Nghiên Cứu Chiết Xuất Acid - Shikimic Từ Đại Hồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHÙNG THỊ MỸ HẠNH

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT ACID SHIKIMIC TỪ ĐẠI HỒI

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM – BÀO CHẾ MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Văn Hân

HÀ NỘI 2013

LỜI CẢM ƠN !

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS. Nguyễn Văn Hân, người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và giúp đỡ em hoàn thành luận văn này. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện và toàn thể các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành luận văn đúng thời hạn. Và em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy dỗ và chỉ bảo em tận tình trong suốt những tháng năm học tập tại trường. Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép được gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân, bạn bè đã động viên và hỗ trợ em trong suốt thời gian qua. Do thời gian có hạn và trình độ bản thân còn hạn chế nên luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em rất mong nhận được sự chỉ bảo tận tình của các thầy cô và sự góp ý chân thành của bạn bè.

Em xin chân thành cảm ơn !

Hà Nội, tháng 08 năm 2013 Học viên: Phùng Thị Mỹ Hạnh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ......................................................................3 1.1. Tổng quan về cây hồi ............................................................................3 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố..................................................................3 1.1.2. Đặc điểm thực vật...............................................................................3 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến ......................................................4 1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng......................................................5 1.1.5. Tinh dầu hồi .......................................................................................6 1.2. Tổng quan về acid shikimic ...................................................................7 1.2.1. Công thức hóa học và tính chất...........................................................7 1.2.2. Kỹ thuật phân tích ..............................................................................8 1.2.3. Nguồn gốc acid shikimic ....................................................................8 1.2.4. Vai trò acid shikimic ..........................................................................9 1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi ........................10 1.3. Nhận xét ................................................................................................11 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......13 2.1. Nguyên vật liệu .....................................................................................13 2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................13 2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ ..................................................................14 2.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................15 2.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất .......................................................15 2.2.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước ......16 2..3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................16 2.3.1. Phương pháp định lượng acid shikimic...............................................16 2.3.2. Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu.........................18

2.3.3. Phương pháp tinh chế acid shikimic ...................................................19 2.3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm ............................................................19 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.................................................21 3.1. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi..................................................21 3.2. Khảo sát giai đoạn chiết xuất .................................................................22 3.2.1. Chiết xuất theo phương pháp A ..........................................................22 3.2.2. Chiết xuất theo phương pháp B .........................................................25 3.2.3. Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất ....................................29 3.3. Tinh chế acid shikimic...........................................................................33 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế .............................................34 3.3.2. Bước đầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa acid shikimic bằng isopropanol ..........................................................................................41 3.4. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic và kiểm tra chất lượng sản phẩm ............................................................................................................42 3.4.1. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic....................................42 3.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm ............................................................44 3.5. Mở rộng quy mô....................................................................................48 3.5.1. Mô tả quy trình ...................................................................................48 3.5.2. Kết quả ...............................................................................................50 CHƯƠNG 4 : BÀN LUẬN.........................................................................51 4.1. Về giai đoạn chiết xuất ..........................................................................51 4.2. Về giai đoạn tinh chế .............................................................................52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AC

:

aceton

AS

:

acid shikimic

DD

:

dung dịch

DL

:

dược liệu

EtOH

:

ethanol

IPA

:

isopropanol

MeOH

:

methanol

PP

:

phương pháp

SP

:

sản phẩm

IR

:

phổ hồng ngoại

MS

:

phổ khối lượng

1

:

phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

:

phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C

H-NMR

13

C-NMR

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.)……..…......3 Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A……...24 Bảng 3.2. Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B….27 Bảng 3.3. Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B………….28 Bảng 3.4. Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp…………….30 Bảng 3.5. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp……………………....31 Bảng 3.6. Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất……….......32 Bảng 3.7. Kết quả quá trình tinh chế sử dụng các dung môi tinh chế khác nhau…………………..........37 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát liên quan tới hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế………………………………..........42 Bảng 3.9. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại…………..........45 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) ………………..........46 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) …….47 Bảng 3.12. Các thông số của quá trình chiết tách và phân lập acid shikimic với cỡ mẻ 2kg………………………………….….48 Bảng 3.13. Kết quả chiết xuất acid shikimic với cỡ mẻ 2kg đại hồi….….….50

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu dược liệu ………………………….......…..…21 Hình 3.2. Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn………………...…………..…21 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A………………...………………….…..…23 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu theo PP B………………...………..................………….…………26 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn nồng độ acid shikimic theo thời gian của PP B...27 Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp...29 Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp……………..30 Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế acid shikimic sử dụng các loại dung môi………………………………………..35 Hình 3.9. Hình ảnh sản phẩm thô và sản phẩm tinh chế……..……………..38 Hình 3.10. Sơ đồ tinh chế acid shikimic……………………………...……..43 Hình 3.11. Sản phẩm acid shikimic………………………...………...……..50

ĐẶT VẤN ĐỀ Cây hồi (còn gọi là cây đại hồi, hồi hương, …), tên khoa học Illicium verum Hook. f. là một loài cây phân bố chủ yếu ở Trung Quốc và khu vực Đông Bắc Việt Nam. Quả chín phơi khô của cây hồi (đại hồi) được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực Trung Hoa, là hương liệu trong sản xuất rượu mùi và nướng bánh ở các nước phương Tây, là một gia vị trong món phở của Việt Nam,… Trong Đông y, dược liệu này chủ trị đau bụng, nôn mửa, đau nhức cơ-khớp do lạnh [4], [5]. Đại hồi còn được biết đến là nguồn nguyên liệu sản xuất acid shikimic, thành phần quan trọng trong bán tổng hợp sản xuất thuốc chống virus điều trị cúm gia cầm type A và type B oseltamivir phosphat (tên thương mại là Tamiflu) [7], [14]. Tamiflu đang được coi là dược phẩm có triển vọng nhất để làm giảm tác hại của bệnh cúm gia cầm – loại bệnh vẫn đang là mối lo ngại và tiềm ẩn nguy cơ bùng phát thành đại dịch cúm đối với con người. Ở Việt Nam và trên thế giới, nhiều nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng dung môi ethanol, methanol, nước… cho hiệu suất khá cao nhưng thao tác thực hiện phức tạp, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ qua vấn đề khai thác tinh dầu [6], [8], [10], [12], [22], [24], [25]. Giá trị của đại hồi bị giảm đáng kể vì được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua acid shikimic. Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu mà chưa tận thu được hoạt chất này. Trong khi đó, acid shikimic do Việt Nam sản xuất lại có giá thành cao hơn acid shikimic do Ấn Độ sản xuất – quốc gia phải nhập đại hồi. Đã có nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra nguồn acid shikimic từ các phương pháp tổng hợp hóa học hay lên men vi sinh,… tuy nhiên hiệu suất không cao và giá cả không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ dược liệu [8], [15], [16].

1

Đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi” được thực hiện nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi đạt các tiêu chí: quy trình thao tác đơn giản, an toàn, chi phí thấp và kết hợp thu tinh dầu; từ đó có thể triển khai áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam ở quy mô lớn hơn. Mục tiêu nghiên cứu đặt ra gồm có: 1. Khảo sát và lựa chọn được phương pháp chiết xuất acid shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước. 2. Xây dựng được phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước.

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về cây hồi 1.1.1. Vị trí phân loại và phân bố Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, cây hồi (Illicium verum Hook. f.) có vị trí phân loại khoa học được thể hiện trong bảng dưới đây [1], [9]. Bảng 1.1: Vị trí phân loại của cây hồi (Illicium verum Hook. f.) Giới

Thực vật - Plantae

Không phân hạng

Nhóm thực vật có hoa - Angiospermae

Bộ

Mộc lan dây - Austrobaileyales

Họ

Hồi - Illiciaceae

Chi

Hồi - Illicium

Loài

I. verum

Chi Hồi (Illicium) có khoảng trên 40 loài, phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á, Đông Á và Bắc Mỹ. Ở Việt Nam chi Hồi có 16 loài [8]. Cây hồi (Illicium verum Hook. f.) là một loại cây xanh quanh năm, phần lớn ở Trung Quốc và Đông Bắc Việt Nam. Nó còn có tên gọi khác là cây đại hồi, bát giác hồi hương, hồi hương, hồi sao, mác chác, mác hồi (Tày), pít cóc (Dao),… [2]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật Cây gỗ nhỏ, cao 6 - 8m, có thể đến 10m hay hơn. Cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt, sau chuyển sang màu nâu xám. Lá mọc so le, nhưng thường tụ tập ở những mấu trông như mọc vòng, hình mác hoặc hình trứng thuôn, dài 8-12cm, rộng 3-4cm, đầu nhọn, mặt trên màu lục sẫm, mặt dưới rất nhạt, gân mờ, cuống lá ngắn [1], [2], [3].

3

Hoa mọc riêng lẻ hoặc 2-3 cái ở kẽ lá; đài 5 răng, dễ rụng, mép viền hồng, cánh hoa 5-6, đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ nhị rộng, mập, trung đới dày [1], [2]. Quả thường cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau, có khi 9-12 đại (nhưng hiếm), các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa, khi non màu lục sau chuyển sang màu nâu sẫm, phần đính vào cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn, ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên; hạt hình trứng nhẵn bóng, màu nâu. Toàn cây, nhất là quả có mùi thơm [1], [2]. 1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 1.1.3.1. Bộ phận dùng Đại hồi (quả) – Fructus Illicium veri là quả chín đã phơi khô của cây hồi - Illicium verum Hook. f. (họ Hồi – Illiciaceae). Mô tả: Quả phức, thường gồm 8 đại, đôi khi nhiều đại hơn, màu nâu đỏ đến nâu sẫm, xếp thành hình sao xung quanh một trụ trung tâm. Mỗi đại hình lòng thuyền dài 1-2cm, rộng 0,5cm, cao 0,7-1cm. Bờ trên gần như thẳng, nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt. Bờ dưới hơi tròn và sần sùi. Hai mặt bên nhăn nheo, tận cùng bởi 1 chỏm tù, ở 1 góc có khoảng nhẵn hơn (nơi đính giữa các đại). Mặt trong màu vàng nhạt hơn và nhẵn bóng. Cuống quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả. Hạt hình trái xoan, màu vàng nâu, nhẵn bóng. Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt [5]. 1.1.3.2. Thu hái và chế biến Hàng năm cây ra hoa kết quả theo 2 vụ, vụ chính thu hoạch vào tháng 8-10 (vụ mùa), vụ muộn thu hoạch vào tháng 2-4 năm sau (vụ tứ quý). Vụ muộn cho năng suất thấp hơn. Cây trồng sau 5-6 năm bắt đầu cho thu hoạch. Sau 15 năm mỗi cây có thể cho 10-20kg quả tươi/năm, sau 20 năm, năng suất tương đối ổn định ở mức 20-30kg/năm [2]. Vào vụ thu hoạch, hái lấy quả từ màu lục biến thành vàng, nhúng qua nước sôi, sấy nhẹ hoặc phơi trong bóng râm khoảng 5-6 ngày cho khô [5].

4

Trên thị trường, sản phẩm quả hồi khô được chia thành 3 loại: - Loại 1 (hồi đại hồng): quả đủ 8 cánh to, đồng đều, không bị lép, màu đỏ nâu, cuống ngắn (3-5 mm), không mốc. Đây là loại có phẩm cấp tốt nhất. - Loại 2 (hồi xô): quả có cánh không đều, màu cánh gián, một số cánh bị lép, giập, gãy. - Loại 3: quả thu hái non, quả vụn, lép nhiều, màu nâu đen. Đây là loại có chất lượng kém. 1.1.4. Thành phần hóa học và công dụng 1.1.4.1. Thành phần - Tinh dầu: hàm lượng 3-3,5 % trong quả tươi, 9-10 % trong quả khô. Chứa 80-90 % trans-anethol, ngoài ra còn có linalol, estragol, terpineol, anysaldehyd… [8], [11]. - Acid hữu cơ: acid shikimic, protocatechic, anisatinic, isoanisatinic. Trong đó quan trọng nhất là acid shikimic [2], [8]. - Ngoài ra còn 1 số chất thuộc nhóm flavonoid, tannin, sesquiterpen, sesquiterpen lacton, sesquilignan, sesqui-neoliganan; dầu béo chủ yếu chứa trong hạt [4], [8]. 1.1.4.2. Công dụng Đại hồi (quả) có vị cay, tính ôn, quy kinh can, thận, tỳ, vị. Nó có công dụng giúp tiêu hóa, lợi sữa, giảm đau, giảm co bóp nhu động ruột, dùng chữa ỉa chảy, ăn không tiêu, bụng đầy. Khi dùng ngoài, đại hồi có tác dụng chữa đau nhức, thấp khớp, bong gân [4], [5]. Dạng dùng của loại dược liệu này là bột, rượu thuốc. Ngày dùng 3-6 g. Quả hồi và tinh dầu hồi được dùng làm gia vị và hương liệu cho rất nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm từ thịt [4].

5

1.1.5. Tinh dầu hồi Tên thương phẩm: Star Anis Essential Oil, Anise Star,… 1.1.5.1. Tính chất vật lí Là chất lỏng không màu hay vàng nhạt , mùi đặc biệt, vị ngọt, kết tinh khi để lạnh. Tỷ trọng ở 200C: 0,978-0,988. Điểm đông đặc không nhỏ hơn 150C [29]. 1.1.5.2. Thành phần Thành phần chủ yếu và quan trọng nhất của tinh dầu hồi là transanethol (82,5 %). Ngoài ra còn có linalol (0,1-1,5 %), estragol (0,3-6 %), terpineol (0,1-1,5 %), anysaldehyd (0,1-3,5 %). Và các thành phần khác: 1,4cineol, β-bisabolen, β-faruesen, α-copaen, caryophylen, nerolidol, methylanisoat,

trans-methyleugenol,

cadimen,

foeniculin,

β-phellandren

hydroquinon, p-allylanisol, α-terpineol, α-bergamoten, anysyl-aceton, 1,8cineol, limonen, 1-phellandren, sabinen, α-pinen [8]. 1.1.5.3. Công dụng Tinh dầu hồi có tác dụng tương tự dược liệu, thường được phối hợp trong nhiều thuốc khác. Ngoài ra tinh dầu còn dùng để tổng hợp các hormon oestrogen (diethyl stilbestrol, diethyl stilbestrol propionat). Tinh dầu hồi được dùng làm gia vị và hương liệu cho rất nhiều sản phẩm dùng trong kỹ nghệ thực phẩm: rượu mùi, kẹo gôm, bánh kẹo, gelatin, pudding, thịt, sản phẩm của thịt. Hàm lượng tinh dầu tối đa được phép đưa vào thực phẩm là 0,07%. Ngoài ra tinh dầu còn được dùng trong kỹ nghệ sản xuất xà phòng, kem đánh răng, thuốc lá…[4]. 1.1.5.4. Chiết xuất tinh dầu từ đại hồi Có thể cất tinh dầu khi quả còn tươi hay đã phơi khô. Đồng bào các dân tộc ở Lạng Sơn thường cất tinh dầu hồi bằng các nồi cất thủ công, đơn giản,

6

tương tự như cất rượu. Thời gian cất có thể kéo dài từ 18-24 giờ. Để có hiệu suất và chất lượng tinh dầu cao, cần sử dụng các thiết bị chưng cất liên tục bằng hơi nước có hồi lưu với nồi hơi riêng. Bã còn lại sau khi cất tinh dầu có thể dùng làm nhiên liệu để đun hoặc ủ trộn với phân súc vật để bón cho cây trồng. 1.2. Tổng quan về acid shikimic 1.2.1. Công thức hóa học và tính chất Acid shikimic có công thức hoá học và các tính chất cụ thể như sau [21], [26]: Công thức cấu tạo:

1 6 2 5 3

4

Tên khoa học: acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen -1carboxylic. Công thức phân tử: C7H10O5. Trọng lượng phân tử: 174,15. Tính chất: Acid shikimic là một chất kết tinh màu trắng, rất dễ tan trong nước (18%), tan trong ethanol tuyệt đối (2,25%), trong methanol, không tan trong các dung môi ít phân cực ethyl acetat, aceton, cloroform, benzen, ether dầu hỏa. Nhiệt độ nóng chảy: 183 - 184,50C. Năng suất quay cực: []18= -183,8 (c = 4,03% trong nước).

7

Cực đại hấp thụ: Dung dịch acid shikimic trong ethanol có cực đại hấp thụ ở 213 nm. 1.2.2. Kỹ thuật phân tích Denis V. Bochkov và cs. đã trình bày các kỹ thuật phân tích acid shikimic trong bài tổng quan về hợp chất này [17]. Các kỹ thuật được nêu ra gồm có: - Sắc ký giấy.

- Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân.

- Phản ứng màu.

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.

- Kỹ thuật phân tích định lượng.

- Một số kỹ thuật phân tích khác.

1.2.3. Nguồn gốc acid shikimic Acid shikimic được Eykman F. và cộng sự phân lập lần đầu tiên vào năm 1885 từ một loài hồi Nhật Bản (Illicium anisatum). Đến 50 năm sau cấu trúc hóa học của acid shikimic mới được xác định [23]. Acid shikimic có trong nhiều loài thực vật như đại hồi (Illicium verum), bạch quả (Gingko biloba), quyển bá trường sinh (Selaginella tamariscina, Hoselaginellaceae), kha tử (Terminalia chebula), chuối tiêu (Musa sapientum), hướng dương (Heliantus annus), tiểu hồi (Foeniculum vulgare)… [27]. Nhưng hiện nay đại hồi vẫn là nguyên liệu quan trọng để chiết xuất, bởi hàm lượng acid shikimic trong quả hồi tương đối cao (5%-10%) [8]. Acid shikimic còn có nguồn gốc từ tổng hợp hoặc bán tổng hợp. Raphael (1960) và Smissman (1959) đã tổng hợp acid shikimic từ 1,3butadien-1,4-diyl diacetate qua phản ứng Diels Alder. Grewe (1964) và cộng sự tổng hợp acid shikimic từ 1,3-butadien. Ngoài ra, acid shikimic có thể được tổng hợp từ benzen, bán tổng hợp từ acid quinic và D-manose [15]. Giáo sư Frost, trường đại học Michigan, đã nghiên cứu công nghệ sản xuất acid shikimic bằng con đường lên men vi sinh sử dụng chủng Escherichia coli tái tổ hợp, sau đó chiết xuất acid shikimic từ dịch lên men và

8

tinh chế. Tuy nhiên hiệu suất không cao và giá thành không thể cạnh tranh với phương pháp chiết xuất từ đại hồi [16]. 1.2.4. Vai trò acid shikimic 

Trong sinh học nói chung, acid shikimic đóng vai trò quan trọng trong

quá trình sinh tổng hợp các acid amin thơm như phenylalanin, tryptophan, tyrosin; các alcaloid, hợp chất phenolic, các phenyl propanoid [28]. Nó là chất trung gian hóa học quan trọng của các quá trình chuyển hóa trong thực vật và vi sinh vật (con đường shikimat) [22], [23]. 

Về tác dụng dược lý, acid shikimic có tác dụng chống viêm, giảm đau,

có khả năng ức chế ngưng tập tiểu cầu và bệnh tắc nghẽn động mạch do tác động của acid arachidonic [24]. Các nhà khoa học đã chứng minh acid shikimic có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống co giật, chống oxy hóa, kìm hãm phát triển tế bào ung thư [2]. 

Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, acid shikimic được biết đến là

nguyên liệu tổng hợp (-)zeylenon, hoạt chất có hoạt tính kháng sinh, có tác dụng chống virus, chống ung thư và được sử dụng cho bệnh nhân ung thư trước khi tiến hành hóa trị liệu [18]. Đặc biệt trong những năm gần đây acid shikimic là nguyên liệu để bán tổng hợp oseltamivir phosphat – một chất có vai trò ức chế neuraminidase, một enzym cần cho quá trình giải phóng và lây lan virus từ các tế bào bị nhiễm. Oseltamivir phosphat có tác dụng trên virus cúm type A và type B, đặc biệt với chủng H5N1. Theo tổng hợp của Nguyễn Quyết Chiến [7]: Kim và cộng sự (1997) đã tìm ra con đường tổng hợp oseltamivir phosphat từ acid shikimic nhưng mới chỉ ở quy mô phòng thí nghiệm; Sau đó Rohloff và cộng sự đã xây dựng được phương pháp tổng hợp có hiệu quả và có thể triển khai ở quy mô pilot, hiệu suất tổng thể của quá trình là 21% với 10 công đoạn phản ứng và vẫn qua công đoạn tạo azid, mặc dù được phép áp dụng trong sản xuất nhưng nó luôn tiềm ẩn những nguy cơ do các tác nhân và các hợp chất azid

9

trung gian có độc tính cao và có khả năng gây nổ. Năm 2004, Harrington và cộng sự đã nghiên cứu thành công phương pháp tổng hợp oseltamivir phosphat và tránh được công đoạn tạo azid. Phương pháp này được các tác giả gọi là “phương pháp thế hệ thứ 2”, hiệu suất tổng của phương pháp đạt 61% và được xem là phương pháp tối ưu nhất hiện nay [14]. 1.2.5. Một số nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi Khi đại dịch cúm gia cầm xảy ra, hãng Roche và thế giới lo lắng vì không đủ acid shikimic để sản xuất. Nhiều nhóm nghiên cứu đã cố gắng tìm ra acid shikimic với các phương pháp và nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. Payne R. và Edmonds M. (2005) tiến hành chiết acid shikimic từ đại hồi bằng thiết bị Soxhlet với dung môi ethanol 95%. Dịch chiết được cất loại ethanol. Hòa tan cắn vào nước nóng, gạn bỏ lớp dầu. Dung dịch được loại bớt tạp bằng formaldehyd và lọc. Acid shikimic được tinh chế bằng phương pháp trao đổi ion (dùng nhựa Amberlit IRA-400) và kết tinh lại trong ethyl actetatmethanol. Hiệu suất đạt 2,4-7,0 % [24]. Nguyễn Quyết Chiến (2006) cũng tiến hành và tinh chế acid shikimic từ đại hồi theo phương pháp tương tự. Hiệu suất quá trình đạt 5,4%. Nhược điểm của phương pháp này là tinh chế bằng nhựa trao đổi ion phức tạp và chi phí cao [6]. Nguyễn Đình Luyện và cộng sự (2006) chiết Soxhlet bằng cồn 950, chiết bằng nước ở 60oC và chiết hồi lưu trong cồn 900 và 950, quy mô phòng thí nghiệm (50 và 100g quả hồi khô), loại tạp với formaldehyd, tinh chế trên cột anionit chứa 50g Amberlit và thu được acid shikimic với hiệu suất từ 5,06,8 % [12]. Phương pháp này có cùng nhược điểm nêu trên. Iyer Sankar V. (2007) công bố phương pháp chiết tách acid shikimic gồm các bước [25]: - Chiết hồi lưu nguyên liệu đại hồi (400g) với 2x2L isopropanol 95%. - Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm để thu được dịch chiết đậm đặc.

10

- Dung dịch đậm đặc được pha loãng với 900mL nước. - Tiến hành loại tạp dung dịch nước lần lượt bằng ethyl acetat (1200mL), dung dịch formaldehyd 37% và than hoạt (60g). - Cô đặc dung dịch nước. Thêm 50mL methanol và cô đến cắn. - Hòa cắn vào 40mL methanol, đun hồi lưu 45 phút, để lạnh (0-50C) cho acid shikimic kết tinh. Hiệu suất quá trình 3,5-5%. Phương pháp của Iyer Sankar V. có ưu điểm là bước tinh chế không sử dụng nhựa trao đổi ion. Nhưng quá trình tinh chế qua nhiều công đoạn và khá phức tạp, tốn ethyl acetat và than hoạt; sử dụng formaldehyd 37% là dung môi độc hại để loại tạp và hiệu suất thấp. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Hiroki Ohira (2009) - Trường Đại học Tohoku, Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ chiết xuất bằng khí hóa lỏng siêu tới hạn (Research Center of Supereritical Fluid Tecnhnology) đã nghiên cứu chiết xuất nhanh acid shikimic bằng nước nóng ở nhiệt độ 120oC trong 5 phút với 0,5g hồi có hiệu suất 8% [22]. Hiệu suất chiết cao, thời gian chiết nhanh nhưng kỹ thuật khá phức tạp, tốn kém, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại. Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2010) đã chiết xuất được acid shikimic từ lá và quả đại hồi thu hoạch ở các tỉnh khác nhau ở Việt Nam bằng dung môi nước và methanol, tinh chế bằng hỗn hợp ethyl acetat-methanol (3:1) cho hiệu suất 0,985-1,33% trong lá và 4,47% trong quả [8]. Đỗ Thị Loan (2011) chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước theo phương pháp chiết nóng với nước ở 1000C, tinh chế bằng hỗn hợp dung môi methanol-aceton cho hiệu suất cả quá trình đạt 6,61% [10]. 1.3. Nhận xét Cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát thành đại dịch bất cứ lúc nào ở nước ta và các nước khác trên thế giới. Chủ động nguồn nguyên liệu acid

11

shikimic để bán tổng hợp oseltamivir (hoạt chất có tác đụng chống cúm gia cầm hiệu quả hiện nay) có ý nghĩa hết sức to lớn. Chiết xuất acid shikimic từ đại hồi là phương pháp hiệu quả nhất tính đến thời điểm hiện tại để thu được hoạt chất này. Giá trị kinh tế của đại hồi bị giảm đáng kể, do được sử dụng chủ yếu để lấy tinh dầu mà bỏ qua hoạt chất acid shikimic. Thực tế ở Việt Nam, đại hồi cũng chỉ dùng để cất lấy tinh dầu mà chưa tận thu được acid shikimic. Các phương pháp chiết xuất hoạt chất này đã được công bố trước đây thường phức tạp, khá tốn kém, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, sử dụng dung môi tinh chế độc hại (methanol, formaldehyd,…) và hầu hết bỏ qua vấn đề khai thác tinh dầu. Chính vì vậy, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi sử dụng dung môi chiết xuất là nước và kết hợp chưng cất tinh dầu nhằm góp phần tìm ra phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi có thể áp dụng trong điều kiện thực tế tại Việt Nam.

12

CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu 2.1.1. Nguyên liệu Nguồn gốc Đại hồi thu mua từ tỉnh Lạng Sơn.

Mô tả nguyên liệu Quả phức, thường gồm 8 đại, màu nâu đỏ, xếp thành hình sao xung quanh một trụ trung tâm. Mỗi đại hình lòng thuyền dài 1-2cm, cao dưới 1cm. Bờ trên gần như thẳng, nhẵn, có 1 đường nứt thành 2 mảnh để lộ ra 1 hạt. Bờ dưới hơi tròn và sần sùi, hai mặt bên nhăn nheo, mặt trong màu vàng nhạt hơn và nhẵn bóng. Cuống quả nhỏ và cong, đính vào trụ quả. Hạt hình trái xoan, màu vàng nâu, nhẵn bóng. Quả có mùi thơm dễ chịu, vị ngọt. Đặc điểm nguyên liệu phù hợp với mô tả trong Dược điển Việt Nam IV [5].

13

Xử lí dược liệu - Phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước (phương pháp A): Đại hồi loại bỏ tạp, sấy khô ở 500C. - Phương pháp ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau (phương pháp B): Đại hồi loại bỏ tạp, sấy khô ở 500C, xay, rây qua cỡ rây 2mm. Hàm ẩm nguyên liệu xác định được là 3,26 %. 2.1.2. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ 2.1.2.1. Hóa chất TT

Tên hóa chất

Tiêu chuẩn, nguồn gốc

1

Ethanol 96%

Việt Nam

2

Aceton

P, Trung Quốc

3

Methanol

P, Trung Quốc

4

Methanol

HPLC, Merck

6

H2SO4

P, Trung Quốc

7

Isopropanol

P, Trung Quốc

8

NaCl công nghiệp

Việt Nam

9

Acid shikimic chuẩn

99,0%, Merck

2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ Máy móc 

Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Đức): Công suất P= 400W, tần số f =

35 kHz. 

Tủ sấy MEMMERT (Đức).



Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).



Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S ( Thụy Sỹ).

14



Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ).



Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức).



Bếp ôm bình cầu có bảo ôn Heating Mantle (Trung Quốc).



Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gồm: bộ

phân loại khí DGU – 14A, bơm cao áp LC – 10ADVP, buồng chứa cột CTO – 10AVP, bộ điều khiển SCL – 10AVP, detector dãy diod quang SPD – M10AVP và phần mềm Class vp 6.14. 

Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt (Mỹ).



Phân cực kế KRÜSS (Đức).



Thiết bị xác định phổ hồng ngoại (IR) Perkin Elmer.



Thiết bị xác định phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Bruker AM500

FT-NMR Spectrometer. 

Thiết bị xác định phổ khối lượng Varian 320 Ms (Mỹ).

Dụng cụ 

Hệ thống cất tinh dầu: Bình cầu 2L, sinh hàn, bếp ôm bình cầu có bảo

ôn, bình chứa tinh dầu. 

Sinh hàn hồi lưu.



Bình cầu 250mL, 500mL, 2L.



Cốc thủy tinh loại 100mL, 250mL, 500mL, 1000mL.



Bình gạn 500mL.



Bình định mức 10mL, 25mL, 50mL, 100mL.



Pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL.



Ống đong 10mL, 50mL, 300mL, 500mL.



Màng lọc cellulose acetat 0,45μm (Satorius).

2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Lựa chọn phương pháp chiết xuất

15

Phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước (phương pháp A) và phương pháp ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau (phương pháp B) được khảo sát. Nội dung này nhằm đánh giá tốc độ chiết hoạt chất, hiệu quả chiết xuất acid shikimic, tính chọn lọc và lượng tinh dầu thu được. Từ đó có dữ liệu để so sánh và lựa chọn phương pháp ưu việt hơn. 2.2.2. Xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước - Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế. Các dung môi nghiên cứu gồm có: methanol, hỗn hợp methanol-isopropanol, hỗn hợp methanol-aceton, isopropanol. - Bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tinh chế sử dụng dung môi đã lựa chọn. - Đề xuất quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi. Quy trình này được áp dụng với cỡ mẻ lớn hơn nhằm nâng cao tính thực tiễn của đề tài và sơ bộ đánh giá hiệu quả của quy trình khi mở rộng quy mô. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp định lượng acid shikimic Xác định hàm lượng acid shikimic trong dược liệu, trong dịch chiết và sản phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2.3.1.1. Điều kiện sắc ký Tham khảo các tài liệu [19], [20] và qua thực nghiệm, điều kiện sắc ký được xác định như sau: - Cột: Supelco C8 (150 x 4mm, 5µm).

- Tốc độ dòng: 0,8mL/phút.

- Pha động: dung dịch acid sulfuric 0,01%. - Thể tích mẫu tiêm: 5L. - Bước sóng phát hiện: 210 nm.

- Nhiệt độ buồng cột: 30C.

16

2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu - Dung dịch chuẩn: Cân chính xác 25mg acid shikimic chuẩn vào bình định mức 50mL, thêm nước cất, lắc hòa tan hoàn toàn. Thêm nước vừa đủ đến vạch. Hút chính xác 5mL, cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng 0,45µm. Dung dịch chuẩn có nồng độ 100µg/mL. - Mẫu thử là dược liệu: Cân chính xác 250mg bột dược liệu, gói vào giấy lọc, cho vào bình nón 100mL, thêm 50ml nước, ngâm trong 1 giờ cho trương nở hoàn toàn. Siêu âm trong 30 phút. Gạn lấy dịch chiết, bã tiến hành chiết lần 2, lần 3, mỗi lần 20mL nước, tiến hành như lần 1. Gộp dịch chiết cho vào bình định mức 100mL, thêm nước đến vạch, lắc đều. Hút chính xác 10mL cho vào bình định mức 25mL, thêm nước đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng 0,45µm. - Mẫu thử là dịch chiết: Pha loãng dịch chiết đến nồng độ acid shikimic trong khoảng 50 – 150µg/mL, lọc qua màng 0,45µm. 2.3.1.3. Công thức tính  Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi:

X% 

m .a.V .f .S T T T 100% C m .V .f .S T C C C

Trong đó: X%: hàm lượng acid shikimic trong đại hồi. mC: Khối lượng acid shikimic chuẩn. mT: Khối lượng đại hồi đem chiết.

17

1

SC: Diện tích peak mẫu chuẩn. ST: Diện tích peak mẫu thử. fC, fT: Hệ số pha loãng của mẫu chuẩn và mẫu thử. VC, VT: Thể tích của dung dịch chuẩn và dung dịch thử. a: hàm lượng acid shikimic trong mẫu chuẩn.  Hiệu suất chiết xuất:

HC % 

HLA/dc HLA/dl

 100%

2

Trong đó: HC%: hiệu suất chiết xuất. HLA/dc: hàm lượng acid shikimic trong dịch chiết. HLA/dl: hàm lượng acid shikimic trong dược liệu.  Hiệu suất cả quá trình:

H %

mSP 100% mT

3

Trong đó: H%: hiệu suất cả quá trình mSP: khối lượng sản phẩm mT: khối lượng acid shikimic có trong dược liệu đem chiết 2.3.2. Phương pháp chiết xuất acid shikimic và cất tinh dầu 

Phương pháp A: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo

hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic. 

Phương pháp B: Chiết acid shikimic bằng phương pháp ngâm lạnh có

khuấy trộn, bã dược liệu được cất lấy tinh dầu bằng phương pháp cất kéo hơi nước. 

Sử dụng phương pháp cất kéo hơi nước để thu tinh dầu hồi. Muối ăn

được sử dụng để tách tinh dầu từ dịch cất nước. Tiến hành để phân lớp trong

18

bình gạn. Khi dịch cất tách lớp hoàn toàn, gạn bỏ lớp nước bên dưới thu được tinh dầu. 2.3.3. Phương pháp tinh chế acid shikimic Các giai đoạn tinh chế gồm có: - Dịch chiết nước được để lắng, lọc qua giấy lọc để loại tạp cơ học. Dịch lọc được cô đến cao đặc. - Loại bớt tạp chất và giảm hàm ẩm trong cao tinh chế bằng ethanol 96%. - Sử dụng các loại dung môi sau: methanol, hỗn hợp methanol isopropanol, hỗn hợp methanol - aceton và isopropanol để kết tủa hoạt chất thu sản phẩm thô. - Sử dụng than hoạt và kết tinh lại trong isopropanol thu sản phẩm. 2.3.4. Kiểm tra chất lượng sản phẩm Sản phẩm của quy trình được kiểm tra chất lượng theo các phương pháp sau: - Đo nhiệt độ nóng chảy: Tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy trên máy máy đo nhiệt độ nóng chảy Ez-Melt (Mỹ) tại Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. - Đo năng suất quay cực: Tiến hành trên phân cực kế KRÜSS (Đức) với c = 4,03% trong nước tại Bộ môn Công nghiệp Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội. - Đo phổ hồng ngoại (IR): Mẫu được nghiền với KBr và phổ hồng ngoại (IR) của sản phẩm được xác định trên máy Perkin Elmer đo trong vùng bước sóng 4000-400 cm-1 tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

19

- Đo phổ khối lượng (MS): Phổ khối lượng của sản phẩm được xác định bằng máy Varian 320 Ms (Mỹ), nguồn ion hoá ESI tại Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO) và

13

C-NMR (125 MHz, DMSO) của sản phẩm được xác định trên

máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer tại Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Mỗi thí nghiệm được tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

20

CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Hàm lượng acid shikimic trong đại hồi Xác định hàm lượng acid shikimic bằng phương pháp HPLC như chỉ dẫn ở mục 2.3.1. Hàm lượng acid shikimic có trong đại hồi xác định được là 10,8% ± 0,1%. Sắc ký đồ của mẫu dược liệu và acid shikimic chuẩn được trình bày trong hình 3.1 và 3.2. PDA-210 nm shikimic acid duoc lieu.dat Retention Time

200

2.656

mAU

400

0 0

1

2

3

4

5

Minutes

Hình 3.1. Sắc ký đồ của mẫu dược liệu PDA-210 nm shikimic acid chuan merk 5.dat Retention Time

200

2.667

mAU

400

0 0

1

2

3

4

Minutes

Hình 3.2. Sắc ký đồ của acid shikimic chuẩn

21

5

Nhận xét: Hàm lượng acid shikimic trong dược liệu khá cao (10,8% ± 0,1%). Trên sắc ký đồ cho thấy ngoài peak của acid shikimic trong đại hồi hầu như không có peak của chất nào khác. 3.2. Khảo sát giai đoạn chiết xuất 3.2.1. Chiết xuất theo phương pháp A Phương pháp A là phương pháp gắn liền với thực tiễn chưng cất tinh dầu đại hồi. Trong giai đoạn đầu nghiên cứu, chúng tôi thực hiện khảo sát phương pháp A với các nội dung nghiên cứu gồm có: tốc độ chiết acid shikimic, hiệu quả cất tinh dầu đại hồi, hiệu suất chiết acid shikimic và tính chọn lọc. 3.2.1.1. Khảo sát tốc độ chiết Tiến hành: Cân 100g bột dược liệu cho vào bình cầu thể tích 2L có 2 cổ có nút mài. Một cổ lắp hệ thống cất thu hồi dung môi, một cổ có nút đậy để lấy mẫu định kỳ. Thêm 700mL nước. Đun sôi trong 5 giờ. Lấy mẫu sau khi sôi, sau mỗi giờ lấy mẫu 1 lần. Các mẫu được pha loãng như sau: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL, thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1. Kết quả được thể hiện trong hình 3.3.

22

PP A

1.2 Nồng độ (%)

1 1.01

0.8

1.07

1.1

1.12

4

5

0.76

0.6 0.4 0.2 0

0 0

1

2

3

Thời gian (giờ)

Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn nồng độ của acid shikimic theo thời gian của PP A Nhận xét: Dựa trên đồ thị thấy, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp A là khoảng 3giờ. 3.2.1.2. Cất tinh dầu đại hồi Tiến hành: Cho 100g nguyên liệu vào bình cầu 2L. Cho thêm 1,5L nước. Lắp hệ thống cất kéo hơi nước. Cất cho đến khi hết tinh dầu. Dịch cất được cho thêm 50g muối NaCl, hòa tan muối rồi chuyển sang bình gạn 500mL. Để dịch cất tách lớp hoàn toàn. Gạn bỏ lớp nước bên dưới thu được tinh dầu. Thể tích tinh dầu được đong bằng ống đong thể tích 10mL. Kết quả: Thu được 9,5mL tinh dầu. Nhận xét: Thực nghiệm cho thấy: thời gian để cất hết tinh dầu là 5 giờ. Thể tích tinh dầu thu được khá cao 9,5% (9,5mL/100g dược liệu). Phương pháp cất kéo hơi nước tiến hành khá đơn giản. Hỗn hợp sau khi cất tinh dầu được đem xử lý chiết acid shikimic.

23

3.2.1.3. Chiết xuất acid shikimic Tiến hành: Hỗn hợp sau khi cất tinh dầu được lọc thu lấy dịch chiết. Bã còn lại được tiếp tục chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 700mL, thời gian đun sôi với mỗi lần là 1 giờ. Lọc lấy dịch chiết. Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC. Tiến hành như sau: Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi đem định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả hiệu suất chiết acid shikimic theo phương pháp A Thể tích

Nồng độ

Hiệu suất

(mL)

(%)

chiết (%)

Lần 1

700 ± 26

1,12 ± 0,07

72,5

Lần 2

680 ± 13

0,29 ± 0,01

18,2

Lần 3

640 ± 5

0,13 ± 0,01

7,7

Lần chiết

Tổng

hiệu

suất

chiết

=

98,4%

Nhận xét: Hiệu suất chiết acid shikimic trong dịch chiết lần 1 là 72,5 %, lần 2 là 18,2%, lần 3 là 7,7%. Hiệu suất chiết acid shikimic sau 3 lần chiết là 98,4%.

24

Kết quả cho thấy phương pháp chiết acid shikimic sau khi cất tinh dầu có thể thu được gần như hoàn toàn lượng acid shikimic trong dược liệu với 3 lần chiết. Như vậy trong quá trình cất tinh dầu acid shikimic hầu như không bị phân hủy. 3.2.1.4. Khảo sát tính chọn lọc Tiến hành: Dịch chiết của 3 lần chiết theo mục 3.2.1.3 được gộp lại. Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Xác định nồng độ acid shikimic bằng phương pháp HPLC. Sau đó cô đến cắn, cân lượng cắn thu được. Hàm lượng acid shikimic trong cắn (S) được tính theo công thức: CxV S (%) = m Trong đó : C : Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết (%) V : Thể tích dịch chiết (mL) m : Khối lượng cắn (g) Đánh giá: S càng lớn thì dịch chiết càng ít tạp, quá trình tinh chế thuận lợi hơn. Kết quả: Phương pháp A có S = 54,57 (%). 3.2.2. Chiết xuất theo phương pháp B Phương pháp ngâm lạnh có khuấy trộn tiến hành chiết acid shikimic trước, cất tinh dầu sau. Quá trình được tóm tắt trong hình 3.4.

25

Bột dược liệu (100g) Nước (700ml)

Khuấy liên tục 14 giờ Lọc

Bã DL

Dịch chiết L1 Khuấy liên tục 14 giờ H2O (700ml) Chiết 2 lần Dịch chiết L2,3 Gộp dịch chiết Dịch chiết

Bã DL Cất tinh dầu

Tinh dầu

Bã DL

Hình 3.4. Sơ đồ quy trình chiết acid shikimic và cất tinh dầu theo PP B Khảo sát phương pháp B về tốc độ chiết, hiệu suất chiết acid shikimic, tính chọn lọc và thể tích tinh dầu thu được sau khi đã chiết acid shikimic. Tiến hành so sánh với phương pháp A, từ đó lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic cho hiệu suất cao. 3.2.2.1. Khảo sát tốc độ chiết Khảo sát thời điểm cân bằng của phương pháp B trong dịch chiết lần 1 để so sánh tốc độ chiết với phương pháp A. Phương pháp nào nhanh đạt đến thời điểm cân bằng tức là có tốc độ chiết nhanh hơn. Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L. Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn. Thêm 670 mL nước. Đậy kín. Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng. Khảo sát trong 22 giờ, lấy mẫu sau mỗi giờ. Mẫu được xử lý trước khi đem định lượng bằng HPLC như sau:

26

 Mẫu lấy từ 1 giờ đến 5 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều.  Mẫu lấy từ 6 giờ đến 22 giờ: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1. Kết quả: Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.5. Bảng 3.2. Nồng độ acid shikimic trong dịch chiết sau mỗi giờ theo PP B Giờ

Nồng độ (%)

Giờ

Nồng độ (%)

1

0,30

12

1,09

2

0,42

14

1,14

3

0,55

16

1,16

4

0,67

17

1,17

5

0,79

18

1,21

6

0,87

20

1,20

8

1,02

22

1,23

Nồng độ (%)

PP B 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

1

2

3

4

5

6

8

12

14

16

17

18

20

22

Thời gian (giờ)

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn nồng độ acid shikimic theo thời gian của PP B

27

3.2.2.2. Xác định hiệu suất chiết Hiệu suất chiết cho biết sau mỗi lần chiết, lượng acid shikimic trong dược liệu đã được chiết kiệt hay chưa. Tiến hành xác định hiệu suất chiết của phương pháp B để so sánh với phương pháp A, từ đó đánh giá hiệu quả của phương pháp. Tiến hành: Cân 100g bột đại hồi cho vào cốc có mỏ có thể tích 1L. Thêm 30mL nước ngâm cho dược liệu trương nở hoàn toàn. Thêm 670 mL nước. Đậy kín. Đặt lên máy khuấy từ, để nhiệt độ phòng. Khuấy liên tục trong 14 giờ. Lọc lấy dịch chiết lần 1. Tiến hành chiết thêm 2 lần như trên, mỗi lần 700mL nước, khuấy liên tục trong 14 giờ. Lọc thu được dịch chiết lần 2 và 3. Xác định nồng độ acid shikimic trong từng dịch chiết bằng HPLC: Dịch chiết lần 1: Hút chính xác 1mL dịch chiết cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Dịch chiết lần 2: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 50mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Dịch chiết lần 3: Hút chính xác 2mL dịch chiết cho vào bình định mức 25mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc kỹ cho đều. Các mẫu được lọc qua màng lọc 0,45µm trước khi định lượng bằng HPLC theo mục 2.3.1. Hiệu suất chiết được tính theo công thức 2 mục 2.3.1.3. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.3. Bảng 3.3. Kết quả hiệu suất 3 lần chiết acid shikimic bằng PP B Lần chiết

Thể tích (ml)

Nồng độ (%)

Hiệu suất chiết (%)

Lần 1

630 ± 9

1,23 ± 0,06

71,5

Lần 2

620 ± 13

0,30 ± 0,02

17,2

Lần 3

610 ± 10

0,09 ± 0,01

5,0

Tổng

hiệu

suất

chiết

28

=

93,7%

3.2.2.3. Khảo sát tính chọn lọc Tiến hành tương tự theo mục 3.2.1.4, ta có hàm lượng acid shikimic trong cắn tương ứng với phương pháp B là 60,65%. 3.2.2.4. Cất tinh dầu Từ 100g dược liệu ban đầu, sau khi chiết hết acid shikimic, bã dược liệu được cho thêm 1L nước, lắp hệ thống cất kéo hơi nước, cất cho đến khi hết tinh dầu. Phương pháp thu được 8 ± 0,1 mL tinh dầu. 3.2.3. Đánh giá và lựa chọn phương pháp chiết xuất 3.2.3.1. Về tốc độ chiết Tốc độ chiết của hai phương pháp được thể hiện trong hình 3.6.

Nồng độ (%) 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

PP B

1

2

3

4

5

6

PP A

8 12 14 16 17 18 20 22

Thời gian (giờ)

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn nồng độ AS theo thời gian của 2 phương pháp Nhận xét: Thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp A là khoảng 3giờ, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp B là khoảng 14 giờ. Vậy phương pháp A có tốc độ chiết nhanh hơn phương pháp B.

29

3.2.3.2. Về hiệu suất chiết Từ các kết quả thu được, ta có đồ thị so sánh hiệu suất chiết của hai phương pháp (hình 3.7).

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết của 2 phương pháp Nhận xét: Hàm lượng acid shikimic thu được sau mỗi lần chiết trong phương pháp A đều lớn hơn hàm lượng trong phương pháp B. Lần 1, phương pháp A thu được 72,5%, trong khi phương pháp B thu được 71,5%. Lần 2, phương pháp A thu được 18,2 %, phương pháp B thu được 17,2%. Lần 3 phương pháp A thu được 7,7% , phương pháp B thu được 5,0%. Tổng hiệu suất chiết của phương pháp A (98,4%) lớn hơn phương pháp B (93,7%) là 4,7%. Vậy hiệu suất chiết của phương pháp A cao hơn hiệu suất chiết của phương pháp B. 3.2.3.3. Về tính chọn lọc Kết quả khảo sát tính chọn lọc được thể hiện trong bảng 3.4.

30

Bảng 3.4. Kết quả xác định hệ số chọn lọc của 2 phương pháp C (%)

mAS(g)*

Phương pháp A 2020 ± 36

0,53 ± 0,01

10,706

19,62 ± 0,89 54,57

Phương pháp B

0,54 ± 0,01

10,044

16,56 ± 1,08 60,65

V (mL)

*

1860 ± 9

m (g)

S (%)

mAS = V.C/100

Nhận xét: Phương pháp A có hàm lượng AS trong cắn (S) thấp hơn, như vậy dịch chiết nhiều tạp hơn. Tuy nhiên sự khác biệt về giá trị S của hai phương pháp là không nhiều. 3.2.3.4. Kết quả cất tinh dầu Tinh dầu được coi là sản phẩm phụ trong nghiên cứu này. Tuy nhiên, đây vẫn là một sản phẩm giá trị từ đại hồi và có ý nghĩa ứng dụng thực tế. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp được tổng hợp trong bảng 3.5. Bảng 3.5. Kết quả cất tinh dầu của hai phương pháp

Chỉ tiêu Phương pháp

Cảm quan Thể tích (ml) Màu sắc

Mùi vị

Phương pháp A

9,5

Vàng nhạt

Vị ngọt

Phương pháp B

8,0

Vàng nhạt

Vị ngọt

3.2.3.5. Nhận xét và lựa chọn phương pháp chiết xuất Các kết quả được tổng hợp trong bảng 3.6.

31

Bảng 3.6. Bảng so sánh tốc độ cân bằng, hiệu suất chiết, hàm lượng AS trong cắn (S), thể tích tinh dầu và thời gian chiết xuất PP

PP A (chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước)

PP B (ngâm lạnh kết hợp cất tinh dầu sau)

3

14

Hiệu suất chiết (%)

98,4

93,7

S (%)

54,57

60,65

Thể tích tinh dầu (mL)

9,5

8,0

Thời gian chiết xuất và cất tinh dầu (giờ)

8,5

47

Chỉ tiêu Tốc độ cân bằng (giờ)

Các kết quả nghiên cứu nghiên cứu trên cho thấy rằng: -

Tốc độ cân bằng trong phương pháp cất tinh dầu trước (phương

pháp A) nhanh hơn trong phương pháp ngâm lạnh (phương pháp B). Hiệu suất chiết và thể tích tinh dầu thu được cũng nhiều hơn. Tuy nhiên tính chọn lọc của phương pháp A là thấp hơn so với phương pháp B (thể hiện qua hàm lượng acid shikimic trong cắn). -

Khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán cũng tăng, lượng chất

khuếch tán cũng tăng lên. Hơn nữa khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất. Vì vậy tốc độ chiết của phương pháp A là nhanh hơn (thời gian đạt đến cân bằng khoảng 3 giờ) và chiết được hầu như toàn bộ acid shikimic (98,4%). Tốc độ chiết của phương pháp A nhanh hơn phương pháp B, đồng thời phương pháp này có thể kết hợp cất tinh dầu trong lần chiết thứ nhất do đó rút ngắn được thời gian chiết xuất và cất tinh dầu 5,5 lần so với phương pháp B. Tuy nhiên khi tăng nhiệt độ làm tăng độ tan của acid shikimic cũng làm tăng độ tan của các tạp

32

chất, dịch chiết sẽ bị lẫn nhiều chất nhầy, gôm… Phương pháp này có hàm lượng acid shikimic trong cắn thấp hơn và lượng tạp trong dịch chiết nhiều hơn phương pháp ngâm lạnh; tuy nhiên, xét về tổng thể, lượng hoạt chất thu được với phương pháp A (10,706 g) vẫn lớn hơn phương pháp B (10,044 g). Độ nhớt của dịch chiết tăng gây khó khăn trong việc lọc và loại tạp. Đồng thời, phương pháp cất tinh dầu trước có sử dụng nhiệt độ, tinh dầu được cất trước hết nên không bị thất thoát, do đó thu được lượng tinh dầu nhiều hơn phương pháp B. Như vậy phương pháp này có ưu điểm là: thời gian chiết nhanh, hiệu suất chiết acid shikimic tốt, thu được lượng tinh dầu cao. Nhược điểm: tiêu tốn nhiệt lượng, dịch chiết thu được khó lọc và nhiều tạp. -

Trong phương pháp ngâm lạnh có khuấy trộn liên tục để tạo ra

sự chênh lệch nồng độ liên tục giữa lớp dung môi phía sát màng tế bào với lớp dung môi ở phía xa, từ đó đẩy nhanh tốc độ chiết. Tuy nhiên, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp B là khoảng 14 giờ. Lượng tinh dầu thu được là 8 mL, ít hơn 1,5 mL so với phương pháp cất tinh dầu trước. Nguyên nhân có thể do tinh dầu bị bão hòa một phần trong dịch chiết nước trong quá trình khuấy trộn liên tục trong nhiều giờ. Dịch chiết thu được cũng khá nhớt và khó lọc. Với những ưu điểm trên, chúng tôi lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước là phương pháp A: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic. 3.3. Tinh chế acid shikimic Acid shikimic thường được phân lập bằng nhựa trao đổi ion. Hoạt chất này rất dễ tan trong nước, tan trong ethanol, methanol và khó kết tinh. I. V. Sankar (2007) phân lập acid shikimic bằng methanol, tránh được việc dùng nhựa trao đổi ion; nhưng quá trình tinh chế phức tạp, tốn dung môi, sử dụng

33

formaldehyd là dung môi độc hại. Trong khi đó, acid shikimic và nhiều tạp chất tan khá tốt trong methanol nên hiệu suất phân lập chưa cao. Các nghiên cứu khác đã công bố thường sử dụng hỗn hợp methanol và một dung môi khác (aceton, ethyl acetat) để kết tủa hoạt chất này, nên hiệu suất thu được còn thấp, sản phẩm kém tinh khiết và việc thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn. Nghiên cứu này được thực hiện với mong muốn tìm ra được phương pháp khắc phục các hạn chế nêu trên của các công trình đã công bố trước đây. 3.3.1. Khảo sát và lựa chọn dung môi tinh chế Trên nguyên tắc giảm dần độ tan của acid shikimic (bằng cách thêm đối dung môi hoặc giảm nhiệt độ), trước hết cao đặc chứa acid shikimic phải được hoà tan trong dung môi sao cho hoạt chất được chiết sang dung dịch. Methanol là dung môi rẻ tiền, dễ kiếm và hoà tan tốt acid shikimic; trong khi đó hoạt chất này ít tan trong isopropanol và không tan trong aceton. Qua thực nghiệm thấy, nếu chỉ sử dụng dung môi methanol cũng có thể kết tinh hoạt chất. Vì vậy chúng tôi tiến hành so sánh hiệu quả tinh chế của 4 loại dung môi: methanol, isopropanol, hỗn hợp dung môi methanol – aceton, hỗn hợp dung môi methanol – isopropanol. Sản phẩm thô thu được được kết tinh lại trong isopropanol. Các chỉ tiêu đánh giá chính: - Khối lượng và hàm lượng sản phẩm thô. - Chất lượng sản phẩm (hàm lượng hoạt chất). - Khả năng thu hồi dung môi. Trên thực tế, phương pháp chiết bằng nước ở nhiệt độ cao thường kéo theo rất nhiều tạp vào trong dịch chiết như: đường, chất nhầy, gôm, pectin… Lựa chọn ethanol 96% để loại bớt các tạp chất này. Từ dung dịch trong ethanol đem kết tinh sản phẩm bằng các loại dung môi khác nhau: methanol, hỗn hợp dung môi methanol – aceton, hỗn hợp methanol - isopropanol và isopropanol.

34

Quá trình tạo tủa thô được sơ đồ hóa trong hình 3.8.

Dịch chiết/nước EtOH96%

Cô đến cao đặc

Cao đặc/EtOH 96% MeOH-AC(IPA)

MeOH

MeOH (20mL) Than hoạt(1g) Đun DD/MeOH

IPA

MeOH(20mL)

IPA(50mL) (50ml)

DD/MeOH

AC (IPA) Để kết tinh Gạn 60mL Lọc Tủa Rửa bằng MeOH Sấy DD/hỗn hợp dung môi Sản phẩm thô

Đun, khuấy 30ph Gạn Tủa Thêm 20mL IPA Đun, khuấy 30ph Gạn Tiến hành 2 lần

DD/IPA Cô bớt

Cô bớt 20mL DD/hỗn hợp dung môi

DD/IPA (20mL)

Để kết tinh Lọc Rửa bằng AC(IPA) Sấy

Sản phẩm thô

Để kết tinh Lọc Rửa bằng IPA Sấy

Sản phẩm thô

Hình 3.8. Sơ đồ quy trình tinh chế acid shikimic sử dụng các loại dung môi 35

Tiến hành: Thí nghiệm chiết xuất acid shikimic trong mục 3.2.1.3 được tiến hành 4 lần, mỗi thí nghiệm 100g dược liệu. Gộp các dịch chiết, cô cho đến khi thành cao đặc. Thêm 400mL ethanol 96%, khuấy trộn và để lắng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc thu dịch. Tủa được rửa lại 2 lần, mỗi lần 60mL ethanol 96%, đun nóng, khuấy, để nguội, lọc lấy dịch. Gộp dịch lọc và dịch rửa, cô đến cao đặc. Cao đặc trong ethanol được chia làm 4 phần bằng nhau bằng phương pháp cân (mỗi phần 13g cao đặc tương đương với 9,7g acid shikimic) và sử dụng 4 loại dung môi khác nhau để tinh chế: methanol, hỗn hợp dung môi methanol – aceton, hỗn hợp dung môi methanol – isopropanol và isopropanol. 3.3.1.1. Phân lập bằng methanol Hòa 13g cao đặc (tương đương với 9,7g acid shikimic) vào 20mL methanol, thêm 1g than hoạt, đun cách thủy 15 phút. Lọc bỏ than. Để kết tinh ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần bằng 5mL methanol lạnh. Sấy thu được sản phẩm thô. 3.3.1.2. Phân lập bằng hỗn hợp methanol – aceton Hòa cao đặc (tương đương với 9,7g acid shikimic) vào 20mL methanol, thêm 60mL aceton. Xuất hiện tủa keo. Để lắng, gạn lấy dịch. Phần tủa keo tiếp tục tiến hành 2 lần nữa, mỗi lần 20mL hỗn hợp methanol : aceton (1:3), đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút, gạn lấy dịch. Gộp dịch gạn, cô bớt dung môi đến khi còn 20mL. Để kết tủa ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần, mỗi lần bằng 5mL aceton. Sấy thu được sản phẩm thô. 3.3.1.3. Phân lập bằng hỗn hợp methanol – isopropanol Tiến hành tương tự như kết tủa trong methanol – aceton. Để kết tủa ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần, mỗi lần bằng 5mL isopropanol. Sấy thu được sản phẩm thô.

36

3.3.1.4. Phân lập bằng isopropanol Hòa 13g cao đặc (tương đương với 9,7g acid shikimic) vào 50mL isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Để lắng, gạn lấy dịch. Phần tủa keo tiếp tục tiến hành 2 lần nữa, mỗi lần 20mL isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Gạn lấy dịch. Gộp dịch gạn, đem cô bớt dung môi đến khi còn 20mL. Để kết tinh ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần, mỗi lần bằng 5mL isopropanol. Sấy thu được sản phẩm thô. 3.3.1.5. Kết tinh lại Từ sản phẩm thô, đem hòa tan vào 50mL isopropanol, thêm 3g than hoạt, đun cách thủy trong 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, dịch lọc cô bớt đến còn khoảng 20mL, để kết tinh. Sản phẩm kết tinh được lọc và rửa 3 lần bằng isopropanol, mỗi lần khoảng 5mL. Sấy khô thu được sản phẩm kết tinh màu trắng. Kết quả: Kết quả thu được từ quá trình tinh chế và một số hình ảnh sản phẩm được thể hiện trong bảng 3.7 và hình 3.10. Bảng 3.7. Kết quả quá trình tinh chế sử dụng các dung môi tinh chế khác nhau MeOH/Aceton MeOH/IPA (1:3) (1:3)

Dung môi tinh chế

MeOH

Khối lượng SP thô (g)

7,05 ± 0,16

8,05 ± 0,06

Hàm lượng AS trong tủa thô (%)

80,20

90,60

Khối lượng SP sau tinh chế (g)

5,23 ± 0,07

6,89 ± 0,03

Hàm lượng AS trong sản phẩm (%)

95,16

99,51

98,05

99,18

Hiệu suất tinh chế (%)

51,31

70,68

60,65

66,87

37

IPA

7,58 ± 0,10 7,83 ± 0,09 83,51

88,5

6,00 ± 0,03 6,54 ± 0,02

Loại SP Dung môi

Sản phẩm thô

Sản phẩm tinh chế

Methanol

Hỗn hợp methanol aceton

Hỗn hợp methanol isopropanol

Isopropanol

Hình 3.9. Hình ảnh sản phẩm thô và sản phẩm tinh chế

38

Nhận xét và lựa chọn dung môi tinh chế 

Khả năng loại tạp của methanol không triệt để như sử dụng 3 loại dung

môi còn lại. Khối lượng sản phẩm thô khi kết tinh bằng methanol ít nhất (7,05g) do acid shikimic rất dễ tan trong methanol. Vì vậy sau khi kết tinh vẫn còn một lượng acid shikimic tan trong methanol mà không thu được hoàn toàn. Ưu điểm của phương pháp là tiến hành khá đơn giản, chỉ cần sử dụng một loại dung môi nên thuận lợi để thu hồi dung môi. Nhược điểm: sản phẩm thô có lượng tạp bám dính lớn, độ tinh khiết của sản phẩm không cao (80,2%), các tạp chất chưa được loại khỏi môi trường kết tinh làm dịch kết tinh nhớt dính gây cản trở việc lọc, thời gian lọc lâu, dung môi sử dụng độc hại. 

Khối lượng sản phẩm thô kết tinh bằng isopropanol là 7,83g với hàm

lượng acid shikimic 88,5%. Acid shikimic có độ tan trong isopropanol không cao. Qua thực nghiệm cho thấy độ tan của acid shikimic trong isopropanol là 1/50 ở nhiệt độ thường. Quá trình hòa tan phải sử dụng nhiệt để tăng độ tan của acid shikimic. Vì độ tan thấp nên khi giảm nhiệt độ acid shikimic dễ kết tinh trong isopropanol. Sản phẩm trong isopropanol không tơi xốp như trong hỗn hợp dung môi methanol – aceton mà cứng chắc hơn. Ưu điểm: tiến hành khá đơn giản, chỉ cần sử dụng một loại dung môi nên thuận lợi để thu hồi dung môi; đồng thời loại được đáng kể tạp chất dạng keo, dễ lọc hơn dung môi methanol, dung môi đỡ độc. Nhược điểm: acid shikimic khó tan trong isopropanol, lượng dung môi sử dụng nhiều.

39



Sử dụng hỗn hợp methanol – isopropanol thu được sản phẩm thô có

khối lượng và hàm lượng hoạt chất thấp hơn khi chỉ dùng isopropanol (tương ứng là 7,58g và 83,51%) do tác động của methanol như đã nêu ở trên. Sử dụng hỗn hợp dung môi này có thể giảm bớt lượng isopropanol sử dụng so với phương pháp chỉ dùng isopropanol để tinh chế. Tuy nhiên, dung môi methanol độc hại, sử dụng hỗn hợp 2 dung môi khó thu hồi. 

Khối lượng sản phẩm thô trong hỗn hợp dung môi methanol – aceton

(1:3) lớn nhất (8,05g), hàm lượng cũng cao nhất (90,6%). Acid shikimic tan tốt trong methanol và không tan trong aceton. Một lượng methanol vừa phải đủ để hòa tan hoàn toàn acid shikimic cùng với aceton thêm vào với tỉ lệ methanol/aceton 1:3 làm giảm độ tan của acid shikimic, tạo điều kiện cho acid shikimic dễ kết tinh trong môi trường đó. Mặt khác, aceton thêm vào giúp loại bớt một lượng đáng kể tủa dạng keo, làm cho sản phẩm sạch hơn. Quá trình rửa tủa sử dụng dung môi aceton, tránh được mất mát do hòa tan trở lại một phần vì acid shikimic không tan trong aceton. Ưu điểm: khối lượng sản phẩm thô thu được nhiều nhất với hàm lượng cao nhất, sản phẩm tơi xốp, ít bị bám dính dụng cụ. Nhược điểm: Dung môi methanol độc hại, sử dụng hỗn hợp 2 dung môi khó thu hồi, lượng dung môi sử dụng lớn, thất thoát dung môi nhiều. 

Hiệu suất quy trình sắp xếp theo thứ tự giảm dần như sau:

MeOH/aceton > IPA > MeOH/IPA > MeOH. Sản phẩm sau tinh chế tương ứng với dung môi tinh chế là MeOH/aceton và isopropanol có chất lượng tốt và không khác biệt nhiều (hàm lượng hoạt chất là 99,51 và 99,18).

40



Qua thực nghiệm có thể thu được thêm acid shikimic từ dịch lọc tương

ứng với dung môi tinh chế là hỗn hợp methanol/isopropanol và isopropanol, do đó có thể áp dụng thao tác này để nâng cao hiệu suất quy trình. 

Với những nhận xét nêu trên, chúng tôi nhận thấy rằng isopropanol là

dung môi có tiềm năng để tinh chế thu acid shikimic, đáp ứng được các yêu cầu: loại được nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng và dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại. Isopropanol được lựa chọn làm dung môi tinh chế và quá trình kết tinh hoạt chất trong dung môi này bước đầu được nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo. 3.3.2. Bước đầu khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tinh acid shikimic bằng isopropanol Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tinh hoạt chất bằng isopropanol là: hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế, tạp chất, nhiệt độ,… Với điều kiện nghiên cứu và thời gian còn hạn chế, chúng tôi mới chỉ bước đầu khảo sát yếu tố hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế và cho kết quả cũng như nhận định còn sơ bộ. Tiến hành: Thí nghiệm chiết xuất acid shikimic được thực hiện với 3 mẫu nghiên cứu, mỗi thí nghiệm 100g dược liệu. Với mỗi thí nghiệm, tiến hành theo các bước sau: - Gộp các dịch chiết, cô thành cao, đem xác định hàm ẩm (H) của cao thu được. Lựa chọn các mẫu cao có H là 58,93%, 19,67% và 11,04% để tiếp tục nghiên cứu. - Với mỗi mẫu nghiên cứu: Thêm 100mL ethanol 96%, để lắng 2 giờ ở nhiệt độ phòng, lọc thu dịch. Tủa được rửa lại 2 lần, mỗi lần 20mL ethanol

41

96%, đun nóng, khuấy, để nguội, lọc lấy dịch. Gộp dịch lọc và dịch rửa, cô đến cao đặc. - Hòa cao đặc thu được vào 50mL isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Để lắng, gạn lấy dịch. Phần tủa keo tiếp tục tiến hành 2 lần nữa, mỗi lần 20mL isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Gạn lấy dịch. Gộp dịch gạn, đem cô bớt dung môi đến khi còn 20mL. Để kết tinh ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần, mỗi lần bằng 5mL isopropanol. Sấy thu được sản phẩm thô. Kết quả: Kết quả được thể hiện trong bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả khảo sát liên quan tới hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế Mẫu

Mẫu 1 (H = 58,93%)

Mẫu 2 (H = 19,67%)

Mẫu 3 (H = 11,04%)

Thời gian kết tinh hoàn toàn (ngày)

12

8

7

Khối lượng SP thô (g)

3,16

5,31

7,80

Hàm lượng AS (%)

82,97

85,03

87,08

Chỉ tiêu

Nhận xét: Với các mẫu nghiên cứu, hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế càng giảm thì thời gian để kết tủa càng ngắn và khối lượng tủa thô cũng như hàm lượng acid shikimic trong tủa thô càng cao. 3.4. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic và kiểm tra chất lượng sản phẩm 3.4.1. Đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic

42

Sau khi tiến hành khảo sát nhiều thí nghiệm, chúng tôi đề xuất phương pháp chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước vừa thu được acid shikimic vừa thu được tinh dầu. Từ 100g nguyên liệu, chúng tôi thu được 6,81 g sản phẩm. Phương pháp được sơ đồ hóa trong hình 3.10. Nước 1,5L

Bột dược liệu 100 g

Bột talc

Dịch IPA 1

10g Lọc

Cất tinh dầu Hỗn hợp sau cất

Dung dịch đã loại bớt tạp

Lọc Nước 2 x 700mL

Bã dược liệu

Dịch chiết L1

Cô Để kết tinh *Lọc, rửa, sấy

Lọc, gộp dịch chiết IPA 50mL

Dịch chiết

Sản phẩm thô

Khuấy trộn 800C

Cô EtOH 96% 100mL

Cao đặc/nước

Tạp

Lọc, rửa

Than hoạt 3g

Dịch IPA 2

Dung dịch đã tẩy màu 2

Cô

2 x 20mL

Bã than

Lọc

Dịch EtOH

IPA 50mL

Bã

Cô Để kết tinh *Lọc, rửa, sấy

Cao đặc/EtOH Gạn, rửa, gộp dịch

Acid shikimic

Dịch IPA 1

* Gộp các dịch lọc, dịch rửa, cô thu hồi dung môi, để kết tinh thu hồi acid shikimic Hình 3.10. Sơ đồ tinh chế acid shikimic

43

3.4.2. Kiểm tra chất lượng sản phẩm Chúng tôi tiến hành kiểm tra chất lượng sản phẩm theo các phương pháp ở mục 2.3.4. Sản phẩm acid shikimic có nhiệt độ nóng chảy, năng suất quay cực phù hợp với tài liệu tham khảo, các dữ liệu phổ phù hợp với công thức cấu tạo của acid shikimic (phổ hồng ngoại, phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, phổ cộng hưởng từ hạt nhân

13

C) và có độ tinh

khiết cao. Kết quả kiểm tra chất lượng cụ thể như sau: 3.4.2.1. Nhiệt độ nóng chảy ( tnc) + Kết quả: tnc= 184,30C + Nhận xét: Sản phẩm thu được có nhiệt độ nóng chảy đo được nằm trong khoảng nhiệt độ nóng chảy của acid shikimic (183 - 184,50C The Merck Index 13rd [21]. Như vậy, sơ bộ nhận định sản phẩm thu được chứa hoạt chất này, và có độ tinh khiết cao. 3.4.2.2. Năng suất quay cực + Kết quả: [α]D20 = - 183,6 (với c = 4,03% trong nước). + Nhận xét: Giá trị thu được gần với giá trị năng suất quay cực [α]D18 = - 183,8 (với c = 4,03% trong nước) theo The Merck Index 13rd [21]. 3.4.2.3. Dữ liệu phổ

 Phổ hồng ngoại (IR) + Kết quả: Thu được phổ hồng ngoại của sản phẩm (xem phụ lục 1).

44

Bảng 3.9. Các dải hấp thụ đặc trưng trong phổ hồng ngoại

max(cm-1) Nhóm chức Thực nghiệm Tham khảo [30] 1 6 2 5 3

3491,16

3482

3385,16

3384

3236,74

3236

1645,06

1649

C=C (alken)

1681,72

1682

C=O

O-H

4

+ Nhận xét: Kết quả phân tích phổ hồng ngoại cho phép chúng tôi nhận biết các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức điển hình của acid shikimic.

 Phổ khối lượng + Kết quả: Thu được phổ khối lượng của sản phẩm (phụ lục 2 và 3). + Nhận xét: Phổ khối lượng phù hợp với khối lượng phân tử của acid shikimic. Cụ thể như sau: - Phổ Positive : Pic ion phân tử m/z 197 ứng với mảnh [M+Na+]. - Phổ Negative : Pic ion phân tử m/z 173 ứng với mảnh [M-H+].  Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) + Kết quả: Thu được phổ cộng hưởng từ hạt nhân của sản phẩm (xem phụ lục 4).

45

Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR)

δ (ppm)

1 6

J (Hz)

Vị trí H

2,035

18

1H, d, H-6β

2,381 2,416

2,407

17,5

1H, d, H-6α

2,535 2,554

3,560

4,75

1H, t, H-4

3,827 3,837

3,847

5

1H, d, H-5

4,202

4,220

1H, s, H-3

6,570

6,584

1H, s, H-2

Thực nghiệm

Tham khảo [30]

1,997 2,033

2 5 3

4

C7H10O5 acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 – trihydroxy -1-cyclohexen 1- carboxylic

+ Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của sản phẩm cho thấy phù hợp với công thức acid shikimic; đồng thời các giá trị này cũng gần tương ứng với kết quả phân tích 1H NMR (399,6514MHz, DMSO-d6) theo tài liệu tham khảo [30].  Phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR) + Kết quả: Thu được phổ 13C-NMR của sản phẩm (xem phụ lục 5).

46

Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon (13C-NMR)

δ (ppm) Vị trí C Thực nghiệm

Tham khảo [30]

30,057

29,89

6

65,627

65,42

5

66,951

66,74

4

70,471

70,32

3

128,509

128,34

1

trihydroxy -1-cyclohexen -

138,909

138,59

2

1- carboxylic

168,133

167,87

-COOH

1 6 2 5 3

4

C7H10O5 acid (3R,4S,5R) – 3,4,5 –

+ Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ carbon của sản phẩm phù hợp với công thức acid shikimic; đồng thời các giá trị này cũng gần tương ứng với kết quả phân tích 13C-NMR (22,53 MHz, DMSO-d6) theo tài liệu tham khảo [30]. 3.4.2.3. Định lượng hoạt chất Hàm lượng acid shikimic trong sản phẩm đạt 99,85%. Nhận xét chung: Từ những kết quả kiểm nghiệm trên có thể xác định sản phẩm thu được là acid shikimic và có độ tinh khiết cao.

47

3.5. Mở rộng quy mô Các công trình nghiên cứu chiết xuất acid shikimic đã công bố chủ yếu nghiên cứu trên cỡ mẻ khá nhỏ (5g, 100g, 300g, 400g). Cần áp dụng quy trình được đề xuất với cỡ mẻ lớn hơn để đánh giá hiệu quả của phương pháp. Đo đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu trên cỡ mẻ 2kg đại hồi. 3.5.1. Mô tả quy trình Chiết xuất theo quy trình chiết xuất và tinh chế nêu trên (hình 3.10). Do thời gian có hạn và điều kiện thiết bị hạn chế, thực nghiệm này bỏ qua quá trình cất tinh dầu. Tiến hành với 3 mẻ dược liệu, cỡ mẻ là 2kg. Qua thực nghiệm, các thông số của quá trình được lựa chọn theo bảng 3.12. Bảng 3.12. Các thông số của quá trình chiết tách và phân lập acid shikimic với cỡ mẻ 2kg Đại lượng Khối lượng dược liệu (kg) Thể tích dung môi chiết (L) Số lần chiết Thời gian chiết tính từ thời điểm sôi (giờ) Thể tích ethanol 96% (L) Thể tích IPA trong giai đoạn tạo tủa thô (L) Khối lượng bột talc (g) Thể tích IPA trong giai đoạn kết tinh lại (L) Khối lượng than hoạt (g)

Giá trị 2 V1 = 14, V2 = V3 = 10 3 1 1,6 1 100 1 60

3.3.1.2. Mô tả quy trình Giai đoạn 1: Chuẩn bị nguyên liệu Đại hồi được loại bỏ tạp, sấy ở 500C trong 2 giờ. Xác định độ ẩm (a); kết quả: a = 3,26 %. Cân 2 kg dược liệu thô. Giai đoạn 2: Chiết xuất

48

Tiến hành theo phương pháp ngâm nóng, dung môi là nước. Các thông số kĩ thuật của quá trình chiết xuất được thể hiện trong bảng 3.12 nêu trên. Cách tiến hành: Cho dược liệu cho vào bể chiết. Cho thêm 14L nước, đun sôi 1 giờ, lọc thu lấy dịch chiết lần 1. Bã còn lại được tiếp tục chiết thêm 2 lần nữa, mỗi lần 10L và đun sôi trong 1 giờ. Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc loại tạp cơ học. Giai đoạn 3: Tinh chế + Bước 1: Tạo sản phẩm thô Dịch chiết được cô cho đến khi thành cao đặc. Thêm 1,6L ethanol 96%, để lắng 2 giờ ở nhiệt độ phòng. Lọc thu dịch. Tủa được rửa lại 2 lần, mỗi lần 300mL ethanol 96%, lọc lấy dịch. Gộp dịch lọc và dịch rửa, cô đến cao đặc. Hòa cao đặc vào 1L isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Để lắng, gạn lấy dịch. Phần tủa keo tiếp tục tiến hành 2 lần nữa, mỗi lần 400mL isopropanol, đun cách thủy, khuấy liên tục trong 30 phút. Gạn lấy dịch. Gộp các dịch gạn. Thêm 100g bột talc, đun cách thủy, khấy trộn 10 phút, để ở nhiệt độ phòng 2 giờ, sau đó đem lọc qua giấy lọc trên phễu có hút chân không. Dịch lọc được cô bớt dung môi đến khi còn 400mL. Để kết tinh ở nhiệt độ phòng. Sau 5 ngày, lọc lấy tủa. Rửa tủa 3 lần, mỗi lần bằng 100mL isopropanol. Sấy thu được sản phẩm thô. +Bước 2: Kết tinh lại Từ sản phẩm thô, đem hòa tan vào 1L isopropanol, thêm 30g than hoạt, đun cách thủy trong 15 phút. Lọc lấy dịch lọc, dịch lọc cô bớt đến còn khoảng 400mL, để kết tinh 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Sản phẩm kết tinh được lọc và

49

rửa 3 lần bằng isopropanol, mỗi lần khoảng 100mL. Sấy khô thu được sản phẩm kết tinh màu trắng (hình 3.11).

Hình 3.11. Sản phẩm acid shikimic 3.5.2. Kết quả Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Kết quả chiết xuất acid shikimic với cỡ mẻ 2kg đại hồi

Sản phẩm thô Khối lượng (g)

Hàm lượng acid shikimic (%)

1

170,34

2 3

Mẻ

Sản phẩm tinh khiết

Hiệu suất quy trình

Khối lượng (g)

Hàm lượng acid shikimic (%)

Nhiệt độ nóng chảy (0C)

X

89,95

150,16

99,60

184

69,52

165,04

90,03

146,18

99,81

184,2

67,68

168

90,00

143,16

99,88

184,3

66,28

X + SE

67,83 ± 1,62

Nhận xét: Các mẻ dược liệu cho kết quả tương đối đồng nhất. Như vậy, quy trình chiết xuất và tinh chế acid shikimic là ổn định.

50

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1. Về giai đoạn chiết xuất Hầu hết các công trình nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi sử dụng alcol làm dung môi chiết xuất, do đó việc thu tinh dầu rất khó khăn. Phương pháp chiết xuất bằng nước có những ưu điểm sau đây: - Dung môi rẻ tiền, không độc hại. - Có thể tận dụng phế phẩm của quá trình sản xuất tinh dầu hồi. Mục đích của thí nghiệm khảo sát tốc độ chiết là tìm ra thời gian cân bằng giữa nồng độ acid shikimic trong dịch chiết và nồng độ acid shikimic trong dược liệu. Sau thời điểm cân bằng, nồng độ acid shikimic trong dịch chiết không tăng thêm nữa. Thời điểm cân bằng là thời điểm hợp lý để rút dịch chiết. Phương pháp nào nhanh đạt đến thời điểm cân bằng tức là có tốc độ chiết nhanh hơn. Khảo sát thời điểm cân bằng của 2 phương pháp trong dịch chiết lần 1 để so sánh tốc độ chiết của 2 phương pháp. Kết quả nghiên cứu cho thấy thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp A là 3 giờ, thời gian đạt đến cân bằng của phương pháp B là 14 giờ. Lựa chọn phương pháp A để chiết xuất acid shikimic giúp tiết kiệm thời gian một cách hiệu quả so với phương pháp B. - Chiết acid shikimic bằng phương pháp chiết nóng ở nhiệt độ sôi của nước có thể kết hợp thu tinh dầu ở lần chiết thứ nhất (sử dụng bộ dụng cụ cất kéo hơi nước); từ 100g nguyên liệu thu được 9,5mL tinh dầu. Hiệu suất chiết acid shikimic trong dịch chiết lần 1 là 72,5 %, lần 2 là 18,2%, lần 3 là 7,7%. Hiệu suất chiết acid shikimic sau 3 lần chiết là 98,4%. Như vậy trong quá trình cất tinh dầu acid shikimic hầu như không bị phân hủy và có thể thu được gần như hoàn toàn lượng acid shikimic trong dược liệu với 3 lần chiết. Trên thực tế sản xuất, chúng tôi đề xuất sử dụng dịch chiết lần 1 và 2 để xử lý thu acid shikimic, dịch chiết lần 3 làm dung môi cho mẻ sau. Quy trình chiết xuất

51

theo phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước là phương pháp pháp đơn giản, hiệu quả để tận thu tinh dầu và acid shikimic, có thể ứng dụng trên thực tế. Tuy nhiên, chúng tôi không đề cập đến tỷ lệ dung môi/dược liệu do thông số này chịu tác động lớn của cỡ mẫu. Đồng thời, phương pháp này gắn với thực tiễn sản xuất tinh dầu hồi tại tỉnh Lạng Sơn của nước ta, có thể tận thu nước cái và bã đại hồi sau khi cất tinh dầu để tiếp tục xử lí thu acid shikimic. 4.2. Về giai đoạn tinh chế Nguyên tắc tinh chế acid shikimic được rút ra từ nghiên cứu này: -

Acid shikimic chiếm lượng lớn trong quả đại hồi nhưng rất khó

kết tủa, phân lập nếu trong dịch chiết xử lý còn lẫn tạp. Vì vậy, cần phải xử lý, loại gần như hết tạp trong dịch chiết. -

Trong quá trình tinh chế cần phải hạn chế sự có mặt của nước.

Nước hòa tan rất tốt acid shikimic vì vậy trong dịch chiết xử lý phải loại hết nước để có thể kết tủa acid shikimic. -

Lựa chọn dung môi tinh chế đảm bảo khả năng kết tủa hoạt chất,

mức độ độc hại và tính kinh tế (giá cả, khả năng thu hồi tái sử dụng, thất thoát). Để acid shikimic kết tinh được trong dung môi tinh chế cần phải giảm dần độ tan của acid shikimic (bằng cách thêm đối dung môi hoặc giảm nhiệt độ) hoặc tạo ra dung dịch quá bão hòa (bằng cách làm bay hơi bớt dung môi tinh chế). -

Tẩy màu bằng than hoạt và kết tinh lại để thu được sản phẩm có

độ tinh khiết cao. Qua khảo sát 4 loại dung môi tinh chế (methanol, hỗn hợp methanolisopropanol, isopropanol, hỗn hợp methanol-aceton) cho thấy hỗn hợp methanol-aceton và isopropanol cho hiệu quả chiết tách acid shikimic tốt (70,68% và 66,87%). Tuy nhiên, khó khăn lớn nhất khi sử dụng hỗn hợp methanol-aceton là việc thu hồi, tái sử dụng dung môi; do dung môi thu hồi

52

có lẫn nước từ cao chiết nước. Với aceton thu hồi có lẫn methanol và nước, quá trình kết tủa acid shikimic trở nên khó khăn. Trong khi đó, isopropanol có thể khắc phục được tình trạng này. Song, lượng nước còn lại trong hỗn hợp để kết tủa hoạt chất càng lớn thì khả năng mất mát acid shikimic trong dịch lọc càng cao và thời gian kết tủa hoàn toàn càng lâu. Isopropanol là dung môi có tiềm năng để tinh chế thu acid shikimic, đáp ứng được các yêu cầu: loại được nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng và dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại. Hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế, tạp chất, nhiệt độ,… là các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình kết tủa hoạt chất bằng isopropanol. Như đã trình bày ở trên, với điều kiện nghiên cứu và thời gian còn hạn chế, chúng tôi mới chỉ bước đầu khảo sát các yếu tố hàm ẩm của cao trong nước đem tinh chế và cho kết quả cũng như nhận định còn sơ bộ. Qua thực nghiệm cho thấy, áp dụng các biện pháp giảm tối đa lượng nước lẫn vào hỗn hợp đem tinh chế (sử dụng máy cất quay chân không, cô dịch chiết đến cao đặc) và loại tạp (sử dụng ethanol 96%, bột talc) giúp rút ngắn thời gian tạo tủa, giảm thiểu lượng hoạt chất mất mát trong dịch lọc. Tạp chất hòa tan làm tăng độ nhớt của dung dịch, gây cản trở quá trình kết tinh hoạt chất. Qua thực nghiệm cho thấy, có thể sử dụng bột talc hoặc bột giấy lọc trong giai đoạn tạo tủa thô và sử dụng than hoạt trong giai đoạn kết tinh lại để loại bớt tạp chất này, tạo điều kiện cho quá trình kết tủa/kết tinh hoạt chất. Tạp chất làm cho khối dịch rất khó lọc; do đó, việc hạn chế lượng nước lẫn trong hỗn hợp đem tinh chế và áp dụng các biện pháp loại tạp giúp cho thao tác lọc thu hoạt chất trở nên dễ dàng hơn. Dịch lọc có độ nhớt lớn, đồng thời acid shikimic tuy khó tan, nhưng vẫn tan một phần trong isopropanol, do đó một lượng acid shikimic bị mất mát trong dịch lọc. Gộp các dịch lọc, dịch rửa, cô thu hồi dung môi, để kết

53

tinh thu hồi acid shikimic. Với các dung môi tinh chế khác, lượng acid shikimic thu hồi từ dịch lọc là không đáng kể. Phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước được đề xuất có những ưu điểm sau đây: - Không sử dụng nhựa trao đổi ion (phương pháp này tốn kém và chỉ áp dụng trong phòng thí nghiệm). - Không sử dụng hoá chất độc hại (methanol, formaldehyd,…). - Ít thất thoát dung môi hơn khi sử dụng ethyl acetat hoặc aceton. - Có thể tái thu hồi sử dụng dung môi. - Quy trình thao tác dễ dàng, sử dụng thiết bị đơn giản. Tóm lại: Mặc dù acid shikimic đã được quan tâm nghiên cứu trong và ngoài nước từ nhiều năm gần đây với nhiều công trình được công bố nhưng mới chỉ có ứng dụng ở quy mô nghiên cứu. Các quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi còn khá phức tạp, sử dụng dung môi độc hại, thu hồi tái sử dụng dung môi khó khăn, lượng dung môi sử dụng lớn nên tính kinh tế không cao và khó áp ụng vào thực tiễn sản xuất (nội dung chi tiết đã được trình bày trong mục 1.2.5). Với quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với dung môi nước được chúng tôi đề xuất (hình 3.10), các thao tác thực hiện khá dễ dàng, thiết bị đơn giản, sử dụng nước làm dung môi chiết và các dung môi tinh chế dễ kiếm, rẻ tiền, ít độc hại (ethanol 96%, isopropanol). Quy trình được thử nghiệm với cỡ mẻ 2kg, lượng nước cho mỗi lần chiết được giảm đi do cỡ mẻ lớn, dược liệu xen kẽ vào nhau nên chỉ cần lượng nước với tỷ lệ nhỏ hơn mẻ 100g mà vẫn đảm bảo chiết được gần như toàn bộ hoạt chất; đồng thời giúp rút ngắn quá trình cô dịch chiết. Lượng dung môi tinh chế là tương đối nhiều, tuy nhiên có thể thu hồi tái sử dụng. Quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi với dung môi nước được đề xuất là ổn định và cho hiệu suất quy trình đạt 67,83 ± 1,62 (n = 3).

54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận Mặc dù thời gian có hạn và điều kiện thực nghiệm còn nhiều hạn chế, nghiên cứu đã đạt được 2 mục tiêu đề ra: 1. Đã khảo sát và lựa chọn phương pháp chiết xuất acid shikimic kết hợp thu tinh dầu từ đại hồi với dung môi nước. 2. Đã xây dựng phương pháp tinh chế acid shikimic từ dịch chiết nước. Cụ thể như sau : -

Đã khảo sát hai phương pháp thu được acid shikimic kết hợp cất

tinh dầu: phương pháp chiết nóng kết hợp cất tinh dầu trước và phương pháp ngâm lạnh cất tinh dầu sau; so sánh về tốc độ chiết (thời điểm cân bằng là khoảng 3 giờ và 14 giờ), về hiệu suất chiết (98,4% và 93,7%), về tính chọn lọc (hàm lượng hoạt chất trong cắn lần lượt là 54,57% và 60,65%) và về thể tích tinh dầu thu được (9,5mL và 8mL). Lựa chọn phương pháp: Cất lấy tinh dầu đại hồi bằng phương pháp cất kéo hơi nước, hỗn hợp còn lại đem chiết lấy acid shikimic. -

Đã khảo sát 4 loại dung môi tinh chế gồm có: methanol, hỗn hợp

methanol-isopropanol, isopropanol và hỗn hợp methanol-aceton. Isopropanol được lựa chọn để tinh chế thu acid shikimic do đáp ứng được các yêu cầu: loại được nhiều tạp, hiệu suất quy trình tốt, thu hồi dung môi dễ dàng và dung môi rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại.

55

- Bước đầu khảo sát liên quan đến hàm ẩm của cao chiết nước. Kiểm soát lượng nước lẫn trong hỗn hợp để tạo tủa hoạt chất và áp dụng nhiều biện pháp loại tạp sẽ tạo thuận lợi cho quá trình tạo tủa acid shikimic sử dụng dung môi tinh chế là isopropanol. - Từ các kết quả thu được, đã đề xuất quy trình chiết xuất acid shikimic từ đại hồi, áp dụng trên 3 mẻ thực nghiệm với cỡ mẻ 2kg nguyên liệu cho kết quả tương đối đồng nhất với hiệu suất quy trình đạt 67,83 ± 1,62 (n = 3). Phương pháp không yêu cầu thiết bị phức tạp, dễ tiến hành, chỉ dùng những dung môi an toàn và dễ kiếm.

Kiến nghị Trên đây là những kết quả nghiên cứu bước đầu, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo. Chúng tôi xin kiến nghị: Tiếp tục triển khai đánh giá quy trình chiết xuất acid shikimic trên quy mô lớn hơn để khẳng định tính khả thi của phương pháp.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT: 1. Nguyễn Tiến Bân (1997), Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín ở Việt Nam, Nxb. Nông nghiệp, tr. 9. 2. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Thượng Dong và cs. (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb. Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tập I, tr. 986-990. 3. Đỗ Huy Bích, Nguyễn Văn Tập và cs. (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, Nxb. Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, tr. 534-535. 4. Bộ Y tế (2007), Dược liệu học, Nxb. Y học, tập II, tr. 234. 5. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, tr. 748-749. 6. Nguyễn Quyết Chiến và cs. (2006), “Phân lập acid shikimic từ quả hồi Việt Nam (Illicium verum Hook.f. – Illciaceae)”, Tạp chí Hóa học, 44(6), tr. 745-748. 7. Nguyễn Quyết Chiến (2007), “Chọn lựa một hướng đi trong nghiên cứu tổng hợp Oseltamivir (Tamiflu) ở Việt Nam”, Tạp chí Hóa học, 45(2), tr. 199-206. 8. Nguyễn Thượng Dong, Nguyễn Thị Bích Thu (2010), Nghiên cứu phát triển cây hồi làm nguyên liệu sản xuất acid shikimic và khai thác tinh dầu, Đề tài Khoa học Công nghệ cấp Bộ y tế, Viện Dược liệu. 9. Trần Công Khánh, Nguyễn Thị Sinh (1997), Thực vật dược, Trường Đại học Dược Hà Nội. 10. Đỗ Thị Loan (2011), Nghiên cứu chiết xuất acid shikimic từ đại hồi bằng nước, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. 11. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, tr. 524-525.

12. Nguyễn Đình Luyện (2006), “Chiết xuất acid shikimic từ hoa hồi (Illicium verum Hook. f.)”, Tạp chí Dược học, 358, tr. 8-9. 13. Hà Thị Mai Trang (2007), Nghiên cứu định lượng acid shikimic trong đại hồi bằng HPLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH: 14. Abrecht S., Harrington P., Iding H., Karpf M. et al (2004), “The Synthetic Development of the Anti-Influenza Neuraminidase Inhibitor Oseltamivir Phosphate (Tamiflu®)”, Chimia, 58(9), pp. 621-630. 15. Ambhaikar N. (2005), Shikimic acid, The Baran laboratory Group Meeting, The Scripps Research Institute. 16. Bogosian G. et al. (2008), Use of glyphosate to produce shikimic acid

in

microorganisms,

WIPO

Patent

Application

WO/2008/128076. 17. Denis V. Bochkov et al. (2012), “Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources”, J. Chem. Biol., 5(1), pp. 5–17. 18. Amalia M. Estévez and Ramón J. Estévez (20112), “A Short Overview on the Medicinal Chemistry of (—)-Shikimic Acid”, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 12, pp. 1443-1454. 19. Katarína Hroboňováa, Jozef Lehotaya and Jozef Čižmárik (2007), “Determination of Quinic and Shikimic Acids in Products Derived from Bees and their Preparates by HPLC”, Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 30(17), pp. 2635-2644. 20. LI Wei, CAO Yong, WEI Hua, ZHOU Dong-wu (2008), “Reversed-Phase HPLC Determination of Shikimic Acid in Illicium

Verum Hook. f.” - Abtract, Journal of Jishou University(Natural Sciences Edition), 01. 21. Merck & Co., Inc (2001), The Merk Index 13th edition, pp. 14571458. 22. Ohira H., Torii N., Aida M. T., Watanabe M., Smith L. R. (2009), “Rapid separation of shikimic acid from Chinese star anise (Illicium verum Hook. f.) with hot water extraction”, Separation and Purification Tech., 69, pp. 102-108. 23. Payne R., Edmonds M. (2005), “Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed”, J. Chem. Edu., 82(4), pp. 599-600. 24. Sakaguchi I. et al. (2004), “The water soluble extract of Illicium anisatum stimulas mouse vibrissae follicles in organs culture”, Exp. Dermatol, 13(8), pp. 449-504. 25. Sankar I. V. et al. (2007), Method for obtaining shikimic acid, WIPO Patent Application WO/2007/138607. 26. Shingh G., Jiang S. (1998), “Chemical synthesis of shikimic acid and its analogues”, Tetrahedron, 54, pp. 4697-4753. 27. Shyluk J. P. et al. (1967), “Gas chromatography of the trimethylsilyl derivatives of shikimic acid and biochemically related compounds”, J. Chroma., 26, pp. 268. 28. Stavric B., Stoltz D. R. (1976), “Shikimic acid”, Food Cosmet. Toxicol., 14( 2), pp. 141-145. 29. The United State Pharmacopeia 30, NF 25 (2007), pp. 1063. TÀI LIỆU TIẾNG TRUNG QUỐC: 30. Thư

viện

hóa

chất

http://www.basechem.org/chemical/2869.

BASECHEM,

URL:

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ IR của acid shikimic

Phụ lục 2. Phổ khối lượng (Negative) của acid shikimic

Phụ lục 3. Phổ khối lượng (Positive) của acid shikimic

Phụ lục 4. Phổ 1H-NMR của acid shikimic

Phụ lục 5: Phổ 13C-NMR của acid shikimic