FURB - Fundação Universidade Regional de Blumenau C.C.S. - Centro de Ciências da Saúde D.C.F. - Departamento de Ciências Farmacêuticas Disciplina: Toxicologia Clínica Professor: Marco Aurélio Gomes Mendonça
RELATÓRIO PRÁTICO: TESTES COLORIMÉTRICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE MEDICAMENTOS PARTE II
Daniela Fiamoncini Daniela Franz Felipe Reichert
Março – 2017 2017
1 INTRODUÇÃO
Os antidepressivos tricíclicos são uma classe de fármacos usados no tratamento sintomático da depressão e outras síndromes depressivas. Eles têm esse nome devido a presença de três anéis de átomos, e são quimicamente relacionados com a fenotiazinas. Alguns exemplos de antidepressivos tricíclicos incluem amitriptilina, nortriptilina, clomipramina, desipramina, imipramina, doxepina, f luoxetina e maprotilina. A amitriptilina é um antidepressivo tricíclico amplamente utilizado. É metabolizada pela
desmetilação
N-
para a nortriptilina, que é um antidepressivo por si só. A protriptilina é um análogo da amitriptilina. Envenenamento agudo com amitriptilina e outros antidepressivos tricíclicos pode causar pupilas dilatadas, hipotensão, hipotermia, arritmias cardíacas, depressão respiratória, coma, convulsões e parada cardiorrespiratória. A retenção urinária é também uma característica da intoxicação com estes compostos, o que pode atrasar a obtenção de um espécime adequado para análise. O hidrato de cloral é um sedativo e hipnótico assim como um reagente químico e precursor de sínteses orgânicas. O nome hidrato de cloral indica que é formado do cloral (tricloroacetaldeído) pela adição de uma molécula de água. O hidrato de cloral é descrito como cristais incolores, de odor penetrante e ocre e sabor amargo e cáustico. Seu mecanismo de ação é desconhecido. Não deve ser usado como anestésico, pois sua margem de segurança é muito estreita com o limiar tóxico, nem tampouco como analgésico, por não possuir ação sobre processos dolorosos. É considerada dose oral tóxica, em adultos, 10 g, apesar de haver relatos de pacientes que morreram com a ingestão de 4 g e de outros que sobreviveram com o uso de 30 g. O uso crônico do hidrato de cloral pode causar dependência física, tolerância e vício. Os fenotiazínicos são classificados como antipsicóticos e neurolépticos e promovem tranquilização leve sem que ocorra desligamento do paciente com o meio, promovem pouco ou nenhum efeito analgésico, mas podem potencializar as propriedades analgésicas de outros fármacos. Fenotiazídicos são extensamente metabolizados. A clorpromazina, por exemplo, possui mais de 50 metabólitos em humanos, o teste realizado para pesquisa de fenotiazínicos é baseado na reação de muitos destes compostos com o íon férrico sob condições ácidas. Foi realizado em sala de aula o teste de FORREST, para pesquisa de antidepressivos tricíclicos. Foi utilizado também o reagente FPN para pesquisa de clorpromazina e outros
fenotiazínicos e ainda, o teste de FUJIWARA, para pesquisa de compostos triclorados (hidrato de cloral). O teste de FORREST é baseado na reação destes compostos com solução de dicromato de potássio acidificada, e após realizar o procedimento descrito, colorações que variam do amarelo-esverdeado até verde escuro ou azul sugerem a presença dos antidepressivos tricíclicos. Este reagente é composto por 25 ml da solução aquosa de dicromato de potássio 0,2%, 25 ml de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%, 25 ml de solução aquosa de ácido perclórico 20% e 25 ml de solução aquosa de ácido nítrico 50%. Com o reagente de FPN, uma coloração rosa-vermelha indica a presença de fenotiazínicos (a coloração depende da quantidade de fármaco presente), e esta reação é rápida (5 segundos) se a coloração aparecer após alguns minutos provavelmente é interferente. Para formar o FPN, mistura-se 5 ml de solução aquosa de cloreto férrico 50 g/L, 45 ml de solução aquosa de ácido perclórico 20% e 50 ml de solução aquosa de ácido nítrico 50%. A atividade farmacológica do cloral se dá pela maior parte através do metabólito 2,2,2tricloroetanol, o qual por sua vez é metabolizado para ácido tricloroacético. Este último composto pode ser detectado na urina usando o teste de FUJIWARA, que tem sensibilidade de 1 mg do composto/L de urina. Os testes citados acima (FPN, FUJIWARA, FORREST) são colorimétricos, e este tipo de ensaio tem pontos negativos e positivos. Esses ensaios não são confirmatórios, mas sim eliminatórios, já que várias substâncias podem apresentar grupos funcionais em comum. Os testes coloridos permanecem populares por muitas razões, sendo que a grande vantagem da utilização desse teste justifica-se na sua simplicidade, pois não exige a utilização de equipamentos de alta precisão, nem de reagentes de uso restrito aos laboratórios, ou seja, são testes simples de executar, usa-se reagentes baratos, e dão resultados que são perceptíveis a olho nu, sejam com a mudança de cor (formação de produto colorido ou desaparecimento de cor do analito ou reagente), formação de precipitado ou produção de gás. Outra vantagem é a possibilidade de, dependendo da seletividade da reação, serem aplicados à identificação de fármacos, tanto matérias-primas, quanto em medicamentos (produto acabado). Apelam particularmente em partes do mundo em desenvolvimento onde as instalações de laboratório tendem a ser muito limitadas. Outra desvantagem é que esses testes apresentam menor sensibilidade e o fato de que não são aplicáveis a mistura de fármacos com grupos comuns.
Os testes de cor apenas indicam a presença de um composto ou classe de compostos, por isso todos os testes devem ser confirmados por métodos mais específicos, especialmente importante em casos forenses.
2 DESENVOLVIMENTO
As amostras destinadas a realização do teste foram nomeadas como Amostra 01, Amostra 02 e Amostra 03. Além disso, havia também o controle negativo. Para dar início ao teste, foi escolhida uma amostra dentre três presentes, que foi a Amostra 02. Todos os testes foram realizados, tanto com a amostra, quanto com o controle negativo. Com relação à pesquisa de clorpromzaina e outros fenotiazínicos, utilizou-se o reagente FPN, que é composto de uma solução de cloreto férrico a 5%, ácido perclórico e ácido nítrico (MOFFAT, 2004), colocando-o, de forma suave, em um tubo de ensaio, juntamente com 1,0 mL de urina, sem agitar. Uma variedade de cores, de rosa, vermelho, laranja, violeta a azul, indicam a presença de fenotiazinas. A presença de clorpromazina resulta numa solução de coloração vermelha (MOFFAT, 2004). A coloração da reação é rápida, geralmente aparece em 5 segundos. Se aparecer após alguns minutos, provavelmente é um interferente.
Figura 1. Estrutura química da Clorpromazina.
Ainda sobre a pesquisa de compostos fenotiazínicos, realiza-se um teste com cloreto de ouro, adicionando uma gota do mesmo a uma gota de urina. A presença da clorpromazina e outros fenotiazínicos é confirmada com o aparecimento de uma coloração vermelha (MOFFAT, 2004).
Posteriormente, realizou-se o teste de Fujiwara, indicado para a pesquisa de compostos triclorados. Para isso, foi aquecido, durante 2 minutos, em um tubo de ensaio, 1,0 mL de NaOH 20% e 1,0 mL de piridina. Depois disso, adicionou-se 2,0 mL de urina de forma suave, aquecendo novamente. Uma cor vermelho-rosa na camada de piridina indica a presença de compostos que possuem pelo menos dois átomos de halogênio ligados a um átomo de carbono. O hidrato de cloral sofre metabolismo e resulta no 2,2,2-tricloroetanol, que apresenta uma cor amarela ( MOFFAT, 2004).
Figura 2 - A. Estrutura química do Hidrato de Cloral. B. Estrutura química do 2,2,2-tricloroetanol.
Para a pesquisa de antidepressivos tricíclicos e derivados, fez-se uso do Reagente de Forest, que é composto por dicromato de potássio, uma solução de ácido sulfúrico 30 %, uma solução de ácido perclórico 20% e uma solução de ácido nítrico 50 % (MOFFAT, 2004). Em um tubo de ensaio, foi colocado 0,5 mL de urina. Foi adicionado 1 mL de Reagente de Forrest, misturando a solução por 5 segundos. Colorações que variam do amarelo esverdeado, assim como verde ou azul escuro indicam a presença de antidepressivos tricíclicos (MOFFAT, 2004). A cor azul é inibida pela presença de fenotiazinas, pelo que um excesso de reagente deve ser adicionado para ultrapassar este.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A amostra escolhida pelo grupo, denominada Amostra 02, passou por todos os testes para pesquisa de clorpromazina e outros fenotiazínicos, pesquisa de compostos triclorados, nesse caso, o hidrato de cloral e de antidepressivos tricíclicos e derivados.
Com relação à pesquisa de clorpromazina, o resultado indicou a ausência da mesma na amostra, já que a coloração da solução após a adição dos reagentes deveria ser vermelha, em ambas as etapas. Com relação à pesquisa de compostos triclorados, foi realizado o teste de Fujiwara, onde ambos os tubos apresentaram a mesma coloração, sendo que, o tubo da amostra deveria apresentar uma cor vermelho-rosa na camada de piridina, enquanto que, o hidrato de cloral que sofre metabolismo e resulta no 2,2,2-tricloroetanol, deveria apresentar uma cor amarela (MOFFAT, 2004), resultados esses apresentados pela equipe que analisou a Amostra 03, indicando a presença de compostos triclorados. Posteriormente, realizou-se a pesquisa de antidepressivos tricíclicos, fazendo uso do Reagente de Forest. Quando positivo, a amostra apresenta c olorações que variam do amarelo esverdeado, assim como verde ou azul escuro, indicado a presença de antidepressivos tricíclicos (MOFFAT, 2004). Novamente, a amostra e o tubo controle apresentaram as mesmas colorações (Figura 3), resultando em negatividade para o teste.
Figura 3. Resultado obtido durante a pesquisa de antidepressivos tricíclicos.
É importante ressaltar que, a amostra escolhida pela equipe apresentava antidepressivos tricíclicos em sua composição e, a negatividade para os compostos, mesmo que presentes, pode ser explicada pela baixa dose dos mesmos na amostra, já que os testes colorimétricos são amplamente utilizados quando se trata de intoxicações e, por isso, é possível que não detecte pequenas quantidades do fármaco na urina.
4 CONCLUSÃO
Apesar de que o teste que realizamos com a amostra 02 indica a ausência de antidepressivos tricíclicos, sabemos que a urina testada deveria conter esses compostos, com isso concluímos que, os testes colorimétricos positivam essas substâncias somente em casos de intoxicações pelo medicamento, ou seja, a concentração da substância na urina estará acima da janela terapêutica do fármaco, desta forma os testes colorimétricos não se mostram eficientes. Em relação à pesquisa de triclorados e fenotiazínicos, os resultados obtidos indicam que não há presença destes compostos, por não apresentarem mudança no meio reacional.
5 REFERÊNCIAS
ARENA, Gustavo; BOTELHO, Anderson; EVARISTO, Bruno; MORAIS, Paulo Vitor; NEGRI, Daísa de. FENOTIAZÍNICOS: USOS, EFEITOS E TOXICIDADE EM ANIMAIS DE GRANDE E PEQUENO PORTE. REVISTA CIENTÍFICA ELETRÔNICA DE MEDICINA VETERINÁRIA, n. 12, 2009. Disponível em: < http:// f a ef.revista.inf.br/imagens_arquivos/arquivos_destaque / aFPtCv0LFjvrEUi_2013-6-21-11-7-17.pdf > . Acesso em 06 mar 2017. BULCÃO,Rachel; GARCIA, Solange Cristina; LIMBERGER, Renata Pereira; BAIERLE, Marília; ARBO, Marcelo Dutra; CHASIN, Alice Aparecida da Matta; THIESEN, Flávia Valladão; TAVARES, Rejane. Designer drugs: aspectos analíticos e biológicos. Química Nova, v. 35, n. 1, São Paulo, 2012. Disponível em: < http://www.scielo.br/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0100-40422012000100027> . Acesso em 07 mar 2017 International Programme on Chemical Safety. Basic Analytical Toxicology . World Health Organization, Geneva, 1995. Disponível em: < http://www.who.int/ipcs/publications/ training_poisons/basic_analytical_tox/en/index6.html>. Acesso em 05 mar 2017. MOFFAT, A.C. (ed). Clarke’s isolation and identification of drugs. London: Pharmaceutical Press, 2004. PATROCÍNIO, José A.; PATROCÍNIO, Lucas G.; AMARAL, Pérsio M.; AGUIAR, Alexandre S. F.; PATROCÍNIO, Tomas G. Avaliação da eficácia do hidrato de cloral na sedação de crianças para exame nasofibroscópico. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, v. 67 n. 5, São Paulo, 2001. Disponível em: < http://www.scielo.br/ scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-72992001000500011> . Acesso em 08 mar 2017.
