forma activa sería autodestructivo aut odestructivo ya que hidrolizaría a cualquier proteína celular. celular. De hecho, una de las causas de pancreatitis (a veces mortal) es la liberación prematura de enzimas activas.
Activación Activ ación de zimóge zimógenos nos (casca (cascada da de reaccione reacciones) s)
Complejos enzimáticos
Son agrupaciones de enzimas físicamente unidas unas con otras y que se encuentran relacionadas con una vía metabólica, de tal forma que los intermediarios (sustratos) (sustratos) pasan de un sitio activo a otro sin abandonar el sistema. Cada subunidad (enzima) posee una conformación que le permite unirse a las restantes por medio de enlaces débiles (no covalentes), pudiendo disociarse ésta.
COMPLEJO DE LA PDHasa
Enzimas multifuncionales (multienzimas)
Son proteínas que catalizan reacciones sucesivas de una vía metabólica, que como consecuencia de la evolución, se han unido en una sola cadena polipetídica, de tal forma que esta cadena contiene varios sitios activos. De este modo, los intermediarios (sustratos) no abandonan el sistema. A diferencia de los complejos, éstos no pueden disociarse ya que todo el sistema está unido covalentemente formando una proteína multienzimática.
