Practica #4 Fraccionamiento celular
Objetivo:
Observar los diferentes orgánulos de la célula vegetal y animal mediante el fraccionamiento celular. Introducción:
El fraccionamiento celular es una técnica bioquímica utilizada para separar los distintos orgánulos y componentes celulares para su estudio. La técnica se inicia con la homogeneización. El tejido se tritura en un homogeneizador de manera que las células se comprimen y se libera su contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentes centrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos orgánulos. Homogenización. Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se debe suspender en un medio apropiado (una solución amortiguadora, salina ó azúcar isotónica). Para mantener la integridad de los orgánulos y enzimas durante el procedimiento de la fraccionación, todas las soluciones y cristalería deben mantenerse frías. Después de rebanar las hojas, el tejido está preparado para la homogenización, procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin dañar el medio en suspensión. La suspensión de células constituyentes se llama homogenado. Para los tejidos de plantas, la homogenización se debe realizar con un mortero al cual se le añade arena como abrasivo. En este proyecto los cloroplastos se aislarán de la espinaca; núcleos y mitocondria se aislarán de la coliflor. Centrifugación. Debido a las diferencias en tamaño y densidad, cada componente celular está sujeto a una fuerza centrífuga. La fuerza generada por la centrífuga se expresa como fuerza centrífuga relativa (RCF) en unidades de g. La RCF es una función de velocidad de centrifugación en revoluciones por minutos (rpm) y la distancia de partículas desde el eje de rotación. Conociendo esta distancia (x) y el (rpm), se puede determinar el RCF de la ecuación: RCF =1.19 x 10-5 (rpm)2x, donde x se toma como la distancia (en cm) desde el eje de rotación hasta el margen de afuera del tubo de centrífuga. Centrifugación Diferencial. En la centrifugación diferencial, el homogenado es centrifugado repetidas veces a altas velocidades, sedimentándolo progresivamente en pequeñas partículas. El método está ilustrado en la fig. 2. La primera centrifugación es a 600g por 10 minutos, el cual sedimenta la fracción
nuclear. Este pellet´ contiene el núcleo, células intactas y tejido.. L próxima separaciones el sobrenadante postnuclear ó partículas suspendidas en líquido sobre el ³pellet´ nuclear, el cual es transferido a otro tubo de centrífuga y se centrífuga a 10,000 g por 30 minutos en una centrífuga refrigerada. El material sedimentado se conoce como fracción mitocondrial; éste contiene mitocondria y micro cuerpo. Material
Hígado de pollo Brócoli Espinacas Coliflor Tubos de ensaye Solución tris-hcl 10 Mm. Agua destilada
Procedimiento:
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Partimos de 0,5 gramos de hígado de pollo y de una solución madre de TRIS-HCL 1M.Necesitamos para el homogeneizado 10 ml de solución TRIS-HCl 10 mM, por lo que tomamos10 microlitros de la solución madre y rellenamos con agua destilada hasta 10ml .En un émbolo de potter ponemos los 0,5 gramos de hígado de pollo junto con 4 ml de solución TRIS-HCL 10mM. Machacamos hasta homogeneizar sin que quede ningún fragmento. Luego pasamos 1 ml del extracto a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra núcleo y centrifugamos a 3000 rpm durante 5 minutos. Después de esto, decantamos el sobrenadante a 3 tubos limpios y los marcamos con la palabra mitocondrias. EL pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y lo resuspendemos en 250 microlitros de sacarosa-TRIS. Almacenamos esta fracción a ±20ºCpara ensayos posteriores. Y centrifugamos el sobrenadante restante a 10000 rpm durante 10minutos. Una vez acabada la centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 nuevos
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tubos eppendorf marcados con la palabra microsomas. EL pellet que nos ha quedado es la fracción mitocondrial y lo resuspendemos en 250 microlitros de solución sacarosa-TRIS y almacenamos a ±20ºC. Centrifugamos el sobrenadante a 12000 rpm durante 25 minutos. Finalizada la centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra citosol y almacenamos a ±20ºC. Lo que nos queda en el pellet es la fracción microsomal y la resuspendemos en 250 microlitros de solución sacarosa-TRIS y almacenamos. Ahora observaremos la fracción nuclear. Para ello hacemos un frotis con una gota del tubo marcado con núcleo. Le echamos hematoxilina y dejamos durante 2 minutos. Lavamos con agua caliente, colocamos un cubre y observamos. Observación de mitocondrias. Tomamos 200 microlitros de la fracción mitoncondrial del tubo marcado con mitocondrias y añadimos 300 microlitros de tampón TRIS-HCL y 500 microlitros de verde Jano 0,1%, de manera que estamos diluyendo la fracción mitocondrial 5 veces. Hacemos un frotis y observamos al microscopio óptico. Vemos cantidad de esferas y ovoides que deben corresponder a mitocondrias, lisosomas y peroxisomas. Pero es imposible poder diferenciar la ultraestructura. Para hacer un recuento de las mitocondrias, hacemos uso de un hemocitómetro. Colocamos un cubreobjetos sobre el aparato. Éste posee dos huecos a los lados del cubre, de manera que se inyecta la suspensión con colorante en esas huecos que luego pasa por debajo del cubre y se llena la cámara por capilaridad. Y observamos al microscopio óptico para hacer recuento. EL hematocitómetro posee bajo el cubre una zona cuadriculada, de manera que hace fácil el recuento de los orgánulos. Cada cuadrícula representa 0,1 mm cúbico, es decir, 0,0001 cm a la cuarta. 1cm cúbico=1ml. Luego, el número de mitocondrias por ml es igual a la media de mitocondrias por cuadrículas x factor de dilución. El número total de mitocondrias en la alícuota que tomamos sería el número de mitocondrias por ml x volumen de alícuota.
Evidencias:
Conclusiones: Después de haber realizado todo el procedimiento se procedió a observar observar a microscopio todas las muestras, muestras, se tomo unas gotas del concentrado y se observo los resultados fueron que en ninguna de las muestras se alcanzo a ver nada claramente solo una en excepción se puedo observar unas pequeñas estructuras pero realmente no se sabe qué qué tipo de orgánulo ya que por deducción se cree que fueron núcleos.
