Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya. Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik" . Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (t m) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
Skema Elektroforesis Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa komponen yang bermuatan positif akan bergerak searah dengan medan listrik menuju kutub negatif. Apabila dalam campuran terdapat dua jenis komponen, yakni (1) komponen negatif (-), dan (2) komponen netral (N), maka komponen negatif akan bergerak menuju kutub positif (+) sedangkan komponen netral (N) akan tetap diam. Skema alat elektroforesis secara sederhana dapat dilihat pada gambar di bawah ini. Pada gambar tersebut dapat dilihat komponen yang bermuatan positif akan mengalir ke arah kutub negatif, sedangkan komponen bermuatan negatif akan mengalir ke arah kutub positif.
Rangkaian Alat Elektroforesis Berdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua:
1.
Elektroforesis Planar
2.
Elektroforesis Kolom Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik, juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis, melainkan " elektrokromatografi" . Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut "efek "efek Joule" Joule" yang disebabkan karena adanya tumbukan partikel elektron. Efek
pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara, yakni:
1.
Pendinginan
2.
Efek Konveksi. Efek konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panas dengan mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yang digunakan dibuat dari silika yang bermuatan netral atau negatif. Bagian luar kapiler dilapisi dengan polimer agar bersifat lentur.
(EOF) E l ec t r o O s m o t i c F l o w Jika kapiler pada elektroforesis diberi tegangan, maka akan terjadi perpindahan muatan ke arah kutub negatif (-). Perpindahan yang terjadi disebut "electroosmotic flow (EOF)" . Pergerakan elektrolit yang tidak dipengaruhi oleh EOF disebut "elektroforetik" . Prinsip kerja EOF dapat dilihat pada gambar berikut.
Skema Electroosmotic Flow (EOF)
Dari gambar diatas dapat dilihat bahwa terjadi pemisahan anatara muatan positif dengan muatan negatif akibat adanya lapis rangkap listrik. Lapis rangkap listrik terjadi akibat pemberian tegangan yang sangat tinggi pada dinding pipa kapiler. Sebelum diberi tegangan, permukaan kapiler akan bermuatan netral, setelah diberi tegangan, maka ion negatif akan menempel pada permukaan sebagai lapis pertama. Ion positif akan mengikuti ion negatif membentuk lapisan pada permukaan, dalam hal ini ion positif akan membentuk lapisan kedua. Sistem ini disebut lapis rangkap listrik. Kecepatan migrasi elektroforesis dipengaruhi oleh ukuran, bentuk, serta muatan dari masing-masing komponen. Kecepatan migrasi yang tinggi akan terjadi jika komponen memiliki muatan tinggi dan ukuran rendah, dengan kata lain memiliki densitas muatan yang tinggi. Densitas muatan sendiri adalah perbandingan anatara muatan dengan ukuran yang dimiliki oleh suatu komponen. Contoh Aplikasi Elektroforesis 1.
+
Pemisahan ion Li dan Na +
+ +
Kedua kation ini, Li dan Na sama-sama memiliki muatan +1, namun memiliki ukuran berbeda. Ion +
+
+
Li memiliki ukuran yang lebih kecil dari Na . Ion Li akan lebih tersolvasi dengan air sehingga akan +
+
mengikat banyak molekul air. Akibatnya mobilitas Li akan menjadi kecil dan ion Na akan lebih dahulu keluar dari kapiler.
2.
-
-
Pemisahan NO2 dan NO3 menggunakan EOF HNO3 merupakan asam kuat, dalam air akan terurai sempurna menjadi H+ dan NO3-, sedangkan HNO2 merupakan asam lemah, dalam air akan terdisosiasi sebagian. Pada pH 7, HNO 2 akan terdisosiasi sebagian, menyisakan spesi HNO 2. Hal ini tidak baik untuk pemisahan karena tidak -
semua HNO2 berada dalam spesi NO 2 . Untuk melakukan pemisahan dengan baik, kita harus menggunakan pH yang tinggi sehingga kedua spesi tersebut dapat berada dalam bentuk anionnya. Namun ketika pH sudah diatur tinggi, hanya akan terbentuk satu puncak pada elektroforegram. Hal ini disebabkan karena kedua spesi akan menuju pada kutub yang sama. Pemisahan dapat tetap dilakukan dengan baik asalkan muatan detektor diatur menjadi positif dan muatan injektor diatur menjadi negatif.
Sistem yang berdasarkan pada skema (a) hanya akan menghasilkan satu puncak, artinya pemisahan -
tidak berlangsung dengan baik. Pada skema (b) akan muncul dua puncak, artinya pemisahan NO 3 -
-
dan NO2 terjadi dengan baik. Hal ini disebabkan karena nilai mobilitas elektroforetik (μ ep) NO3 lebih -
-
-
kecil dibanding μ ep NO2 , akibatnya mobilitas total (μt) NO2 menjadi lebih besar dari μ t NO3 . Hal ini -
akan berakibat NO2- akan keluar terlebih dahulu dibanding NO 3 .
ELEKTROFORESIS S e n i n , 24 J a n u a r i 2 0 11 D i p o s k a n o l e h h e y r o c k a p o l k a
ELEKTROFORESIS
A. DEFINISI
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis, elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari cikal-bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik 2004). Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatan sebagai sifat fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatan ionik (Rouessac 2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliran medan listrik (Skoog 2002).
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang ada pada permukaan partikel, tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group ionogenik. Tergantung kepada kekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam mengkateristik, sehingga pemisahan molekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium yang sesuai.
B. MACAM ELEKTROFORESIS 1. Elektroforesis kertas Sesuai dengan perkembangan ilmu bahan, elektroforesis kertas menjadi fasa pertama dari perkembangan elektroforesis zona. Dengan menggunakan medium kertas, pemisahan dan analisis terhadap asam amino,
peptida, nukleotida, dan ion-ion logam yang kecil dapat dilakukan.
Kelemahan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: adanya gangguan yang disebabkan oleh adanya gugus OH- yang terdapat pada selulosa yang dapat berinteraksi dengan molekul polar sehingga daya migrasi molekul tersebut terganggu dan menjadi lebih rendah (Harjadi 1993). Kelemahan ini dapat diatasi dengan cara asetilasi gugus hidroksil dengan menggunakan kertas selulosa asetat yang tidak polar. Hal ini menyebabkan migrasi molekul polar tidak terganggu, resolusi lebih baik, dan proses pemisahan berlangsung lebih cepat.
Keuntungan penggunaan kertas selulosa asetat adalah: • proses migrasi lebih cepat • pemisahan spot menjadi lebih kecil • mudah memisahkan sampel dengan s pektrofotometri • mudah dilarutkan dalam pelarut dalam jumlah sedikit.
Pada elektroforesis kertas selulosa asetat, kertas selulosa asetat harus dibersihkan dengan cara kering dalam percobaan ini. Cara kering lebih baik resolusinya dan spotnya lebih kecil daripada cara basah. Oleh karena itu, percobaan ini menggunakan medium selulosa asetat.
2. Elektroforesis gel Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang disebut fase diam dan fase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek yang akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif. Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih lambat berpindah. C. MEDIUM PENDUKUNG Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan medium pendukung untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan medium pendukung yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Efek penguapan juga dapat diturunkan minimal jika elektroforesis dilakukan di medium pendukung yang dicelupkan dengan larutan buffer. Pemisahan sempurna suatu campuran dapat terjadi efektif dalam zona tertentu. Meskipun medium pendukung relatif stabil (inert), komposisinya mungkin akan menyebabkan penyerapan, migrasi elektron (elektro osmosis) atau penyaringan berdasarkan ukuran molekulnya, yang kesemuanya mempengaruhi kecepatan gerak senyawa.
1. Cellulose asetat
2. Larutan Buffer Larutan buffer (penyangga) ini menstabilkan pH medium pendukung. Buffer juga dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena beberapa hal, yaitu : a. Komposisi Buffer harus tidak mengikat senyawa yang dipisahkan karena akan mempengaruhi kecepatan gerak. Buffer borat dipakai untuk memisahkan karbohidrat, karena dapat membentuk gabungan yang bermuatan listrik dengan karbohidrat. b. Konsentrasi Dengan naiknya kekuatan ion buffer, jumlah arus listrik yang terbawa meningkat dan bagian aliran yang dibawa sampel menurun, sehingga memperlambat geraknya. Kekuatan ion tinggi dalam buffer akan meningkatkan arus keseluruhan sehingga panas juga meningkat, biasanya dipilih 0,05 -0,10M. c. pH Tingkat ionisasi asam-asam organik akan bertambah apabila pH bertambah, sebaliknya untuk basa-basa organik,oleh sebab itu tingkat kecepatan geraknya juga terpengaruh oleh pH. Kedua pengaruh dapat terjadi pada senyawa seperti asam aminoyang memiliki sifat asam dan basa.
3. Medan elektrik Apabila voltase diberikan dian tara dua elektroda, arus ditentu kan oleh tahanan dalam medium. a. Voltase Apabila jarak antara dua el ektroda adalah 1 meter dan perb edaan potensial antara kedua nya adalah V volt sehingga gradient potensialnya adalah V/1m. Kenaikan gradient potensial akan menyebabkan kecepatan gerak ion. b. Aliran listrik Arus aliran listrik dalam larutan a ntara dua elektroda disebabkan umumnya oleh i on buffer dan sedikit oleh i on dalam sampel. Kenaikan voltase akan meningkatkan jumlah muatan yang dipindahkan setiap detik kearah elektroda. Jarak yang ditempuh ion akan sebanding dengan waktunya. c. Tahanan Medium elektroforesa menimbulkan pada aliran ion sebanding dengan jenis medium, jenis buffer dan konsentrasinya. Tahanan akan meningkat dengan bertambahnya jarak antara elektroda, namun berkurang dengan bertambahnya luas permukaan elektroda dan konsentrasi ion dalam buffer.
D. KOMPONEN UTAMA ALAT 1. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu. 2. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat, selulosa nitrat), gel kanji,
gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar. 3. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.
E. PERCOBAAN 1. ELEKTROFORESIS KERTAS TUJUAN a. Menunjukkan bagaimana komponen dalam senyawaan campuran dapat dipisahkan dengan cara elektroforesis b. Menunjukkan bahwa beberapa indikator dan beberapa pigmen pada tinta adalah molekul yang dapat terionisasi, dan menunjukkan keuntungan elektroforesis menggunakan kertas selulosa asetat.
ALAT DAN BAHAN • elektroforesis 200 volt DC (30 menit) dan 150 volt DC (90 menit) • kertas selulosa asetat • bufer amonia dan amonium asetat atau bufer asam asetat dan amonium asetat • tinta warna hitam • indikator congo red, fenol red, brom fenol blue, dan campuran ketiganya, zat warna fluorecein, tartrazine, dan
campuran keduanya, dan pewarna makanan sintetik sunset yellow dan poncean.
CARA KERJA 1. Kertas elektroforesis atau kertas selulosa asetat dipotong dengan ukuran 30 x 10 cm sebanyak 3 buah untuk tinta dan pewarna makanan, indikator, dan zat warna. 2. Kertas diberi garis vertikal di bagian tengah kertas sebagai tanda garis start. 3. Spot dibuat dengan baik. 4. Kertas kemudian dimasukkan ke dalam larutan bufer dan ditempatkan ke dalam alat elektroforesis, dirunning dengan potensial 200 v dan 150 v selama 30 menit dan 90 menit. 5. Pemisahan yang terjadi diamatai dengan interval 5 – 10 menit. 6. Pemisahan dan warna yang teramati dicatat. 7. Setelah 30 menit dan 90 menit, arus dimatikan dan kertas diangkat dari alat tersebut. 8. Bukti kertas hasil pemisahan disimpan untuk dokumentasi dan dicetak untukbahanlaporan.
2. ELEKTROFORESIS GEL TUJUAN Melakukan elektroforesis DNA menggunakan teknik elektroforesis gel agarosa. BAHAN DAN ALAT • DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII • Sampel DNA, misalnya : • DNA kromosom bakteri, • DNA plasmid hasil isolasi (uncut) • DNA plasmid hasil restriksi (cut) • Agarosa • Larutan buffer TAE 50x (242 g tris -base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan
dalam akuades hingga 1000 ml) • Akuades • Gelas Ukur 1000 ml
• Labu Erlenmeyer 50 ml • Tabung mikrosentrifuga • Sarung tangan • Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio -Rad dan Axygen Scientific) • Kertas parafilm • seperangkat alat elektroforesis • Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) • larutan Etidium Bromid (EtBr) • UV transluminator • Kaca mata UV • kamera digital
CARA KERJA 1. Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. 2. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. 3. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki) 4. Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki 5. Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). 6. Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. 7. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. 8. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). 9. siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. 10. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. 11. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. 12. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). 13. nyalakan sumber arus, aturlah volatase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus.
14. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. 15. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. 16. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). 17. nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi.
