AWETAN LAPISAN LUAR MEMBRAN PROTEIN SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN EFEKTIF DARI D ARI Vibrio alginolyticus
TERJEMAHAN Disadur dari makalah : A CONSERVED OUTER MEMBRANE PROTEIN AS AN EFFECTIVE VACCINE CANDIDATE FROM Vibrio alginolyticus alginolyticus a,b
c
Oleh :
Rong-Hua Qian , Zhao-Hua Xiao , Chong-Wen Zhang b, Wu-Yin W u-Ying g Chud, LianSheng Wanga, Hong-Hao Zhou a, Yong-wei Wei b, Lian Yu b,*
Diterjemahkan Oleh :
ROMI NOVRIADI Pengendali hama dan Penyakit Ikan
DEPARTEMEN KELAUTAN DAN PERIKANAN DIREKTORAT JENDERAL PERIKANAN BUDIDAYA BALAI BUDIDAYA LAUT BATAM 2008
AWETAN LAPISAN LUAR MEMBRAN PROTEIN SEBAGAI KANDIDAT VAKSIN EFEKTIF DARI D ARI Vibrio alginolyticus Rong-Hua Qian a,b, Zhao-Hua Xiao c, Chong-Wen Zhang b, Wu-Yin W u-Ying g Chud, LianSheng Wanga, Hong-Hao Zhou a, Yong-wei Wei b, Lian Yu b,* * b
c d
Institut Farmakologi Klinik, Universitas Central South, 410078, China Institut Pengobatan Pencegahan Penyakit Veteriner, Universitas Zhejiang, Hangzhou, 310029, China Rumah Sakit Xiangya Universitas South Central, Changsha, 410078, China Universitas Changsa, Changsa, 410003, China
ABSTRAK Vibrio alginolyticus, yang merupakan bakteri Gram-negatif, adalah satu dari Vibrio patogen yang umumnya terdapat pada manusia dan binatang laut. Lapisan luar membrane protein memainkan sebuah peranan yang penting selama terjadinya infeksi dan induksi dari respon kekebalan tubuh inang. Pada riset yang dilakukan saat ini, gen Ompk dari Ompk dari V.alginolyticus telah V.alginolyticus telah dapat dikloning dan dinyatakan. Frame pembacaan terbuka berisikan 846 bp, dan protein yang sudah matang terdiri atas 261 residu asam amino. Analisis penjajaran menunjukkan bahwa Ompk telah dapat diawetkan, dimana dapat menyediakan sebuah permukaan antigen untuk kandidat vaksin terbaik. SDS-PAGE mengindikasikan bahwa Ompk dapat digunakan pada E.coli BL21(de3). Kombinasi ulang protein dapat dimurnikan dengan menggunakan daya afinitas kromatogafi pada Ni-NTA resin aliran cepat. Analisis noda barat mengungkapkan bahwa protein Ompk telah di immunoreaktivitaskan. Pseudosciaena crocea yang divaksinasikan dengan menggunakan Ompk secara signifikan dapat dilindungi dan dapat melawan infeksi oleh V.alginolyticus . penelitian ini menunjukkan bahwa awetan Ompk merupakan kandidat vaksin yang efektif dalam melawan infeksi oleh V.alginolyticus . Kata Kunci : Vibrio alginolyticus, Ompk, Pernyataan, Pemurnian, Kandidat Vaksin
I. Pendahuluan Pada bakteri pathogen gram-negatif, lapisan luar membran memainkan sebuah peranan penting pada infeksi dan tingkat patogenisitasnya kepada inang (Tsolis,2002 Tsolis,2002). ). Lapisan membran luar bakteri pada dasarnya tersusun atas protein, lemak dan gula, yang dapat dengan mudah dikenali sebagai unsur zat asing pada sistem pertahanan tubuh inang. Diantara komponen ini, protein membran memiliki peranan rumit pada pada banyak proses sel dan fisiologi, dimana sangat menarik digunakan untuk dikembangkan sebagai kandidat vaksin dan
diagnosa kit (Pizza ( Pizza et al., 2000; Qian et al., 1999 ). Studi terbaru saat ini ditekankan pada peranan OMPs dari bakteri pathogen pada sifat perlindungan antigen ( Fang et al., 2000; Bricknell et al., 1999 ). Ompk, sebagai satu dari bagian besar OMPs secara luas didistribusikan diantara Vibrio dan Photobacterium, menunjukkan dapat bertindak sebagai reseptor dari KVP40, sebuah cakupan-lebar-inang Vibriofag pada V.parahaemolyticus ( Inoue et al., 1995 ). Vibrio alginolyticus, bakteri halophilis gram-negatif, tinggal di laut dan lingkungan muara, adalah satu dari bakteri Vibrio patogen terhadap manusia ( McLaughlin et al., 1999 ), yang secara garis besar menyebabkan sindrom penyakit klinis termasuk infeksi luka, otitis media, intoksikasi makanan, gastroenteritis (tukak lambung) dan septicemia ( Hlady dan Klontz, 1996; Morris dan Black, 1985 ). Selain hal itu, Vibrio alginolyticus adalah satu dari Vibrio patogen utama yang dapat menyebabkan peristiwa serius pada binatang laut, seperti pada ikan laut, udang dan kerang-kerangan ( Lee et al., 1996; Zorilla et al., 2003 ), dan membawa dampak kerusakan yang besar pada perekonomian. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengeksplorasi cara perlindungan yang efektif untuk melawan infeksi dari mikroorganisme ini. Pada penelitian yang paling baru, awetan dari Ompk dari strain Vibrio alginolyticus ZJ04107 alginolyticus ZJ04107 telah dikloning, dikloning, dan dinyatakan, rekombinasi protein yang telah dimurnikan dan dievaluasi jika itu dapat digunakan sebagai kandidat vaksin efektif melawan Vibrio alginolyticus . alginolyticus . 2. Bahan dan Metoda 2.1 Strain Bakteri dan Plasma Strain bakteri V.alginolyticus ZJ04107 telah diisolasi dari Pseudosciaena crocea yang terinfeksi dan dibudidayakan di Keramba Jaring Apung di pantai Xiangshan, Provinsi Zhejiang, China. Strain V.alginolyticus lainnya yang disediakan sebagai jenis khusus/khas lainnya telah dibeli dari Institut Mikrobiologi Akademi Ilmu Pengetahuan China. Kedua strain tersebut dikultur dengan menggunakan media agar TCBS (Thiosulfat-Citrat-Bile Salt-Sukrosa) (Tianhe, Hangzhou, China). China ). Kemudian dikultur dalam Zobell2216E broth yang terdiri atas 15% gliserol pada suhu 70 0c, strain E.coli DH5α, BL21 (DE3) (Novagen) yang digunakan untuk subsion dan menyatakan Ompk gen. Ompk gen. pGEM-TEasy vector plasmid digunakan untuk megawetkan cloning Ompk gen untuk proses Sequencing. pET-30a(+) (Novagen) dengan etiketnya digunakan untuk membangun recombinant plamid yang dihasilkan.
Gambar 1. Identifikasi elektroforesis dari Ompk cloning gen dan deteksi dari pET-Ompk recombinant plasmid oleh analisis pembatasan enzim. Baris 1. DNA marker (DL2000); Baris 2-3, 846 Bp fragment amplifikasi dari gen Ompk ; Baris ke-4, deteksi dari pET-Ompk rekombinan plasmid disarikan dengan BamHI dan Xhol; Baris ke-5, pET-30a (+); Baris ke-6, Generuler TMDNA Lander Mix. 2.2 Kloning gen Ompk Genomik DNA dari strain V.alginolyticus ZJ04107 diekstraksi dari kultur pada media tumbuh Vibrio dengan menggunakan pemurnian DNA genomik wizard kit (Promega) menurut prosedur manual pada produk. Dirancang menurut sequencing dari kebanyakan wilayah awetan dari Ompk Vibrio lainnya Vibrio lainnya di GenBank (Gambar 2). Primer (P1 ATGCG-TAAATCACTTTTAGCTCTTAG) dan primer P2 (TTAGAACTTGTAAGTTACTGCCGATGTAG) digunakan untuk memperoleh fulllength open reading frame (ORF) dari Ompk gen. proses menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR) dilakukan dengan denaturasi awal pada suhu 950c selama 3 menint; 32 siklus dengan tahapan denaturasi selama 45 detik pada suhu 94 0c, annealing selama 30 detik pada suhu 54,5 0c dan ekstensi selama 3 menit pada suhu 72 0c, dan reaksi disempurnakan dengan melakukan inkubasi pada suhu 72 0c selama 10 menit. Produk dari PCR dianalisa dengan melakukan elektroforesis dengan 1,0% gel agarose, dan dimurnikan dengan PCR Purification kit (Sangon, Shanghai, China). Produk PCR yang murni kemudian di sub-kloningkan kedalam pGEM-T-Easy vector (Promega). Rekombinan plasmid kemudian diidentifikasi dengan analisis pembatasan enzim dan di Sequencing pada sebuah Sequencer ABI Prisma otomatis (Invitrogen). 2.3 Konstruksi dari Plasmid Rekombinant Primer (P3 GCGAATTCGCGGCTACTTCAGCTCCAGTTATG dan primer P4 GCCTCGAGAACTTGTAAGTTACTGCGATGTAGT dengan elemen pembatasan spesifik (BamH I/Xho 1) yang dirancang dari sequencing cloning nukleotida untuk menuju proses amplifikasi sandi sequencing untuk Ompk protein, dan disatukan kedalam PCR. Prosedur PCR dilakukan seperti berikut : Denaturasi awal pada suhu 94 0c selama 3 menit; 30 siklus dari 35 s pada suhu 940c, 30 s pada suhu 60,5 0c, dan 1,5 menit pada suhu 72 0c, diikuti dengan penambahan 10 menit pada suhu 72 0c. hasil produk PCR kemudian di digestion dengan endonuclease yang sama. Produk plasmid dinamakan pET-Ompk dideteksi dengan analisa pembatasan enzim dan tahapan sequencing. 2.4 Pernyataan dan Pemurnian Dari Nilai Rekombinan Protein Kultur yang dilakukan selama 24 jam dari BL21 (DE3) yang mengandung nilai rekombinan plasmid pET-Ompk diencerkan 1:100 (v/v) dalam LB segar dengan Kanamycin (50 µg ml-1) dan diinkubasi pada suhu 37 0c hingga
kepadatan absorbansi optikal 600 nm (OD 600) mencapai 0,6. pernyataan nilai protein disebabkan oleh 1 mM isoprophyl- β-D-thiogalaktosida (IPTG)(BBI) selama 5 jam pada suhu 37 0c setelah optimalisasi kondisi pernyataan. Sel bakteri diambil dengan metoda sentrifugasi pada 10 000 xg selama 20 menit pada suhu 4 0c. Kemudian seluruh pellet dicuci dengan 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dan 100 mM NaCl (pH 8.0), disuspensi kembali dalam 50 mH Buffer Natrium Posfat (pH 8.0) terdiri atas 10 mM Imidazole dan 8 M Urea, kemudian diinkubasikan selama 30 menit dalam ice bath. Suspensi sel diganggu oleh dentuman dalam ice bath (350 w, 10 menit x 3). Diikuti dengan sentrifugasi pada 12000 xg selama 20 menit pada suhu 4 0c. Sel yang tertinggal dibuang, lapisan supernatant digunakan untuk pemurnian dengan sifat afinitas kromatografi pada Ni-NTA superflow resin (Pierce) menurut instruksi pabrikan. Bagian yang di elusi kemudian dikumpulkan dan dianalisa dengan SDS-PAGE dengan 12% gel acrylamide. Konsentrasi protein dianalisa dengan menggunakan metode Lowry. Protein murni disimpan pada suhu -40 0c sebelum digunkaan. 2.5 Antiserum Serum dari kelinci telah digunakan untuk mendeteksi nilai rekombinasi protein. Dua ekor kelinci Selandia Baru laki-laki dewasa, secara beraturan diimunisasikan secara Intramuskular dengan rekombinasi protein Ompk murni (300 µg tiap kelinci) dan diemulsikan dengan Freund’s complete adjuvant. Setelah 4 minggu dari proses imunisasi awal, diberikan dosis lain dari protein murni dalam Freund’s complete adjuvant (100 µg protein per dosis). Dua minggu berikutnya, Sampel darah diambil dari kelinci dan dibekukan pada suhu ruang selama 1 jam, dan disimpan pada suhu 4 0c semalaman. Dengan menggunakan sentrifugasi, antiserum yang dipisahkan disimpan pada suhu -70 0c. Serum kelinci yang telah diimunisasikan diencerkan 1:3000 dan ditambahkan pada masingmasing sampel Ompk murni selama 15 jam inkubasi. Setelah dicuci sebanyak 6 kali dengan 1xPBS plus 0,5% Tween20, sampel yang telah diinkubasikan dengan 1:1000 antibodi kambing sekunder antibodi anti-kelinci dikonjugasikan dengan HRP selama 15 jam. Setelah pengembangan substrat, plate dibaca dengan menggunakan plate reader. 2.6 SDS-PAGE dan Analisa Western Blot Pernyataan dari rekombinasi protein Ompk telah diuji dengan elektroforesis gel Sodium dodecyl Sulfate Polyacrylamide (SDS-PAGE). Menggunakan antiserum kelinci polyklonal yang telah disiapkan melawan rekombinasi protein Ompk. Aktifitas kekebalan telah dianalisa dengan metode Western blot menurut prosedur standart ( Sambrook et al., 2000 ). Lima puluh mikroliter dari sampel protein dicampur dengan jumlah yang sama dari 2x SDS loading buffer, dan dipanaskan selama 10 menit. Duabelas persen SDS gel Polyacrylamide digunakan untuk menganalisa rekombinasi protein. SDS-PAGE telah dilakukan dalam sistem elektroforesis protein menggunakan EPS 601 Elektroforesis Power Suplai (Amersham). Setelah proses elektroforesis
dilakukan, gel diwarnai dengan Coomasie briliant blue R250 untuk penampakan pita protein. Setelah SDS-PAGE, pita protein dipindahkan ke membran nitrosellulosa (Hybond-C,Amersham) dan membran diperlakukan dengan larutan blocking (5% susu bebas lemak) selama 2 jam. Setelah mencuci sebanyak tiga kali (15 menit untuk masing-masing waktu) dengan TBST ( TBS dengan 0,05% Tween-20). Membran diinkubasikan dengan anti-Ompk serum kelinci dicairkan dengan 1:800 dengan guncangan lembut selama 1 jam. Dan dilanjutkan dengan inkubasi selama 1 jam dengan Horse Radish Peroksida (HRP)-dikonjugasi dengan antikelinci Immunoglobulin G antibodi (Diagnosa Roche) diencerkan 1:1000. Setelah melalui pencucian dengan TBST, membran dicelupkan ke dalam HRP TMB (Tetramethylbenzidine) Liquid Membran Substrate (Amresco, Solon, USA) untuk pengembangan warna 2.7 Vaksinasi dan Uji Tantang Pseudosciaena crocea (n=250) dengan berat sekitar 50 gram yang diambil dari Keramba budidaya di Ningbo, China, secara random dibagi menjadi dua kelompok. Dan diaklimatisasi selama satu minggu. Sementara divaksinasi, ikan dibius dengan dimasukkan ke dalam 50 mgL -1 larutan Tricaine methan sulfonate (MS-222), grup 1 (n=125) telah secara intraperitonel diimunisasikan dengan Ompk (100 µg protein tiap ikan) dalam 100 µl dari PBS Steril, kelompok 2 (n=125) secara oral diinjeksi dengan 100 µl PBS sebagai negatif kontrol. Dua minggu kemudian, ikan diperlakukan dengan prosedur yang sama. Ikan dipelihara dalam 6 m 3 air yang masuk dengan proses filterisasi pasir dan perlakuan UV air laut pada suhu 28 0c. Salinitas 36 ppm, pH 8.0 dan 7,5 mg/l oksigen terlarut melalui proses injeksi oksigen. Ikan diberi makan dua kali setiap hari dengan 3-5 mm pelet diet kering (10% karbohidrat, 20% lemak, 55% protein dan 12% kadar abu). Setelah 4 minggu, lima ekor ikan pada tiap-tiap kelompok mengalami pendarahan dari pembuluh darah caudal. Dan Sera digunakan sebagai antibodi pada pendeteksian. Tabel 1. Strain dan Kenaikan jumlah dari gen Ompk yang digunakan untuk Analisa Strain untuk Kenaikan Ompk Jumlah V.alginolyticus DQ063588 V.parahaemolyticus DQ016304 V.vulnificus AE016795 a = P.,Photobacterium
Starin untuk Ompk V. chloreae V.harveyi V.profundum a
Kenaikan Jumlah AE004301 DQ279076 CR378665
Sisa ikan pada masing-masing kelompok kemudian secara random dibagi menjadi 2 sub-kelompok (60 per kelompok) untuk uji tantang. Ikan pada duasubkelompok dari masing-masing kelompok kemudian dibius. Dan berturut-turut ditantang dengan injeksi pada Intraperitoneal dengan strain V.alginolyticus
ZJ04107 dan strain yang khusus. Dosis uji tantang dari dua strain secara berturut-turut adalah 1,0x10 8 CFU (100 µl dari 1 x 10 9 CFU ml-1) dan 4,0x10 8 CFU (00 µl dari 1 x 10 9 CFU ml-1) per ikan (LD 50 yang ditentukan sebagai 2,0x107 CFU untuk strain ZJ04107 dan 8,0x10 7 untuk strain khusus pada pengujian kadar logam pendahuluan). Suspensi bakteri dipersiapkan sebagai berikut : strain V.alginolyticus ZJ04107 dan strain khusus ditumbuhkan semalaman dalam Zobell2216E broth pada suhu 37 0c. Diambil dengan cara sentrifugasi pada 6000 xg selama 10 menit dan dicuci tiga kali dengan PBS buffer. Bakteri akan tersuspensi dalam 0,01 M PBS (pH 7.8) dan konsentrasi disesuaikan kira-kira 1x10 9 CFU ml-1. jumlah kumulatif kematian dan tanda-tanda klinis dicatat tiap hari selama tiga minggu setelah uji tantang. Kematian ikan diotopsi untuk menentukan penyebab kematian dan untuk mengetahui pengaruh keberadaan dari V.alginolyticus dalam jaringan oleh kultur bakteri pada media agar TCBS. Persentase relatif survival (RPS) dikalkulasikan sebagai : RPS=1(Kematian kelompok yang divaksin/kematian kelompok kontrol) x 100% (Amend,1981 Amend,1981). ). Perbedaan signifikan dikalkulasikan menggunakan uji Fisher’s exact.
Gambar 2. Pelurusan Sequencing Ompk dari V.alginolyticus dan strain lainnya (daftar pada tabel 1). Sequencing asam amino diperjelas dengan menggunakan program Clustal W dari Bioinformatika Institut Eropa (Cambridge, Inggris). Idntitas residu asam amino ditunjukkan pada kotak yang dihitami, dan blok abuabu menunjukkan residu yang sejenis. Perbedaan tersebut diluruskan dengan ditandai (-). Tanda panah menunjukkan signal-sequence peptide cleavage. V-XA menunjukkan kutub ellips. Wilayah yang digunakan untuk rancangan primer ditunjukkan dengan kutub vertikal.
2.8 Elisa Lima sampel sera dari masing-masing kelompok yang divaksinasi dan kelompok kontrol diambil untuk dianalisa melalui enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Antisera dan negatif kontrol dilarutkan pada 2-fold serial in a 96lubang ELISA plate ( 50 µg per lubang/sumur) dan dihentikan dengan inkubasi pada 40c selama seharian. Plate dicuci tiga kali dengan PBS yang mengandung 0,1% Tween-20, dihalangi dengan 10% susu krim yang mengandung 0,02% NaN3 selama 12 jam pada suhu 4 0c dan dicuci tiga kali dengan PBST.antigen Ompk dalam PBS (40 µg/ml, 50 µl per lubang/sumur) telah ditambahkan (pelemahan sera dan konsentrasi dari antigen Ompk ditunjukkan pada uji pendahuluan). Setelah 12 jam inkubasi pada suhu 4 0c, plate dicuci tiga kali dengan PBST dan direaksikan dengan anti kelinci-serum Ompk, kemudian direaksikan dengan goat anti-rabbit IgG. Reagen pewarna (0,25% ophenylendiamine, asam sitrat-H 2O 1.02 g NaH 2PO4.12H2O 3.69 g/100 mL) telah ditambahkan pada 100 µl di tiap-tiap lubang. Dan diinkubasikan selama 20 menit pada suhu 25 0c, 1 M H2SO4 ditambahkan untuk menghentikan reaksi. Plate kemudian dibaca pada 492 nm dengan menggunakan micro-plate reader. Perbedaan signifikan kemudian dikalkulasikan menggunakan uji Student’s.
Gambar 3. (A) SDS-PAGE dari pET-Ompk pada E.coli (DE3). Baris 1, Protein molekular marker, Baris ke-2, pET-Ompk dengan induksi IPTG. Baris ke-3, pETOmpk tanpa induksi IPTG, Baris ke-4, pET-30ª(+) dengan IPTG Induksi. (B) Analisa Western blot dari pET-Ompk. Baris 1 Protein molekulat marker, Baris ke2 pET-Ompk dengan induksi IPTG; Baris ke-3, pET-30ª(+) dengan induksi IPTG.
3. Hasil dan Pembahasan 3.1 Kloning gen Ompk Dengan menggunakan PCR dan proses sequencing, 846 bp full length ORF dari gen Ompk telah dihasilkan dari genome DNA V.alginolyticus strain ZJ04107 (Gambar ( Gambar 1). 1). Sequence asam amino yang dihasilkan dari gen Ompk terdiri atas 281 residu asam amino dengan berat berat molekul diprediksikan adalah 31,3 kDa. Jumlah protein Ompk terdiri atas 261 asam amino (Gen Bank accession no dq063588) 3.2 Karekterisasi Sequence Berdasarkan data di GenBank, Ompk dari V.alginolyticus telah V.alginolyticus telah ditemukan memiliki kesamaan yang sangat tinggi dengan bakteri Vibrio spp Vibrio spp lainnya (Tabel ( Tabel 1). Identitas asam amino memiliki kisaran : 81,2% dengan V.parahaemolyticus , V.parahaemolyticus , 78,1% dengan V.harveyi , 75,2% dengan V.vulnificus . 73,7% dengan V.chloreae , yang mengindikasikan bahwa protein Ompk telah diawetkan. Analisa pelurusan dari terjemahan sequence asam amino dari Ompk juga telah ditunjukkan dapat diawetkan (Gambar ( Gambar 2). 2). Dimana dapat menyediakan antigen permukaan untuk kandidat vaksin terbaik. Pada C-terminal, protein Ompk memiliki a phenylalanine, sebuah karakteristik yang umum terdapat pada protein membrane lapisan luar (Struywe et al., 1991). 1991 ).
Gambar 4. titer spesifik antibody ELISA pada serum Pseudosciaena crocea 4 minggu setelah divaksinasi dengan Ompk. Lima kolom pada (A) adalah sera dari ikan yang divaksinasi divaksinasi dengan Ompk. Pada (B) adalah sera dari ikan yang tidak divaksin dengan Ompk. 1 – 5 adalah jumlah individu ikan. Dasil diperoleh dengan pengamatan duplo. Perbedaan signifikan dari kelompok control p<0,05
Gambar 5. Tingkat kelulus hidupan Pseudosciaena crocea setelah uji tantang dengan V.alginolyticus ZJ04107 (A) dan strain khusus/khas. (B) kelompok divaksin dengan Ompk. Merupakan kelompok ikan yang tidak divaksin dengan Ompk. Perbedaan signifikan dari kelompok control telah diperoleh pada table (A) dan (B). Analisa menggunakan SignalP 3.0, ORF dari Ompk termasuk kedalamnya 20 asam amino signal peptide dalam daerah N-terminal. Dimana umumnya memiliki karakteristik pada signal bakteri peptida. Signal peptide memiliki sebuah bagian pembelahan bersama untuk petunjuk peptidase. Pada posisi-3 hingga -1, A(G/S/L/T/V/C)-X-A- adalah umum diamati dalam proses sequence (Von Heijne,1985,1986). Heijne,1985,1986 ). Pada gambar 2, tanda panah menunjukkan bagian signal-sequence peptide merusak bagian. Posisi asam amino -3 hingga -1 adalah V-M(L/F)-A untuk Ompk, dimana tetap konsisten dengan sequence yang diamati V-X-A dari signal peptide transmembran OMP. Karakterisasi dengan menggunakan struktur β-barrel, OMPs transmembran dapat berpindah menyeberangi membrane sitoplasma oleh mesin sekresi. membelah signal peptide oleh Leader peptidase (Lep) dan tiba di lapisan luar membrane ( Schulz, 2002, Eicken et al., 2002 ). 3.3 Pernyataan dan Pengukuran Protein Ompk rekombinasi Dideteksi oleh analisa enzim pembatasan (Gambar 1) dan proses sequencing. Pernyataan konstruksi rekombinasi plasma pET-Ompk telah diperlakukan pada E.coli BL21 (DE3), dan kontrol negative telah ditransformasikan ditransformasi kan dengan pET-30a(+) vector sendirian. Percobaan pendahuluan menunjukkan bahwa dimulainya pernyataan nilai rekombinan dari protein pada 2.5 h dan mencapai maksimum level pada 4-6 h. Selanjutnya, waktu optimal untuk pernyataan protein adalah 5 h setelah induksi 1 mM IPTG. Rekombinan
protein dianalisa dengan menggunakan SDS-PAGE dengan 12% SDS gel polyacrilamide. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kedua nilai rekombinan protein Ompk diperoleh melebihi pernyataan pernyataan pada E.coli BL21 (DE3) (Gambar 3A). dengan tambahan western blot analisa menggunakan serum anti-kelinci. Sifat antigen dari gabungan rekombinan protein telah didemonstrasikan. Kelinci yang telah diimunisasi sera mengenali rekombinan protein Ompk memiliki ukuran yang sama seperti rekombinan gabungan protein dengan etiket-nya. 3.4 Vaksinasi dan Uji Tantang Respon immunitas dari Pseudosciaena crocea terhadap vaksinasi Ompk telah dapat diketahui dengan menggunakan ELISA. Ikan yang divaksin secara intraperitoneal dengan Ompk menghasilkan antibody anti-Ompk yang sangat efektif. Pada ikan yang divaksinasi, antibody melawan Ompk secara statistik berfungsi pada pengenceran serum 1:100 dalam hubungannya dengan negative kontrol. Gambar 4 mengindikasikan bahwa titer spesifik antibody melawan Ompk terdeteksi pada seluruh sera dari Pseudosciaena crocea yang divaksinasi menggunakan ELISA (p<0,05) ( p<0,05).. Control test menunjukkan penurunan absorbansi menurut kepada uji pelemahan antigen dan antibody. Dengan vaksinasi Ompk, ikan memperoleh perlindungan pada tingkatan tertentu. Hasil menunjukkan bahwa tingkat kelulushidupan ikan secara signifikan lebih tinggi pada ikan yang divaksin dibandingkan kelompok kontrol setelah uji tantang dengan strain V.alginolyticus ZJ04107 dan strain khusus lainnya (Gambar 5). Pada hari ke-tiga, ikan mulai ada kematian pada kelompok control, pada hari ke 5-10, ikan mengalami peningkatan kematian mendadak, kemudian menurun hingga hari ke-17. Bagaimanapun, pada kelompok ikan yang divaksinasi memiliki tingkat kelulushidupan secara signifikan lebih tinggi dibandingkan ikan yang tidak divaksin. Dari perbandingan pada gambar 5A dan B, sangat mudah untuk mengetahui bahwa, strain khusus RPS (79,2%) adalah lebih tinggi dibandingkan strain ZJ04107 (70,4%). Dimana diindikasikan bahwa keganasan dari strain khusus lebih lemah dibandingkan isolasi strain ZJ04107 dari Pseudosciaena crocea patogen besar. Selanjutnya hal ini juga mengindikasikan ikan yang divaksinasi dengan Ompk dapat berbeda dalam melawan strain V.alginolyticus . analisa Histopatologi dari ikan yang divaksin dengan ikan yang tidak divaksin yang dapat bertahan hidup melawan uji tantang bakteri dapat mengungkapkan tanda dari luka jaringan yang dihasilkan dari infeksi v.alginolyticus. luka berat pada umumnya yang sedang diamati terdapat pada liver, limpa dan ginjal termasuk beberapa nekrosis dan heemorhagic (data tidak dapat ditampilkan). V.alginolyticus, adalah satu dari bakteri Vibrio patogen yang paling utama Terhadap binatang laut.. dan memimpin terhadap dampak kerusakan ekonomi pada budidaya ikan. Sangatlah dirasa perlu untuk mengembangkan vaksin yang efektif untuk melawan bakteri pathogen lainnya. Vaksinasi dengan Omps telah ditunjukkan sangat efektif dalam melawan infeksi Aeromonas salmonicida, V.anguillarum, dan A.hydrophilia pada ikan. (Fong ( Fong et al.,2000, Bricknell et al., 1999). 1999 ). Studi ini menunjukkan bahwa awetan Ompk dari strain V.alginolyticus
ZJ04107 adalah kandidat vaksin terbaik dari V.alginolyticus. Pada saat yang bersamaan, peneliti mengamati apakah awetan Ompk ini juga berguna sebagai vaksin yang efektif melawan bakteri Vibrio pathogen Vibrio pathogen lainnya. Kesimpulan Studi ini didukung oleh bantuan dana dari National Key Technologies R&D Program, China (No. 2004BA757C) dan Zhejiang Province Key Technologies R&D Program, China (No. 2005C23085) dan Dr. Zhijuan Mao Referensi Amend, D.F, 1981, Potency testing of fish vaccines, In : Anderson, D.P., Hennesen, H (eds) Fish Biologics. Serodiagnostics and Vaccines, Departemen Standarisasi Biologi, Karger, Basel, hal.447-454 Bricknell, I.R., King,J.A., Bowden, T.J., Ellis, A.E., 1999, Duration of Protective Antibodies, And the Correlation With Protection In Atlantic Salmon ( Salmo solar L) Following Vaccination With an Aeromonas salmonicida Vaccine Containing Iron-Regulated Outer Membrane Proteins and Secretory Polysaccharide. Fish Shellfish Immunol. 9, hal.139-151 Eicken,C., Sharma, V., Klabunde, T., Lawrnz, M.B., Hardham, J.M., Norris, S.J., Sacchettini, J.C., 2002, Crystal Structure of Lyme Disease Variable Surface Antigen VIsE of Borrelia burgdorferi J. Biol. Chem.227, 2169121696 Fang H.M., Ling, K.C., Ge, R., Sin, M., 2000, Enhancement of Protective Immunity In Blue Gourami, Trichogaster trichopterus (Pallas), against Aeromonas hydrophila dan Vibrio anguillarum by A.hydrophila major adhesion. J. Fish, Dis 23. hal 137-145 Hlady, W.G., Klontz, K.C., 1996, The Epidemiology of Vibrio Infections In Florida, 1981-1993. J.Infect, Dis.173, 1176-1183 Inoue, T., Matsuzaki, S., Tanaka.S., 1995, Cloning and Sequence Analysisi of Vibrio parahaemolyticus Ompk gen encoding a 26-kDa outer membrane protein, that serves a receptor for a broad-host-range Vibriophage, KVP40. FEMS Microbiol, Lett, 134. 245-249 Lee, Kuo-kau, Yu, Shu-Ru, Liu, Ping-Chung, 1996, Alkaline serine protese Is a Ecotoxin of V.alginolyticus In Kuruma Prawn, Penaeus japanicus, Curr, Microbiol, 34, Hal 110-117 McLaughlin J.C., 1999, In:Murray,P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A., Tenofer, F.C., Yolken, R.H.,(Eds)., Manual of Clinical Microbiology, Edisi ke-7, ASM Press, Washington, D>C., hal465-476. Vibrio Morris, J.G., Black, R.E., 1985, Chlorela and Chlorela and other Vibrioses in Vibrioses in the United States, N.Engl. J.Med. 312. 343-350 Pizza,M., Scarlato, V., Masignani. V., et al., 2000. Identification Of Vaccine Candidates Against Serogroup B Meningococcus by Whole-genome Sequencing. Science 287, 1816-1820
Qian, R.H., Chu, W.Y., Mao, Z.J., et al., 2007. Expression, Characterization and Immunogenicity of a Major Outer Membrane Protein From Vibrio alginolyticus , Acta Biochim. Biophys. Sin.39, 194-200 Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 2000. Molecular cloning: a Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor. Schulz, G.E., 2002, The Structure of Bacterial Outer membrane Protein. Biochem. Biophys. Acta 1565, hal 308-317 Struywe, M., Moons, M., Tommassen, J., 1991. Carboxy-terminal Phenylalanine Is essential For The Correct Assembly Of a Bacterial Outer Membrane Protein. J.Mol. Biol 218, 141-148 Tsolis, R.M., 2002. Comparative Genome Analysis Of The Alpha-Proteobacteria : Relationships Between Plant and Animal Pathogens and Host Specifity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12503-12505 Von Heijne, G., 1985, Signal Sequence. The Limits Of Variation. J.Mol.Biol 184, 99-105 Von Heijne, G., 1986, A New Method For Predicting Signal sequence Cleavage Sites. Nucl.Acid Res. 14, 4683-4690 Zorilla, L., Arijo, S., Chabrillon, M., Diaz, P., et al., 2003, Vibrio species Vibrio species Isolated From Diseased Farmed Sole (Solea ( Solea senegalensis, kaup), and Evaluation Of The Potential Virulence Role Of Their Extracellular Products. J.Fish Dis 26. hal 103-108
