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Amperometria L'amperometria si basa su misurazioni dì corrente: in modo più specifico, viene misurata la corrente che passa attraverso due elettrodi, posti in una soluzione agitata, tra cui viene applicata una differenza di potenziale fissata, causando l'ossidazione o la riduzione dell'analita. Le determinazioni amperometriche dipendono dalla misurazione quantitativa della corrente limite. La ragione per la quale è possibile condurre un'analisi quantitativa mediante amperometria è che la corrente limite è direttamente proporzionale alla concentrazione della specie che si sta ossidando o riducendo all'elettrodo di lavoro. i L =
costante x concentrazione dell'analita elettroattivo.
La costante viene determinata con il ricorso a soluzioni standard 1
La corr corren ente te limi limite te mis misurat urata a ne nell lla a ridu riduzi zion one e elet elettr troc ochi himi mica ca dell de ll'a 'ana nali lita ta o in con ondi dizi zion onii cont contro roll llat ate e da dall pu punt nto o di vist vista a idrodinamico, ossia in condizioni di diffusione conv convet ettiv tiva, a, pu può ò esse essere re espr espres essa sa come: come: i l = nFAm o c o
dove m 0 è il coefficiente di trasporto di massa, che è dipendente dalla velocità di flusso, e co è la concen concentra trazio zione ne di ana analita lita..
In amperometria la soluzione è in movimento e lo spessore dello strato di diffusione è costante quin quind di si osse osserv rva a una una corr corren ente te di stat stato o staz stazio ion nario ario che che non non dipe dipend nde e dal dal temp tempo. o.
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Le applicazioni più importanti della amperometria si riferiscono a: • Rivelazione e determinazione di composti eluiti da una colonna cromatografica • Determinazioni di routine di ossigeno, e specie di interesse biochimico • Studi di processi elettrochimici • Determinazione del punto finale di titolazioni.
I metodi di titolazione si dividono in: 1. Titolazioni con elettrodo polarizzabile 2. Titolazioni con due elettrodi polarizzabili 3 (biamperometriche/bipotenziometriche).
Rivelazione e determinazione di composti eluiti da una colonna cromatografica
Volume di cella 0.1-1 µl Tra l’elettrodo di lavoro di metallo o di carbone vetroso e l’elettrodo di riferimento ad Ag/AgCl si applica il potenziale corrispondente alla corrente limite per la specie da analizzare
Limite di rivelabilità 10-9-10-10 M 4
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1) Elettrodi SCREEN PRINTED
Basso costo Semplice e facile da produrre Adattabile ad una produzione di massa 8
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Potentiostat - Galvanostat PG580 from Uniscan Instruments
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Strumento e sensore portatili 0.8 cm
m c 5 . 4
Graphite-based working electrode 11
AMPEROMETRIA: Elettrodo ad ossigeno.
E’ una cella completa. L’Ossigeno diffonde attraverso la membrana e si riduce al catodo di platino. L’anodo (coil) è un elettrodo di riferimento Ag/AgCl.
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Biosensore amperometrico per la misura di H2O2
H2O2 si ossida all’elettrodo di Pt applicando un potenziale di +0.6 V vs. Ag/AgCl: H2O2 = O2 + 2H+ + 2e-
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DEFINIZIONE DI BIOSENSORE Un biosensore è un dispositivo analitico che incorpora un elemento di riconoscimento biologico (o di derivazione biologica) integrato o intimamente associato ad un trasduttore di segnale chimico-fisico. Lo scopo del biosensore è quello di produrre un segnale elettronico, discreto o continuo, proporzionale alla concentrazione di un singolo analita o gruppo di analiti. Daniel R. Thevenot, Klara Toth, Richard A. Durst, George S. Wilson Biosensors & Bioelectronics 16 (2001) 121–131
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Un’area di ricerca ‘calda’ 2000 i t a c i l b u p i r o v a L
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
primo biosensore di Clark
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0 6 5 7 0 7 5 8 0 8 5 9 0 9 5 0 0 6 9 9 1 9 1 9 1 9 1 9 1 9 1 9 2 0 1 1
E’ previsto un ulteriore aumento di lavori data la crescente importanza delle nano - e biotecnologie
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Meccanismo di un Biosensore Soluzione
NO RICOGNIZIONE RICOGNIZIONE
e r o t t e c e R
e r o t t u d s a r T
NO Segnale Misurabile Segnale Misurable
Sottile membrana selettiva =Analita
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Cosa hanno in comune? Biosensore
Analita/biorecettore/trasduttore/processore di segnale
Naso
Piccole molecole/membrana olfattiva/cellule nervose/cervello
Occhi
Luce Visibile /bastoncelli e coni/ cellule nervose/cervello 18
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Aree di Applicazione • medica glucosio, alcool, DNA, RNA, proteine, ormoni, aspirina, paracetamolo, penicillina
• bioprocessi industriali amminoacidi, lieviti, acido lattico, etanolo, etc.
• ambientale pesticidi, fertilizzanti, sostanze estrogeniche, CO, CO 2
• difesa/forense antrace, ricina, agenti nervini, TNT, cocaina 19
Il primo ed ancora più importante biosensore: glucosio biosensore: glucosio • Diabete di tipo 1: incapacità di produrre l’ insulina • Glucosio non può essere convertito in glicogeno per essere conservato nel corpo • Il primo biosensore per glucosio fu realizzato da Clark nel 1960 • 50% della ricerca attuale nel campo dei biosensori è sui sensori a glucosio • Il mercato dei test per glucosio è il più esteso 20
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Sensore per glucosio di Clark del 1960 Glucosio
Acido Gluconico
Glucosio Ossidasi Ossigeno
Acqua ossigenata O2
5.4 mM
H2 O 2 2H+, 2e-
ELETTRODO 21
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GENERAZIONI DI BIOSENSORI
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Sensori basati su mediatori Sensori amperometrici indipendenti dall’O 2 utilizzano composti a basso peso molecolare detti mediatori che si sostituiscono all’O2 e trasportano elettroni dal centro di ossido-riduzione degli enzimi alla superficie dell’elettrodo. Tornando alla reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi, la riossidazione del FADH2 viene effettuata dal mediatore secondo la reazione:
Enzima-FADH2 + Med ox
→
Enzima-FAD + Med rid + 2 H +
il mediatore ridotto si riossida all’elettrodo di lavoro:
Med rid
→
Med ox + 2e-
La riossidazione del mediatore genera un segnale di corrente che viene registrata da uno strumento connesso agli elettrodi. Nel caso del ferrocene il potenziale al quale avviene l’ossidazione è <500 mV (vs.Ag/AgCl); tale potenziale è sufficiente a da ridurre le interferenze da parte di composti elettroattivi che possono essere presenti nel campione. L’uso del mediatore consente inoltre di avere delle curve di calibrazione indipendenti dalla concentrazione di O2 in soluzione, e questo, vista la scarsa solubilità dell’ossigeno in acqua, determina un’espansione dell’intervallo di linearità della 24 risposta.
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II GENERAZIONE DI BIOSENSORI
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More than 33 different meters are commercially available from 11 companies. They differ in several ways including:: •Amount of blood needed for each test •Testing speed •Alternative site •Overall size •Ability to store test results in memory •Cost of the meter •Cost of the test strips used
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