UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA FACULTAD DE CIENCIAS Y FILOSOFIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS CELULARES Y MOLECULARES
BIOINFORMÁTICA 2014-I ENSAMBLAJE DEL GENOMA DE E. coli
David J. Edwards, Kathryn E. Holt , incluido en el artículo adicional 1 del artículo científico titulado Beginner s guide to comparative bacterial genome analysis using next-generation sequence data ,
"Este ejercicio ha sido adaptado para el curso a partir del ejercicio elaborado por
’
publicado en el journal Microbial Informatics and Experimentation 2013, 3:2".
Descargar los FastQ para el ensamblaje del genoma de E. coli En esta parte del tutorial, vamos a crear un archivo de calidad del genoma E. coli O14:H4. Para empezar necesitamos secuencias para ensamblar. Para este ejemplo práctico utilzaremos los reads de Illumina HiSeq paired-end de E. coli O104:H4 O104:H4 strain TY-2482 (número de accesión SRR292770 en European Nucleotide Archive (ENA)) - disponible aquí http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/SRR292770&display=HTML Busque el 'Fastq file (ftp)' en la recuadro a la derecha - haga click en cada uno de los dos enlaces de archivos, y guárdelos en el escritorio. Estos archivos están en formato FASTQ (Ver http://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format)) y están comprimidos en gzip (no es necesario http://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format descomprimirlos).
Se debe descargar tanto el Fordward como el Reverse de los reads ('SRR292770_1.fastq.gz' y 'SRR292770_2.fastq.gz'). Guarde estos archivos en una nueva carpeta con un nombre adecuado, por ejemplo ' Ensamblaje'. Este será nuestra carpeta de trabajo para el tutorial.
El examen de la calidad de los reads (FastQC)
Antes de tratar de armar un conjunto reads, es una buena práctica examinar los reads para ver si son de buena calidad. Un paquete fácil de instalar y ej ecutar para examinar es el FastQC.
Sitio web: Descargue e instale FastQC de http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ La página web también cuenta con ejemplos de buena y mala calidad de reads para un número de plataformas de secuenciamiento.
Input: archivos de secuencia, Fordward y Reverse de los reads (formato FASTQ) Instrucciones: Una vez FastQC se ha instalado, abra el programa para comenzar. Entonces : 1. Para seleccionar la secuencia de archivos a comprobar, vamos a " File > Open " en el menú FastQC. Navegue a la carpeta en donde guardamos los reads de TY - 2482 y seleccionemos el archivo 'SRR292770_1.fastq.gz'.
Cuando el análisis haya finalizado, se les presentará con una serie de informes sobre las secuencias. Seleccione 'Per base de la calidad de la secuencia 'Per base sequence quality'. Se debe obtener este gráfico:
Es posible examinar los otros reportes. Tenga en cuenta que esta secuencia para el ejemplo pasa la mayor parte de las pruebas, aunque el nivel de secuencia de duplicación es un poco alto (en torno al 26%). El ensamblaje se puede mejorar eliminando primero los duplicados, haciendo uso de un paquete de control de calidad FASTQ como las herramientas en línea de comandos FASTXToolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastxtoolkit/ ) o Trimmomatic (http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic ). Sin embargo, como los reads para el tutorial son de buena calidad, vamos a dejar el tema importante del control de calidad, y sus trampas, para que otros la describen. Los sitios web de los dos paquetes son un buen lugar para empezar, junto con la información de apoyo para FastQC. Ahora puede cerrar FastQC y continuar con el resto del tutorial. Si desea para guardar el informe de antemano, utilizar " File > Save Report ' antes del cierre.
Velvet – ensamblaje de reads dentro de contigs
Sitio web: Descargue e instale Velvet y su manual (~25 MB) de http://www.ebi.ac.uk/~zerbino/terciopelo/
Referencia: Zerbino, D. R. and Birney, E., Velvet: algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs. Genome Res, 2008. gr.074492.107 [pii] 10.1101/gr.074492.107.
Referencia Instrucción: Zerbino, D. R., Using the Velvet de novo assembler for shor-read sequencing technologies. Current protocols in bioinformatics/editor board, Andreas D. Baxevanis... [et al.], 2010.10.1002/0471250953.bi1105s31.
Inputs: archivos de secuencia, Fordward y Reverse de los reads (formato FASTQ)
Instrucciones: The Velvet es un programa de ensamblaje de novo que se instaló con un 'MAXKMERLENGTH' fijó en 101 pb (hacer 'MAXKMERLENGTH=101') - véase el manual para más detalles. Tenga en cuenta que un máximo k-mer de 41 será suficiente para este ejercicio, pero k-mers más largos se requieren cuando se trabaja con reads generados por HiSeq y MiSeq (que ahora son típicamente > 100 pb). Nota También tendrá que añadir el directorio ruta ($PATH=), o utilizar la ruta completa de los ejecutables 'velvetg' y 'Velveth' en las líneas de comandos descritas más adelantes.
1. Abra una sesión de terminal y cambie al directorio en el que se contienen los archivos SRR292770:
cd Ensamblaje 2. En primer lugar tenemos que correr Velveth , escriba: velveth out_data_35 35 -fastq.gz -shortPaired -separate SRR292770_1.fastq.gz SRR292770_2.fastq.gz
Esto tomará ~1-2 minutos y se producirá una tabla hash de reads utilizando el k-mer de longitud especificado (k = 35), guardados en la carpeta 'Out_data_35'.
3. El siguiente paso del Velvet es ejecutar velvetg para construir el gráfico.
velvetg out_data_35 -clean yes -exp_cov 21 -cov_cutoff 2.81 -min_contig_lgth 200 Esto tomará ~ 5 minutos. La ejecución de este comando es la salida de un número de archivos en la misma carpeta que Velveth, incluyendo el archivo que contiene nuestros contigs ensamblados recientemente - este llevará el nombre de 'contigs.fa'. Longitud mínima contig se establece en 200 pb, ya que es la longitud más corta para la presentación de proyectos de genomas a GenBank. La cobertura del cut-offs especificado aquí son los que hemos pre-determinado para que sea óptimo para el ensamblaje de este conjunto de reads. Véase más abajo para obtener información sobre el uso de VelvetOptimiser y establecer cut-offs para diferentes conjuntos de reads.
4. Cambiar el nombre del archivo output del Velvet cp out_data_35/contigs.fa SRR292770_unordered.fasta A continuación, puede eliminar la carpeta de salida "fuera - de datos - 35 ', aunque es posible que desee guardar o ver el archivo de estadísticas, 'stats.txt ', antes de hacerlo. Mientras que proporcionamos valores "óptimos" para las tres opciones de Velvet (kmer=35, la cobertura esperada=20, la cobertura de corte de 2,81) , estos se pueden cambiar para examinar cómo cada uno afecta a los contigs producidos.
Nota: se puede volver a ejecutar el comando sólo velvetg con nuevos valores si está variando sólo los dos últimos y mantener el k-mer constante para mantener la carpeta de salida de Velvet entre las corridas de velvetg.
Usando VelvetOptimiser para optimizar el montaje de novo con Velvet Para obtener los valores "óptimos", utilizadas aquí, haremos uso de la secuencia de comandos Perl VelvetOptimiser (utilizamos la versión 2.2.5) disponible para descargar en http://bioinformatics.net.au/software.velvetoptimiser.shtml. En este caso, se proporcionan instrucciones para ejecutar VelvetOptimiser para demostrar cómo se obtuvieron estos valores, y para aquellos interesados en hacer lo mismo - lo incluimos como un ejercicio más para hacer uso de Velvet. Los interesados en explorar aún más debe comenzar con el papel de instrucción por Zerbino (2010). (Los que aún no se siente cómodo con Unix , Perl y la línea de comandos pueden querer saltar el siguiente.) 1. Abra una sesión de terminal y vaya al directorio que contiene la lee archivos. 2. Para ejecutar VelvetOptimiser , escriba:
VelvetOptimiser.pl -s 33 -e 41 -f '-fastq.gz -shortPaired -separate SRR292770_1.fastq.gz SRR292770_2.fastq.gz' -o '-min_contig_lgth 200' -p SRR292770 Con estos ajustes, VelvetOptimiser establecerá una serie de ejecuciones de Velveth utilizando oddnumbers Kmers entre 33 y 41. A continuación, ejecuta velvetg para cada uno, tomando el que tiene la mejor N50 como la semilla para la optimización final del corte de la cobertura, donde se utiliza el número de bases en contigs de más de 100 pb como la estadística de optimización. La salida es el mismo que para una corrida de Velvet regular, aunque la carpeta de salida tendrá el prefijo ' SRR292770 ' para mantenerlo separado de la corrida de Velvet descrito anteriormente. El archivo de registro para la corrida (SRR292770_logfile.txt) contiene los detalles de dicha corrida, incluidos los comandos que se utilizan para ejecutar Velveth y velvetg.
Ordenar contigs contra un genoma de referencia utilizando Mauve Una vez que las secuencias de los reads han sido ensambladas en contigs, es útil ordenarlos en función de un genoma de referencia adecuado. Una manera sencilla de lograr esto es utilizar la opción 'Move Contigs' disponible en Mauve.
Sitio web: http://asap.ahabs.wisc.edu/mauve/ (Incluye enlaces de descarga, instrucciones de instalación y guía del usuario)
Referencia: Darling, A. E., Mau, B. and Perna, N. T., “progressiveMauve: multiple genome alignment with gene gain, loss and rearrangement”. PLoSOne, 2010 5(6): e11147.
Inputs: Estas serán sus contigs ensambladas recientemente y un genoma de referencia - aquí hemos optado por utilizar Ec55989 (NCBI adhesión NC_011748), una cepa cercana relacionada con un genoma completo, disponible para su descarga desde NCBI. Ir a este enlace: ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genomes/Bacteria/Escherichia_coli_55989_uid59383/ y descarga la secuencia en formato fasta, NC_011748.fna (haga clic para guardarlo en su ordenador).
Instrucciones: Una vez que haya instalado MAUVE y localizado su genoma de referencia y contigs, podemos ordenar los contigs. 1. Inicie la aplicación de MAUVE. 2. En el menú Herramientas, seleccione "Move Contigs".
3. Debería aparecer un cuadro de diálogo, con un recuadro llamado “Choose location to keep output files and folders”. Navegue a la carpeta con las secuencias y los contigs copiados, haga clic en el botón de opción "Crear nueva carpeta". Dé esta carpeta un nombre adecuado, por ejemplo ' MauveOutput "y después haga clic en 'Aceptar'.
4. Debería aparecer un mensaje que le dice sobre el proceso iterativo involucrados en la reordenación de los contigs. Tomar nota de que, después haga clic en "Aceptar" para descartarla. 5. Debería aparecer un cuadro de diálogo, con un recuadro llamado "Align and Reorder Contigs". Haga clic en el botón de abajo de la caja "Add Sequence…" y navega hasta el genoma de referencia para alinear, en este caso 'NC_011748.fna'. 6. Haga clic en el botón ' Add Sequence…' de nuevo y vaya al archivo fasta del contigs que desea alinear, 'SRR292770_unordered.fasta' del ejercicio anterior. Compruebe que ha puesto el genoma de referencia primero, y el proyecto después, como era de esperar por el MAUVE. 7. Haga clic en "Start" para ejecutar el r eordenamiento. Esto puede tardar una media hora más o menos en total. Una nueva ventana debe aparecer la indicación 'Mauve Console', donde se mostrará el progreso de la ejecución, incluyendo cualquier mensaje de error (ver más abajo para un ejemplo). Una nueva ventana de la herramienta de visualización debería lanzamiento para cada iteración completado, la mención “Mauve unknown – alignmentX”, donde X es el número de iteración. Si encuentra errores, compruebe que ha especificado los archivos correctos de entrada - deben ser fasta o múltiples - archivos de secuencias FASTA. 8. Por último, debería aparecer un mensaje que indica el nuevo pedido se ha completado. Clic en 'OK' y salga de Mauve - aunque usted puede inspeccionar la alineación final (y otros) de antemano. 9. El conjunto final de contigs ordenados y orientados están en el archivo FASTA ubicada en la última de las alineaciones iteradas. Para encontrarlo, busque en la carpeta
'MauveOutput' creado anteriormente. Para cada iteración del reordenamiento habrá una carpeta de salida, por lo que el resultado final es el archivo de contig ubicado en el subdirectorio 'AlignmentX' con la más alta X, donde X es el número de iteración. Cambiar el nombre de 'SRR292770_unordered.fasta' en este subdirectorio , a 'SRR292770.fasta' y copiarlo en el directorio de tr abajo principal.
Visualización de los contigs ordenados (Mauve) Para examinar los contigs recién ordenados, nosotros disponemos de dos GUI - enfoques basados. Para el primero, tanto el programa de MAUVE y las instrucciones para el método de comparación son como se detalla a continuación, aunque con algunas pequeñas (pero importantes) cambios. En este ejemplo, vamos a generar un alineamiento múltiple de los contigs ordenados del brote del genoma O104:H4, el genoma Ec55989 utilizado como referencia para el pedido, y otro ensamblado creado, usando más grupos reads para nuestro proyecto genoma, y un ensamblador diferente. Este conjunto alternativo de cepa TY-2482 (accesión del NCBI: AFVR01) está disponible para su descarga aquí http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/?val=AFVR01 en formato gzip FASTQ a través de la pestaña de descarga. Una vez descargado, descomprima el archivo antes de continuar. Pide este ensamblaje alternativo para el primer genoma de referencia Ec55989 - utilice las instrucciones proporcionadas anteriormente.
Instrucciones: 1. Inicie la aplicación de MAUVE 2. Desde el menú Archivo, seleccione “Align with progressiveMauve…” 3. Aparecerá un cuadro de diálogo, con un cuadro denominado “Sequences to align: ”. Haga clic en el botón de abajo de la caja “Add Sequence…” y navega hasta el archivo de contigs ordenado, 'SRR292770.fasta'. 4. Haga clic en el botón “Add Sequence…” de nuevo y vaya al archivo FASTA de un genoma que desea alinear. En este caso, vamos a comenzar con el ensamblaje alternativo, 'AFVR01.fasta' Si usted proporciona un archivo multi-FASTA que contiene contigs, Mauve concatenará estos juntos antes de ejecutar la alineación. 5. Repita el paso 4 para agregar cualquier otra secuencia de interés. En nuestro ejemplo, se acaba de agregar el genoma Ec55989 CEEA. 6. Ahora tenemos que especificar el archivo de salida. Haga clic en el botón marcado "..." para seleccionar un archivo de salida. Navegue hasta el directorio en el que desea que la salida aparezca. Ahora especifique un nombre para el archivo de salida (por ejemplo, 'mauve_output'), y haga clic en “Save ".
7. Haga clic en "Align...” para ejecutar la alineación. Esto puede tardar una media hora más o menos. Una nueva ventana debe aparecer la indicación “Mauve Console” , donde se mostrará el progreso de la ejecución, incluyendo cualquier mensaje de error. Si encuentra errores, compruebe que ha especificado los archivos correctos para los inputs - todos ellos deben ser fasta o múltiples-archivos de secuencias FASTA, y pueden incluir hasta un genoma en formato GenBank (para proporcionar una anotación). 8. Una vez finalizada la alineación, aparecerá la herramienta de visualización. Para simplificar la imagen un poco, seleccione View Style uncheck ‘LCB connecting lines’. Se debe tener este aspecto:
Row 1 = O104 ordered contigs. Row 2 = alternative assembly Row 3 = Ec55989 (EAEC) genome
Bloques coloreados indican regiones de la secuencia con homología en los otros genomas. Las líneas rojas indican los límites de los contigs. Nótese la similitud en las órdenes de nuestra asamblea de VELVET y el conjunto alternativo. Ambas ensamblajes contienen contigs que no se asignan a la referencia del genoma. Puede guardar una imagen estática de lo que usted está viendo, seleccione Tools Export Export image…
¡¡¡Fin del sufrimiento!!!
