Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Celular Profesores:Fraccionamiento Verónica NochesSubcelular
Organización subcelular
Integrantes: Josefina Castillo Javiera Olivares Marcia Suarez Sección: 6 Bio131
Introducción
Las células que existen hace muchos años. Antiguamente, existían células parecidas a las que hoy conocemos como eucariontes, pero con los años han ido evolucionando, siendo la eucarionte la presente en todos los seres vivos. (2) Las células eucariontes presentan diversos organelos, los cuales cumplen funcionen especificas dentro de ella. Los principales organelos son: Núcleo, que contiene toda la información genética. La membrana plasmática, que envuelve a toda la célula con una bicapa de fosfolípidos, en los cuales se encuentras e ncuentras proteínas, para la comunicación celular, Mitocondrias, las cuales realizan la síntesis de ATP y llevan a cabo la respiración celular. Retículo endoplásmico rugoso, el cual presenta ribosomas en su estructura, donde las proteínas, terminan su proceso de traducción tra ducción y el retículo endoplásmico liso, en el cual se realiza la síntesis de lípidos. Aparato de Golgi, en el cual las proteínas terminan su maduración, siendo modificadas en el A. de Golgi, y son exportadas a los lugares en donde deben realizar su función. Lisosomas, que mantienen aislados componentes tóxicos para las células. Los peroxisomas, en el cual se produce el peróxido de hidrogeno durante la oxidación de moléculas, los peroxisomas mantienen aislado esta molécula, que es toxica para la célula. Y el citoesqueleto, que le da la forma a la célula, además de ser el sostén que posee la célula. (2) Todos estos componentes pueden ser separados mediante el proceso de fraccionamiento sub-celular, que posee dos etapas: Homogenización y centrifugación. (3A) La homogenización corresponde a utilizando un homogeneizador, se rompen las células, siendo filtrado, obteniendo un Homogenizado crudo (HC). Este HC debe permanecer a baja temperatura, y en un ambiente similar al de la célula, luego es sometido a diversas centrifugaciones, a distintas velocidades, que hacen sedimentar los componentes más pesados al fondo de un tubo de ensayo, separando los distintos organelos de esta forma, obteniendo un pellet, que es el sedimento, y el sobrenadante que se vuelve a someter a centrifugación. (3B) Sin embargo, el proceso de fraccionamiento, no entrega un 100% de pureza, por lo que no se sabe con certeza lo que se obtiene en los tubos, para esto se utilizan los marcadores moleculares, los cuales revelan la presencia de organelos al unirse a algo propio de ese organelo. Hipótesis A través del fraccionamiento celular se puede diferenciar los componentes dentro de cada fracción, y a través de reactivos, reconocer los organelos. Objetivos: Realizar, paso a paso, las diferentes etapas de la técnica de fraccionamiento celular. Utilizar marcadores moleculares para identificar los componentes de las distintas fracciones celulares. Visualizar mediante microscopia los componentes de una de las fracciones.
Materiales y Métodos
Actividad I: Se cortó un trozo de hígado de Pollo, y con un bisturí se trozo en partes más pequeñas dentro de un vaso precipitado, con 100 ml de Solución salina al 0,9% para mantener a los organelos en óptimas condiciones, y luego se utilizó un homogeneizador mecánico ULTRA TURAX, para triturar y homogenizar la muestra, siendo filtrada a través de una gasa, para que la muestra no estuviera contaminada con restos más grandes de Hígado, obteniendo un Homogenizado crudo (HC) Con 10 ml de HC, siempre a 4°C, para que no se activen proteasas, y fosfolipasas, del cual se guardó 1ml del homogenizado crudo en un tubo eppendorf, para utilizarlo después. Los otros 9 ml restantes de HC del vaso precipitado se colocaron en un tubo Falcon, para centrifugarlos a 2.500 rpm durante 5 min, de donde se obtuvo un Pellet 1 (P1) y un sobrenadante (SN1). Luego del centrifugado se traspasó el SN1 a un nuevo tubo Falcon, añadiéndole 1 ml de suero al P1 para resuspenderlo con una pipeta pasteur. Este P1 se guardó en hielo para ser analizado después. Del pellet 1, que se encontraba en hielo, se extrajeron dos gotas, que se colocaron en portaobjetos, añadiéndole a una de las muestras una gota azul de tripán, se le colocó un cubreobjetos siendo observada al microscopio a 4x, 10x y finalmente en 40x, la cual finalmente se dibujó. La segunda gota, se colocó en un portaobjetos, y se le adiciono un cubreobjetos, se observó al microscopio en 4x, 10x, y 40x, siendo finalmente dibujada en 40x. A dos tubos eppendorf de 2ml se le agregó 2 ml del sobrenadante 1, para ser centrifugados a 13.000 rpm por 20 min, Luego se traspasó el sobrenadante 2 utilizando una micropipeta de 1 ml y fue traspasada a un tubo eppendorf de 1,5 ml. El Pellet 2 fue resuspendido en 500 µl de suero fisiológico, dejándolo en hielo. Para reconocer las estructuras que se encontraban en las distintas fracciones, mediante los marcadores moleculares, se marcaron 6 tubos eppendorf de 2 ml, añadiendo homogenizado crudo, Pellet 1, sobrenadante 1, pellet 2, sobrenadante 2 y agua destilada, en un volumen de 400µl de cada uno, y añadiéndoles 400µl de Succinato 0,1 M y 100 µl de Azul de Metileno. Luego se agitó cada tubo, y se le agregaron 200 µl de vaselina líquida, para que no haga contacto con el aire, sin ser agitados. Finalmente se colocaron a un baño termorregulador a 37°C por 10 minutos. Se observó y se anotaron los resultados.
Resultados
A.2.1. Tabla 1) Detectar mitocondrias a través de reacción de SDH en las fracciones
TUBO
MUESTRA
Succinato 0,1 M
Azul de Metileno
Agua Destilada
Reacción (-) o (+)
1
400 µl de Agua Control
400 µL
100 µL
400 µL
(-)
2
400µl de HC
400 µL
100 µL
400 µL
(+)
3
400 µl de P1
400 µL
100 µL
400 µL
(+)
4
400 µl de SN1
400 µL
100 µL
400 µL
(+)
5
400 µl de P2
400 µL
100 µL
400 µL
(+)
6
400µl de SN2
400 µL
100 µL
400 µL
(-)
Observaciones
La reacción es negativa y de color azul intenso dado que es una muestra control. Se aprecia un color verde dado que, en el homogenizado hay células enteras con ADN y poseen mitocondrias. La reacción es positiva con un color verde, porque existe una alta presencias de células enteras que contienen mitocondrias y ADN. La muestra tiene una coloración verdosa porque se mantiene la presencia constante de mitocondrias Se observa un color verde con aspecto más denso, ya que, decantan los componentes más pesados de la célula como lo son las mitocondrias. La muestra es de coloración azul, porque contienen componentes más pequeñas , sin un nivel energético tan alto como lo son mitocondrias
En la tabla 1: Se concluyó que las muestras que no hubo reacción fueron las (-) siendo el control y SN2, que casi no posee ADN, ni mitocondrias , sin embargo las m uestras que si reaccionaron a los distintos componentes de las fracciones subcelulares son las (+), lo que nos da como resultados re sultados que si había presencia presencia de mitocondrias dando dando un color mas verdoso.
A.2.Figura I. Observación microscópica de las fracciones
Fracción Nuclear de Hígado de pollo
Microscopia Óptica de campo claro Aumento ocular: 10X Aumento objetivo: 40X Aumento Total: 400X Tipo de muestra: Fresca, temporal Tinción: Sin tinción Observaciones: En la muestra de Hígado de pollo no se aprecian los componentes de la fracción, dado que no posee tinción y no hay nada que marque las estructuras presentes.
Figura 2: Observación microscópica de la fracciones Fracción Nuclear de Hígado de pollo
Microscopia Óptica de campo claro Aumento ocular: 10X Aumento objetivo: 40X Aumento Total: 400X Tipo de muestra: Temporal y fresca Tipo de tinción: Azul de tripán Observaciones: En la muestra, gracias a la tinción de Azul de Tripán, se logran identificar concretamente los núcleos de la célula, dado que la tinción azul de tripán marca el ADN dentro de esta.
Discusión
En la observación microscópica de las fracciones del fraccionamiento celular, se sacó una gota suspendida de Pellet 1 (P1) y luego, se observó en el microscopio, usando para ello el objetivo 40X. Al observar esta muestra no se logró identificar ningún componente dentro de ella solo se observó un color piel, debido al hígado de pollo. Luego se tomó otra gota de P1, y se le agregó una gota de azul de tripán, se observó en el microscopio usando para ello el objetivo de 40X. Se logró observar un fondo azul claro con puntos pequeños de color azul intenso. Esto resultados se obtuvieron debido al azul de tripán, que se le conoce como un colorante básico, que se une al ADN localizado dentro de los núcleos, núcle os, y que los colorantes básicos se unen a ella cuando se encuentra ionizada. En el primer caso, al no tener azul de tripán, nada marcaba al ADN, por lo que, no se podían ver los núcleos con claridad, que al no estar marcados con el microscopio óptico no se logra identificar. En cambio en el segundo caso, los puntos azules, si correspondían a los núcleos, ya que, en esta muestra si contenía azul de tripán, por lo que, su ADN fue marcado logrando ver los núcleos.(1) Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares, primero se colocaron en distintos tubos de ensayo muestras obtenidas, a través, de una centrifugación diferencial, la cual separa la muestra dependiendo del de l tamaño de cada componente celular del hígado de pollo, el cual fue tratado con un buffer de suero salino 0,9% cloruro de sodio, para evitar que las células se reventaran, además se homogeneizo con el Ultra-Turax, para obtener un homogeneizado total, que es filtrado para que este no este contaminado, obteniéndose el homogeneizado crudo (HC). Parte Parte de este HC es guardado, y la otra parte centrifugada 2 veces a distintas velocidades y distintos tiempos para obtener el fraccionamiento celular.(1) Luego de este proceso las muestras de 1ml que fueron guardadas para evaluar, que eran Homogeneizado crudo de hígado de pollo (HC), Pellet 1 (P1), sobrenadante 1 (SN1), pellet 2 (P2), sobrenadante 2 (SN2) y por último, un control de agua oxigenada. A cada uno de esos tubos se les agregó la misma cantidad de 400 µl de succinato 0,1M, 100µl de azul de metileno, 400µl de agua oxigenada y 200µl de vaselina, la cual evita que la muestra sea afectada por el oxígeno que se encuentra en el ambiente. Todas las muestras tenían un azul intenso debido al azul de metileno aplicado, luego fueron sometidas a un baño termorregulado de 37ºC 37º C durante 10 minutos.(1) Se pudo observar, que después del proceso anterior las muestras HC, P1, SN1 y P2 pasaron del color azul intenso a un color verde, y las muestras de agua oxigenada y SN2 se mantuvieron su color azul intenso. La separación de los distintos componentes celulares se permiten diferencian por los distintos tipos de organelos, que contienen distintas enzimas o moléculas que lo caracterizan ya que no se encuentran en las distintas separaciones y que con colorantes básicos se pueden identificar.(5) identificar.(5 ) El azul de metileno, es uno de los tipos de colorantes que sirven para definir qué tipo de componentes existen dentro de la muestra, ya que, al estar en un estado oxidado tiene un color azul pero al ser reducido este se transforma a un color incoloro, es decir, se destiñe. Además que al estar reducido, se puede fácilmente volver a oxidar, debido al oxigeno que se encuentra en el aire, por eso se recomienda cubrirlo con algún aceite mineral o vaselina liquida.(4)
Por otra parte, el Succinato al momento de entrar en contacto con la enzima Succinato deshidrogenada (SDH), cataliza la deshidrogenación, especifica de Succinato transformándolo a Fumarato, junto con la liberación de dos protones y dos electrones durante el ciclo de krebs.(5) Las mitocondrias, se identifican por SDH complejo proteico ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en el Ciclo de Krebs.(6) Dado a esto, los resultados que cambiaron de color azul a verde fue debido a que al agregarle Succinato y azul de metileno, las muestras que contenían mitocondrias produjeron la reacción de que del Succinato, fuera catalizado por SDH formando forman do Fumarato Fumar ato junto con la liberación de dos protones y dos electrones, que provocan una reducción del azul de metilo el cual fue desteñido formando el color verde. Esto quiere decir que dentro de HC, P1,SN1 y P2 contenían mitocondrias.(1) Por otra parte, las dos muestras que no reaccionaron se debieron que primero, el agua oxigenada, es solo una muestra blanca que sirve como control, para poder compararla con las otras muestras y ver si reaccionaron o no. La otra muestra que no reacciono fue el SN2, que por lo mencionado anteriormente no contenía mitocondrias. Esto se debe a que al momento de la centrifugación diferencial, se separan las moléculas por su peso, por lo cual las mitocondrias al tener un coeficiente de sedimentación alto, (es uno de los más pesados) y no es hasta centrifugar el SN1 a 13000rpm, durante 20 minutos, que se separa en un pellet 2 que contiene las mitocondrias y un SN2 el cual al ser separado de la sedimentación P2 quedando libre de mitocondrias.(1)
Conclusión
Se pudo concluir, que los objetivos de este laboratorio si fueron logrados, ya que, el fraccionamiento celular obtenido, a través, de los distintos pasos como la homogeneización y la centrifugación del hígado de pollo fueron exitosos, ya que, se logró poder seguir todos estos pasos para la obtención del fraccionamiento celular. Al momento de identificar las distintas fracciones todas dieron concordes con lo que previamente fue visto en la literatura. Al momento de ver una de las fracciones en el microscopio que fue el pellet 1 se logró visualizar sus componentes al ser marcados con una tinción, que en este caso eran los núcleos.
Bibliografía
Acceso a páginas de internet a través de: https://www.google.cl de: https://www.google.cl 1) Universidad Andrés Bello, Guía de Laboratorio N°5 organización subcelular, Laboratorio de Biología Celular, BIO131, 2015. 2) Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff,Roberts,Walter, Introducción a la Biología Celular.(2011). Panamericana, 3ª edición. España. Pág 26-27 3ª) Lodish, Berk, Matsudaria, Káiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell, Biología Celular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5ª Edición,United States of America. Pág. 145 3B) Lodish, Berk, Matsudaria, Káiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell, Biología Celular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5ª Edición,United States of America. Pág. 207 4) http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox 4) http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/indicador-redox 5)http://es.scribd.com/doc/177564133/Bioquimica-Final#scribd 6)http://es.swewe.net/word_show.htm/?261814_2&Succinato_deshidrogenasa
