INFORME - FRACCIONAMIENTO
OBTENCIÓN Y ANÁLIS DE FRACCIONES CELULARES Objetivos.1
INFORME - FRACCIONAMIENTO 1. Ideti!"#$%#s &$#""ioes "e%'%#$es # (#$ti$ de )*+#do de (o%%o. ,. Ded'"i$ e% $ediieto ('$e/# de "#d# &$#""i0. . Coo Coo"e "e$$ %# t2" t2"i" i"# # de &$#" &$#""i "io o# #ie iet to o "e%' "e%'%# %#$$ (#$# (#$# e% est' est'di dio o de %#s %#s o$+# o$+#e e%# %#ss "e%'%#$es. 3. Us#$ "o%o$#tes 4'e ideti!4'e o$+#e%#s es(e"*!"#s "e%'%#$es. 5. Disti+'i$ %os ti(os de i"$os"o(*# de "#(o "%#$o 6'o$es"e"i# e %#s 'est$#s ($e(#$#d#s.
F'd#eto te0$i"o.¿De qué se trata el fraccionamiento celular?
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de que tienen como objetivo obtener fracciones puras o determinado componente celular, ya sea éste un (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una membrana (m (membrana to total, pl plasmática, do dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueleto microtúbulos, poros nucleares, etc.).
métodos y técnicas enriquec idas en un orgánulo fraccin de basolateral, dominio de actina,
Fases:
Pre-analítica: !btencin preparacin preliminar preliminar de la muestra "asta llegar al laboratorio #nal$tica% o de aplicacin aplicacin de procedimientos procedimientos.. &oma &oma y tratamiento de de datos, recogida recogida de resultados en en un informe Pos- analítica: 'alidacin técnica del informe anal$tico.
Todo To do proceso de fraccionamiento f raccionamiento subcelular tiene dos etapas: otura de las células o tejidos para obtener un lisado celular (o tisular) en el que la fraccin deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificacin. eparacin de la fraccin deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugacin en gradientes o centrifugacin diferencial), la presencia de algún ant$geno (cromatograf$a de inmunoafinidad, inmunoafinidad, inmunoprecipitacin, inmunoprecipitacin, etc.).
Técnicas Técnic as de rotura rotu ra de células célu las y tejidos tej idos El primer paso en la purificacin de la mayor$a de las prote$nas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la prote$na, el complejo multiproteico o la es tructura subcelular se encue encuentr ntre e en condi condicio cione ness que permit permitan an su aisla aislamie miento nto.. Esto Esto se consig consigue ue empleando procedimientos mecánicos suaves conocidos generalmente como "omo "omoge geni ni*a *aci cin n.. Esto Estoss méto método doss prod produc ucen en la rotu rotura ra de las las memb membra rana nass celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
,
INFORME - FRACCIONAMIENTO Los procedimientos de homogenización más comunes son: +a purificacin de cada uno de los principales organelos subcelulares represent un gran logro en la iolog$a celular al "acer posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metablicas. +a purificacin se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. +as células deben estar suspendidas en una solucin con p- y concentracin concentracin de sales apropiada. ormalmente se emplea sacarosa isotnica (/,012) o una combinacin de sales similar a las de la célula. El proceso de fraccionamiento fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas%
1. ! !"! "!#$ #$%& %&'( '()& )&!% !%.3 *.
e trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el "omogenei*ador. 4élulas anexas% primero se deben romper conexiones con otras células. 4élulas no anexas% pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o caracter$sticas que puedan marcarse. Existen dispositivos de "omogeni*acin en los que está calibrada la separacin entre el émbolo y la pared de cristal para producir "omogeni*ados con un tama5o de part$cula determinado. determinado. 4onsiste en el procesamiento procesamiento del tejido y posteriormente posteriormente de las células con el fin de obtener una me*cla me*cla fluida en la cual estén todos todos los componentes celulares, celulares, para lo cual podemos recurrir a diversos métodos f$sicos.
1.*. "!+T$+! , "(%! .3 E un método convencional convencional de rompimiento por friccin. 6ueden emplearse materiales abrasivos como cuar*o, cuar*o, vidrio molido, molido, arena, o material materiales es sil$ceos. sil$ceos. +a masa celular celular contenida contenida en un volumen de buffer se me*cla con un volumen de medio moledor (/.178). +a friccin sobre las células genera calor que puede afectar la actividad que se desea estudiar. #ctualmente #ctualmente se dispone de "omogenei*adores más sofisticados que emplean el mismo principio, pero que permiten controlar el nivel de friccin y la temperatura del proceso, son conocidos como plotters. +os principales problemas de esta técnica son% la eficiencia baja cuando se usan peque5as cantidades de medio moledor cuando es baja la la co concentracin celular9 la friccin genera calor y pueden presentarse alteracin en las prote$nas
1.. !%&)()&!% .4onsiste en la aplicacin de ultrasonidos ultrasonidos a una suspensin celular. +a intensa agitacin producida destruye las membranas celulares. :ependiendo de la frecuencia, intensidad y energ$a aplicada se pueden destruir asimismo las estructuras subcelulares e incluso solubili*ar complejos proteicos. e suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podr$a provocar la desnaturali*acin de las prote$nas. e transmite una corriente eléctrica a un sistema mecánico que la convertirá en vibraciones de alta intensidad generándose ondas ondas de ultrasonido que generan millones millones de burbujas microscpicas, microscpicas, las cuales se expanden y colapsan contra las células causando la ruptura de su membrana. Este fenmeno llamado cavitacin puede incrementarse adicionando adicionando al medio fin$simas esferas de vidrio.
FILTRADO.e deno denomi mina na filtración al proceso unitario de separacin de slidos en suspensin suspensin en en un l$quido mediante un medio poroso, poroso , que retiene los slidos y permite el pasaje del l$quido.
INFORME - FRACCIONAMIENTO +as aplicaciones de los procesos de filtracin son muy extensas, muc"os ám ámbitos de de la la ac actividad "u "umana, ta tanto en en la la vi vida la industria general, donde so s on pa p articularmente im i mportantes industriales que requieren de las técnicas qu$micas. +a filtracin se "a desarrollado tradicionalmente desde un estudio recibi recibiend endo o una una mayor mayor atenci atencin n teric terica a desde desde el siglo ;;. +a filtracin y los equipos es diversa y en general, las categor$as de unas de otras.
encontrándose en doméstica como de aquellos procesos
de arte práctico, clasificacin de de lo l os pr p rocesos de de clasificacin no se excluyen
+a varied variedad ad de dispo disposit sitivo ivoss de filtra filtraci cin n o filtros es tan exten extensa sa como como las las varied variedad ades es de mater material iales es poros porosos os disponibles como medios filtrantes y las condiciones particulares de cada aplicacin% desde sencillos dispositivos, como los filtros domésticos de café café o o los embudos de filtracin filtracin para separaciones de laboratorio, "asta grandes sistemas complejos de elevada automati*acin como los empleados en las industrias petroqu$micas petroqu$micas y y de refino refino..
CENTRIFU7ADO 89URIFICACIÓ 89URIFICACIÓN:.N:.+a centrifugación es un método método por por el cual se pueden separar slidos de l$quidos de difer ente densidad por medio de una una fuer fuer*a *a gira girato tori ria. a. +a fuer fuer*a *a cent centr$ r$fu fuga ga es pro provist vista a por por una una máqu máquin ina a llamada centrifugadora centrifugadora,, la cual imprime a la me*cla un movim movimien iento to de rotaci rotacin n que que origina una fuer*a fuer*a que que produce la sedimentacin de los slidos o de las part$culas de mayor densidad. +os componentes más densos de la me*cla se despla*an fuera del eje de rotacin de la centr$fuga, mientras que los componentes menos densos de la me*cla se despla*an "acia el eje de rotacin. :e esta manera los qu$micos y bilogos pueden aumentar la fuer*a de gravedad efectiva en un tubo de ensayo para producir una precipitacin precipitacin del del sedimento en la base del tubo de ensayo de manera más rápida y completa.
;i+#do de (o%%o.Es la más voluminosa de las v$sceras v$sceras y y una de las más importantes por su actividad metablica. Es un rgano glandular
al
que
se
adjudica
funciones
muy
importantes, ta t ales
como como la s$n s$ntesi tesiss de prote$nas plasmáticas plasmáticas,, funcin
desintoxicante,
alma almace cena naje je
secrecin de bilis bilis,,
de vitaminas y glucgeno glucgeno,,
además
de
entre otras. &ambién es el responsable de eliminar de
la sangre sangre las las
sust sustan anci cias as que que pu edan edan resul resultar tar nocivas para el
organismo,
convirtiéndolas en inocuas9 está presente en el ser
"umano y se le
puede "allar en vertebrados vertebrados y y algunas otras especies del reino animal. Materiales.-
3
INFORME - FRACCIONAMIENTO MATERIALES DEL LABORATORIO
1. Mo$te$o 2. 7#s# T'bos de e(edo$& de 1<5% 3. T'bos 4. , be#=e$ de 1>>% 5. ?e$de de j#'s C'bet#s "o )ie%o 6. 1 BEA@ER de 5>% 7. B'e$ t$is 1> M (; <5 8. Co%o$#te ;oe")st ,5 9. Mtot$#"=e$ 10. Li#s %#ii%%#s 11. Mi"$os"o(io de "#(o "%#$o 6'o$es"e"i# 12. 1> +$. De )*+#do de (o%%o. Procedimientos:
8. e coloc el "$gado en el mortero, se moli llegando a tener una pasta de forma uniforme, luego se le adiciono 0/ ml de tris, 8/n< p- =,1, y al final con una una gasa filtrarlo a un beac>er beac>er peque5o 0. 4on ayuda de la micro3pipeta pasamos pasamos a dos tubos eppendorf eppendorf 0/ ?l, luego se agreg 1// ?l de la solucin de buffer &ris 8/ m< p- =,1. En los tubos rotulados con la palabra núcleo, se lo llevo a la máquina de centrifugado y se lo centrifugo por @ min. @. e coloc el sobrenadante del proceso de los núcleos en 0 tubos eppendorf nuevos, rotulados con la pala palabr bra a mito mitoco cond ndri ria, a, al igua iguall que que en el proc proced edim imie ient nto o ante anterio riorr se lo llev llevo o a la máqu máquin ina a de centrifuga centrifugado, do, centrifugan centrifugando do este por A min. a 8//// 8//// rpm. e elimin elimin el sobrenada sobrenadante nte quedando quedando la fraccin mitocondrial y resuspendi el pellet en 0// ?l de buffer &ris 8/ m< p- =,1. B. 6## 6## !E'# !E'# C4+E!% e coloc 8/ ?l del resuspendido del tubo marcado como núcleo, en una lámina porta objeto con ayuda de una gota de Da*ul de metileno la cual se cubri con una lámina cubre objeto. En otra lámina adicion 8/ ?l del colorante -oec"st -oec"st @@01A y se cubri con una lámina cubreobjeto cubreobjeto y esta se dej reposar por 0 min.
1. 6## 6## !E' !E'# #
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ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.1. A% oeto oeto de %# e(e$iet# e(e$iet#"i0< "i0< "'#do "'#do e")#os e")#os #+'# #+'# &$*# # 'est$# e/"%# e/"%# es e"es#$io 4'e este &$*# G9o$ 4'2H Lo 4'e (#s# e 4'e %# est$'"t'$# de )*+#do de (o%%o tiee e/i#s 4'e ('ede #&e"t#$ %# 'est$# dete$io$#$%# #% oeto de e")#$ #+'# &$*# %o 4'e )#"eos es e't$#%i/#$ est#s e/i#s (#$# 4'e o "#'se i+ e&e"to. ,. G9o$ G9o$ 4'2 4'2 es e"e e"es# s#$i $io o 4'e 4'e j't j't#$ #$ "ie$t "ie$tos os "o%o "o%o$# $#t tes es "o "o "ie$ "ie$t# t#ss est$' est$'"t "t'$ '$#s #s<< eje(%o< 4'e$eos e#i#$ %os "%eos de% )*+#do de (o%%o < (e$o o (odeos (oe$ "'#%4'ie$ "o%o$#te < tiee 4'e se$ 'o "o "#$"te$ bsi"o < # 4'e< %os "%eos (o$t# ADN %o 4'e )#"e 4'e se# #"ido es e% +$'(o &os&#to #% e")#$ '
INFORME - FRACCIONAMIENTO "o%o$#te bsi"o "oo e% #/'% de eti%eo %o e't$#%i/# )#"iedo 4'e %# 'est$# se# s visib%e. . Es e"es#$i e"es#$io o )#"e$ )#"e$ todo e% ($o"e ($o"eso so de &$#""i &$#""io# o#ie ieto to "e%'%#$ "e%'%#$JJ # 4'e< e este este "#so "#so e% )*+# )*+#do do tie tiee e '") '")#s #s est$ est$'" '"t' t'$# $#ss 4'e 4'e o 4'e$ 4'e$e eos os vis' vis'#% #%i/ i/#$ #$ e"esit#os "et$#$os e %o 4'e $e#%ete 4'e$eos (o$ eso teeos 4'e )oo+ei/# )oo+ei/#$< $< !%t$#$ ('$i!"#$ ('$i!"#$ 'est$# 'est$# (#$# se(#$#$ todo %o 4'e o os ite$es#. 3. E ' i"$os"o(i i"$os"o(io o de 6'o$es"e"i# 6'o$es"e"i# se ('ede ('ede #($e"i#$ #($e"i#$ %#s est$'"t'$#s est$'"t'$#s ejo$< ejo$< # 4'e< este se "et$# e %#s est$'"t'$#s ite$#s es(e"*!"#s.
Co"%'sioes.En esta práctica de laboratorio aprendimos que el procedimiento debe "acerse en temperatura fr$a para mantener el buffer tris y este a su ve* nos ayuda a limpiar unas encimas de la célula para que sea más fácil observarla. #prendimos que algunos colorantes colorantes como es el a*ul de metileno o el verde de Hanus le da un color a la célula pero por ser una solucin base esta puede ser absorbida mejor por algunas organelos para reconocerlas de mejor manera. e de buscar el equilibrio del p- para que las muestras reaccionen mejor, que sean de carácter básico o alcalino con ácido. +as técnicas de fraccionamiento se deben seguir al pie de la letra, pues los resultados no pueden ser favorables para elaborar el informe.
Re"oed#"ioes.-
1. A% oeto de% "et$i&'+#do %#s 'est$#s tiee 4'e est#$ '# &$ete # %# ot$#
(#$# 4'e #%% e4'i%ib$io %os $es'%t#dos se# s &#vo$#b%es. 2. Es"'")#$ o #ot#$ todos %os (#sos 4'e ($o('so %# ($o&eso$# < (o$4'e es '# e(e$iet#"i0 $eb's"#d# %os $es'%t#dos (od$*# v#$i#$
Linkografía.-
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