Informe 5 Fraccionamiento Celular

Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Celular BIO !"

Trabajo práctico N°6: Fraccionamiento subcelular

Alumnos:

Fabi#n $scobar% Luis Alarcón% Alondra Barra&a% Catalina 'egri% Sección:

! Profesores:

Agustina Undabarrena Fernanda Rodriguez

 

Introducción

(ace millones de a)os se generaron las células* las cuales son la unidad principal de los seres vivos + se encuentran tanto como célula procarionte ,bacterias- + eucariontes ,seres .umanos* animales* etc%- estas est#n presentes tanto en animales ,célula animal- + plantas ,célula vegetal- + adem#s est# compuesta por di/erentes organelos* los cuales cumples variadas /unciones ,0-% $n primer lugar est# la membrana plasm#tica encargada de darle  protección a la célula + adem#s regular lo 1ue ingresa + sale de esta + la pared celular  ,presente solo en la célula de tipo vegetal- encargada de darle protección a esta 2ltima% $n el interior de la célula nos encontramos con los siguientes organelos3 4itocondria* encargada de la reserva energética* producción de A56 + la respiración celular* Cloroplasto ,presente 2nicamente en células vegetales-* encargado del proceso de /otosíntesis* Lisosoma* cu+a /unción es la digestión celular* 6ero7isoma* responsabili&ado de la decodi/icación celular* Aparato de 8olgi* encargado del movimiento celular* tanto de los organelos en si como de la célula completa* '2cleo* el cual lleva en su interior la in/ormación genética o D'A* 9etículo $ndoplasmatico liso encargado de la síntesis de lípidos* el 9etículo $ndoplasmatico 9ugoso* responsable de la síntesis de proteínas + los ribosomas* encargados de la traducción de síntesis de proteínas% ,:6ara lograr el estudio de un organelo en especí/ico de la célula* e7isten di/erentes métodos* es decir* procesos para separar sus componentes* aislarlos + de esta /orma estudiarlos para comprender su /uncionamiento% 6ara reali&ar algunas de estas técnicas de separación se utili&a la centri/uga* la cual consiste en un sistema de rotores con cavidades para colocar los tubos 1ue contienen la muestra + .acerlos girar a di/erentes velocidades para /inalmente lograr la separación% Uno de los procesos m#s utili&ados es el /raccionamiento celular% $ste 2ltimo consiste en : etapas* la primera consiste en .omogenei&ar la muestra* a través de  procesos como el s.oc; osmótico o el simple rompimiento de las células en .omogenei&adores mec#nicos% $stas 2ltimas 1ue .an sido .omogeni&adas reciben el nombre de lisados% $l resto de los componentes contin2a intacto ,!-% La segunda etapa consiste en una serie de centri/ugaciones* reali&ada con la centri/uga antes mencionada* a di/erentes velocidades* + en cada una de estas se obtienen : porciones* el pellet* el cual 1ueda depositado en el /ondo* + el sobrenadante 1ue 1ueda por encima ,<-% $ste 2ltimo es re=utili&ada para las centri/ugaciones posteriores para así poder ir obteniendo el resto de los componentes celulares% 6ara la identi/icación m#s clara de los organelos* se utili&an marcadores subcelulares como como el D'A + en&ima* las cuales son marcadores de la presencia de n2cleos + mitocondrias respectivamente% $stos marcadores pueden ser identi/icados con colorantes* los cuales* se unen a ella cuando esta ioni&ada* como por e>emplo3 el a&ul de tripan* a&ul de toluidina* etc% ,"Dado la siguiente* se .a planteado la siguiente interrogante3 ?$ste método es e/ectivo para  poder visuali&ar claramente los organelos por separado@

Ob>etivos3 0% Aprender el uso correcto del método de /raccionamiento celular  :% Identi/icar los organelos mediante el uso de marcadores subcelulares

4ateriales + 4étodos% Actividad '03 Fraccionamiento subcelular  Fraccionamiento Subcelular del (ígado3 Se tomó un tro&o de .ígado de pollo /rio de 0 gramos apro7%* para luego picarlo en tro&os  pe1ue)os* utili&ando una ti>era ,trituración-% Dic.os tro&os se colocaron en un tubo de 0" ml* en el cual le ec.aron un bu//er* en este caso 'aCl al * de suero /isiológico* con el /in de sacar el e7ceso de sangre% sta muestra se llevó al Ultraturra7* el cual busca romper  a nivel celular la membrana plasm#tica* por lo 1ue 1uedan sus organelos suspendidos en el  bu//er% sta muestra estuvo " minutos e7puesto a las di/erentes capacidades del Ultraturra7* en una cubeta de .ielo a < C apro7imadamente* +a 1ue* se minimi&a la activación de da)o generado por /os/olipasas + proteasas% La muestra se lleva a un proceso llamado /raccionamiento* el cual consiste en colocar la muestra en tubos Falcon de  polipropileno para centri/ugar* previo a esto* se /iltró la muestra utili&ando una gasa dispuesta en un embudo de vidrio para luego rotularlos% 6ara este proceso de /raccionamiento* se llevó el tubo Falcon a la centri/uga* de>#ndolo por  0 minutos a :" 964 ,revoluciones por minutos-% Finali&ado este tiempo se sacó el tubo* en el cual se observaron dos /racciones de sustancias di/erentes + retir#ndose 0 ml de sobrenadanteE el pellet* en la parte in/erior del tubo* + el sobrenadante en la parte superior% Obteniéndose así la /racción nuclear en el sedimento + la mitocondrial en el sobrenadante% Consiguientemente se re suspende en otro tubo Falcon el sobrenadante correspondiente al ml retirado con la a+uda de una pipeta* para una posterior centri/ugación* pero por " min a 0! 964% $n este proceso el sedimento corresponde a la /racción mitocondrial + el sobrenadante a la porción restante de material subcelular% $valuación del Fraccionamiento Subcelular mediante marcadores moleculares3 Se dispuso del 6ellet 0G m#s " ml de suero /isiológico* se me&cló el contenido + se aplicó 0 gota de ésta muestra e7puesta a tinción de a&ul de trip#n en un portaob>eto con el correspondiente cubre ob>eto* + se llevó al microscopio a un ob>etivo <H% Luego se reali&ó el mismo procedimiento + método con la muestra 1ue contenía el sobrenadante de 6ellet :G para ser observada en microscopio ba>o tinción de a&ul de trip#n% Finalmente se dispuso de " tubos de ensa+o los cuales /ueron rotulados de la siguiente manera3 6ellet 0G* pellet :G* sobrenadante 0G* sobrenadante :G* .omogeni&ado crudoG los cuales contenían las muestras correspondientes* a los cuales se le aplico 0 ml de succinato *0 4* 0 ml de a&ul de metileno* 0 ml de agua destilada + 0 ml de vaselina li1uida ,a modo de aislar la muestra del o7ígeno-% $n 2ltimo lugar los tubos de ensa+o /ueron dispuestos en una gradilla met#lica apta para la e7posición de un ba)o termorregulador a una temperatura apro7% de !C por un tiempo cronometrado de ! minutos para observar  la correspondiente reacción%

9esultados% Actividad n03 aMuestra.

Pellet 1 (Fracción Nuclear).

 Tinción.

Azul de Tripán.

Aumento Total.

4!. "e logra o#ser$ar su#estructuras celulares es%&ricas azuladas 'ue segn el procedimiento realizado pertenecen al ncleo celular.

#ser$ación. b)

Muestra.

Pellet * (Fracción Mitocondrial).

 Tinción.

Azul de Tripán.

Aumento Total.

4!. "e logra o#ser$ar su#estructuras celulares es%&ricas azuladas las cuales segn el procedimiento realizado de#er+a ser una mezcla rica en mem#rana plasmática, mitocondrias otros organelos, aun'ue, no se puede ser determinante - se re'uiere.

#ser$ación.

Actividad n:3 9esultados iniciales obtenidos sin ser colocados en ba)o termorregulador% antida d de Agua Muestr "uccinat Azul de destila a o ,1 M Metileno da

Resultado olorim&trico /nicial

 Tu#o 0omogenizad o crudo 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

"o#renadante 1 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

alipso opaco

1 ml

1 ml

1 ml

alipso traslucido

Pellet 1 1 ml "o#renadante * 1 ml

Tur'uesa erde esmeralda

Pellet *

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

eleste traslucido

9esultados obtenidos luego de colocar las muestras en el ba)o termorregulador a !C%

 Tu#o

antida d de Agua Muestr "uccinat Azul de destila a o ,1 M Metileno da

0omogenizad o crudo 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

"o#renadante 1 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Pellet 1

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

"o#renadante * 1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Pellet *

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Resultado olorim&trico Final erde agua muclaro poco traslucido. erde esmeralda. No se registran cam#ios olor medio $erdoso con restos de pellet en %ondo de coloración ro2iza clara. alipso traslucido. No se registran cam#ios eleste traslucido. No se registran cam#ios.

Conclusión% 6odemos concluir en primer lugar 1ue la utili&ación de métodos como el /raccionamiento celular permite determinar la presencia de organelos especí/icos* en con>unto con el uso de marcadores moleculares los cuales determinan tal presencia mediante tinciones o la acción en&im#tica 1ue caracteri&a a estas moléculas debido a su especi/icidad* siendo así* 1ue en consecuencia se puede determinar no solo la presencia sino 1ue también la /unción de los +a determinados organelos% Finalmente podemos decir 1ue la interrogante planteada es respondida de manera positiva* +a 1ue* aun1ue no se puede ser altamente especi/ico si se  pueden di/erenciar organelos mediante los métodos utili&ados%

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