MEDIOS DE CULTIVOS Y CLASIFICACIÓN Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observ observar ar su crecim crecimien iento to en sustan sustancia ciass alime alimenti ntici cias as artif artifici iciale aless prepar preparada adass en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 1. medios de cultivo diferentes. !ara que las bacterias cre"can adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son# temperatura$ grado de humedad y presión de o%&geno adecuado$ as& como un grado correcto de acide" o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar e%ento de todo microorganismo contaminante. 'a mayor&a de las bacterias patógenas requieren nutrientes comple(os similares en composición a los l&quidos orgánicos del cuerpo humano. !or eso$ la base de muchos medios de cultivo es una infusión de e%tractos de carne y !eptona a la que se a)adirán otros ingredientes. ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se lic*a completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a + grados. Con m&nimas e%cepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en ,l. En los los dife difere rent ntes es medi medios os de cult cultiv ivo o se encu encuen entra tran n nume numero roso soss mate materi rial ales es de enriquecimiento como hidratos de carbono$ suero$ sangre completa$ bilis$ etc. 'os hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales# para incrementar el valo valorr nutr nutrititiv ivo o del del medi medio o y para para dete detect ctar ar reac reacci cion ones es de ferm fermen enta taci ción ón de los los microorganismos microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se a)aden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.
CLASIFICACIÓN 'os medios de cultivo pueden clasificarse seg*n diferentes criterios$ pero los más importantes son aquellos que se basan en#
Su consistencia Su utilización Su composición Su oi!en
SE"#N SU ESTADO F$SICO %CONSISTENCIA&'
1- Medios l&quidos# Son los que se presentan en este estado$ denominándose por esta ra"ón caldos. El medio l&quido más utili"ado es el llamado caldo nutritivo$ compuesto principalmente de e%tracto de carne$ peptona y agua. Se utili"a fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración. - Medios sólidos# Se preparan a partir de los medios l&quidos$ agregándoles un agente gelificante. 'os más utili"ados son la gelatina y el agar. /elatina# Es una prote&na animal obtenida de los huesos. 0iene el inconveniente de que es hidroli"ada por muchas bacterias$ y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es ba(o lic*a a temperatura ambiente- ra"ón por la que no puede utili"arse para cultivos a 234C$ que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos. 5gar6agar#Es un pol&mero de a"*cares obtenido de algas marinas. 5pro%imadamente la mitad de todo el agar que se produce$ se utili"a en traba(o microbiológico$ por lo que es importante la ausencia de metales tó%icos. 2- Medios semisólidos# Se preparan a partir de los medios l&quidos$ agregando a ,stos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias
SE"#N SU UTILI(ACIÓN' 1- Medios comunes# Son aquellos que poseen los componentes m&nimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar com*n$ que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. 7tros representantes de este grupo son el agar triplicase de so(a$ el agar Columbia$ etc. - Medios de enriquecimiento# Son aquellos que$ además de las sustancias nutritivas normales$ incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos e%igentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos sangre$ suero$ leche$ huevo$ bilis$ etc.- que aportan dichos factores. En ocasiones es posible a)adir suplementos artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo. El gonococo$ por e(emplo$ necesita cistina y ciste&na para su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo agar chocolate-. 2- Medios selectivos# Son medios utili"ados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población poli microbiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una
población microbiana espec&fica. Un e(emplo de medio selectivo es el caldo selenito$ que se utili"a para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias. +- Medios inhibidores# Cuando las sustancias a)adidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana$ se denomina inhibidor. 'os medios inhibidores podr&an considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos. 'os medios inhibidores se consiguen habitualmente por adición de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. 8- Medios diferenciales# Se utili"an para poner en evidencia caracter&sticas bioqu&micas que ayuden a diferenciar g,neros o especies. 'a adición de un a"*car fermentable o un sustrato metaboli"able se utili"an para este fin. El medio MacCon9ey es un medio diferencial porque permite distinguir los g,rmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. 0ambi,n lo son el C.'.E.:. lactosa ;ligler$ el medio de Simmons y en general$ cualquier medio al que se le haya a)adido un elemento diferencial de un microorganismo$ son medios utili"ados en identificación. 3- Medios de multiplicación# Sirven para obtener una gran cantidad de c,lulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtención de vacunas$ en la investigación y en la industria. 'os medios más adecuados para la multiplicación suelen ser l&quidos. El caldo6infusión cerebro6cora"ón ?@A-$ es un e(emplo t&pico de estos medios. B- Medios de conservación# Se utili"an para conservar una cepa que$ por diversas ra"ones nos interese mantener. undamentalmente se utili"an como controles de calidad de las pruebas y reactivos utili"ados en el laboratorio de Microbiolog&a. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas# a- haciendo pases periódicos de placa a placa$ b- mediante liofili"ación de una suspensión bacteriana$ y c- congelando las cepas en leche descremada est,ril al $1D. - Medios de transporte# Se usan para el transporte de muestras cl&nicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Su utili"ación debe hacerse
introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio generalmente en un tubo-.
ATENDIENDO A SU COM)OSICIÓN' Seg*n las sustancias que entren a formar parte en su composición$ los medios de cultivo pueden ser clasificados en# 1- Medios comple(os# ueron los primeros utili"ados$ y los más empleados se preparan a partir de te(idos animales$ y más raramente de vegetales. Su composición no es e%actamente definida$ y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones e%perimentales$ donde la reproductibilidad no podrá ser e%acta. En la práctica corriente estos medios dan e%celentes resultados y son los más empleados. - Medios sint,ticos# Son aquellos que contienen en su composición e%clusivamente sustancias qu&micas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas$ resultando un medio de composición perfectamente definida. 2- Medios semisint,ticos# El gran n*mero de factores de crecimiento e%igidos para ciertos g,rmenes hace que la fabricación de un medio sint,tico para estos g,rmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento ba(o la forma de un e%tracto orgánico comple(o e%tracto de levadura$ e%tracto de te(idos$ etc.-.Ciertos g,rmenes no crecen en ning*n medio por muy enriquecido que est, ,ste$ haci,ndolo e%clusivamente en c,lulas vivas con unas caracter&sticas determinadas. E(emplos de este tipo son$ aparte de los virus$ las Chlamydias$ Fic9ettsias$ etc.
SE"#N SU O*I"EN+ a- G50UF5'ES# son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser e%tractos de te(idos o infusiones y cuya composición qu&mica no se conoce e%actamente. b- SAG0H0AC7S# son los medios que contienen una composición qu&mica definida cualitativamente y cuantitativamente. Se utili"an para obtener resultados reproducibles . c- SEMASAG0H0AC7S son los sint,ticos a los que se les a)aden factores de crecimiento ba(o una forma de un e%tracto orgánico comple(o$ como por e(emplo e%tracto de levadura.
M,TODOS DE ESTE*ILI(ACION Se denomina esterili"ación al proceso por el cual se obtiene un producto libre de microorganismos viables. El proceso de esterili"ación debe ser dise)ado$ validado y llevado a cabo para asegurar que es capa" de eliminar la carga microbiana del producto o un desaf&o más resistente. :ado que la esterilidad no puede demostrarse de manera absoluta sin causar la destrucción completa de todas las unidades del lote de producto terminado$ se define la esterilidad en t,rminos probabil&sticos$ en donde la probabilidad de que una unidad de producto est, contaminada es aceptablemente remota. Se considera que un producto cr&tico es est,ril cuando la probabilidad de que un microorganismo est, presente en forma activa o latente es igual o menor de 1 en 1.. coeficiente de seguridad de esterilidad 1I6=-. 'os m,todos t,rmicos de esterili"ación son com*nmente los más utili"ados para eliminar los microorganismos$ incluyendo las formas más resistentes como lo son las endoesporas.
M-to.os /u0micos Estos m,todos provocan la perdida de viabilidad de los microorganismos. Con o%ido denetileno# Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrógenos lábiles como los que tienen grupos carbo%ilos$ amino$ sulfhidrilos$ hidro%ilos$ etc. Es utili"ado en la esterili"ación gaseosa$ generalmente en la industria farmac,utica. :estruye todos los microorganismos incluso virus. Sirve para esterili"ar material termosensibles como el descartable goma$ plastico$ papel$ etc.-$ equipos electrónicos$ bombas cardiorrespiratorias$ metal$ etc. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y e%plosivo$ y además cancerigeno.
Con al.e10.os+ Son agentes alquilantes que act*an sobre las prote&nas$ provocando una modificación irreversible en en"imas e inhiben la actividad en"imática. Estos compuestos destruyen las esporas.
"lutaal.e10.o+ Consiste en preparar una solución alcalina al D y sumergir el material a esterili"ar de a 2 minutos$ y luego un en(uague de 1 minutos. Este m,todo tiene la venta(a de ser rápido y ser el *nico esterili"ante efectivo fr&o. !uede esterili"ar plástico$ goma$ vidrio$ metal$ etc.
ormaldeh&do# Se utili"an las pastillas de paraformaldehido$ las cuales pueden disponerse en el fondo de una ca(a envueltas en gasa o algodón$ que despu,s pueden ser e%puesta al calor para un rápida esterili"ación acción del gas formaldeh&do-. 0ambi,n pueden ser usadas en Estufas de ormol$ que son ca(as de doble fondo$ en donde se colocan las pastillas y se calienta hasta los =J C y pueden esterili"ar materiales de láte%$ goma$plásticos$ etc. 'as pastillas de formalina a temperatura ambiente esterili"an en 2= hs. Esterili"ación por gas6plasma de !eró%ido de @idrógeno Es proceso de esterili"ación a ba(a temperatura la cual consta en la transmisión de peró%ido de hidrógeno en fase plasma estado entre l&quido y gas-$ que e(erce la acción biocida.
)osee como 2enta3as+ Go de(a ning*n residuo tó%ico. Se convierte en agua y o%&geno al final del proceso. El material no precisa aireación. El ciclo de esterili"ación dura entre 8+ y 38 minutos. Des2enta3as+ Go se pueden esterili"ar ob(etos que contengan celulosa$ algodón$ l&quidos$ humedad$ madera o instrumental con l*menes largos y estrechos. Es el m,todo de esterili"ación más caro de entre los descritos.
M-to.os 40sicos Calo 'a utili"ación de este m,todo y su eficacia depende de dos factores# el tiempo de e%posición y la temperatura. 0odos los microorganismos son susceptibles$ en distinto grado$ a la acción del calor. El calor provoca desnaturali"ación de prote&nas$ fusión y desorgani"ación de las membranas y
T7n.alización Esterili"ación por acción discontinua del vapor de agua$ se basa en el principio de 0yndalL 'as bacterias que resisten una sesión de calefacción$ hecha en determinadas condiciones$ pueden ser destruidas cuando la misma operación se repite con intervalos separados y en varias sesiones. Se efect*a por medio del autoclave de Chamberland$ de(ando abierta la válvula de escape$ o sea funcionando a la presión normal. !uede tambi,n reali"arse a temperaturas más ba(as$ 8=4 u B4 oc*para evitar la descomposición de las sustancias a esterili"ar$ por las temperaturas elevadas. Venta3as .el calo 16me.o+ Fápido calentamiento y penetración :estrucción de bacterias y esporas en corto tiempo Go de(a residuos tó%icos @ay un ba(o deterioro del material e%puesto Económico Des2enta3as+ Go permite esterili"ar soluciones que formen emulsiones con el agua Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metálicos Calo seco+ El calor seco produce desecación de la c,lula$ es esto tó%icos por niveles elevados de electrolitos$ fusión de membranas. Estos efectos se deben a la transferencia de calor desde los materiales a los microorganismos que están en contacto con ,stos. 'a acción destructiva del calor sobre prote&nas y lipidos requiere mayor temperatura cuando el material está seco o la actividad de agua del medio es ba(a.
Estu4as :oble cámara$ el aire caliente generado por una resistencia$ circula por la cavidad principal y por el espacio entre ambas cámaras$ a temperatura de 134 C para el instrumental metálico y a 1+4 C para el contenido de los tambores. Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal$ que al dilatarse por el calor$ cortan el circuito el,ctrico. Venta3as .el calo seco+ Go es corrosivo para metales e instrumentos. !ermite la esterili"ación de sustancias en polvo y no acuosas$ y de sustancias viscosas no volátiles. Des2enta3as+ Fequiere mayor tiempo de esterili"ación$ respecto al calor h*medo$ debido a la ba(a penetración del calor. Fadiaciones Su acción depende de# El tipo de radiación
El tiempo de e%posición 'a dosis Ionizantes+ !roducen iones y radicales libres que alteran las bases de los ácidos nucleicos$ estructuras proteicas y lip&dicas$ y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.0ienen gran penetrabilidad y se las utili"a para esterili"ar materiales termolábiles termosensibles- como (eringas descartables$ sondas$ etc. Se utili"an a escala industrial por sus costos.
*a7os Ulta2ioletas+ 5fectan a las mol,culas de :G5 de los microorganismos. Son escasamente penetrantes y se utili"an para superficies$ se utili"an para la esterili"ación en quirófanos.
*a7os "amma+ Su empleo esta basado en los conocimientos sobre la energia atomica. Este tipo de esterili"ación se aplica a productos o materiales termolábiles y de gran importancia en el campo industrial. !uede esterili"ar antibióticos$ vacunas$ alimentos$ etc.
Filtación Se usan membranas filtrantes con poros de un tama)o determinado. El tama)o del poro dependerá del uso al que se va a someter la muestra. 'os filtros que se utili"an no retienen virus ni micoplasmas$ estos *ltimos están en el l&mite de separación seg*n el diámetro de poro que se utilice. 'a filtración se utili"a para emulsiones oleosas o soluciones termolábiles. Su usa para esterili"ar aceites$ algunos tipos de pomadas$ soluciones oftálmicas$ soluciones intravenosas$ drogas diagnósticas$ radiofármacos$ medios para cultivos celulares$ y soluciones de antibióticos y vitaminas.
E8isten tes tipos 9:sicos .e 4iltos+ iltros profundos o iltros de profundidad# Consisten de un material fibroso o granular prensado$ plegado$ activado$ o pegado dentro de los canales de flu(o. En este tipo de filtros la retención de las part&culas se produce por una combinación de absorción y de retención mecánica en la matri". Mem9anas 4iltantes+0ienen una estructura continua$ y la retención se debe principalmente al tama)o de la part&cula. !art&culas más peque)as al tama)o del poro quedan retenidas en la matri"a del filtro debido a efectos electrostáticos.
