5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Curs BIOSENSORI Introducere Ce este un biosensor? Definitia unui biosensor Proiectarea si constructia biosenzorilor; Principiul de functionare Principiul detectiei *Detectia electrochimica Clasificare Componentele biosensorului Exemple de electrozi enzimatici din generatia a I-a Electrozi enzimatici din generatia a II-a Electrozi enzimatici bazati pe enzime FAD-dependente Electrozi enzimatici bazati pe enzime NAD-dependente
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
1/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
• Notiuni de voltametrie ciclica • Electrozi chimic modificati • Mediatori redox
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
2/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Ce este un biosensor?
Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalul biochimic intr-un semnal -electric, optic, termic sau mecanic- masurabil (cuantificabil)
Analiti
Bioreceptor Traductor (catalitic fizico-chimic afinitate)
Componenta electronica
Reprezentarea schematica a unui biosenzor http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
3/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
4/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Ce au in comu n? Biosensor
Analit / bioreceptor / traductor / procesor
Nas
Molecule mici / membrana olfactorie / celule nervoase / creer
Ochi
Lumina / bare si conuri / celule nervoase / creer
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
5/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor Un biosensor este un instrument analitic constand dintr-un component biologic imobilizat, responsabil pentruadecvat. recunoasterea selectiva a speciei de analizat, aflat in contact intim cu un traductor
Interactie “cheielacat“
Analati
METABOLITI, IONI, GAZE VAPORI ORANICI
ENZIME, ANTICORPI ORGANITE, CELULE
Etapa generarii semnalului BIOCOMPONENT
Transmiterea
semnalului
TRADUCTOR
ELECTROCHIMIC, OPTIC CALORIMETRIC PIEZOELECTRIC
Amplificare si procesare
Interactia specifica de bioafinitate (ex. “lacat-cheie”) dintre analit de determinat si elementul de recunoastere conduce la o modificare fzico-chimica, care este detectata de traductor, masurata si procesata adecvat. http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
6/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Principiul Detectiei
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Masoara modificari de
masa
Masoara modificari de
distributie electrica
Masoara modificari de
intensitate luminoasa
Masoara modificari de
caldura
7/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinat in cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei
§Poate
fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil)
§“Disposable”
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
(de unica folosinta)
8/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
CLASIFICAREA BIOSENSORILOR Functie de:
Elementul de recunoastere moleculara
Tipul traductorului
Reactiile monitorizate ex. redox hidroliza
Speciile monitorizate
Monitorizare directa a
Monitorizare indirecta a
-concentratiei de analit -reactiilor in care se consuma
Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de recunoastere biologica
sau se produc substrate noi
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
9/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Diferitele categorii de biosensori
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
10/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
TRADUCTORUL BIOMOLECULAR (asigura selectivitatea biosenzorului)
Avantaje
si
Dezavantaje
Enzime Sinzime
Selectivitate mare
activitate
Stabilitate limitata
Sisteme mutienzimatice
Cresterea posibilitatilor de imobilizare, marirea gamei de compusi detectabili
Cresterea interferentelor, probleme legate de optimizarea conditiilor de lucru
Tesut animal sau vegetal
Simplitatea constructiei biosenzorului, marirea gamei de compusi detectabili
Cresterea interferentelor si a timpului de raspuns al biosenzorului
Microorganisme
Varietate mare, simplitatea constructiei, posibilitati de regenerare
Selectivitate redusa, mare de raspuns
Selectivitate mare Relative ieftini
Cost ridicat Selectivitate limitata
selectivi
instabili
Organite celulare
timp
Anticorpi monoclonali policlonali Acizi nucleici Aptameri Receptori celulari Receptori sintetici
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
11/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
TRADUCTORUL FIZICO-CHIMIC (asigura sensibilitatea biosenzorului)
Electrochimic
Modul de masurare (marimea masurata)
Potentiometric (potentialul)
Avantaje
Dezavantaje
Domeniu mare de raspuns; instrumentatie simpla
Variatie logaritmica a raspunsului; selectivitate limitata Posibile interferente
Amperometric (curentul) Impedimetric (impedanta)
Variatie liniara raspunsului
a
Coductometric
Conductivitatea (conductanta)
Pret de cost scazut
neselectivi
Optic/optoelectronici (absorbanta, fluorescenta, luminiscenta, unda
Optic fibre optice
Dimensiuni mici, raspuns rapid, maresc domeniul compusilor detectabili
Instrumentatie speciala, probleme in cazul solutiilor tulburi
Dimensiuni reduse
Raspuns lent
Simpli, liniar
Neselectivi, dificultati de lucru in faza gazoasa
evanescenta) Piezoelectric Termistor
Modificari de (frecventa)
masa
Calorimetric/termometric (caldura/temperatura)
raspuns
Magnetic
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
12/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Componentele biosensorului •
Bioreceptor care costa dintr-o biomolecula ex. enzime, anticorpi, acizi nucleici care recunoaste un analit specific;
•
Traductor care converteste etapa de recunoastere intr-un semnal masurabil;
•
Procesarea semnalului
Elementele biosensorului
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
13/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
1. Analit (substrat)
Tipul/natura: biologic, chimic (chiar anaorganic) Microbi (antrax, E.coli, Candida, Salmonella) Molecule mici (glucoza, alcool, CO, CO2, uree, pesticide, aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, amino acizi)
Bio-macromolecule (AND, ARN, enzime, proteine, hormoni, virusuri)
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
14/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Anticorp
Acizi nucleici
Receptori proteici
FAD din Gox
Selectivittate/ stabilitate Receptori biochimici Organisme Tesuturi Cellule Organite
Enzime Anticorpi Acizi nucleici Chemoreceptori
Membrane http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
15/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Membrana este un amestec de proteine si alte molecule imbibate in matricea fluida a dublului strat lipidic Glicoproteine
Fluid extracelular
Glicolipide
Fosfolipide Colesterol Proteina periferica
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Citoplasma
Proteine transmembranare Filamentele citoscheletului 16/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Functiile Proteinelor Membranare Exterior Membrana plasmatica Interior
Transportor
Activitate enzimatica
Marker de suprafata Adeziune celulelor de identificare http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Receptor celular de suprafata
Atasare de citoschelet 17/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC
ØStabilitate ØPret ØNecesitatea
mica a biomoleculelor
de cost ridicat pentru enzime si receptori
adaugarii unor compusi suplimentari (ex. Oxigenul, cofactori)
ØProbleme
legate de imobilizarea biocomponentilor
ØPerformante ØCompatibilitate
scazute in medii neapoase
scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in
dificultati legate de proiectarea multisenzorilor ØDimensiunile moleculare
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
18/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Biosensorul ideal • Sensibilitate mare • Selectivitate mare • Timp de raspuns si revenire rapid • Pret de cost scazut • Usor de utilizat
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
19/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Dializa
Receptor
Traductor
® ® ®
Prima generatie
MEMBRANA
A doua generatie
Componenta electronica
SENSOR
® ® ® SENSOR MODIFICAT BIOCHIMIC
A treia generatie
® ® ® Biochip
Generatiile de biosensori. R - receptor
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
20/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Electrozi enzimatici
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
21/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
BIOSENSORII au fost clasificati functie de modul de transfer de electroni dintre enzima si electrod in 3 generatii
La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometric biosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cu concentratia compusului de analizat
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
22/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Domeniul optim de potential: - 200 si 0,0 mV
*curenti de baza mici, zgomot redus *nu are loc reducerea oxigenului *interferente minime datorate oxidarii acidului ascorbic acidului uric paracetamol, etc
3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
23/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Oxido- reductazele “enzimele redox” reprezinta o clasa bine cunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor
Transfer de electroni S
Enzox
e
-
electrod P
Enzred
Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal de utilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transfer direct de electroni cu suprafata electrodului A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
24/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Prima generatie
3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
25/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Electrod enzimatic
Solutie de analit
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Strat bio- activ
Traductor ectrochimica
26/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Inventator Leland C. Clark Jr.
Electrodul de oxigen a stat la baza Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956) Ann. NY Acad. Sci. 102, 29-45 (1962).
in 2005 a obtinut Premiul Fritz J. and Dolores H. Russ.Foto realizata cu aceea ocazie
“constructiei unor sensori electrochimici mai inteligenti prin fixarea unei enzime”
GOx β − D − glucoza + O2 → δ − D − glucono - lactona + H2 O2
Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967)
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
27/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Biosensorul pentru glucoza
Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt Reactia enzimatica Glucoza Glucozoxidaza + O2
S
Glucolactona + H 2O2
E E
H 2O2
H 2 O2
Reactia electrochimica 2 H + + O2 + 2 eE > + 0,6 V
H2O2 formata difuzeaza atit
cit si spre
in afara membranei spre solutie
suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic FG.G. FS.J.
Guilbault, G.J. Lubrano, Anal.Chim.Acta, 60 (1972) 254
Updike, G.P. Hicks, "The Enzyme Electrode", Nature, 214, 1967
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
28/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Exemple de biosensori din prima generatie METABOLIT PRODUS ELECTROACTIV Reactia Substrat + O2
ENZIMA
PRODUS ELECTROACTIV
SENZOR electrochimic Enzima
VARIATIE SEMNAL ELECTRIC Produs + H2O2
(oxidaza)
Glucoza + O2
E1
acidul gluconic + H2O2
E2
Lactatul + O2
Piruvat + H2O2 hidrolaza
Urea
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
ureaza
-
HCO3 +
+ NH4
29/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
30/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
BIOSENZORI CLASICI (prima generatie) DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FI DETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI
METODA
SENZOR
Dom. Conc. mol/l
Potentiometrie
H+, Na+, CN-, NH4+, I-
10-5 – 10-2
Amperometrie
Pt/H2O2
10-7 – 10-3
Sensor de gaz potentiometric
NH3, CO2
10-4 – 10-2
Sensor de gaz amperometric
Oxygen
10-5 – 10-4
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
31/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
PANCREASUL ARTIFICIAL
POMPA ANALITICA
ANALIZA
INJECTAREA INSULINEI
COMPUTER
GLUCOZEI
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
32/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
INJECTAREA INSULINEI
0,5 C B ) A n ( I
0,3
A ASIMILAREA GLUCOZEI 360 mg/dL
0,1 0
15
30
TIMP (minute)
SEMNALUL DAT DE UN SENZOR PENTRU GLUCOZA IN TIMPUL VARIATIEI DE GLUCOZA INTR-UN SOARECE ANESTEZIAT A = MASURAREA GLUCOZEI INITIALE B = MASURAREA GLUCOZEI DUPA ASIMILAREA DE GLUCOZA C = MASURAREA GLUCOZEI IN URMA INJECTARII DE INSULINA
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
33/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Biosensor pentru determinarea alcoolului
El are la baza un sensor amperometric de Pt pentru H 2O2 acoperit cu o membrana continind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gaz permeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile. Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila si reactioneaza cu enzima conform ecuatiei:
AOx
Alcool + O2 H2O2 + Acetaldehidea Aox = alcool oxidaza H2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
34/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Etanol
Acetaldehidă
ADH
NAD+
ADH=alcool dehidrogenaza
NADH + H+
Detecţie la 340nm
Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului
Concentraţia de NADH creşte proprorţional cu cea a etanolului. NADH-ul este determinat pe baza absorbanţei lui la 340nm
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
35/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
• exemplu reprezentativ de steroid • component esential in membranele celulare animale •
precursor in biosinteza tuturor steroizilor, hormonilor, a vitaminei D etc.
• stocat in celule sub forma unui ester a acizilor grasi
Valori normale: colesterol liber- 1,29-2,07 mM colesterol total- 3,36-6,47 mM
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
36/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Reactia catalizata de enzima •
Colesterol oxidaza (COx) Colesterol
+
O2
COx
Colesterol-4-en-3-ona
+ H2O2
Reactia bioelectrochimica de detectie a colesterolului
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
37/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
C OXIDAZE
-
acceptorul natural de e O2
Dezavataje:
solubilitate limitata a O2 H2O2 denatureaza enzima H2O2 poate reationa cu alte substante din solutie species Eappl > -600mV +
-
2OH-
O2 + 2H + 4e
C Electrodul Clark dezavanaje:
masoara scaderea semnalului (semnal de baza mare) Supra-potential Eappl > +600mV
H2O2
C dezavantaje:
O2 + 2H+ + 2e-
supra-potential raspunsul electrodului nu este stabil
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
38/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Prima generatie de biosensori
Oxidarea electrochimica a H2O2 la suprafata electrozilor conventionali are loc la valori de potentiale ≥ + 600 mV fata de Ag|AgCl •Sistemul este supus unor reactii de interferenta •Raspunsul nu este stabil in timp
Electrochimia O2 si H2O2 sufera de aplicarea unor valori mari de potentiale = suprapotentiale
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
39/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
I. Probleme in electrochimia proteinelor • Existenta unor viteze mici cu transfer de electroni cu
sau in interiorul proteinelor (viteza transferului de electroni reprezinta etapa limitativa de viteza ). Ø
necesara realizarea unei orientari speciale proteina-electrod
• Adsorptia la suprafata electrodului Ø
proteinele trebuie sa fie de puritate analitica
(!!) Ambele fenomene impun necesitatea modificarii suprafatei de electrod
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
40/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
ADSORBTIA ORIENTATA A PROTEINELOR REDOX LA SUPRAFATA ELECTRODULUI MODIFICAT CU PROMOTOR
M. J. Eddowes, H.A.O. Hill, J. Am. Chem. Soc., Chem. Commun., 771-772 (1977).
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
41/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
TIOLI FOLOSITI CA PROMOTORI PE Au
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
42/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
EFECTUL Promotorilor ASUPRA ENZIMEI E
cresterea stabilitatii operationale si pe termen lung a enzimei in pasta E
E
imbunatatirea cineticii enzimatice
produce legarea corecta a enzimei redox pe suprafata electrodului, facilitand transferul direct de electroni
L. Guo and H. A. O. Hill, Direct Electrochemistry of Proteins and Enzymes , Adv. Inorg. Chem., 36 (1991) 341- 375.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
43/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Mono-straturi auto-asamblate (SAM) folosite in orientarea-reconstructia enzimelor
+ apo-HRP + hemina (si EDC) + diaminoalcani SAM mixte ex., Gox, GDH-PQQ
Refacerea HRP la suprafaţa unui electrod de aur modificat cu grupări tiol-heminice H. Zimmermann, A. Lindgren, W. Schuhmann, L. Gorton, Chem. Eur. J. 6 (2000) 592-599
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
44/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
II. Probleme in electrochimia proteinelor •
Difuzia lenta a proteinei Ø
•
trebuie utilizati transportori de electroni redox activi (mediatori).
Reactiile cu transfer de electroni (ET) sunt deseori cuplate cu transferul de protoni Ø
potentialele redox sunt puternic dependente de pH.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
45/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Elctrozi chimic modificati
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
46/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Electrozi chimic modificati
Llimitarile metodelor electrochimice în analiza şi sinteza chimica: - pasivarea electrodului datorită adsorbţiei sau depunerii pe suprafaţa acestuia a unor compuşi chimici sau a unor precipitate nedorite; - existenţa unor viteze de reacţie electrochimică mici pentru anumite specii chimice care în aceste condi ţii necesită aplicarea unui suprapotenţial pentru realizarea reacţiei.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
47/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
ELECTROZI CHIMIC MODIFICATI (CME)
Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentând o modificare raţionala intentionată a structurii moleculare a suprafe ţei electrozilor convenţionali în scopul utilizării lor în cadrul unor aplicaţii specifice
Electrozii chimic modificaţi (CMEs) se bazează pe fixarea unui centru redox (mediator) pe suprafaţa electrodului. Acesta funcţionează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni Spre molecula de substrat, care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafaţa unui electrod convenţional.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
48/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
(Bio)compozite / Integrate electroanalitice (bio)sisteme (Bio)sensori amperometrici bazati pe particule conductoare (bio)compozite
Electrozii chimic mo dificati (Chemosensori) Electrozii modificati biologic (Biosensori)
R
R R
R
TT
R
R
R
R
R Mo dificarea suprafetei R
Modificatori Electrocatalizatori Enzime Anticorpi ADN
T
Carbon Aur Platina
R
R
R
R R
R R
R
R R
Modificarea in masa “Bu lk” Biocompozite • moi/rigide
Compozite
S. Alegret, A. Merkoçi, M.I. Pividori, and M. del Valle. Electrochemical biosensors based on rigid conducting carbonpolymer composites. Encyclopedia of Sensors, vol. 3 (2006) pp 23-44
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
49/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Medred
SUBSTRATox
-
e
SOLUŢIE SUBSTRATred
Medox SUPRAFAŢA ELECTRODULUI
la interfaţa electrod modificat/soluţie
Mox +
Mred - ne-
Sred
La elctrod
Sox+Mred
Mox
Reprezentarea schematică a unui CME si a reacţiei de electrod
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
50/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Reactiile chimice si electrochimice
Reactie omogena
Substrat Substrat Mediator Mediator oxidat oxidat
Produs Produs Mediator Mediator redus redus
Reactie heterogena
Electrod M. Sadakane, E. Stechkhan, Chem. Rev ., 98 (1998) 219.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
51/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de câte ori viteza directă a transferului de electroni este mică şi
la nivelul unui electrod convenţional este necesară aplicarea unui suprapotenţial
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
52/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Caracteristicile unui electrod chimic modificat ideal pentru aplicaţii analitice: -stabilitate mecanică şi chimică atât ale electrodului de bază cât şi ale grupării modificatoare, precum şi a legăturii dintre electrod şi acesta din urmă;
- stabilitate în timp a activităţii grupării modificatoare faţă de compusul de analizat;
- un domeniu larg de linearitate a răspunsului;
- curenţi de bază mici şi stabili pe domeniul de potenţial utilizat;
- compatibilitate cu o gamă largă de solvenţi apoşi şi organici;
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
53/120
5/13/2018
PROPRIETATILE MEDIATORILOR FOLOSITI IN CONSTRUCTIA BIOSENSORILOR biosensori-slidepdf.com
CPotentialul
formal apropiat de al biomoleculei, posibil in domeniul potentialului optim Si independent de pH; Celectrochimie CReactie
reversibila
rapida cu enzima redox
Cstoichiometrie CStabili CSa
a reactiei cu transfer de electroni bine definita (1 sau 2 electroni)
atit in stare oxidata cit si in cea redusa
nu se autooxideze
CSuficient de
solubili pentru a permite un mecanism de transfer (mediatori difuzionali)
sau CSolubilitate mica
in mediul inconjurator (mediatori imobilizati)
P. N. Bartlett, P. Tebbutt, R. G. Whitaker, "Kinetic Aspects Of The Use Of Modified Electrodes And Mediators In Bioelectrochemistry ", Progress in Reaction Kinetics, l6 (2), 1991
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
54/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Ralph Buzz Adams (1924 – 2002)
Electrod PC picurator
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Hidrofilizarea suprafetei de electrod realizata prin pretratarea oxidativa a suprafetei CPE
55/120
5/13/2018
De ce pasta de carbune? Ø Ø
biosensori-slidepdf.com
Domeniu de potential de lucru extins Valori mai scazute ale curentului de fond si ale zgomotului
Fmodificarea chimica
simplu de efectuat Fieftina
Fsuprafata electrodului usor reinnoibila Fposibilitatea fabricarii usoare de ultramicroelectrozi
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
56/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Pasta de carbune
Nanotuburi de Carbon -straturi cilindrice de grafit bi-dimensional
Structura grafitului
formate din hexagoane de atomi de carbon
SWNT Grupari functionale chinonice care pot fi prezente pe suprafata carbonului.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
MWNT
S. Iijima, Nature 354, 56 (1991) – MWNT S. Iijima, T. Ichihashi, Nature 363, 603 (1993) – SWNT
57/120
5/13/2018
DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI biosensori-slidepdf.com
a) depunerea unor metale nobile pe suprafata electrozilor de carbon Pt sau Pd/Au pe suprafata electrozilor de carbon •Electrozi de carbon platinizati •Depunere sub vid a Pd, Au pe grafit •Depunerea electrochimica a Pt, Rh pe carbon
Micsoreaza potentialul cu aprox. ≈200-300 mV
b) Folosirea altor materiale de electrod pentru oxidarea H2O2 Ni SnO2 TiO2
Stabilizeaza raspunsul fata de oxidarea H2O2 Micsoreaza suprapotentialul pentru oxidare al H2O2
F
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
58/120
5/13/2018
DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI biosensori-slidepdf.com
c)Inlocuirea oxigenului O2 cu un alt acceptor de e- (mediatori); ex. FEROCENUL
d)folosirea unor electro-catalizatori ex.metalo-ftalocianinele e) folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
59/120
5/13/2018
Electrozii chimic modificati bazati pe enzime biosensori-slidepdf.com
Combina trei etape selective Øenzima Ømediatorul ØPotentialul aplicat
Imobilizarea atit a enzimei redox cit si a mediatorului pe/in suprafata de electrod
Adaugarea doar a substratului UN SENSOR “REAGENTLESS” http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
60/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Voltametrie ciclică • Voltametria ciclică reprezintă o tehnică electrochimică fundamentală. Principial, aceasta constă în măsurarea curenţilor de electroliză în timpul baleajului ciclic al potenţialului electrodului de lucru faţă de un electrod de referinţă nepolarizabil, care operează la curent nul, în timp ce curentul de electroliză se scurge spre un contra-electrod.
A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods; Fundamentals and Applications , Wiley Interscience Publications, 2000.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
61/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Celula electrochimica
Cconstructie: -sticla pyrex - dimensiune variabila functie de volumul utilizat 2550 cm3 ; in cazul folosirii enzimelor volumul celulei este de 1cm3 -Orificiu barbotare gaz inert (ex. azot, argon, heliu)
Electrozi: Indicator (de lucru): metale nobile sau materiale carbonice Referinta (Ag/AgCl) Auxiliar (Pt)
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
62/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Instrumentatie
(BAS inc., USA)
Masuratorile electroanalitice sunt realizate cu potetiostate controlate prin intermediul unui calculator incluzand un software adecvat.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
63/120
5/13/2018
Tehnici electroanalitice de interogare abiosensori suprafetei-slidepdf.com de electrod Voltametria ciclica – informatii electroanalitice
Voltamograma ciclica redand parametrii de pic importanti
Parametrii importanti ai unei voltamograme ciclice sunt picurile de potential Ep si picurile de curenti ip.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
64/120
5/13/2018
Parametrii care caracterizează voltamograma ciclică a unui proces redox reversibil biosensori-slidepdf.com
•
separarea dintre potenţialele corespunzatoare picurilor anodice si catodice (Epa - Epc) este egală cu 0,059/n (mV) pentru toate vitezele de baleaj unde n este num ărul electronilor echivalenţi transferaţi în timpul procesului redox: ∆E=Epa -Epc =0.059/n (mV)
•
Prin experiente de voltametrie ciclica se poate determina valoarea potentialului formal de oxido-reducere(Ef) pentru un cuplu redox reversibil : Ef=(Epa+Epc)/2
•
raportul curenţilor de pic (ipa/ipc) este egal cu 1 pentru toate vitezele de baleaj. ipa /ipc =1
•
funcţia curentului de pic creşte liniar cu rădăcina pătrată a v (viteza de baleaj) – pentru un proces limitat de difuziune;
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
65/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Dependenta picurilor de curenti si de potential de viteza de baleaj poate fi redata prin graficul ip vs . (viteza de scanare)1/2 Un proces cvasi-reversibil este caracterizat de o ΔEp > 58/n mV, valoarea crescand cu cresterea n.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
66/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Transferul de electroni din cadrul biosensorilor Generatia a doua
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
67/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Transferul mediat de electroni intre o enzima redox si un electrod (pentru o reactie de oxidare)
3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 3 Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
68/120
Cei mai folositi mediatori ferrocenulbiosensori si derivatii-slidepdf.com acestuia
5/13/2018
S
Oxidaseox
Medred electrode -
P
Oxidasered
e
Medox
Biosensorul va opera la potentialul formal redox al mediatorului MECHANISMUL DE REACTIE β-D-Glucoza + E-FAD (Goxox)
E-FADH2
+
2Fe (Cp)2 R+
E-FADH2 + gluconic acid (Goxred)
E-FAD + 2Fe (Cp)2 R + 2H+
220mV vs Ag /AgCl 2Fe (Cp)2 R
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
2 Fe(Cp) R+ + 2e-
69/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Voltamograma ciclica pentru hidroxi-ferocen proces redox cu transfer de un electron conform schemei:
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
70/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
71/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
2Fc
2Fc2+
FAD
FADH2
glucoza
gluconolactona
volti Schema medierii in mediu omogen a reactiei de oxidare a glucoz oxidazei prin intermediul ferocenului. In figura se prezinta voltamogramele ciclice ale sistemului in prezenta unor concentratii crescatoare de glucoza. Datele au fost inregistrate la nivelul unui electrod de carbune sticlos. a) fara glucoza, b) 0,5 mmol dm-3 glucoza, c) 2,5 mmol dm-3 glucoza.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
72/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
DEHIDROGENAZE NAD+-dependente S
NAD+
MEDre
P
NADH
MEDox
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
73/120
Dehidrogenazele NAD+ dependente
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
reprezinta unele din putinele enzime care transfera direct electronii prin intermediul moleculei de cofactor (NADH)
(!)Problema: regenerarea cofactorului in urma transferului de electroni Realizata prin folosirea mediatorilor,fara degradarea cofactorului
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
74/120
5/13/2018
MEDIATORI SELECTIVI FOLOSITI PENTRU MICSORAREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului biosensori-slidepdf.com
O functionalitate de baza utilizata ca mediator
parafenilendiimina – prezinta o sarcina electrica
R-N
N
+
R R
++ prezinta viteze mari de reactie cu NAD(P)H nNu
este stabila redox
nGreu nE0'pH 7.0
de imobilizat
= + 200 mV vs SCE este destul de mare
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
75/120
5/13/2018
OXIDAREA ELECTROCHIMICA A NADH-ului LA SUPRAFATA UNUI ELECTROD CHIMIC MODIFICAT biosensori-slidepdf.com
0’
Para-fenilendiimina
prezentand sarcina +
domeniul optim de potentiale 0 and -100 mV vs SCE ≈
++ viteza de reactie mare cu NAD(P)H Interferente minime
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
76/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Mediatorii incarcati pozitiv par a fi utili (necesari) ØEi
prezinta viteze mari de reactie cu NADH ØNu
ØConduc ØSe
conduc la reactii secundare
la molecule de NAD+ enzimatic active
formeaza un complex cu transfer de sarcina intre NADH si mediator
ØCeea ce pare a fi o singura etapa cu transfer de
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
H- e un proces mult mai complicat
77/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
MEDIATORI FOLOSITI PENTRU SCADEREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului • MEDIATORI ORGANICI (neselectivi) • MEDIATORI SELECTIVI • NOI MEDIATORI ARTIFICIALI • PROTEINELE REDOX – MEDIATORI NATURALI
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
78/120
5/13/2018
I. MEDIATORI ORGANICI - neselectivi biosensori-slidepdf.com (structurile de baza pentru multi mediatori)
NMP + = N-metilfenazinium
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
TCNQ = tetracianochinodimetanide
79/120
5/13/2018
PARAMETERII CARE DETERMINA VITEZA DE REACTIE A MEDIATORULUI (constanta de viteza de ordinul II, k) CU ENZIMA biosensori-slidepdf.com
ØE0'
(potentialul formal)
log k ~ ∆E0' (in acord cu teoria lui Marcus) ∆E0' = (E0'mediator – E0'enzima)
Ønatura
mediatorului
(acceptor de 1e- sau de 2e- (H+))
Øsarcina
(ex. centrul activ al glucoz oxidazei este incarcat negativ)
Ødimensiunea
(mediatorul trebuie sa se potriveasca la dimensiunile si structura centrului activ)
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
80/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
OXIDAZELE SI DEHIDROGENAZELE CU COFACTORI LEGATI (FAD, FMN, PQQ, Cu) ambele pot utiliza mediatori care transfera 1 si 2 e- - (ne-acceptori de protoni si acceptori de protoni) = = = > transmiterea de 2 e- de la cofactorul legat redus spre mediator poate decurge sevential
Dehidrogenazele NAD(P)+ dependente (oxidarea NAD(P)H-ului) In cazul lor functioneaza numai acceptorii de 2 e- (si proton) care prezinta viteze mari de reactie = = = > ceea ce sustine ideea unei etape cu transfer a unui H- de la NAD(P)H la molecula acceptoare
PEROXIDAZELE functioneaza “orice" agent reducator (donor de e-)
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
81/120
5/13/2018
MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE biosensori-slidepdf.com
aceptori/donori 1 e-
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
vs
aceptori/donori 2 e--H+
82/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Diferente intre mediatorii acceptori/donori de 1 e- si 2 e-
acceptori/donori de 1 e-
acceptori/donori 2 e--H+
+E°’ nu variaza cu pH-ul
-E°’ variaza cu pH-ul
ionii H+ nu participa
participa 1-2 ioni de H+
+nu exista intermediari radicalici
-prezinta intermediari radicalici
reactie redox stabila
reactie redox instabila
-(!)viteze de reactie mici cu NADH
+ viteze de reactie mari cu NADH
-viteze de reactie moderate cu
+ viteze de reactie mari cu
peroxidazele
peroxidazele
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
83/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Generatia a III-a de biosensori
PEROXIDAZELE PQQ-DEHIDROGENAZELE http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
84/120
5/13/2018
ENZIME CU COFACTORI micsti
PEROXIDAZE
biosensori-slidepdf.com
Peroxidaze din plante
CHINOHEMOPROTEINE FLAVOHEMOPROTEINE
HRP, tutun, boabe de soia
Hemul
chinohemoproteine, PQQ
Peroxidaze din fungii Arthromyces ramosus cloroperoxidaze
Peroxidaze din drojdii citocrom c peroxidaze
Microperoxidaze
Plante Bacterii Ciuperci Tesuturi animale
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
- fructoz dehidrogenaza - alcool dehidrogenaza PQQ sau FAD
Hemul
flavohemoproteine, FAD - flavocitocromul b 2 - lactat dehidrogenaza - flavocitocromul c 552 - sulfit oxidaza - celobioz dehidrogenaza
85/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
86/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
87/120
5/13/2018
EXEMPLE DE ENZIME IMPLICATE ÎN BIOELECTROCATALIZĂ biosensori-slidepdf.com
PEROXIDAZA LACAZA CELOBIOZ DEHIDROGENAZA
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
88/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
1980 Yaropolov şi colab., au demonstrat capacitatea HRP de a cataliza reacţia de electro-reducere H2O2 F în
HRP +
-
H2O2 + 2H + 2e
2H2O
POD-ale prezinta activitate catalitică oxidând un număr mare de: Øpolifenoli Øpoliamine
şi
aromatice A.I.Yaropolov et al., Doklady Phys.Chem ., 249 (1980) 1077
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
89/120
Peroxidazele ≈ 40 enzime
enzime din clasa oxido-reductazelor
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
care contin feriprotoporfirina drept cofactor Cofactor Ü hemul COO
-
OOC
H2C
CH
CH2
H2C H3C
-
CH3
N
N Fe
H2C
N
C H
N CH3
H3C
C H
CH2
Feriprotoporfirina IX
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
PEROXIDAZELE
≈ 40 enzime
90/120
PEROXIDAZELE 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
3+
HRP=este nativa in stare ferica in (Fe ), oxidata, compusul I enzima si II=intermediari de reactie stare SH2 =substrat donor de electroni (sau mediatorul), SH* =radical liber care este produsul reactiei de oxidare a substratului, k1, k2 si k3=constatele de viteza ale reactiei.
P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
MECANISMUL DE RE-REDUCERE A PEROXIDAZEI
91/120
MECANISMUL DE RE REDUCERE A PEROXIDAZEI (revenire la starea nativa) POATE FI REALIZAT PRIN INTERMEDIUL
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
ELECTROZILOR (DET) SI/SAU AL MEDIATORILOR (MET)
k s -
+
3+
HRP (Fe ) + H2O (DET)
Compus I + 2e + 2H
(d)
Eappl (detectia H2O2) = 0,01 V vs. Ag/AgCl k s, m -
+
2 SH* + 2 e + 2 H
(MET)
2 SH2
(e)
k 1
3+
HRP (Fe ) + H2O2
IV
+
compus I (Fe =O, P •)+ H2O
(a)
k 2 IV
+
IV
Compus I (Fe =O, P •)+ SH2 → compus II (Fe =O)+ SH k 3 3+ * Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe ) + SH + H2O IV
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
*
(b) (c)
92/120
5/13/2018
Ciclul reactiei bioelectrocatalitice de reducere a H2O2 catalizata de HRP si de inactivare a acesteia biosensori-slidepdf.com
-
1e H2O2
-
forma nativa
-
2e
H2O
compusul – II
compusul – I
e
uzual neselectiv
-
1e
e d r o n o d a c l u d o r t c e l E
compousul – III (forma inactiva) exces de H2O2) selectiv
Enzima schimba direct electroni cu electrodul (electrodul substituie substratele donoare de electroni din ciclul obisnuit de reactie al HRP).
E. Csoregi si colab. J. Biotechnol. 30 (1993) 315
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Potentialul aplicat pentru detectia H 2O2 Eappl. = 0,01 V fata de Ag/AgCl la pH = 7,0; •Curenti de baza mici •Oxigenul molecular nu este redus •Interferente minime
93/120
MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
uzual neselectiv
2H+ +
Pinelul reprezinta un sau radical cationicpolipeptidica localizat pe porfirinic pe catena
compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata,
*ELECTROCHIMIC NU SE POATE FACE DIFERENTA INTRE COMPUSUL I SI II
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
94/120
MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
reactie electrochimca (b)
H2 O 2
H2 O
POD
k1
ks 2e-
H2 O
electrod
Cmp
0,0 mV / Ag/AgCl
2H+
reactie chimica (a)
experimental, observandu-se numai reactiile (a si b) redate schematic mai sus ks = viteza transferului de electroni dintre RDE si formele oxidate ale enzimei (avand unitatile s-1).
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
95/120
MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
HRP (Fe3+) + H2O2
compus I (FeIV=O, P+•)+ H2O k 2 IV + IV * Compus I (Fe =O, P •)+ SH2 → compus II (Fe =O)+ SH k 3 IV 3+ * Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe ) + SH + H2O
(a) (b) (c)
Compusi donori de electroni anilina
OH
NH2
fenolul OH
OH
NH2
NH2
OH
NH2
o-fenilendiamina
o-aminofenolul catecolul
p- fenilendiamina
NH2
OH
NH2
OH
I3
-
OH
p-aminofenolul
Fe(CN)6
NH2
4-
Mred si Mox sunt formele reduse si respectiv oxidate ale mediatorului
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
96/120
MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Mediatorul (SH 2 ) transporta electronii intre enzima si electrod. Donorul oxidat enzimatic (SH•) este redus de catre electrod.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
97/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
BIOSENSORI PE ADN PENTRU BAZATI DETECTIA AGENTILOR TOXICI
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
98/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
In ultimii ani, acizii nucleici (ADN sau ARN) au fost din ce in ce mai utilizati
in recunoasterea si monitorizarea multor compusi de importanta analitica (poluanti, substante toxice, medicamente anticancer, secvente patogene de acizi nucleici etc.) datorita, in principal: stabilitatii
si
mari
variabilitatii
foarte mari
a secventelor de acizi nucleici.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Structura ADN-ului
99/120
compozitia chimica 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
vADN-ul
consta din: Capat 5’ terminal
4 baze azotate: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T), si Citozina (C)
Legǎturi de hidrogen
Capat 3’terminal
Un rest de zahar (deoxiriboza) Grupare fosfat
T
A
S c h e l e t u l d e o x i r i b o z a f o s f a t
Capat 3’terminal
G purine
C pirimidine
Structura ADN-ului: dublu helix
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Capat 5’ terminal
Baze purinice: A,G Baze pirimidinice: C, T
100/120
5/13/2018
(complementar)
biosensori-slidepdf.com
ADN-ul prezinta o structura de elice dublu catenare cnstand din doua catene polinucleotidice care “merg” ele in directii opuse si care sunt mentinute impreuna prin legaturile de hidrogen dintre baze.
capatul 5’
capatul 3’ Dublul helix al ADN este constant datorită orientării bazelor spre interior şi a legăturilor de hidrogen dintre ele
Stabilitatea ADN-ului este data de
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
101/120
5/13/2018
biosensori -slidepdf.com Legaturile de hidrogen dintre bazele pereche care apar la intervale regulate de-a lugul axei ADN-ului;
Interactiile dintre bazele existente de-a lungul axei dublu elice Continutul, dimensiunea si ordinea bazelor; (cu cit continutul in G si C este mai mare cu atit molecula este mai stabilacresterea constantei de asociere)
Specificitatea ADN-ului este data de capacitatea nucleotidelor de a forma numai anumite perechi A-T si C-G
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
102/120
Structura ADN-ului: dublu helix (complementar) 5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Bazele sunt bine legate una deasupra alteia in asa fel incat santurile se intind pe intreaga suprafata a helixului.
Aceste caracteristici structurale, alaturi de complementaritatea perechilor de baze, au permis cercetatorilor sa realizeze o varietate de metode, de la simple la elegante pentru a determina cantitatea de ADN continuta intr-o anumita proba.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
103/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Coloranti: Bromura de etidiu Medicamente: Daunomicina , Adriamicina , Cloramfenicolul ,,, Poluanti: Proflavina , Antraciclina … Proteine: tirozina …
Proprietati ale ADN-ului: reactia de hibridizare
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
104/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
ADN-ul hibridizează prin împerecherea bazelor azotate
Recunoasterea intre secvente complementare este dependenta de formarea unor legaturi de hidrogen stabile intre cele 2 catene.
M.I. Pividori et al., Biosensors & Bioelectronics 15 (2000) 291.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
105/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
In cardrul reactiei de hibridizare legaturile de hidrogen apar la intervale regulate de lungul structurii ADN-ului, in timp ce legaturile Ag:Ac apar la nivelul unor centre specifice
Diferenta majora fata de reactia Ac-Ag – unde apar interactii de tip ionic, hidrfob si de hidrogen.
TEHNOLOGIA GENOSENSORILOR ARE APLICATII
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
106/120
5/13/2018
FUNDAMENTALE biosensori -slidepdf.com in INTELEGEREA BAZEI MOLECULARE A VIETII PRACTICE In MAPAREA GENETICA-ANALIZA SECVENTELOR DE GENE-la diferite organisme domeniu care contribuie la:
Evidentierea mutatiilor genetice cu rol in - identificarea unor organisme modificate genetic - identificarea unor agenti patogeni (bacterii, virusuri)
Elucidarea organizarii genomului uman
- stabilirea unor diagnosticari prenatale - identificarea unor gene asociate unor posibile boli (de inima, cancer, etc)
Elaborarea unor diagnosticari clinice timpurii si a unor terapii bazate pe modificarea genelor asociate diferitelor boli ereditare sau nu Detectia prezentei organismelor patogene/ infectioase in diferite medii (aer, apa,sol, alimente, plante, animale, tesuturi umane, etc) Modificarea genetica a diferitelor organisme Realizarea unor noi medicamente
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
107/120
5/13/2018
Detectia agentilor patogeni din alimente, mediu si de interes medical biosensori-slidepdf.com
Agentii patogeni responsabili pentru diferite maladii sau boli precum bacteriile si virusurile, sunt detectabili datorita secventei lor unice a ADN-ului
21 de familii de virusuri ce infecteazǎ oamenii
Intr-un gram de sol se gasesc approx. 108 bacterii, numarul de specii bacteriene fiind de peste 10.000. Numarul de specii bacteriene din lume este estimat a fi mai mare ca 1000 de milioane.
Principiul care sta la baza functionarii unui Genosensor
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
108/120
5/13/2018
Secveta “genei tinta” (cADN-ul saubiosensori ADN-ul de detectat) este indentificata prin -slidepdf.com intermediul unei “gene receptoare” (ssDNA) care impreuna formeaza un hibrid dublu catenar (dsDNA).
Reactia de hibridizare este Eficienta Specifica are loc in prezenta unui amestec foarte diferit de molecule de ADN necomplementare E. Palecek, Talanta 56 (2002) 809-819
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
109/120
5/13/2018
Semnalul de oxidare al bazelor din ADN biosensori-slidepdf.com
Guanina, Adenina
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
Inozina, Adenina
110/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
111/120
5/13/2018
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
112/120
5/13/2018
Inozina este un analog electro-inactiv al guaninei, care se poate lega de citozina prin doua legaturi de hidrogen.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
biosensori-slidepdf.com
113/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
lead
electrod screen-printed
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
114/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Adaugarea substratului enzimatic pentru
Masurarea Electrochimica Tub magnetic
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
115/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Determinarea secventelor specifice de ADN asigura baza detectiei pentru o mare varietate de infectii si boli ereditare.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
116/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
In functionarea biosensorilor bazati pe ADN trebuiesc indeplinite doua criterii importante:
-Sensibilitate mare in detectia unei secvente de nucleotide -Specificitate mare: incluzind detectia unei sinure neimperechere intre baze, sau o singura mutatie a unei baze
IN PRACTICA sunt necesare metode de punere in evidenta a diferentelor dintre o gena salbatica si una mutanta, precum si a mutatiilor genetice
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
117/120
5/13/2018
la nivelul unei singure baze azotate.
biosensori-slidepdf.com
Gena sălbatică – A – T – T – C – G – A – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – T – G – A – C – A – T – G – C – Tranziţie (AT este înlocuită cu GC) – A – T – T – C – G – G – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – C – G – A – C – A – T – G – C – Transversie (AT este înlocuită cu TA) – A – T – T – C – G – T – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – A – G – A – C – A – T – G – C – Inserţie (GC este inserată) – A – T – T – C – G – A – G – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – T – C – G – A – C – A – T – G – C – Deleţie (AT este eliminată) – A – T – T – C – G –– C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C –– G – A – C – A – T – G – C –
Mutatii posibile la nivelul unei singure baze azotate “single point mutation”
Detectia electrochimica a reactiei de hibridizare a permis identificarea a unei singure necomplementaritati la nivelul bazelor azotate
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
118/120
5/13/2018
Patogeni de interes biosensori-slidepdf.com
• Bacterii • Bacillus anthracis • E. coli O157:H7 • Salmonella Typhimurium, si S. Enteritidis • Helicobacter pylori • Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)
• Virusuri • Virusul viral de diaree bovina • Adenovirusurile (HAdV 40/41) • Virusul gripei aviare
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
119/120
5/13/2018
biosensori-slidepdf.com
Virusul gripal care apartine familiei orto-mixovirusurilor este o cauza majora a infectiei respiratorii. Acest virus are diferite tipuri de antigeni ca A, B si C care sunt grupati in functie de diferentele in matricea lor de proteine. Tipul A cauzeaza aviara, tipurile B si C gripa sunt cauzele epidemiilor umane.
http://slidepdf.com/reader/full/biosensori
120/120