Analises Em Plantas -Neto

Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas

Egídio Bezerra Neto Lev evyy Paes Bar B arret retoo

UFRPE 2011

M  E E UNIVERSIDADE UNIV ERSIDADE FEDERAL FEDERAL RURAL RUR AL DE PERNAMBUCO Reitor: P. P. V V C  A A  Diretor da Editora Universitária da UFRPE: A M F A C C Av. Dom Manoel de Medeiros, s/n Dois Irmãos – Recife / PE CEP: 52171-900 Autores: P. P. E B N  P. L P B Projeto Gráco e Capa: B  S L Departamento de Química Tel.: (81)3320-6367 [email protected] [email protected] Catalogação na Fonte Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE B574m B57 4m

Bezerra Bezer ra Neto, Egídio Análises Análi ses químicas quím icas e bioquímicas em plantas / Egídio Bezerra Neto, Levy Paes Barreto. -Recife: UFRPE, Editora Universitária da UFRPE, 2011. 2011. 261p. 261p. : il. 1. ANÁLISE QUÍMICA 2. QUÍMICA VEGETAL 3. NUTRIÇÃO MINERAL I. Barreto, Levy Paes II. Título CDD 581.19 ISBN: XXXXXXXXXXXXXX

Apresentação 7 1 | Coleta e Preparo de Amostra Vegetal para Análise Química 9 2 | Determinação de Umidade 13 3 | Determinação de Resíduo Mineral Minera l (R.M.) (R.M.) 16 4 | Determinação de Açúcares Redutores em Caldo de Cana 20 5 | Determinação de Sacarose em Caldo de Cana 27 6 | Determinação de Amido 35 7 | Determinação de Carboidratos Solúveis Totai Totaiss 41 8 | Determinação de Sacarose 48 9 | Determinação de Açúcares Redutores 53 10 | Determinação de Carboidratos Totais Não Estruturais 59 11 | Determinação de Óleo em Sementes de Oleaginosas 64 12 | Determinação de Fibra Bruta 69 13 | Determinação de Nitrogênio Total e Estimativa do Teor de Proteína Bruta 73 14 | Determinação de Proteína Solúvel 79 15 | Determinação de Aminoácidos Livres Totais 84 16 | Determinação de Prolina Livre em Tecido Tecido Foliar Fresco 90

O I R Á M U

S

17 | Determinação de Glicinabetaina 93 18 | Determinação de Nitrato em Tecido Vegetal 99 19 | Determinação da Atividade de Nitrato Redutase (E.C.1.6.6.1) em Tecido Vegetal 103 20 | Determinação da Atividade da Peroxidase (EC 1.11.1.7) 110 110 21 | Atividade Atividade da Fenilalanina Fenilalani na Amônia Liase (EC. 4.3.1.5) 115 22 | Determinação da Atividade da Beta Glucanase (EC 3.2.1.39) 119 23 | Separação de Pigmentos Fotossintéticos por Cromatograa em Papel 123 24 | Determinação de Clorola em Tecido Foliar 127 25 | Derminação Derm inação da Acidez em Suco de Frutas 130 26 | Determinação do pH em Suco de Frutas 136 27 | Determinação de SST em Suco de Frutas 138 28 | Determinação de Vitamina C em Suco de Frutas 141 29 | Determinação de Fenóis Totais 146 30 | Determinação Determi nação de Fenóis Fenóis Totais e Taninos 150

31 | Determinação de Carbono Orgânico Total em Tecido Vegetal 156 32 | Digestão Nitro-Perclórica para Análise de Elementos Minerais 161 161 33 | Determinação de Fósforo 165 34 | Determinação Determi nação de Enxofre 170 170 35 | Determinação Determi nação de Cloreto 173 36 | Determinação Determi nação de Boro 177 37 | Determinação de Silício 182 38 | Determinação de Sódio e Potássio em Tecidos Vegetais por Fotometria de Chama 188 39 | Determinação de Nutrientes Minerais por Espectrofotometria de Absorção Atômica 192 Anexo 1 | Conselhos Úteis para Trabalhos em Laboratório 203 Anexo 2 | Instruções In struções para Elaboração de Relatórios Relatórios de Análises Químicas Quí micas 205 Anexo 3 | Transformações de Resultados de Análises Químicas 207 Anexo 4 | Exercícios Propostos 209 Anexo 5 | Padronização de Soluções 240

Anexo 6 | Composição Bromatológica Aproximada de Algumas Hortaliças, Frutas e Culturas de Larga Escala 246 Anexo 7 | Princípios Básicos de Análises Espectrofotométrica 248 Anexo 8 | Tabela de Eynon-Lane para Análise de Açúcares, Titulando 10 mL da Solução de Soxhlet 254 Anexo 9 | Concentração de Alguns Ácidos Comuns em Laboratórios 256 Anexo 10 | Teores Adequados de Nutrientes Minerais nas Folhas para Diversas Culturas 257 Anexo 11 | Tabela Períódica dos elementos químicos 260

A PRESENTAÇÃO

O livro “A Q  B  P ” é direcionado à área agrária, mais especicamente à nas Universidades e Centros de Ensino. Foi concebido com base no interesse dos professores-autores Dr. Egídio Bezerra Neto e Levy Paes Barreto (que lecionam no Departamento de Química da Universidade Federal Rural de Pernambuco) de favorecer o processo de aprendizado ao trazer para os estudantes valiosas recomendações sobre trabalhar num laboratório, a sequência usada na elaboração de relatórios de aulas práticas (que tanto os confunde) e representações de tabelas. Os que desejarem aprender vão encontrar nesse livro uma ferramenta útil para responder aos seus questionamentos no que concerne a essas análises. A estrutura de cada prática traz esclarecimentos importantes que se traduzem logo na introdução, seguida pelos métodos e técnicas utilizados. Para sedimentar o aprendizado, o livro conta com exercícios propostos nos anexos. Tais ações desenvolvem sobremaneira o lado cognitivo e fazem aorar o interesse por um tema que pertence à realidade do mundo acadêmico e que no futuro, fará parte do dia a dia dos prossionais que a Universidade assume a missão de formar.

Egídio Bezerra Neto • Levy Paes Barretos | 7

Considero meus queridos colegas Egídio e Levy pesquisadores competentes, que com muita dedicação nos presenteiam esta obra: ao mesmo tempo um material rico, que norteia as análises de natureza Química e Bioquímica. Agradeço o convite para apresentar esse trabalho, o que me honrou. Expresso também a minha alegria pela homenagem (veja contra-capa) ao meu também querido colega Prof. Emanoel Lopes de Albuquerque. Sêneca nos disse que “Ensinando, aprende-se”. Este livro é uma prova do trabalho responsável dos professores que dividem agora com os seus alunos um pouco do que aprenderam ensinando e os convidam a aprender mais, para que um dia possam ensinar outros. Esse é o pensamento coletivo da nossa Universidade, comprometida na busca do conhecimento cientíco. E é na difusão desse conhecimento que encontramos no meio acadêmico a contribuição maior que podemos deixar para a sociedade.

Rosangela Ma S. Lucena Prof a. do Departamento de Química da UFRPE

Recife, maio de 2011

C OLETA DE

E

P REPARO

A MOSTRA VEGETAL

PARA

A NÁLISE Q UÍMICA I. I NTRODUÇÃO O sucesso de qualquer método analítico que visa a caracterização do estado siológico da planta, dos processos bioquímicos, e dos produtos dela obtidos, baseia-se fundamentalmente em dois fatores: a. Correto estabelecimento dos métodos para coleta, conservação e preparo das amostras de órgãos ou de tecidos a analisar. b. Interpretação correta dos resultados em função de um sistema referencial. Na amostragem de uma população a ser analisada deve-se estabelecer a representatividade da amostra, isto é, tomar um número de amostras individuais ou compostas que realmente espelhem a população dentro da variabilidade natural. Os tecidos frescos são altamente perecíveis, assim como, após a coleta continuam a funcionar os processos siológicos e


1

começa a se estabelecer a senescência com o aumento da respiração, hidrólise de proteínas, etc. Para a realização de testes bioquímicos, os quais simulam as condições in vivo , é necessária a utilização de tecido recém-colhido. Neste caso, devem-se promover as análises imediatamente após a coleta ou promover um sistema adequado para a conservação da amostra, como o congelamento, por exemplo. Para análise de certos componentes orgânicos como proteínas, carboidratos, etc. bem como dos nutrientes minerais, o melhor meio de conservação da amostra é através da desidratação em estufa com circulação forçada de ar regulada entre 60 e 70°C, moagem e em seguida acondicionamento em recipiente hermeticamente fechado. A amostra assim tratada chama-se “amostra preparada ou amostra pré-seca”. Em algumas situações, antecedendo o processo de conservação da amostra, é necessário realizar a descontaminação do material vegetal. No caso de amostras impregnadas por solo ou poeira, as mesmas devem ser lavadas inicialmente com água corrente (potável), posteriormente com detergente neutro a 0,1% e por último com água destilada. No entanto, se o material vegetal foi adubado via foliar ou pulverizado com defensivos agrícolas, o mesmo deve ser submetido a lavagem com HCl a 3% em substituição ao detergente neutro citado anteriormente. É importante que o tempo total de lavagem não ultrapasse 3 minutos com vistas a evitar perdas de nutrientes como K e Ca.

10 | Análises Químicas e Bioquímicas em Plantas

II. M ARCHA A NALÍTICA PARA P REPARO DE A MOSTRA VEGETAL PARA A NÁLISE V ISANDO O A SPECTO A LIMENTAR OU N UTRICIONAL 1. Colher (ou obter no mercado) a amostra, seguindo os critérios da representatividade; 2. Quando necessário, lavar o material com água corrente, detergente neutro a 0,1% ou HCl a 3%, conforme o caso, seguida de lavagem com água destilada, e deixar secar à sombra; 3. Acondicionar em saco plástico limpo e transportar para o la boratório, o mais breve possível; 4. Cortar o material em pequenos fragmentos (0,5–1,0cm) e colocar em recipiente aberto tipo bandeja; 5. Levar o material a uma estufa regulada a 60–70°C e deixar desidratando por cerca de 48–72 horas (ao nal desse tempo, o material deve apresentar aspecto quebradiço); 6. Moer o material em moinho de facas de aço inoxidável (tipo Willey), com peneira de 2mm; 7. Acondicionar o material em recipiente hermeticamente fechado e devidamente identicado.


III. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, mimeografado, 1975. 130p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


D ETERMINAÇÃO

DE

U MIDADE

I. I NTRODUÇÃO O conteúdo de água das plantas, também denominado de teor de umidade, varia de uma espécie vegetal para outra e, dentro da mesma espécie, varia de um órgão para outro, bem como, com o estádio de desenvolvimento da planta. As plantas lenhosas contêm, em seus caules, cerca de 50% de água. Os caules das plantas herbáceas contêm normalmente 70 a 80% de água enquanto que certos frutos podem atingir até mais de 90% de água, como por exemplo, a melancia. As sementes maduras geralmente contêm de 7 a 15% de água (veja ANEXO 5). Como regra geral o teor de água nos tecidos está relacionado com as atividades metabólicas dos mesmos. É importante conhecer o teor de umidade dos tecidos e das amostras porque a preservação das mesmas está relacionada com o teor de umidade, além de que para se comparar o valor nutritivo de dois ou mais alimentos, tem-se que levar em consideração os respectivos teores de matéria seca. A matéria seca é a amostra isenta de umidade. Nos trabalhos de rotina dos laboratórios, geralmente se determina o teor de umidade de tecidos vegetais pelo método indireto. Por este processo, pesa-se uma quantidade de amostra e em seguida a mesma é posta para desidratar completamente.


2

Após completa desidratação, pesa-se a matéria seca e por diferença calcula-se o quanto a amostra tinha de umidade, expressando-se o resultado em termos de percentagem. Na realidade, outras substâncias voláteis (óleos essenciais, por exemplo) além da água, são desprendidas, ocasionando algum erro, o qual pode geralmente ser considerado desprezível. Tradicionalmente, na determinação de umidade, recomenda-se pesar a amostra e colocar a mesma em uma estufa regulada a 100-105°C até obter peso constante. Entretanto na prática, muitos laboratórios adotam o método rápido de determinação de umidade. Pelo método rápido, a amostra após ser pesada é colocada em uma estufa regulada a 135° C por uma hora; em seguida deixa-se a mesma esfriar em um dessecador e pesa-se a matéria seca.

II. M ARCHA A NALÍTICA PARA D ETERMINAÇÃO U MIDADE PELO M ÉTODO R ÁPIDO

DE

1. Tarar um pesa-ltro previamente seco em estufa; 2. Pesar no próprio pesa-ltro 5,0 g da amostra; 3. Colocar o pesa-ltro (aberto) em uma estufa regulada a 135 ºC (± 2 ºC) e deixar desidratando por uma hora; 4. Fechar o pesa-ltro e transferir para um dessecador; 5. Aguardar cerca de 10 a 15 minutos e em seguida pesar o pesaltro com a amostra seca;


6. Calcular o teor de umidade e expressar o resultado em termos de percentagem.


CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, mimeografado, 1975. 130p. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.


3

D ETERMINAÇÃO

DE

R ESÍDUO

M INERAL (R.M.) I. I NTRODUÇÃO Os elementos minerais que as plantas absorvem, seja pelas raízes, seja pela parte aérea são classicados em elementos essenciais, elementos úteis (ou benécos) e elementos tóxicos. Não existe uma metodologia universal para analisar todos estes elementos conjuntamente. Contudo, a maior parte dos elementos contidos nos tecidos vegetais pode ser analisada partindo de um extrato único. A preparação de extratos vegetais para a análise dos elementos minerais pode ser realizada tanto através de uma digestão seca como de uma digestão úmida. A digestão seca é obtida através da incineração (calcinação) da amostra e em seguida dissolução do resíduo mineral (cinza) em um ácido. Portanto, a cinza corresponde ao resíduo inorgânico resultante da oxidação (através da queima) completa da matéria orgânica, e representa o total de elementos minerais. A digestão por via úmida é obtida através da ação de ácidos minerais concentrados (ácido nítrico, ácido perclórico, etc.) à temperatura elevada (veja capítulo 32). Durante a digestão por via seca, além de água, gases como CO2 , NH3 , e outros são eliminados, permanecendo no cadinho


apenas o resíduo mineral, o qual é formado de cátions como: K , Na , Mg2+ , Fe3+ , Al3+ , etc. e ânions como silicato, fosfato e sulfato e dos respectivos óxidos. O conteúdo de resíduo mineral varia de espécie para espécie vegetal. Dentro da mesma espécie vegetal varia com o órgão e idade da planta. O teor de cinzas está diretamente relacionado com a atividade metabólica. Desta forma, as folhas contêm muito mais cinzas de que as sementes. O lenho (madeira) contém pouca cinza. +

+

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Aquecer um cadinho em uma mua à temperatura de 350°C por uma hora; 2. Deixar o cadinho esfriar em dessecador e em seguida pesar no mesmo 2,0000g da amostra; 3. Colocar o cadinho com a amostra em um fogareiro elétrico ou bico de Bunsen com chama branda e deixar o material carbonizar completamente. Reconhece-se que o material está completamente carbonizado quando o mesmo deixar de eliminar fumaça; 4. Transferir o cadinho para uma mua previamente aquecida a 300°C e em seguida regular a mesma para 575°C (± 25°C); 5. Após quatro horas, baixar a temperatura da mua para 300°C. Quando esta temperatura for atingida, transferir o cadinho para um dessecador, deixar o mesmo esfriar e pesar;


2

6. Calcular o conteúdo de cinzas e expressar em termos de percentagem. O:

1. Nunca abrir a mua quando a mesma estiver aquecida a mais de 350°C. 2. Se após quatro horas de calcinação a amostra ainda não se apresentar com cor clara, continuar o processo de calcinação por mais duas ou quatro horas. 3. Não desprezar as cinzas. As mesmas podem ser utilizadas para a determinação do conteúdo de certos elementos como fósforo, cálcio, potássio, sódio, etc. Para isto, é necessário preparar o extrato das cinzas conforme segue: a. Com o auxílio de um bastão de vidro dissolver as cinzas (R.M.), usando 10 mL de HCl 2 N; b. Filtrar para um balão volumétrico de 100 mL; c. Lavar o cadinho e resíduo do ltrado com água destilada e completar o volume do balão volumétrico;




SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos , Vicosa: UFV, 2002. 235p.


4

D ETERMINAÇÃO

DE

R EDUTORES

C ALDO

M ÉTODO

DE

EM

AÇÚCARES DE

C ANA

E YNON -L ANE

I . INTRODUÇÃO

Os monossacarídeos em geral, em reações de óxido-redução, comportam-se como agentes redutores, fornecendo elétrons ao sistema, sendo eles, simultaneamente oxidados, transformando-se nos ácidos carboxílicos correspondentes. Um exemplo dessa reação é ilustrado na Figura 1. O método de Eynon-Lane para análise de açúcares redutores, está fundamentado na propriedade acima exposta, de forma que o cobre, presente na solução de Soxhlet, é reduzido pelo açúcar redutor. Nessa reação, a redução do cobre cúprico (Cu2+) para cobre cuproso (Cu ) ocorre com a formação de um precipitado vermelho tolo, característico da formação de óxido cuproso (Equação II). Durante a titulação, usa-se o indicador azul de metileno para auxiliar na visualização do ponto nal da reação. Os sucos de frutas em geral são ricos em monossacarídeos como glucose, frutose, etc., os quais podem ser analisados conjuntamente pelo método de Eynon-Lane. O caldo de cana+


de-açúcar apresenta, entre outros açúcares redutores, uma elevada proporção de glucose e frutose. A mistura equimolecular desses dois açúcares é denominada de açúcar invertido, e sua análise constitui uma rotina de elevada importância na agroindústria açucareira.

H H HO H H H

C C C C C C H

O OH H OH OH OH

NaO

+

cupritartarado de sódio e potássio

glucose

HO H HO H H H

C C C C C C H

O C H C O 2 Cu H C O C KO O

O OH H OH OH OH

ácido glucônico

NaO +

2

O

C H C OH H C OH C KO O

tartarato duplo de sódio e potássio

+

Cu2O

óxido cuproso

F 1. Esquema representativo da oxidação da glucose, pelo cobre presente na solução de Soxhlet, durante a titulação pelo método de Eynon-Lane.


II. M ARCHA A NALÍTICA PARA D ETERMINAÇÃO DE A ÇÚCAR I NVERTIDO EM C ALDO DE C ANA - DE A ÇÚCAR 1. Pesar 20g de caldo de cana em uma cápsula de porcelana (ou recipiente equivalente); 2. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 200mL, e adicionar 4mL do claricante acetato neutro de chumbo (54,3°Brix); 3. Agitar suavemente o balão e em seguida adicionar 6mL da solução fosfato-oxalato para remover o cálcio e o excesso de chumbo; 4. Completar o volume do balão com água destilada. Se necessário adicionar 2 a 3 gotas de éter para remover a espuma; 5. Agitar e ltrar com papel de ltro qualitativo; 6. Com o ltrado, encher uma bureta de 50mL e zerar a mesma; 7. Preparar a solução de Soxhlet, pipetando para um erlenmeyer de 250mL, 25mL da solução A e 25mL da solução B do licor de Fehling. Usar pipetas volumétricas nesta operação; 8. Pipetar para dois erlenmeyers separadamente, 10mL da solução de Soxhlet recentemente preparada (item 7). Nesta operação também é recomendado usar pipeta volumétrica;


E P* 9. Em um erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet (item 8), adicionar a frio, 15mL do ltrado contido na bureta (item 6) e colocar para aquecer em um fogareiro elétrico; 10. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adicionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. O nal da titulação é reconhecido pela mudança da cor azul para vermelho tolo; 11. Se após adicionar o indicador (item anterior), vericar que já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma diluição do ltrado. Como sugestão, pipetar 50mL do ltrado para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme descrito nos itens 9 e 10; 12. Anotar o volume do ltrado gasto no ensaio preliminar, o qual servirá como referência para a realização do ensaio denitivo; E D* 13. Novamente, encher a bureta com o ltrado (diluído se for o caso), zerar a mesma e em seguida pegar outro erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet e adicionar a frio, o volume do ltrado correspondente ao que foi gasto na titulação do ensaio preliminar, menos 2mL;


14. Colocar o erlenmeyer para aquecer e 2 minutos após o início da fervura, adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. A titulação do ensaio denitivo não deve gastar mais que 1 minuto após a adição do indicador; 19. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio denitivo e calcular a percentagem de açúcar invertido do caldo de cana, mediante correlação com os valores da tabela de Eynon-Lane (ANEXO 8). OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio único, com adição de 15mL do ltrado a frio na solução de Soxhlet, adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul para vermelho tolo (Pessoa et al., 2007).

III. P REPARO D OS R EAGENTES a. Acetato neutro de chumbo. Dissolver cerca de 250g de acetato neutro de chumbo em 500mL de água (solução saturada) e em seguida ltrar em tecido de náilon de malha na. b. Solução A de Soxhlet. Dissolver 34,639g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O) em cerca de 300mL de água destilada e em seguida completar o volume para 500mL. Filtrar e transferir para recipiente apropriado.


c. Solução B de Soxhlet. Dissolver 173g de tartarato duplo de sódio e potássio em cerca de 300mL de água destilada, adicionar 100mL de hidróxido de sódio a 50% e em seguida completar o volume para 500mL. Filtrar e transferir para recipiente apropriado. d. Solução fosfato-oxalato. Pesar 3,0g de oxalato de potássio e 7,0g de fosfato dissódico, dissolver separadamente em água destilada, em seguida misturar as duas soluções e completar o volume para 100mL. e. Solução de azul de metileno a 1% . Pesar 1,0g de azul de metileno, dissolver em água destilada e completar o volume para 100mL.


IV. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, mimeografado, 1975. 130p. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008.

1020p. PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do tempo de aquecimento precedente à adição do indicador na análise de amido pelo método de Eynon-Lane.

In

: VII JORNADA DE

ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.


D ETERMINAÇÃO EM M ÉTODO

DE

DE

C ALDO

S ACAROSE DE

C ANA

E YNON -L ANE

I. I NTRODUÇÃO A sacarose é o açúcar comum comercial, amplamente distribuído nas plantas superiores, constituindo em certas espécies, tais como a cana-de-açúcar e a beterraba, uma reserva de grande importância. Nestas, por exemplo, sua extração produz matéria prima para grandes indústrias mundiais. Quimicamente a sacarose é um dissacarídeo formado pela união de uma molécula de glucose com uma molécula de frutose. Ao contrário da glucose e da frutose que são açúcares redutores, a sacarose não é um açúcar redutor, portanto não pode ser determinada diretamente pelo método de Eynon-Lane. No entanto, a sua hidrólise produz partes iguais de glucose e frutose (açúcar invertido) os quais são açúcares redutores, podendose desta forma, determinar o teor de sacarose, indiretamente, por este método. Para tanto, provoca-se hidrólise da sacarose, determina-se o teor de açúcar invertido e em seguida, através de um cálculo estequiométrico obtém-se o teor de sacarose que continha a amostra. Veja a estequiometria a seguir:


5

C12H22O11 + H2O sacarose

água

H+

C6H12O6 + C6H12O6 glucose

342 (sacarose)

360 (açúcar invertido)

X

X =

sacarose =

frutose

1

342 x 1 360

=

0,95

a.i. x 0,95

É importante salientar que todo caldo de cana-de-açúcar contém normalmente uma determinada quantidade de açúcar invertido, a qual é denominada aqui como açúcar invertido previamente existente no caldo (a.i.c). A esta quantidade de açúcar invertido soma-se o proveniente da hidrólise da sacarose (a.i.s), dando o que denominamos de açúcar invertido total (a.i.t). Como mostram as equações abaixo, por subtração pode-se saber o teor de açúcar invertido proveniente da hidrólise da sacarose. a.i.c + a.i.s = a.i.t a.i.s = a.i.t - a.i.c


O método químico de determinação de açúcares redutores baseia-se na propriedade que têm estes açúcares de reduzir o cobre da solução Soxhlet. O cobre presente na solução de Soxhlet encontra-se na forma de cupritartarato de sódio e potássio (Cu2+), oriundo da reação de sulfato de cobre com o tartarato duplo de sódio e potássio. Esta solução apresenta-se de cor azul piscina. Sob a ação de agentes redutores, como os açúcares redutores em geral, e em condições favoráveis, o cobre precipita na forma de óxido cuproso (Cu 2O), reconhecível pela coloração vermelho tolo. Sob a forma de óxido cuproso, o cobre encontra-se com o número de oxidação 1 , isto é, Cu , e portanto encontra-se reduzido. +

+

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 20,0g de caldo de cana em uma cápsula de porcelana (ou recipiente equivalente); 2. Transferir, quantitativamente, para um balão volumétrico de 200mL, e adicionar 4mL do claricante acetato neutro de chumbo (54,3°Brix); 3. Agitar suavemente o balão e em seguida adicionar 6mL da solução fosfato-oxalato para remover o cálcio e o excesso de chumbo; 4. Completar o volume do balão com água destilada. Se necessário, adicionar 2 a 3 gotas de éter para remover a espuma;


5. Agitar e ltrar com papel de ltro rápido; 6. Para provocar a hidrólise da sacarose, transferir 50mL do ltrado para um balão volumétrico de 100mL e adicionar 20mL de água destilada; 7. Introduzir um termômetro no balão volumétrico e colocar para aquecer em “Banho-Maria” até o líquido atingir 65°C; 8. Atingida a temperatura desejada, retirar o balão volumétrico da fonte de aquecimento e imediatamente adicionar 5mL de ácido clorídrico concentrado (12,5 N); 9. Agitar suavemente o conteúdo do balão e em seguida deixar em repouso por 30 minutos para que ocorra a hidrólise da sacarose. Enquanto espera a hidrólise da sacarose, determinar o teor do açúcar invertido previamente existente no caldo de cana (a.i.c). A I P E  C

10. Tomar outra porção do ltrado (item 5), encher e zerar uma bureta de 50mL, para determinação do açúcar invertido previamente existente no caldo de cana; 11. Preparar a solução de Soxhlet, pipetando para um erlenmeyer de 250mL, 25mL da solução A e 25mL da solução B do licor de Fehling. Usar pipetas volumétricas nesta operação; 12. Agitar a solução de Soxhlet, referida no item anterior e em seguida, com o uso de uma pipeta volumétrica, transferir


quatro porções de 10mL, para erlenmeyers individuais, com capacidade para 250mL; 13. Em um erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet (item 12), adicionar a frio, 15mL do ltrado contido na bureta (item 10) e colocar para aquecer em um fogareiro elétrico; 14. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adicionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. O nal da titulação é reconhecido pela mudança da cor azul para vermelho tolo; 15. Se após adicionar o indicador (item anterior), vericar que já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma diluição do ltrado. Como sugestão, pipetar 50mL do ltrado para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme descrito nos itens 13 e 14; 16. Anotar o volume do ltrado gasto no ensaio preliminar, o qual servirá como referência para a realização do ensaio denitivo; E D*

17. Novamente encher e zerar a bureta com o ltrado (diluído se for o caso) e, em seguida, usar outro erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet e adicionar, a frio, o volume do


ltrado correspondente ao que foi gasto na titulação do ensaio preliminar, menos 2mL; 18. Colocar o erlenmeyer para aquecer e 2 minutos após o início da fervura, adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. A titulação do ensaio denitivo não deve gastar mais que 1 minuto após a adição do indicador; 19. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio denitivo e calcular a percentagem de açúcar invertido do caldo de cana, mediante correlação com os valores da tabela de Eynon-Lane (ANEXO 7). A I T

20. Transferir o conteúdo do balão volumétrico referido no item 9, para um balão volumétrico de 500mL e em seguida com o auxílio de NaOH 2,5 M e de um peagâmetro (ou papel indicador), elevar o pH do meio para quase neutro (levemente ácido); 21. Completar o volume do balão volumétrico e em seguida determinar o teor de açúcar invertido total, titulando a solução de Soxhlet em dois ensaios, conforme foi realizado para a determinação do açúcar invertido previamente existente no caldo de cana; 22. Calcular a percentagem de açúcar invertido total, em segui-


da a percentagem de açúcar invertido proveniente da hidrólise da sacarose e, nalmente, a percentagem de sacarose. OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio único, com adição de 15mL do ltrado a frio na solução de Soxhlet, adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul para vermelho tolo (Pessoa et al., 2007).

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

(Vj  4)



CARVALHEIRA, J.H.P. da. Química vegetal. Recife: UFRPE, mimeografado, 1975. 130p. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz. 2008. 1020p.

PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do tempo de aquecimento precedente à adição do indicador na análise de amido pelo método de Eynon-Lane.

In

: VII JORNADA DE ENSINO,

PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.


D ETERMINAÇÃO M ÉTODO

VOLUMÉTRICO DE

DE

A MIDO

E YNON -L ANE

I. I NTRODUÇÃO O amido é um polissacarídeo de reserva das plantas superiores, formado pela união de várias moléculas de glicose. Pode ser encontrado em folhas, no entanto seu armazenamento é mais comum em raízes, tubérculos e grãos. O amido é extraído industrialmente do trigo, milho, arroz, mandioca, batata, etc. Por ser um alimento bastante rico em calorias e de fácil assimilação pelo organismo humano, é muito utilizado na alimentação de crianças e de adultos. Pela mesma razão, dos animais domésticos em geral. Da mesma forma que a sacarose, o amido não pode ser determinado diretamente pelo método de Eynon-Lane, pois o mesmo não é um açúcar redutor. No entanto, sua hidrólise completa produz a glicose, a qual pode ser determinada diretamente pelo método de Eynon-Lane, por se tratar de um açúcar redutor. Desta forma, para se analisar o amido pelo método de Eynon-Lane, provoca-se a sua hidrólise através de um ácido mineral forte, determina-se o teor de glicose e em seguida calcula-se estequiometricamente quanto havia de amido na amostra. A seguir, é fornecida a equação da hidrólise do amido, com


6

a demonstração da estequiometria necessária à conversão de glicose em amido. (C6H10O5)n + nH2O amido 162

+

nC6H12O6

água

glicose

18

180

162 (amido) X

180 (glicose) 1

amido = glicose x 0.9

Antes de se provocar a hidrólise do amido, é necessário remover os açúcares solúveis que porventura existam na amostra, como sacarose, glicose, frutose, etc. A remoção dos açúcares solúveis é feita através de uma solubilização em água destilada e em seguida ltração.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 1 a 3g da amostra, transferir para um béquer de 125mL e adicionar cerca de 50mL de água destilada; 2. Agitar por 1 hora em mesa agitadora orbital e em seguida ltrar lavando o resíduo com 250mL de água destilada; 3. Transferir o resíduo para um erlenmeyer de 500mL, adicionar 200mL de água destilada e, em seguida, 20mL de HCl 8 M;


4. Adaptar ao erlenmeyer, um condensador de reuxo e colocar para aquecer por três horas, sob ebulição suave; 5. Após as três horas de aquecimento, deixar esfriar e com o auxílio de NaOH 2,5 M e de um peagâmetro (ou papel indicador), elevar o pH do meio para quase neutro (levemente ácido); 6. Adicionar 4mL de acetato neutro de chumbo (54,3°Brix), homogeneizar e em seguida adicionar 6mL da mistura fosfatooxalato; 7. Transferir o conteúdo do erlenmeyer para um balão volumétrico de 500mL e completar o volume; 8. Filtrar e com o ltrado encher uma bureta de 50mL. Em seguida, zerar a bureta para posterior titulação da solução de Soxhlet; 9. Para preparar a solução de Soxhlet, pipetar para um erlenmeyer 20mL da solução A e 20mL da solução B. Usar pipetas volumétricas nesta operação. 10. Agitar suavemente a solução de Soxhlet referida no item anterior e, em seguida, com o uso de uma pipeta volumétrica, transferir 2 porções de 10mL, para erlenmeyers individuais, com capacidade para 250mL; E P*

11. Em um dos erlenmeyers contendo 10mL da solução de So-


xhlet, adicionar a frio, 15mL do ltrado referido no item 8 e colocar para aquecer em fogareiro elétrico; 12. Marcar 15 segundos após o início da fervura, e então adicionar 3 gotas do indicador azul de metileno e continuar a titulação gota a gota, sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. O nal da titulação é reconhecido pela mudança de cor azul para vermelho tolo; 13. Se após adicionar o indicador (item anterior), vericar que já ocorreu a mudança de cor, torna-se necessário fazer uma diluição do ltrado. Como sugestão, pipetar 50mL do ltrado para um balão volumétrico de 100mL, completar o volume com água destilada e repetir o ensaio preliminar conforme instruções anteriores; 14. Anotar o volume do ltrado gasto no ensaio preliminar, o qual servirá como referência para o ensaio denitivo; E D*

15. Novamente encher e zerar a bureta com o ltrado (diluído se for o caso) e em seguida pegar um erlenmeyer contendo 10mL da solução de Soxhlet e adicionar a frio, o volume do ltrado correspondente ao que foi gasto na titulação do ensaio preliminar, menos 2mL; 16. Colocar o erlenmeyer para aquecer e, 2 minutos após o início da fervura, adicionar 3 gotas de azul de metileno e completar


a titulação sem remover o erlenmeyer da fonte de aquecimento. A titulação do ensaio denitivo não deve gastar mais que 1 minuto após a adição do indicador; 17. Anotar o volume gasto na titulação do ensaio denitivo e calcular a percentagem de amido na amostra analisada. OBS.: Esta análise também pode ser realizada em ensaio único, com adição de 15mL do ltrado a frio na solução de Soxhlet, adicionando-se o indicador azul de metileno dois minutos após a fervura e continuando a titulação até a viragem da cor de azul para vermelho tolo (Pessoa et al., 2007).

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

(Vj  4)




PESSOA, C. de O.; SANTOS, D. S. dos; BARRETO, L.P. Efeito do tempo de aquecimento precedente à adição do indicador na análise de amido pelo método de Eynon-Lane.

In

: VII JORNADA DE ENSINO,

PESQUISA E EXTENSÃO DA UFRPE, 2007.


D ETERMINAÇÃO

DE

C ARBOIDRATOS S OLÚVEIS TOTAIS M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO

DE

A NTRONA

I. I NTRODUÇÃO Quimicamente os carboidratos são polihidroxialdeídos ou polihidroxicetonas ou compostos que por hidrólise produzem esses compostos. Fisiologicamente são compostos de elevado teor caloríco, servindo como fonte de energia para os organismos em geral. Além da função de reserva energética, merece destaque a função estrutural desempenhada pela celulose, como componente da parede celular dos vegetais. No universo dos carboidratos existem aqueles que são insolúveis em água tal como a celulose e os que são solúveis em água como a sacarose, frutose e glicose, estes últimos são chamados de açúcares solúveis. Os carboidratos solúveis podem ser determinados colorimetricamente mediante o aquecimento dos mesmos em presença de antrona. Nestas condições, a reação ocorre com a formação de compostos de coloração esverdeada. A reação da antrona fundamenta-se na ação hidrolítica e desidratante do ácido sulfúrico concentrado sobre os carboidratos, e na conse-


7

quente condensação com a antrona, formando um composto colorido. Quando a reação é realizada com dissacarídeos, trissacarídeos ou polissacarídeos, estes são hidrolisados a monossacarídeos os quais são desidratados para furfural ou hidroximetil furfural. Essas substâncias se condensam com a antrona originando um composto de coloração azul (Figura 2). A primeira etapa da determinação de carboidratos solúveis em tecido vegetal consta da extração de tais açúcares, empregando-se um solvente ou sistema de solventes cuja escolha vai depender da natureza do tecido a ser analisado, se no estado fresco ou seco. Quando se pretende determinar carboidratos em amostra seca, a água destilada é o solvente mais indicado para a extração dos açúcares solúveis. No entanto, se o material a ser analisado tratar-se de folhas verdes, recomenda-se o uso de etanol a 70% ou 80% como sistema de solvente extrator de açúcares. Sabe-se que os carboidratos, mesmo os de baixo peso molecular, não se solubilizam em etanol, e sim, solubilizam-se muito bem em água. Por outro lado, o etanol é um ótimo solvente para as clorolas, as quais interferem negativamente na análise dos carboidratos solúveis pelo método da antrona, haja vista tratar-se de um método colorimétrico. Para solucionar este problema, após a extração dos carboidratos solúveis em folhas frescas, usando etanol a 70% ou 80%, removem-se os pigmentos fotossintéticos através de uma cromatograa de partição, empregando-


se clorofórmio ou benzeno, resultando com isto a fase aquosa livre dos pigmentos e contendo os carboidratos. O C H C OH HO C H H C OH H C OH H C OH H hexose H

H HO C H

H2SO4 -3H 2O

O C

H

O hidroximetil furfural O

H HO C H

O C

+

H

O H H antrona

hidroximetil furfural O

C H

O

derivado de coloração azul

H C OH H

F 2. Esquema da reação química característica da identicação de carboidratos em presença de antrona.


II. M ARCHA A NALÍTICA P  

1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlenmeyer de 125mL; 2. Adicionar 20mL de etanol* a 80%; 3. Agitar por 30 minutos e em seguida ltrar em tecido de náilon de malha na; 4. Completar o volume do ltrado para 50mL com água destilada; 5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um tubo de ensaio rosqueával, identicar e manter o extrato diluído em refrigerador até o momento da análise química. OBS.: Este extrato também pode ser usado para a determinação de sacarose. Embora a água destilada seja um bom solvente para a extração dos carboidratos solúveis, é recomendado usar etanol a 70 ou 80% por duas razões: o etanol auxilia a quebrar a tensão supercial facilitando uma melhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvimento de microorganismos.


P     

6. Preparar uma bandeja de isopor (ou de polipropileno) com gelo triturado e colocar estantes com tubos de ensaio devidamente identicados para extratos das amostras e soluções padrões; 7. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 0,2mL dos extratos das amostras e das soluções padrões e manter em banho de gelo; 8. Adicionar a cada tubo de ensaio, 2,0mL do reagente antrona, fechar hermeticamente os tubos de ensaio e agitar suavemente até que a mistura se apresente bem homogênea, mantendo os tubos de ensaio em banho de gelo; 9. Cautelosamente transferir os tubos de ensaio para um aparelho de “banho-maria”, regulado a 100°C e manter sob aquecimento por 10 minutos, para o desenvolvimento da cor (azul esverdeada); 10. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 5 minutos para que sejam resfriados; 11. Transferir o conteúdo do tubo de ensaio para uma cubeta espectrofotométrica de 1,0mL e fazer a leitura em um colorímetro com ltro vermelho ou em espectrofotômetro a 620nm;


12. Proceder aos cálculos e expressar os resultados em termos de percentagem de carboidratos solúveis em relação à amostra analisada. OBS.: É recomendado realizar esta determinação com três repetições analíticas, e usar cubetas espectrofotométricas de vidro.

III. R EAGENTES Reagente especíco (antrona a 0,2%). Pesar 0,200g de antrona, dissolver em ácido sulfúrico 12,854 M e completar o volume para 100mL. Recomenda-se que esta solução seja preparada no mesmo dia a ser utilizada. O ácido sulfúrico 12,85 molar é preparado adicionando-se 500mL do ácido puro (96%) a 200mL de água destilada. S  Solução estoque de glucose (solução estoque 2,5 g.L-1). Pesar 0,500g de glucose (P.A.), dissolver em 100mL de água destilada e completar o volume para 200mL com etanol a 80%. Transferir para recipiente adequado e manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200 mg.L -1.


Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétricos de 100mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de glucose (2,5 g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de glicose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200 mg.L -1. O padrão zero corresponde à água deionizada. OBS.: Mais precisamente, as soluções padrões diluídas tam bém podem ser preparadas com base na massa em vez do volume.


YEMM, E. W. ; WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. Biochemical Journal , v.57, p.508-514, 1954.


8

D ETERMINAÇÃO

DE

S ACAROSE

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO DE VAN H ANDEL I. I NTRODUÇÃO A sacarose é obtida industrialmente da cana de açúcar ou da beterraba. É um dissacarídeo constituído por uma molécula de α-D-glucose interligada com uma molécula de β-D-frutose por ligação α 1-2. A sacarose não é um açúcar redutor, pois a mesma não possui hidroxila glucosídica livre. Este dissacarídeo é encontradoamplamente no reino vegetal, e na maioria das espécies predomina sobre os demais carboidratos solúveis. O método da antrona (Yemm & Willis, 1954) é um método colorimétrico que quantica todos os açúcares solúveis presentes na amostra (mono e oligossacarídeo). Tal metodologia pode ser empregada para a determinação dos oligossacarídeos solúveis de uma amostra, desde que se aplique um artifício para remover ou mascarar a presença dos monossacarídeos presentes na amostra. Van Handel (1968) descreve uma metodologia para a determinação da sacarose mediante uma prévia destruição dos monossacarídeos presentes na amostra, pela ação do hidróxido de potássio, e posterior desenvolvimento da cor em presença da antrona.


II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P  . Partindo de material vegetal pré-seco. 1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlenmeyer de 125mL; 2. Acrescentar 20mL de etanol* (80%) e tampar o erlenmeyer; 3. Colocar para agitar em mesa agitadora orbital por 30 minutos; 4. Filtrar o extrato em tecido de náilon de malha na, lavando o mesmo e completar o volume para 50mL com água destilada; 5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um tubo de ensaio rosqueával, identicar e manter o extrato diluído em refrigerador até o momento da análise química. OBS.: Para a determinação de sacarose pode ser usado o mesmo extrato preparado para a determinação de carboidratos solúveis totais. Embora a água destilada seja um bom solvente para a extração dos carboidratos solúveis, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: o etanol auxilia a quebrar a tensão supercial facilitando uma melhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvimento de microorganismos.


D   6. Pipetar para tubos de ensaio rosqueáveis, em separado, 200µL das soluções padrões de sacarose e dos extratos das amostras; 7. Acrescentar 200µL de KOH a 30 % em metanol; 8. Fechar hermeticamente os tubos de ensaio e colocar para aquecer em banho-maria por 10 minutos a 100°C; 9. Deixar resfriar em banho de gelo; 10. Com os tubos de ensaio ainda mergulhados no banho de gelo, acrescentar 2mL do reagente antrona, e em seguida agitar suavemente até que a mistura se apresente bem homogênea; 11. Transferir novamente para banho-maria a 100°C por 10 minutos para que ocorra o desenvolvimento da cor; 12. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 3 a 5 minutos para esfriar; 13. Efetuar as leituras espectrofotométricas no comprimento de onda de 620nm. OBS.: É recomendado realizar esta determinação com três repetições analíticas.


III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Reagente especíco: antrona a 0,2 % em ácido sulfúrico. Pesar 0,200g de antrona, dissolver em ácido sulfúrico 12,85 M e completar o volume para 100mL. Recomenda-se que esta solução seja preparada no mesmo dia a ser utilizada. O ácido sulfúrico 12,85 molar é preparado adicionando-se 500mL do ácido puro (96%) a 200mL de água destilada. Solução padrão de sacarose (solução estoque 2,5g.L-1). Pesar 0,500g de sacarose P.A., dissolver em água destilada e completar o volume para 200 mL. Transferir para recipiente adequado e manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200mg.L -1. Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétricos de 100 mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de sacarose (2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de sacarose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L -1. O padrão zero corresponde à água deionizada.


I V. B IBLIOGRAFIA Van HANDEL, E. Direct microdetermination of sucrose. Anal. Biochem., v.22, p.280-283, 1968.

YEMM, E.W.; WILLS, A.J. The estimation of carbohydrates by anthrone. Biochemical Journal , , v.57 v.57,, p.508-514, p.508-514, 1954. 1954.


D ETERMINAÇÃO

DE

AÇÚCARES

R EDUTORES M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO D E S OMOGYI E N ELSON I . I NTRODUÇÃO Os monossacarídeos em geral, em reações de óxido-redução, óxido-redução, comportam-se como agentes redutores, fornecendo elétrons ao sistema, sendo eles, simultaneamente oxidados, oxidados, transformandotran sformandose nos ácidos carboxílicos correspondentes. Um exemplo dessa reação é ilustrado na Figura 9.2 (Bezerra Neto e Barreto, 2004). O método de Somogyi Somogyi e Nelson fundamenta fu ndamenta-se -se na propriedade acima exposta, de forma que o cobre, presente na solução de Somogyi, é reduzido pelo açúcar redutor, formando um cromóforo azulado, relativamente estável, ao ser dissolvido em presença do arsenomolibdato do reagente de Nelson, permitindo dessa forma a sua leitura em espectrofotômetro a 760nm 760nm (Nelson, 1944; Somogyi, 1952) 1952).. Os sucos de frutas em geral são ricos em monossacarídeos como glucose, frutose, etc., os quais podem ser analisados con juntamente pelo método de Somogyi e Nelson. O caldo de cana-de-açúcar apresenta, entre outros açúcares redutores, uma


9

elevada proporção de glucose e frutose. A mistura equimolecular desses dois açúcares é denominada denominada de açúcar invertido, invertido, e sua análise constitui con stitui uma rotina de elevada elevada importância nas usinas de açúcar.

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO H H HO H H H

C C C C C C H

O OH H OH OH OH

NaO

+

H HO H H H

C C C C C C H

C H C O 2 Cu H C O C KO O cupritartarado de sódio e potássio

glucose

HO

O

O OH H OH OH OH

ácido glucônico

NaO +

2

O C H C OH H C OH C KO O

tartarato duplo de sódio e potássio

+

Cu2O

óxido cuproso

represent ativo da oxidação da glucose, glucose, pelo cobre presente F 3. Esquema representativo na solução de Somogyi, e a consequente redução do cobre a óxido cuproso.


P  . Partindo de material vegetal pré-seco.

1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlenmeyer de 125mL; 2. Acrescentar 20mL de etanol* (80%) (80%) e tampar t ampar o erlenmeyer; 3. Colocar para agitar em mesa agitadora orbital orbital por 30 mim inutos; 4. Filtrar o extrato em tecido de náilon de malha na, lavando o mesmo e completar o volume para 50mL com água destilada; 5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um tubo de ensaio rosqueável, identicar e manter o extrato diluído em refrigerador até o momento da análise química. OBS.: Para a determinação de açúcares redutores pode ser usado o mesmo extrato preparado para a determinação de carboidratos solúveis totais. Embora a água destilada seja um bom solvente solvente para a extração dos carboidratos carboidratos solúveis, solúveis, é recomendado usar etanol a 70 ou 80 % por duas razões: o etanol auxilia a quebrar quebrar a tensão supercial facilitando uma melhor interação do solvente com a amostra, além de propiciar uma melhor conservação do extrato, evitando o desenvolvimento de microorganismos.

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Le vy Paes Barretos | 55

D D    6. Pipetar para diferentes tubos de ensaio, 0,2mL das soluções padrões de glicose e dos extratos das amostras; 7. Acrescentar em cada tubo de ensaio 1,0mL do reagente de Somogyi, agitar suavemente e tampar o tubo de ensaio; 8. Aquecer os tubos de ensaio em banho-maria , à tempera temperatura tura de 100°C por 15 minutos; mi nutos; 9. Esfriar Esfria r os tubos em banho ban ho de gelo e depois acrescentar acresce ntar 1,0mL do reagente de Nelson; 10. Agitar suavemente e deixar em repouso por 20 minutos; 11. Acrescentar 5,0mL de água destilada e agitar suavemente; 12. Efetuar as leituras em espectrofotômetro no comprimento de onda de 760nm;

III. P REPARO D O S R EAGENTES R  S 28,0g de fosfato dibásico de sódio anidro (Na 2HPO4) ou 71g de fosfato dibásico de sódio duodeca-hidratado (Na 2HPO4.12H2O); O); 40,0g de tartarato duplo de sódio e potássio; 4,0g de hidróxido de sódio (dissolvido em 100mL de água destilada); 8,0g de sulfato de cobre (dissolvido em 80mL de água destilada); 180,0g de sulfato de sódio anidro;


Misturar os reagentes, dissolver bem e deixar em repouso por dois dias. Filtrar a solução em papel de ltro, armazenar em frasco escuro a temperatura ambiente. R  N 50,0 g de molibdato de amônio (dissolvido em 900mL de água destilada); 23,0mL de ácido sulfúrico concentrado (18 M); 6,0g de arsenato de sódio (Na 2H2SO4.7H2O), dissolvido em 50mL de água destilada; Misturar os reagentes, dissolver bem e deixar em repouso por dois dias. Filtrar a solução em papel de ltro, armazenar em frasco escuro a temperatura ambiente. Solução padrão de glucose (solução estoque 2,5g.L -1). Pesar 0,500g de glucose P.A., dissolver em água destilada e completar o volume para 200mL. Transferir para recipiente adequado e manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200mg.L -1. Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétricos de 100 mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de glucose (2,5 g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de glucose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L -1. O padrão zero corresponde à água deionizada.



NELSON, Norton. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. J. Biol. Chem., v.153, p.375-380, 1944. SOMOGYI, Michael. Notes on sugar determination. J. Biol. Chem., v.195, p.19-23, 1952.


D ETERMINAÇÃO DE

C ARBOIDRATOS TOTAIS N ÃO E STRUTURAIS

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO

DA

A NTRONA

I. I NTRODUÇÃO Carboidratos são compostos ricos em energia e que têm como principais funções nos vegetais: participar ativamente do metabolismo geral, atuar como compostos de reserva energética ou desempenhar função estrutural. Os carboidratos solúveis envolvem os monossacarídeos, oligossacarídeos e alguns poucos polissacarídeos. Esses, conjuntamente com os polissacarídeos hidrolisáveis formam os chamados carboidratos totais não estruturais (CTNE), que diferem dos carboidratos estruturais por conter a energia assimilável pelos animais monogástricos. A determinação de carboidratos pelo método da antrona é própria para a quanticação dos carboidratos solúveis contidos em amostras vegetais. Contudo, tal metodologia também pode ser empregada para a determinação de CTNE em amostra vegetal, desde que se convertam os oligo e polissacarídeos (amido) em suas unidades monométricas, com o mínimo de extração e hidrólise de carboidratos estruturais.


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II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P   1. Pesar 0,250g de amostra pré-seca e transferir para um erlenmeyer de 125mL; 2. Adicionar 20mL de ácido clorídrico 0,2 M; 3. Colocar para aquecer por uma hora em “ banho-maria”, em seguida deixar esfriar e ltrar em tecido de náilon de malha na; 4. Completar o volume do ltrado para 100mL com água destilada; 5. Homogeneizar e transferir uma alíquota de 10mL para um tubo de ensaio rosqueával, identicar e manter o extrato diluído em refrigerador até o momento da análise química. P     

6. Preparar uma bandeja de isopor (poliestireno) com gelo triturado e colocar estantes com tubos de ensaio devidamente identicados para extratos das amostras e soluções padrões; 7. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 0,2mL dos extratos das amostras e das soluções padrões e manter em banho de gelo; 8. Adicionar a cada tubo de ensaio, 2,0mL do reagente antrona, fechar hermeticamente os tubos de ensaio e agitar suavemen-


te até que a mistura se apresente bem homogênea, mantendo os tubos de ensaio em banho de gelo; 9. Cautelosamente transferir os tubos de ensaio para um aparelho de “banho-maria”, regulado a 100°C e manter sob aquecimento por 10 minutos, para o desenvolvimento da cor (azul esverdeada); 10. Após o desenvolvimento da cor, transferir novamente os tubos de ensaio para banho de gelo e aguardar cerca de 5 minutos para que sejam resfriados; 11. Transferir o conteúdo do tubo de ensaio para uma cubeta espectrofotométrica de 1,0mL e fazer a leitura em um colorímetro com ltro vermelho ou em espectrofotômetro a 620nm; 12. Proceder aos cálculos e expressar os resultados em termos de percentagem de carboidratos solúveis em relação à amostra analisada. O 1. É recomendado realizar esta determinação com três repetições analíticas. 2. O método da antrona também pode ser empregado para a determinação dos polissacarídeos de reserva (PR), expressos como amido. Para isto é necessário fazer a determinação dos CTNE e na mesma amostra determinar CST (carboidratos solúveis totais). Em seguida calcula-se o teor de PR pela equação seguinte: % PR = (% CTNE - % CST)


x 0,9; onde 0,9 representa o fator de conversão de glucose em amido.

III. R EAGENTES Reagente especíco (antrona a 0,2 %). Pesar 0,200g de antrona, dissolver em ácido sulfúrico 12,854 M e completar o volume para 100mL. Recomenda-se que esta solução seja preparada no mesmo dia a ser utilizada. O ácido sulfúrico 12,854 molar é preparado adicionando-se 500mL do ácido puro (96%) a 200mL de água destilada. Ácido clorídrico 0,2 M. Em um balão volumétrico com capacidade para 250mL, adicionar cerca de 200mL de água destilada, acrescentar 4,2mL de ácido clorídrico concentrado (12 M) em seguida completar o volume com água destilada. S  Solução estoque de glucose (solução estoque 2,5 g.L-1). Pesar 0,500g de glucose P.A., dissolver em água destilada e completar o volume para 200mL. Transferir para recipiente adequado e manter em refrigerador. A partir desta solução, são preparados os padrões de trabalho, nas concentrações de 0 a 200 mg.L -1. Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétricos de 100mL: 1, 2, 4, e 8 mL da solução estoque de glucose (2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este


procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de glicose nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L-1. O padrão zero corresponde à água deionizada. OBS.: Mais precisamente, as soluções padrões diluídas também podem ser preparadas com base na massa em vez do volume.

IV. B IBLIOGRAFIA SOUZA, A.E.R. de; SILVA, A.B. da; BEZERRA NETO, E.; ALBUQUERQUE, E.L. de. Calibração de metodologia para análise de carboidratos totais não estruturais em tecido vegetal. In: XXIX REUNIÃO NORDESTINA DE BOTÂNICA, Mossoró-RN. Anais… SNB. 2006. Cd-Rom. YEMM, E. W. ; WILLIS, A. J. The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone. Biochemical Journal , v.57, p.508-514, 1954.


11

D ETERMINAÇÃO S EMENTES M ÉTODO

DE

DE

DE

Ó LEO

EM

O LEAGINOSAS

S OXHLET

I. I NTRODUÇÃO As matérias graxas dos vegetais (óleos e gorduras) são misturas de glicerídeos e cerilídios constituídos de ácidos graxos os mais diversos, impuricados por vários lipóides. São encontradas fazendo parte das membranas celulares (onde exercem a função estrutural), na superfície de folhas e frutos (desempenhando a função protetora) e em grandes quantidades nas sementes de oleaginosas, com a função de reserva. As matérias graxas de origem vegetal, em particular os óleos, são amplamente extraídas das sementes de plantas oleaginosas, como: soja, girassol, algodão, oliva, mamona, pinhão manso, etc., assim como do endosperma sólido do coco, e do mesocarpo do dendê (também chamado de óleo de palma). É crescente a demanda por óleos ricos em ácidos graxos poliinsaturados nos produtos alimentícios de modo geral. O de maior consumo é o óleo de soja, o qual possui 61% de ácidos graxos poliinsaturados. O óleo de milho, o óleo de caroço de algodão e o óleo de amendoim contém respectivamente 42, 50 e


21% de ácidos graxos poliinsaturados (Shreve e Brink Jr., 1980) Do ponto de vista químico, os óleos são ésteres de ácidos graxos com glicerol. São insolúveis em água, mas solúveis em solventes orgânicos tais como, éter de petróleo, hexano, benzeno, clorofórmio e tetracloreto de carbono. São pouco solúveis em álcool frio, com exceção dos óleos de cróton, rícino e oliva. A extração das matérias graxas pode ser feita por três processos: a.Simples fusão com aquecimento a seco ou em presença de água. Por este processo, o calor dilacera as células vegetais e o óleo ou a gordura após a fusão se separa das impurezas por diferença de densidade. b. Pressão mecânica a frio, quando se tratar de um óleo, ou a quente, no caso de uma gordura. Neste processo, a matéria gordurosa é expulsa por pressão. c. Extração por solvente orgânico, que consiste em submeter a amostra à ação de um solvente orgânico e em seguida ltrar para separar os detritos vegetais da fase líquida, a qual consta da mistura da matéria graxa com o solvente. Finalmente o óleo (ou gordura) é separado do solvente por destilação, sendo recuperado o solvente. Esta separação ocorre graças a diferença entre o ponto de ebulição dos solventes orgânicos empregados (cerca de 60 a 70°C) e o ponto de ebulição das matérias graxas (em torno de 300°C). A extração das matérias graxas por este processo tem sido historicamente denomina-


da de extrato etéreo devido às primeiras extrações terem sido realizadas com o uso do éter. É importante salientar que o extrato etéreo obtido de materiais pobres em óleo e gordura, como as folhas em geral, apresenta em sua constituição uma boa parcela de outros compostos de natureza lipídica, como os pigmentos. O processo industrial de extração de óleo depende da matéria-prima, no caso do caroço de algodão, utiliza-se a ação combinada da prensagem seguida da extração por solvente, com o objetivo de aumentar o rendimento. Porém, quando a matériaprima é o grão de soja, a extração por solvente é realizada de modo contínuo, em contracorrente, através de diversos estágios de extração. Em termos de eciência, a extração por solvente pode recuperar até 98% do óleo (rendimento de 14,2kg/hl), enquanto a prensagem hidráulica (11,2kg/hl) ou em prensaparafuso (11,9kg/hl) pode recuperar 80-90% do óleo (Shreve e Brink Jr., 1980).

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Tarar um balão coletor previamente seco em estufa; 2. Com o auxílio de um almofariz e de um pistilo, macerar as sementes e pesar, em papel de ltro, 5,0g das mesmas, envolver no próprio papel de ltro e colocar em um cartucho extrator;


3. Transferir este conjunto para um extrator de Soxhlet; 4. Adaptar o extrator de Soxhlet ao balão e, em seguida, adicionar solvente (hexano) em quantidade suciente para sifonar uma vez e mais a metade da capacidade do extrator; 5. Conectar o conjunto extrator ao condensador e em seguida levar a uma fonte de aquecimento; 6. Ligar a fonte de aquecimento e a circulação de água (para resfriamento) e deixar a extração se processar por 8 horas; 7. Após a extração, recuperar o restante do solvente, retirar o cartucho com a amostra e levar o balão coletor para uma estufa regulada a 100°C; 8. Deixar o balão coletor na estufa por três horas e em seguida transferir o mesmo para um dessecador; 9. Deixar o balão coletor (contendo óleo) no dessecador por cerca de 10 minutos e em seguida pesar o mesmo e calcular a percentagem de óleo na amostra analisada. OBS.: Não desprezar a amostra desengordurada (livre de extrativos), pois a mesma serve para a análise de bra bruta.




SHREVE, R.N.; BRINK JR., J.A. Indústrias de processos químicos. 4ª Edição. Rio de Janeiro: LTC, 1980. 732 p. SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Visosa: UFV, 2002. 235p. STRYER, L. Bioquímica. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, 1996. 1000p il.


D ETERMINAÇÃO

DE

FIBRA B RUTA

M ÉTODO G RAVIMÉTRICO I. I NTRODUÇÃO As bras dos vegetais são constituídas principalmente por celulose, hemiceluloses e lignina, componentes estes encontrados em altas concentrações na parede celular das plantas. Em termos analíticos, denomina-se bra bruta, a bra de celulose associada a porções variáveis dos demais componentes citados acima, não extraídos por ácidos e bases diluídos e a quente. A celulose é o principal componente da parede celular e o composto de carbono mais abundante na natureza. É encontrada em forma mais pura nas bras de algodão submetido a cuidadoso tratamento de puricação. O material obtido por esse processo serve como celulose-padrão e apresenta cerca de 99,8% de pureza. As hemiceluloses são os principais polissacarídeos não celulósicos da parede celular e diferem da celulose, em termos analíticos, principalmente por serem solúveis em soluções alcalinas diluídas e serem hidrolisadas pela ação de ácidos diluídos a quente. Esse grupo de carboidratos estruturais é formado por xilana, xiloglicana, glicomanana, arabinoxilana e calose (Lacerda, 2002; Taiz e Zeiger, 2009)


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A lignina é um polímero de natureza fenólica, constituído por três diferentes álcoois de fenilpropanóides: coniferil, cumaril e sinapil. Tais álcoois são biossintetizados a partir do aminoácido fenilalanina. Como um polímero, a lignina é um composto de elevado peso molecular, e é considerada como produto nal do metabolismo do vegetal, pois quando o processo de lignicação é completado, a célula morre, formando o tecido de resistência. Tal composto pode ser hidrolisado pela ação dos ácidos ou bases sob condições apropriadas e altas temperaturas. A determinação da bra bruta de uma amostra vegetal é baseada na remoção (extração) dos demais constituintes da amostra, que não sejam a própria bra bruta. Essa extração é realizada através da hidrólise, solubilização e ltração dos compostos mais facilmente hidrolisáveis e solúveis, os quais não fazem parte do conjunto denominado de Fibra Bruta.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Transferir o resíduo da determinação de óleo para um erlenmeyer de 500mL, adicionar 200mL de ácido sulfúrico a 1,25%, fervente e, em seguida, colocar para aquecer em ebulição suave e sob reuxo por 30 minutos; 2. Filtrar, sob sucção (a vácuo), em funil de Büchner, usando como ltro um tecido de náilon de malha na;


3. Lavar o resíduo com cerca de 100mL de água destilada (fervente) e, em seguida, transferir o resíduo para o mesmo erlenmeyer usado anteriormente, usando 200mL de NaOH a 1,25% (fervente); 4. Colocar para aquecer em ebulição suave e sob reuxo por 30 minutos; 5. Filtrar sob sucção (a vácuo), em funil de Büchner, usando um papel de ltro previamente seco e tarado conjuntamente com um pesa-ltro; 6. Proceder uma lavagem do resíduo, usando água destilada quente, sob ltração a vácuo, até neutralizar o meio (usar papel indicador); 7. Proceder mais uma lavagem por ltração usando 20mL de álcool etílico, e em seguida, 20mL de éter de petróleo; 8. Transferir o papel com o resíduo para um pesa-ltro previamente seco e tarado, e em seguida colocar em uma estufa regulada a 100°C; 9. Após permanecer duas horas na estufa, transferir o pesa-ltro com o resíduo para um dessecador e deixar por cerca de 10 minutos; 10. Após esfriar, pesar o pesa ltro contendo o resíduo (bra bruta + cinzas). 11. Transferir o papel de ltro com o resíduo para um cadinho previamente queimado e tarado, e calcinar a 575°C ( ± 25°C) até obter as cinzas (cerca de 4 horas);


12. Levar o cadinho com as cinzas para um dessecador e deixar esfriar por cerca de 10 a 15 minutos; 13. Pesar o cadinho contendo as cinzas e calcular a percentagem de bra bruta na amostra.



LACERDA, C.F. Fisiologia Vegetal. Fortaleza: UFC, 2002. 356 p. il. SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Vicosa: UFV. 2002. 235p. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 820 p. il.


D ETERMINAÇÃO TOTAL

E

DE

N ITROGÊNIO

E STIMATIVA DE

M ÉTODO

DE

A RRASTE

DO

TEOR

P ROTEÍNA B RUTA

DE

VAPOR (K JELDAHL )

I. I NTRODUÇÃO As proteínas são compostos nitrogenados consideradas macromoléculas formadas a partir da união de vários aminoácidos entre si e que são largamente encontradas nos reinos animal e vegetal. Quanto à função biológica, as proteínas podem ser classicadas em enzimas, proteínas de armazenamento, proteínas transportadoras, proteínas protetoras, toxinas e hormônios. Dependendo do produto vegetal o teor de proteína bruta pode variar de 0,2% (maçã, mamão, etc.) até 17% (castanha do Pará) (Franco, 2000). Considerando que as proteínas em geral contêm cerca de 16% de N, o teor de proteína bruta (PB) de uma amostra vegetal pode ser determinado partindo-se da análise do nitrogênio total e em seguida multiplicando-se seu teor (%) pelo fator 6,25. Este fator é usado principalmente para órgãos de reserva, como por exemplo, grãos de milho e também para ovo e carne. No en-


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tanto, conforme cita Silva (1990), dependendo da natureza do material analisado, outros fatores de transformação podem ser usados, em função das proteínas existentes nestes materiais, possuírem um percentual de N diferente de 16. Alguns exemplos de fatores de transformação de N-total em proteína bruta são dados a seguir: endosperma de trigo (5,70), farelo de trigo (6,31), grão de trigo (5,83), grão de aveia (5,83), farelo de algodão (5,30), farelo de linho (5,30), amendoim (5,46), leite (6,38) e gelatina (5,55). A determinação de nitrogênio pelo método de Kjeldahl é realizada em três etapas, a saber: digestão, destilação e titulação. Durante a digestão da amostra, o nitrogênio orgânico é mineralizado pelo ácido sulfúrico em presença de catalisadores, a temperatura elevada (300°C). A mineralização do nitrogênio orgânico pode ser representada pela equação abaixo:

N-orgânico + H2SO 4

(catalizadores)

(NH 4)2SO4 + CO2 + H20

(I)

Após a digestão, processa-se a destilação, na qual o nitrogênio já mineralizado na forma do cátion amônio (NH 4+) é volatilizado na forma de amônia pela ação de uma base forte (NaOH por exemplo) e, em seguida, é recebido pelo ácido bórico (H3BO3), tornando-se disponível para uma posterior titulação.


As reações envolvidas durante a destilação são representadas a seguir: (NH 4)2SO4 + 2 NaOH Na4OH Na3 + H3BO3

2 NH 4OH + Na2SO4

(II)

NH3 + H2O

(III)

NH4H2BO3

(IV)

Após a destilação, a amônia (NH 3) é titulada por um ácido (H2SO4 por exemplo) e o nitrogênio é quanticado estequiometricamente. A titulação pode ser representada conforme esquema abaixo: 2 NH4H2BO3 + H2SO4

II. E STEQUIOMETRIA

(NH 4)2SO4 + 2 H3BO3 (V)

DOS

C ÁLCULOS

De acordo com a equação V, 2 NH 4 reagem exatamente com um mol de H 2SO4. Seguindo-se esta proporção e sabendose a concentração e volume do ácido empregado na titulação, calcula-se a quantidade de N total da amostra, conforme relações abaixo : +

2 NH4+ + H2SO4 28g (N) 14g (N) 14g (N) 0,7g (N) 0,7mg (N)

(NH 4)2SO4 + 2H+ 98g (H2SO4) 49g (1000mL de H 2SO4 1N) 1000mL de H 2SO 4 1N 1000mL de H 2SO 4 0,05N 1mL de H 2SO4 0,05N


III. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 100mg de uma amostra vegetal. Transferir para um tubo digestor e adicionar 7mL da mistura digestora; 2. Adaptar o tubo digestor a um bloco digestor localizado em uma capela e colocar para aquecer obedecendo a seguinte sequência de tempo e temperatura: Uma hora a 100°C Uma hora a 200°C Uma hora a 300°C 3. Deixar esfriar, dissolver o digerido com cerca de 10mL de água destilada e acoplar o tubo digestor ao destilador de Kjeldahl. 4. Proceder à destilação com o auxílio de 25mL de NaOH (50%) e recolher o destilado em um erlenmeyer contendo 10mL de ácido bórico com indicador misto. Após obter 20mL de destilado, toda a amônia deve ter sido destilada. 5. Titular a amônia destilada usando uma solução padrão de H2SO4 0,05 N. Para a mistura de indicador utilizada, o ponto nal da titulação corresponde à mudança de cor: de verde para vermelho claro. 6. Proceder aos cálculos expressando o teor de N-total em termos percentuais. Em seguida, estimar o teor de proteína bruta multiplicando o teor de N-total pelo fator de conversão adequado ao material analisado.


OBS.: Para calcular o teor de N-total na amostra, considerar que 1,0mL do ácido sulfúrico 0,05 N gasto na titulação corresponde a 0,7mg de nitrogênio na amostra (Bezerra Neto e Barreto, 2004).

IV. P REPARO

DOS

R EAGENTES

a. Mistura digestora 175ml de água destilada; 3,6g de selenito de sódio (Na 2SeO3) anidro ou 5,47g de selenito de sódio penta hidratado (Na 2SeO3.5H2O); 4,0g de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO 4.5H2O); 21,3g de sulfato de sódio (Na2SO4) anidro ou 48,5g de sulfato de sódio deca hidratado (Na2SO4.10H2O). 200mL de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado (36 N). b. Solução de ácido bórico mais indicador misto. Dissolver 20g de ácido bórico em 1 litro de água destilada e acrescentar 15ml de uma solução alcoólica a 0,1% de verde de bromocresol e 6ml de solução alcoólica de vermelho de metila a 0,1%. c. Solução de ácido sulfúrico (0,05 N). Colocar cerca de 500mL de água destilada em um balão volumétrico de 1000mL e em seguida acrescentar 1,4mL de ácido sulfúrico concentrado (36 N) e padronizar (Anexo 5)


V. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

FRANCO, G. Tabela de composição química dos alimentos. 9 ed. São Paulo: Atheneu, 2000. 307p. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.

SILVA, D.J.; QUEIRÓZ, A.C. de. Análise de alimentos: métodos químicos e biológicos. Vicosa: UFV, 2002. 235p.


D ETERMINAÇÃO DE

P ROTEÍNA S OLÚVEL


DE

B RADFORD

I. I NTRODUÇÃO As proteínas são compostos nitrogenados, consideradas macromoléculas formadas a partir da união de vários aminoácidos entre si. Várias são as classicações que se podem empregar para as proteínas. Uma destas classicações, por exemplo, subdivide as proteínas em duas categorias, proteínas solúveis e proteínas estruturais. As proteínas estruturais geralmente encontram-se ligadas a outros compostos e são constituintes das membranas celulares, enquanto que as proteínas solúveis participam diretamente do metabolismo vegetal, notadamente como enzimas. O reagente Coomassie Brilliant Blue G-250 reage com as proteínas produzindo um complexo de coloração azul escuro. A ligação do corante às proteínas causa um aumento no pico máximo de absorção do corante de 465 para 595nm, cuja absor bância apresenta uma correlação bastante linear com valores de concentração de soluções padrões de proteína. O processo de ligação do reagente com as proteínas é bastante rápido, comple-


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tando-se em aproximadamente dois minutos, e mantendo a cor estável por uma hora. Os resultados de análises, empregandose este método, apresentam boa reprodutibilidade, apresentando pouca ou nenhuma interferência de cátions como Na ou K , ou carboidratos tal como a sacarose. Uma pequena intensidade de cor é desenvolvida na presença de agentes tamponantes fortemente alcalinos. No entanto, a análise pode ser efetuada acuradamente empregando-se controles tamponados apropriados. Os poucos componentes que apresentam excessiva interferência na cor, são grandes quantidades de detergentes tais como sulfato de dodecyl sódio, Triton X-100, e detergentes comerciais. A interferência por pequenas quantidades de detergentes tam bém pode ser eliminada pelo uso de controles apropriados. +

+

II. M ARCHA A NALÍTICA P    (  ) 1. Com o auxílio de uma placa de Petri e uma lâmina de aço, remover a nervura principal das folhas a analisar, e em seguida recortar as folhas em pequenos pedaços (cerca de 5mm); 2. Pesar 0,200g das folhas frescas desprovidas da nervura principal; 3. Triturar o material em presença de 10mL de etanol a 80%; 4. Enxaguar o rotor do triturador de tecidos empregando-se mais 10mL do mesmo solvente;


5. Centrifugar uma alíquota do extrato bruto por 5 minutos a 2.000g; 6. Transferir para um tubo de ensaio uma alíquota de 3mL do sobrenadante, e acrescentar a este, 6mL de clorofórmio; 7. Agitar suavemente por cerca de dois minutos e deixar em repouso por cerca de 5 a 10 minutos, para que ocorra a separação das duas fases (orgânica e aquosa); 8. Recolher a fração aquosa (incolor) para um tubo de Eppendorf e manter em congelador até o momento do desenvolvimento da cor. D   9. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, 200 µL das soluções padrões de BSA e dos extratos das amostras. Fazer o “branco” usando água destilada em vez BSA; 10. Acrescentar 4mL do reagente coomassie brilliant blue, agitar suavemente e deixar em repouso por 5 minutos; 11. Fazer as leituras em espectrofotômetro, no comprimento de onda de 595 nm; 12. Calcular o conteúdo de proteína solúvel, expressando os resultados em termos de mg de proteína solúvel por grama de tecido foliar fresco.


III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Coomassie brilliant blue. Pesar 0,0100g de coomassie brilliant blue (G-250), dissolver em 5mL de etanol a 95%, adicionar 10mL de ácido fosfórico concentrado e 85mL de água destilada. Misturar bem, ltrar e manter em frasco escuro. S    . Solução estoque de BSA a 1000 mg.L-1. Pesar exatamente 0,1000g de albumina de soro bovino BSA (PA), dissolver em água destilada e completar o volume para 100 mL; Padrões de trabalho. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, exatamente 1, 2, 4 e 10mL da solução estoque de BSA (1000 mg.L-1) e completar o volume precisamente para 20mL com água destilada, o que proporcionará soluções nas concentrações de 50, 100, 200 e 500 mg.L -1. Observações: 1. Esta análise também pode ser realizada em amostra pré-seca de tecido vegetal. Neste caso, pode-se preparar um extrato aquoso, dispensando, portanto a Cromatograa de Partição com vistas à separação dos pigmentos fotossintéticos. Da mesma forma, também pode ser preparado o extrato etanólico, conforme preparado para a determinação de carboidratos solúveis totais e sacarose;


2. No preparo do extrato vegetal empregando-se tecido vegetal fresco, a diluição da amostra pode ser feita com base no peso nal do extrato em vez do volume. Neste caso minimiza-se o erro decorrente da volatilização do etanol durante o processo de extração. Para a conversão do peso do etanol a 80% em volume, recomenda-se utilizar a densidade de 0,8687 g.mL -1.


BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the determination of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Analitical Biochemistry , v.72, p.248-254, 1976.


15

D ETERMINAÇÃO

DE

A MINOÁCIDOS

L IVRES TOTAIS M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO

DA

N INIDRINA

I. I NTRODUÇÃO Os α-aminoácidos são compostos orgânicos de baixo peso molecular, comumente encontrados nas proteínas. Todos os aminoácidos, com exceção da prolina, têm como denominador comum um grupamento carboxílico livre e um aminogrupo livre não-substituído, no átomo de carbono alfa. Eles diferem uns dos outros na estrutura de suas cadeias laterais distintas, denominadas grupamentos R. Além dos aminoácidos-padrão comuns (que são vinte) e de vários aminoácidos raros das proteínas, mais de 150 outros aminoácidos são conhecidos como ocorrendo biologicamente em forma livre ou combinada, porém nunca em proteínas. Alguns destes são precursores importantes ou intermediários no metabolismo. As plantas superiores possuem uma variedade extraordinária de aminoácidos não-protéicos, sendo a maioria deles de função metabólica desconhecida. Nesta determinação, ocorre uma reação amplamente utilizada do α-aminogrupo, a reação da ninidrina, a qual permite


determinar quantitativamente quantitativamente os aminoácidos a minoácidos em quantidades muito reduzidas. Pelo aquecimento, um α-aminoácido reage com duas moléculas de ninidrina nin idrina para produzir um composto composto intensamente intens amente colorido. colorido. Uma cor púrpura é obtida na reação da ninidrina por todos os aminoácidos e peptídeos que apresentam um α-aminogrupo livre, enquanto enquanto que a prolina e a hidroh idroxiprolina, em que o α-aminogrupo está substituído, produzem produzem derivados derivados com uma cor amarela característica. Durante a reação, a ninidrina, que é um agente fortemente oxidante, ocasiona a oxidação descarboxilativa dos aminoácidos. O amônio e a hidrindantina h idrindantina assim assi m formados, formados, reagem com uma segunda molécula de ninidrina para produzir um composto corado de violáceo, no qual somente o átomo de nitrogênio é proveniente do aminoácido (Lehninger, 2002).

II. M ARCHA A NALÍTICA P   1. PPesar esar 0,5g de tecido vegetal vegetal fresco e triturar em almofariz ou homogeneizador de tecidos, usando cerca de 10mL de etanol a 80% como extrator; 2. Filtrar o macerado em tecido de náilon de malha na, recolhendo o ltrado em um funil de separação. Nesta operação, usar cerca de mais 10mL de etanol a 80% para lavar o resíduo do ltrado;

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Le vy Paes Barretos | 85 85

3. Adicionar 20mL de clorofórmio ou benzeno ao funil de separação, agitar suavemente a mistura, e deixar em repouso por um a dois minutos; 4. Desprezar a fração mais densa, recolhendo a fração menos densa em um tudo de ensaio rosqueável e guardar em geladeira a 4°C. Em se usando o benzeno, deve-se desprezar a fração menos densa. No momento da análise proceder à diluição que for conveniente, dependendo da concentração de aminoácidos presente na amostra. Usualmente, Usualmente, utiliza-se utili za-se um fator de diluição de 25 vezes. D D   . 1. Pipetar para um tubo de ensaio 0,5mL do tampão citrato 200mM, 1,2mL do reagente revelador (ninidrina + KCN) e 1,0mL do padrão de leucina ou amostra problema (deve-se respeitar a ordem de adição de cada reagente); 2. Tampar os tubos de ensaio, agitar suavemente e colocar para aquecer em banho-maria a 100°C por 15 minutos; 3. Esfriar os tubos t ubos em banho de gelo por 5 minutos e, em seguida, adicionar 3,0mL de etanol eta nol a 60% para xar a cor desenvolvida (violeta), cando estável por até 3 horas; 4. Agitar e ler a absorbância a 570nm em espectrofotômetro de emissão. A partir da curva cur va padrão, padrão, obtém-se obtém-se uma equação de regressão para o cálculo das concentrações de aminoácidos nas amostras.


O 1. Esta análise também ta mbém pode ser realizada em amostra pré-seca de tecido vegetal. Neste caso, pode-se preparar um extrato aquoso, dispensando, portanto a cromatograa de partição com vistas à separação dos pigmentos fotossintéticos. Da mesma forma, também pode ser preparado o extrato etanólico, conforme preparado para a determinação de carboidratos solúveis totais e sacarose; 2. No preparo do extrato vegetal empregando-se tecido vegetal fresco, a diluição da amostra pode ser feita com base no peso nal do extrato em vez do volume. volume. Neste caso minimiza-se min imiza-se o erro decorrente da volatilização do etanol durante o processo de extração. Para a conversão do peso do etanol a 80% em e m volume, recomenda-se utilizar a densidade de 0,8687g.mL -1.

III. P REPARO D O S R EAGENTES a. Tampão citrato 200mM 21,014g de ácido ác ido cítri20 0mM (pH 5,0). Pesar 21,014g co monohidratado (P.M. = 210,14), adicionar 200mL de NaOH 1,0 M e uma u ma gota de solução saturada sat urada de Timol Ti mol (P.M. (P.M. = 150,22). 150,22). Ajustar o pH para 5,0 utilizando utiliz ando o NaOH 1,0 1,0 M e completar o volume para 500mL com água destilada. b. Solução estoque de KCN (10 mM). Válida Válida por 3 meses. me ses. Pesar 0,1628g de KCN (P.M. = 65,12), dissolver em água destilada e completar o volume para 250 mL.

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Le vy Paes Barretos | 87 87

c. Solução de KCN 0,2 mM em Metilcelosolve . Válida por 1 mês. Pipetar 5,0mL da solução estoque de KCN 10mM para um balão volumétrico de 250mL e completar o volume com metilcelosolve. Este reagente reagente também é conhecido c onhecido como etilenoglicol monometil éter, metoxietanol e metilglicol (C3H8O2 , P.M. P.M. = 76, 76,10). 10). d. Ninidrina a 5%. Válida por 6 meses. Pesar 12,5g de ninidrina (P.M. = 178,15), dissolver em metilcelosolve e completar o volume para 250mL, com este mesmo solvente. e. Reagente revelador. Preparado no momento da análise. Misturar tu rar a solução solução de KCN 0,2mM com a ninidrin nin idrinaa a 5% na proporção de 1:5 (v/v). f. Preparo da curva padrão. Solução estoque de leucina (50mg.L-1). Pesar 50mg de leucina, dissolver em cerca de 100mL de água deionizada e em seguida completar o volume para 1,0 L com água deionizada. g. Padrões de trabalho. Pipetar para balões volumétricos de 50mL alíquotas de 5, 10, 15, 20 e 25mL da solução estoque de leucina (50mg.L (50mg.L-1) e completar o volume com água deionizada. Ao nal desta etapa, resultarão os padrões 5, 10, 15, 20 e 25mg de leucina por mL de solução. Utilizar água deionizada como padrão zero. Esta curva cur va padrão apresenta boa linea l inearidade. ridade.



Pri ncípios de bioquímica bioquímica (Lehninger) NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios (Lehn inger).. 4.

ed. São Paulo: Sarvier, Sarv ier, 2002. 1232p. 1232p. il. YEMM, E.W.; COCKING, E.C. The determination of amino-acids with ninhy nin hydrin. drin. Aalyst , , v.80, v.80, p.209-21 p.209-213, 3, 1955. 1955.


16

D ETERMINAÇÃO EM

DE

P ROLINA L IVRE

TECIDO F OLIAR FRESCO


DA

N INIDRINA

I. I NTRODUÇÃO A prolina é estudada conjuntamente com os aminoácidos protéicos devido a sua participação como componente das proteínas. No entanto, como pode se constatar em sua fórmula estrutural, trata-se na verdade de um iminoácido heterocíclico de peso molecular igual a 115. H H C

H C H

H C H

C COOH N H

Fórmula estrutural da prolina

As pesquisas têm constatado que a prolina livre é acumulada em plantas cultivadas em condições de estresse hídrico, sendo considerada como um soluto compatível que desempenha papel osmorregulador em determinadas espécies vegetais. A quanticação da prolina livre em tecido vegetal fresco pode ser


realizada por método colorimétrico, de boa precisão e praticamente livre de interferentes dentre os componentes vegetais.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 250mg de tecido foliar fresco; 2. Triturar utilizando 5mL de solução de ácido sulfossalicílico a 3% como solvente; 3. Centrifugar por 10 minutos a 2000g; 4. Transferir para um tubo de ensaio rosqueável: 1mL do padrão ou do extrato centrifugado; 1mL de ninhidrina ácida; 1mL de ácido acético glacial; 5. Fechar o tubo de ensaio e aquecer por uma hora a 100°C; 6. Após uma hora de aquecimento, resfriar o tubo de ensaio em banho de gelo; 7. Adicionar 2mL de tolueno a cada tubo de ensaio e agitar vigorosamente por aproximadamente 20 segundos; 8. Deixar em repouso por cerca de 5 a 10 minutos para que ocorra a separação das fases; 9. Recolher a fase orgânica e ler a absorbância no comprimento de onda de 520nm, usando-se o tolueno como branco; 10. Calcular o teor de prolina livre do tecido foliar fresco, comparando com os valores da curva padrão e expressar os resultados em µmol.g-1 de tecido foliar fresco.


II. P REPARO

DOS

R EAGENTES

1. Ácido sulfossalicílico: solução aquosa a 3% (p/v). 2. Solução Estoque de Prolina (50mg.L -1): pesar 50mg de prolina, dissolver em água destilada e completar o volume para 1 litro. 3.Padrões de Trabalho de Prolina. Partindo da solução estoque e água destilada, dest ilada, preparar prepara r soluções padrões padrõe s contendo 0, 5, 10, 10, 15, 20 e 25mg.L -1 de prolina. 4. Ninhidrina Ácida: Ácida: Pesar 1,25g 1,25g de ninhidrina ninh idrina e transferir tra nsferir para um béquer. Adicionar 30mL de ácido acético glacial e 20mL de ácido fosfórico 6 M. Colocar para aquecer brandamente (aprox. 70°C) sob agitação até dissolver. Esfriar rapidamente em banho de gelo. O reagente permanece estável por 24 horas, se guardado a 4°C.

III. B IBLIOGRAFIA BATES, L.S.; WALDREN, R.P.; TEARE, I.D. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil , , v.39 .39,, p205-207 p205-207, 1973. BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

92 | Análises Anális es Químicas Química s e Bioquímicas Bioquími cas em Plantas Planta s

D ETERMINAÇÃO DE

G LICINABETAINA

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO I . I NTRODUÇÃO A glicinabetaína glicinabetaí na é um derivado derivado do do aminoácid ami noácidoo glicina com o N completamente metilado. Assim como a colina, é um composto de amônio quaternário (QAC), encontrado em várias plantas submetidas às condições de estresse, particularmente as plantas da família das chenopodiáceas. A glicinabetaína ou simplesmente betaína, como também é conhecida, é um intermediário na biossíntese da metionina (aminoácido sulfurado). As plantas quando submetidas à condições de estresse salino ou hídrico necessitam diminuir o potencial osmótico intracelular, para tolerar tal condição. Para baixar o potencial osmótico, as plantas podem absorver íons inorgânicos e ou sintetizar compostos orgânicos, os putativos solutos compatíveis, que funcionam como osmorreguladores ou osmoprotetores. Vários compostos têm sido citados como osmorreguladores ou solutos compatíveis, entre eles, são citados: prolina, glicinabetaina, manitol, carboidratos, aminoácidos, etc. A literatura tem mostrado que plantas de centeio contém 3,2 e 15,8 mg.kg -1 de betaína,

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Le vy Paes Barretos | 93

17

respectivamente em baixa e elevada salinidade, enquanto que plantas de atriplex apresentam 17,7 e 24,6 mg.kg -1 de betaína, respectivamente em baixa e elevada salinidade.

CH3 H +

CH3 N

C

O C

CH3 H

O-

A determinação da glicinabetaína glicinabetaí na pode ser feita em um extrato aquoso, espectrofotometricamente, com periodeto de potássio em presença de dicloroetano.

II. M ARCHA A NALÍTICA Preparo do extrato. Pesar 0,5g da amostra (m.s.), transferir para frascos de vidro, acrescentar 20mL de água deionizada, fechar os frascos e colocar para agitar por 24 horas. horas. D D   . 1. Diluir o extrato, pipetando 1mL do mesmo e acrescentando 1mL de H2SO4 (2N), mantendo em banho de gelo; 2. Homogeneizar e pipetar uma alíquota de 500µL para tubos de centrífuga com parede grossa e manter ma nter em banho de gelo por 1 hora;


3. Adicionar 200µL de KI-I 2 previamente resfriado e agitar suavemente em agitador de tubos de ensaio, tipo vortex; 4. Manter os tubos de centrífuga em refrigerador (0 a 4°C) por 16 horas, para formação do complexo cristalino de QAC-periodeto, em seguida centrifugar por 15 minutos (10.000 rpm a 0°C); 5. Manter em banho de gelo e cuidadosamente aspirar o sobrenadante e desprezar; 6. Dissolver Diss olver os cristai cr istaiss do complexo QA QAC-periodeto em 9mL de 1,2-dicloroetano; 7. Agitar vigorosamente em agitador tipo vortex até completa dissolução; 8. Aguardar de 2 a 2,5 horas e ler a absorbância a 365nm; 9. Comparar com padrões de glicinagetaína.

III. R EAGENTES Solução Solução de periodeto per iodeto de potássio (KI-I2). Pesar 20g de iodeto de potássio, transferir para um béquer contendo cerca de 50mL de água destilada, acrescentar 17,5g iodo, dissolver e completar o volume para 100mL com água destilada; 13,9mL de ácido sulfúrico sulf úrico conÁcido sulfúrico 2N. Pipetar 13,9mL centrado (36N) para um balão volumétrico de 250mL, contendo c ontendo cerca de 200mL de água destilada. Homogeneizar e completar o volume.


Ácido sulfúrico 1N. Pipetar 6,94mL de ácido sulfúrico concentrado (36N) para um balão volumétrico de 250mL, contendo c ontendo cerca de 200mL de água destilada. Homogeneizar e completar o volume, volume, ou diluir parte do ácido sulfúrico 2 N em partes iguais, isto é, 1+1 1+1 (em volume). Solução estoque de glicinabetaína (padrão 2.500mg.L-1). Pesar exatamente 0,250g de glicinabetaína (anidra), dissolver e completar o volume para 100mL com ácido sulfúrico 1N. Tam bém encontrado encontrado nos catálogos catálogos como como betaína (P.M. (P.M. 117 17,,15 15).). Padrões de trabalho de glicinabetaína. Pipetar para balões volumétricos de 100mL, 2, 4, 6 e 8mL da solução estoque de glicinabetaína (2.500mg.L (2.500mg.L-1), completar completar o volume com ácido sulfúrico 1N. Tal diluição proporcionará padrões de trabalho nas concentrações concentraçõe s de 50, 100, 150 e 200mg.L-1. O padrão zero (branco) é o ácido sulfúrico sulf úrico 1N.


IV. B IBLIOGRAFIA FLOWERS, T.J.; TROKE, P.F.; YEO, A.R. The mechanism of salt tolerance in halophytes. Ann. Rev. Plant Physiol., v.28, p.89-121, 1977. GRIEVE, C.M.; GRATTAN, S.R. Rapid assay for determination of water soluble quaternary ammonium compounds. Plant and Soil , v.70, p.303-307, 1983. GREENWAY, H.; MUNNS, R. Mechanisms of salt tolerance in nonhalophytes. Ann. Rev. Plant Physiol., v.31, p.149-190, 1980. STOREY, R.; WYN JONES. Quaternary ammonium compounds in plants in relation to salt resistance. Phytochemistry , v.16, p.447453, 1977. VOLLET, V.C. Teores de glicina betaína no sistema radicular de genótipos de guandu sob efeito do estresse salino associado à poliamina exógena. 2006. 48f. Dissertação (Mestrado em Agronomia).

Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Unesp, Campus de Jaboticabal-SP. 2006. WYN JONES, R.G. An Assessment of quaternary ammonium and related compounds as osmotic eectors in crop plants. In: Rains, D.W.; Valentine, R.G. Hollaender, A. (eds). Genetic engineering of osmoregulation: impact on plant productivity for food, chemical

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WYN JONES, R.G. Phytochemical aspects of osmotic adaptation. In: Zimmerman, B.N.; Steelink, C.; Loewus, F.A. Recent advances in phytochemistry: phytochemical adaptation to stress. London:

Plenum Press, 1984. p.55-78. WYN JONES, R.G.; GORHAM, J. Osmoregulation. In: Lange, D.L.; Nobel, P.S.; Osmond, C.B.; Ziegler, H. Encyclopedia of plant physiology; physiological plant ecology III – Response to chemical

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D ETERMINAÇÃO EM

DE

N ITRATO

TECIDO VEGETAL

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO DO Á CIDO S ALICÍLICO I. I NTRODUÇÃO Nitrato é a principal forma de absorção de nitrogênio pela maioria das plantas. Após sua absorção, o mesmo é reduzido a amônio para em seguida ser incorporado aos compostos orgânicos, formando aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e demais compostos nitrogenados. O acúmulo de nitrato em alta concentração no tecido vegetal pode causar distúrbio nutricional, quando ingerido em concentrações acima de 2.500mg.kg -1 , o nitrato pode ser reduzido a nitrito, o qual na corrente sangüínea pode causar a metahemoglobinemia ou resultar na formação de nitrosaminas, as quais são cancerígenas e mutagênicas. Para a determinação de nitrato geralmente são utilizados métodos potenciométricos ou espectrofotométricos. O método de ácido fenoldissulfônico é versátil, porém tedioso. Já o método enzimático requer uma enzima de difícil preparo e consome muito tempo. A baixa sensibilidade e a interferência de íons como Cl ,- NH4 e NO2- na análise são também responsáveis pelo +


18

desuso desses métodos. No entanto, o método do ácido salicílico é rápido, livre de interferência de outros íons presentes em tecidos vegetais e apropriado para análise de uma ampla faixa de concentrações de nitrato. Neste método, o ácido salicílico (ácido 2-hidroxibenzóico) ao reagir com o N-NO3- tem o carbono 5 (que é para em relação ao grupamento hidroxílico) nitricado. Os nitrocompostos formados são essencialmente o ácido 5-nitrosalicílico e uma pequena quantidade do isômero 3-nitrossalicílico. A reação ocorre em pH alcalino (acima de 12) formando-se o nitro-composto de cor amarela. Na reação, a relação molar entre o ácido salicílico e o nitrato é de 1:1, sugerindo que a nitratação ocorre primariamente em uma única posição, por molécula de ácido salicílico (Cataldo et al., 1975).

II. M ARCHA A NALÍTICA a. Preparo do extrato utilizando matéria fresca. Utilizar o mesmo extrato preparado na análise de aminoácidos livres totais. Apenas a diluição a ser feita deverá ser diferente. Usualmente o fator de diluição utilizado é de no máximo 5 vezes. b. Preparo de extrato utilizando matéria seca. Pesar 0,25g de material vegetal seco e colocar em um tubo de ensaio rosqueável em presença de 10mL de água deionizada, levando, em seguida, a suspensão para aquecer em banho-maria a 45°C


por uma hora; Após o aquecimento, agitar e ltrar a mistura em tecido de náilon de malha na, recolhendo o ltrado em outro tubo de ensaio rosqueável, ou centrifugar a mistura a 2000g por 15 minutos. Guardar o ltrado (ou sobrenadante) em geladeira até o momento da análise. c. Análise do nitrato. 1. Pipetar para um tubo de ensaio 0,2mL da solução padrão ou extrato da amostra e 0,5mL do reagente revelador (AS-H2SO4), agitando vigorosamente em seguida; 2. Deixar a mistura em repouso por 20 minutos à temperatura ambiente; 3. Adicionar lentamente 10mL de NaOH 4 M, e logo depois agitar para deixar a mistura com uma coloração homogênea (unifásica). Neste momento ocorre a formação de um composto de cor amarelada estável por menos de 48 horas; 4. Deixar o tubo esfriar e proceder à leitura de absorbância a 410nm em espectrofotômetro de emissão. A partir da curva padrão, obter a equação de regressão para o cálculo da concentração de nitrato nas amostras.

III. P REPARO D OS R EAGENTES a. Solução de ácido salicílico a 5% em H2SO4 (AS-H2SO4). Pesar 1,25g de ácido salicílico (P. M.= 138,12) e dissolver em H 2SO4


concentrado (P.A). Completar o volume para 25mL com o mesmo solvente. Guardar em frasco âmbar (validade de uma semana). b. Solução estoque de nitrato (1.000mg.L-1). Pesar 1,3710g de NaNO3 (P.M.=85,00), dissolver em água deionizada e completar o volume para 1.000mL. Conservar em geladeira. c. Padrão de trabalho. Pipetar para cinco balões volumétricos de 50mL, 1,25; 2,5; 5,0; 10,0 e 15mL de solução estoque de nitrato (1.000 mg.L-1) e completar o volume com água deionizada. Ao nal, resultarão soluções padrões nas concentrações de 25, 50, 100, 200 e 300mg.L-1 de NO3-. O branco (padrão zero) corresponde à água deionizada. d. Solução de NaOH 4 M. Pesar 40g de NaOH, dissolver em 200mL de água destilada, deixar esfriar e completar o volume para 250mL.

IV. B IBLIOGRAFIA CATALDO, D.A.; HAROON, M; SCHRADER, L.E.; YOUNHG, V.L. Rapid colorimetric determination of nitrate in plant tissue by nitration of salicylic acid. Commun. Soil Science and Plant Analysis , v.6, n.1, p.71-80, 1975.


D ETERMINAÇÃO

DA

ATIVIDADE

DE

N ITRATO R EDUTASE (E.C.1.6.6.1) EM

TECIDO VEGETAL

I. I NTRODUÇÃO A nitrato redutase é uma enzima complexa, contendo vários grupos prostéticos, incluindo FAD, citocromo e molibdênio. Em plantas superiores, seu peso molecular é da ordem de 200.000 Daltons, enquanto que em organismos inferiores, é cerca de 500.000 Daltons. A mesma desempenha um papel importante na assimilação (utilização) do nitrogênio pelas plantas. Depois que o nitrogênio é absorvido pelas raízes na forma de nitrato (NO 3-), o mesmo é translocado através do xilema para as folhas, onde é reduzido a nitrito (NO 2-) e posteriormente a amônio. Este processo de redução tam bém pode ocorrer, geralmente em menor escala, nas raízes, dependendo da espécie vegetal, até mesmo de forma aparentemente exclusiva. A redução do nitrato a nitrito é catalisada pela nitrato redutase e não requer a participação direta de luz, porque o agente redutor primário é o NADH, que provém das reações


19

oxidativas do citoplasma, onde está localizada a enzima. Em tecidos não clorolados, como as raízes, o doador de elétrons poder ser o NADH ou o NADPH. As nitrato redutases encontradas em vegetais superiores são constituídas por duas su bunidades idênticas contendo três grupos prostéticos cada: FAD, heme e um complexo formado entre o molibdênio e a pterina. Por outro lado, a redução do nitrito a amônio (NH 4 ) ocorre nos cloroplastos, exigindo a transferência direta de elétrons via ferredoxina, estando portanto, associada às reações fotossintéticas (Taiz & Zeiger, 2009). As equações abaixo representam o processo de redução do nitrato a nitrito, e do nitrito a amônio: +

NADH NO3 -

nitrato redutase

Fd-red NO2-

NAD+ NO2-

Fd-ox

nitrito redutase

NH 4+

Fd-red = Ferredoxina reduzida; Fd-ox = Ferredoxina oxidada

As mais altas atividades da nitrato redutase são obtidas em folhas jovens, provenientes de plantas cultivadas com


adequada provisão de nitrato e adequada iluminação. Geralmente a taxa máxima da atividade da nitrato redutase é atingida 3 a 4 horas após o início do dia, em plantas cultivadas em campo. As determinações da atividade da nitrato redutase podem ser sumarizadas em dois métodos: método in vitro e método in vivo. Para a análise pelo método in vitro , a enzima é extraída do tecido vegetal, através da maceração do tecido em solução tampão adequada, em seguida o extrato é puricado por centrifugação em gradiente ou cromatograa. Após a puricação, alíquotas do extrato enzimático são adicionadas à mistura de reação e em seguida a atividade da mesma é medida por espectrofotometria. O método in vivo é assim denominado porque a atividade da enzima é medida sem provocar o rompimento das células vegetais. Por este método, pequenos discos de folhas recém colhidas são incubadas no escuro, em solução tampão contendo nitrato e outros componentes que facilitam a difusão do substrato através da membrana celular. Após determinados intervalos de tempo, recolhem-se alíquotas do extrato incubado e determina-se por colorimetria ou espectrofotometria, a quantidade de nitrito formada. A atividade da enzima é então calculada em função da quantidade do produto da reação formado, durante um determinado intervalo de tempo, por grama de tecido analisado.


II. MARCHA A NALÍTICA PARA D ETERMINAÇÃO IN V IVO DA ATIVIDADE DA N ITRATO R EDUTASE EM TECIDO F OLIAR. 1. Preparar quatro cubetas de leitura espectrofotométrica de 1mL e pipetar para cada uma, 400µL de água deionizada e 500µL da mistura de reagentes reveladores; 2. Pipetar 5mL do meio de incubação para um tubo de ensaio; 3. Pesar cerca de 250mg de seções de folhas (desprezando as nervuras), com cerca de 5mm de diâmetro e transferir para o tubo de ensaio contendo o meio de incubação (item 2); 4. Colocar o tubo de ensaio contendo a amostra e meio de incu bação (item 3), em local escuro, à temperatura de 30°C; 5. Adaptar uma mangueira de borracha, conectada à uma bomba de vácuo, à boca do tubo de ensaio que contém o meio de incubação (item 4), e provocar uma leve sucção por 60 segundos; 6. A cada 15 minutos, após o início da incubação, retirar uma alíquota de 100µL do extrato de incubação, e transferir para uma das cubetas de leitura espectrofotométrica, que contém as soluções de leitura (item 1); 7. Após a coleta da alíquota correspondente a 60 minutos da reação enzimática, aguardar 15 minutos para permitir o desenvolvimento da cor (violeta) e fazer a leitura em espectrofotômetro a 540nm;


8. Enquanto aguarda a reação enzimática se processar (item 7), preparar a curva padrão. Para isto, pipetar para 6 cubetas, separadamente, 400µL de água deionizada, 500µL da mistura de reagentes reveladores e 100µL das soluções padrões contendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50µM de nitrito; 9. Aguardar 15 minutos e fazer a leitura da mesma forma como mencionado no item 7; 10. De posse dos valores das leituras espectrofotométricas da amostra e das soluções padrões, proceder aos cálculos da atividade enzimática e representar gracamente a atividade da enzima em função do tempo de reação. Adote como unidade da atividade enzimática, µmol de nitrito produzido por grama de tecido.

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Meio de incubação. Pipetar 20µL de espalhante adesivo para um béquer, adicionar 2mL de n-propanol e agitar suavemente até dissolver o espalhante adesivo. Adicionar cerca de 100mL de água deionizada, 2,022g de nitrato de potássio e 2,7218g de fosfato monobásico de potássio. Agitar até dissolver os sais, transferir para um balão volumétrico de 200mL e completar o volume com água deionizada. Solução dos reagentes reveladores. A solução dos reagentes reveladores é preparada juntando-se partes iguais em volume,


de solução 0,02% de N-(1-nail) etilenodiaminocloridrato com a solução 1,0% de sulfanilamida (em HCl 1,5 M). Solução Padrão de Nitrito do sódio 1,0 mM . Pesar 0,0069g de nitrito de sódio, dissolver em água deionizada e completar o volume para 100mL. A partir desta solução estoque, preparar uma curva padrão na faixa de 0 a 50µM de nitrito. Pipetar para balões volumétricos de 50mL, separadamente, 500, 1000, 1500, 2000 e 2500µL da solução estoque de nitrito, completando o volume com água deionizada. Como padrão zero de nitrito, utiliza-se apenas água deionizada. Após o preparo das soluções, transferir as mesmas para frascos apropriados e conservar em geladeira.



CARVALHO, P.G. de; AIDAR, M.P.M.; ZAIDAN, L.B.P.; CARVALHO, M.A.M. de. Aspectos do crescimento e atividade da redutase do nitrato em plantas de Vernonia herbacea (Vell.) Rusby submetidas a diferentes fontes de nitrogênio. Hoehnea , v.33, n.1, p.89-97, 2006. MACHADO, A.T.; SODEK, L.; FERNANDES, M.S. N-partitioning, nitrate reductase and glutamine synthetase activities in two contrasting varieties of maize. Pesq. Agropec. Bras., Brasília, v.36, n.2, p.249-256, fev. 2001. OLIVEIRA, M.A.J. de; BOVI, M.L.A.; MACHADO, E.C.; RODRIGUES, J.R. Atividade da redutase de nitrato em mudas de pupunheira (Bactris gasipaes). Ciência Rural , Santa Maria, v.35, n.3, p.515-522, mai-jun, 2005. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 4. ed. Porto Alegre: Artmed, 2009. 820 p. il.


20

D ETERMINAÇÃO DA

DA

ATIVIDADE

P EROXIDASE (EC 1.11.1.7)

I. I NTRODUÇÃO As peroxidases (POD) são enzimas comuns em plantas e o aumento de sua atividade, como resposta ao ataque de patógenos, indica seu envolvimento em mecanismo de defesa, desempenhando importante papel no processo siológico, incluindo catabolismo das auxinas, modicações das propriedades da parede celular e lignicação (Wya et al., 1991). No mecanismo de defesa das plantas, as peroxidases atuam no processo de lignicação da parede celular, participando na conversão do álcool cinâmico em formas de radicais livres com o consumo do peróxido de hidrogênio, caracterizando o último passo da formação da lignina, embora, alguns autores consideram que o mecanismo ainda não está totalmente esclarecido (Heldt, 1997). Certas enzimas associadas ao estresse causado por excesso de oxidantes também são importantes nos mecanismos de defesa. As superóxidos dismutases, por exemplo, ajudam a anular radicais livres. Como o peróxido de hidrogênio (H 2O2) é altamente tóxico para as células, os organismos aeróbicos criaram meios de proteção contra seus efeitos, usando enzimas (cata-


lases e peroxidases) para removê-lo. As catalases convertem o composto em O2 e H2O e as peroxidases em H 2O. A atividade da POD é estimada com base na diferença de absorbância produzida com a oxidação do guaiacol e concomitante redução do peróxido de hidrogênio (Dann e Deverall, 2000). Representação da reação entre o guaiacol e o peróxido de hidrogênio, catalisada pela peroxidase 4 guaiacol + 4 H 2O2

peroxidase

tetraguaiacol + H2O

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P   a. Pesar 1,0g da amostra, colocar em almofariz e acrescentar 50mg de PVP e cerca de 10mL de nitrogênio líquido; b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imediatamente acrescentar 3mL da solução tampão acetato de sódio (50mM, pH 5,0), contendo 1mM de EDTA; c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 minutos a 10.000g* e 4°C; d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e armazenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade enzimática. * Nas separações de compostos por centrifugação é importante levar em consideração que o raio do rotor da


centrífuga inuencia diretamente na capacidade de precipitação das partículas em suspensão. Assim, de acordo com a equação a seguir, a força centrífuga relativa (FCR) ou força gravitacional (g) é proporcional ao quadrado da velocidade do rotor, expressa em rpm, multiplicado pelo raio do rotor da centrífuga, expresso em centímetro (Ro byt & White, 1990). g = 1,119 x 10 -5 x (rpm)2 x r

A  a. Pipetar para uma cubeta espectrofotométrica: 50µL de guaiacol (0,2 M), 0,5mL de peróxido de hidrogênio (0,38M) e 2,0mL de tampão de sódio (0,2M, pH 5,0); b. Agitar suavemente a mistura e iniciar a reação enzimática com a adição de 50µL do extrato enzimático; c. Efetuar as leituras espectrofotométricas a 470nm, intercaladas de 10 segundos, pelo prazo de um minuto; d. Estimar a atividade enzimática com base na diferença de absorbância por minuto e por peso da amostra fresca. OBS.: A prova em “branco” é preparada usando-se água destilada em vez do extrato enzimático.

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

a. Guaiacol (0,2 M). Pipetar para um frasco de cor âmbar, 230µL


de guaiacol (C7H8O2) e em seguida acrescentar 10mL de água destilada. b. Tampão acetato de sódio (50mM, pH 5,0). Misturar 14,8mL de solução 0,2 M de ácido acético com 35,2mL de solução 0,2 M de acetato de sódio, ajustar o pH para 5,0, usando ácido acético ou acetato de sódio, em seguida completar o volume para 200mL. c. Ácido acético (0,2 M). Pipetar 2,31mL do ácido acético glacial e completar o volume com água destilada para 200mL. d. Acetato de sódio (0,2 M). Dissolver 3,28g de acetato de sódio anidro (ou 5,44g de acetato de sódio tri-hidratado) e completar o volume para 200mL com água destilada.


IV. B IBLIOGRAFIA DANN, E.K.; DEVERALL, B.J. Activation of systemic disease resistance in pea by an avirulent bacterium or benzothiadiazole, but not by a fungal leaf spot pathogen. Plant Pathology , n.49, p.324-333, 2000. HELDT, H.W. Plant biochemistry and molecular biology. Oxford: Oxford University Press, 1998. 552p. ROBYT, J.F.; WHITE, B.J. Biochemical techniques: theory and practice. London: Academic Press. 1990. 407p. WYATT, S.E.; PAN, S.Q.; KÚC, J. β-1,3-glucanase, chitinase and peroxidase activities in tabacco tissue ressistance and suceptible to blue mould as related to owering, age and sucker development. Physiological and Molecular Plant Pathology , London, v.39. p.433-

440, 1991.


ATIVIDADE

DA

FENILALANINA

A MÔNIA L IASE (EC. 4.3.1.5) I. I NTRODUÇÃO A fenilalanina amônia liase é a enzima que catalisa a conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico, participando, portanto da rota biossintética dos fenilpropanóides. Está envolvida na síntese de compostos antimicrobianos, de baixo peso molecular, como toalexinas, além de avonóides e da lignina. A lignicação dos tecidos atua como uma barreira mecânica contra o avanço de patógenos. A indução de lignicação está relacionada como resposta de defesa em várias interações patógeno/hospedeiro. A biossíntese da lignina envolve uma rota longa com várias etapas, iniciando com a conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico (Figura 9.4). A enzima fenilalanina amônia liase (PAL) catalisa a primeira de uma série de reações metabólicas que gera inúmeros produtos naturais baseados em fenilpropanos, incluindo a lignina, certos pigmentos e protetores contra luz ultravioleta. A produção de tal enzima é regulada durante o crescimento vegetal, mas é também induzida em células vizinhas ao local de infecção por vários estímulos ambientais, como infecção, ferimentos, contaminação por metais pesados, luz e reguladores de crescimento.


21

A atividade da PAL é estimada com base na diferença de absorbância resultante da conversão da fenilalanina em ácido trans-cinâmico (Hyodo et al., 1978). O

OH

O

C H C NH2 H C H

OH

C C H

H C

+ NH3

PAL

fenialanina

ácido trans-cinâmico

F 9.4 Representação da reação catalisada pela fenilalanina amônia liase.

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P   a. Pesar 1,0g da amostra, colocar em almofariz e acrescentar 50mg de polivinilpirrolidone e cerca de 10mL de nitrogênio líquido; b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imediatamente acrescentar 3mL da solução tampão TRIS (0,5 M, pH 8,5), contendo 1mM de EDTA; c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 minutos a 10.000g e 4°C;


d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e armazenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade enzimática. A  a. Pipetar 0,5mL do extrato enzimático para tubo de ensaio; b. Acrescentar 2,0mL de tampão TRIS (0,5 M, pH 8,5) e 0,5mL de solução de fenilalanina (300µM); c. Incubar por 30 minutos a 40°C por uma hora; d. Após a incubação, transferir imediatamente os tubos de ensaios para banho de gelo, com o objetivo de encerrar a reação; e. Realizar as leituras espectrofotométricas a 290nm e expressar os resultados em termos de mmol de ácido cinâmico produzido por hora e por grama da amostra fresca; OBS.: A prova em “branco” é preparada usando-se água destilada em vez da fenilalanina.

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

a. TRIS (0,5 M, pH 8,0), contendo 1mM de EDTA. Pesar 4,44g de TRIS (básico), colocar em um béquer de 200mL, acrescentar 0,075g de EDTA, dissolver com 150mL de água destilada, ajustar o pH para 8,0 e em seguida completar o volume para 200mL.


b. Fenilalanina (30µM). Pesar 0,2478mg de fenilalanina (PM = 165,19), dissolver em água destilada e completar o volume para 50mL.

IV. B IBLIOGRAFIA HYODO, H.; KUROOA, H.; YANG, S.F. Induction of phenilalanine ammonia lyase and increase in phenolics in leyce leaves in relation to the development of russet spoting caused by ethylene. Plant Physiology , n.62, p.31-35, 1978.


DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA BETA GLUCANASE (EC

3.2.1.39)

I. I NTRODUÇÃO As quitinases e β-1,3-glucanase são enzimas que ocorrem nas plantas e hidrolisam a quitina (um polímero de N-acetilglucosamina) e a β-1,3-glucana respectivamente. Apresentam função de defesa, pela ação direta sobre o patógeno e como elicitores ativando outros mecanismos locais ou sistêmicos da defesa das plantas (Bol et al. 1990). O aumento da atividade da β-1,3-glucanase foi constatado em várias plantas, principalmente em Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata , após a indução com produtos químicos ou organismos não patogênicos, reduzindo a severidade de doenças causadas por vários patógenos (Dann et al., 1996). A β-1,3-glucanase, também conhecida como glucan endo 1,3-glucosidase, pertence à família das PR-2 proteínas e apresenta peso molecular de cerca de 33kDa (Lubner-Metzer e Meins, 1999). Sua atividade pode ser avaliada mediante a dosagem da glucose produzida com a hidrólise da laminarina (Tuzun et al., 1989). A laminarina é um polissacarídeo formado por unidades de β-1,3-glucose, encontrado em várias algas pardas, como por exemplo a Laminaria digitata.


22

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P   a. Pesar 1,0g do fruto, colocar em almofariz e acrescentar 50mg de polivinilpirrolidone (PVP) e cerca de 10mL de nitrogênio líquido; b. Macerar a amostra com o auxílio de um pistilo e imediatamente acrescentar 5mL da solução tampão acetato (0,1 M, pH 5,0) e 1mL de EDTA (1mM); c. Homogeneizar a mistura e em seguida centrifugar por 10 minutos a 10.000g e 4°C; d. Transferir o sobrenadante para tubos de Eppendorf e armazenar a -80°C até o momento da avaliação da atividade enzimática. A  a. Pipetar 25µL do extrato enzimático para tubo de ensaio; b. Acrescentar 200µL de solução tampão acetato (0,1 M, pH 5,0) e 200µL de laminarina (15mg.mL-1); c. Incubar por 30 minutos a 37°C; d. Após a incubação determinar o teor de glicose produzido com a hidrólise da laminarina. D   a. Pipetar para tubos de ensaio rosqueáveis, em separado,

120 | Análises Químicas e Bioquími cas em Plantas

200µL dos padrões de glucose e do extrato enzimático após ter sido incubado; b. Acrescentar 1,0mL do reagente de Somogyi, tampar os tubos e agitar suavemente; c. Colocar para aquecer a 100°C por 15 minutos e em seguida resfriar em banho de gelo; d. Acrescentar 1,0mL do reagente de Nelson e 5,0mL de água destilada; e. Agitar suavemente e deixar em repouso por 20 minutos; f. Realizar a leitura espectrofotométirca a 760nm. g. Comparar os resultados com padrões de glicose

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

a. Tampão acetato (0,1 M, pH 5,0). Transferir para um béquer 14,8mL de ácido acético 0,2 M, acrescentar 35,2mL de acetato de sódio 0,2 M, conferir o pH e se necessário ajustar para 5,0 usando uma das duas soluções componente da mistura tampão. Completar o volume para 100mL com água destilada. b. Ácido acético (0,2M). Pipetar 2,31mL de ácido acético glacial para um balão volumétrico de 200mL e completar o volume com água destilada. c. Acetato de sódio (0,2 M). Dissolver 1,64g de acetato de sódio (anidro) ou 2,72g de acetato de sódio tri-hidratado em água destilada e completar o volume para 100mL.


d. EDTA (1mM). Pesar 0,2922g de EDTA (PM = 292,2), dissolver em água destilada e completar o volume para 1000L. e. Laminarina (15mg.mL-1). Pesar 0,15g de laminarina e dissolver em 10mL de água destilada.

IV. B IBLIOGRÁFIA BOL, J.F.; LINTHORST, H.J.M.; CORNELISSEN, B.J.C. Plant pathogenesis-related proteins induced by virus infection. Annual Review of Phytopathology. Palo Alto, v.28, p.113-138, 1990.

DANN, E.K. MEUWLY, P.; MÉTRAUX, J.P.; DEVERAL, B.J. The eect of pathogen inoculation of salicylic in leaves of green bean, Phaseolus vulgaris L. Physiological and Molecular Plant Pathology , London, v.49, p.307-319, 1996. LEUBNER-METZGER, G.; MEINS JUNIOR. Function and regulation of plant β-1,3-glucanase (PR-2). In: DATA, S.K.; MUTHUKRISHNAN,

S. (eds..) Florida: CRC Press LLc., p.49-76. 1999. TUZUN, S.; RAO, N.M.; VOGEL, J.U.; SCHARDL, C.L.; KÚC, J. Induced systemic resistance to blue mold: early induction and accumulation of β-1,3-glucanase, chitinase and other pathogenesis-ralated proteins (b-proteins) in immunized tabacco. Physiology and Biochemistry , v.79, 979-983, 1989.


S EPARAÇÃO

DE

P IGMENTOS

F OTOSSINTÉTICOS POR

C ROMATOGRAFIA

EM

PAPEL

I. I NTRODUÇÃO As técnicas cromatográcas constituem um conjunto de métodos utilizados na identicação, puricação e quanticação de compostos e íons orgânicos e inorgânicos. A separação dos compostos (ou íons) analisados cromatogracamente ocorre devido às diferenças de solubilidade destes, nos solventes utilizados, bem como, devido ao grau de anidade entre os compostos analisados e a fase adsorvente. Basicamente, um sistema cromatográco é constituído de duas fases: uma estacionária, que pode ser um sólido ou um líquido, e uma fase móvel, a qual pode ser um líquido ou um gás. Na cromatograa, a fase móvel desloca-se através dos interstícios ou sobre a superfície da fase estacionária, arrastando os compostos a serem separados, em diferentes velocidades. A cromatograa em papel é um tipo de cromatograa de adsorção. Adsorção é a capacidade de uma substância reter outra na sua superfície. Essa retenção se dá através de forças de Van der Waals (física) ou de forma mais intensa (adsorção química).


23

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Colocar em um almofariz cerca de dois a cinco gramas de folhas verdes de uma planta qualquer. 2. Adicionar 4mL de álcool etílico e em seguida macerar as folhas completamente. 3. Transferir o material macerado para um tecido de náilon de malha na e espremer o mesmo ltrando para uma cápsula de porcelana. 4. Preparar uma tira de papel de ltro nas dimensões de 20cm x 1,5cm e em seguida fazer uma marca com um lápis de grate a 1,5cm de uma das extremidades (veja Figura 3-A). 5. Com o auxílio de uma pipeta de 0,1mL, transferir uma gota de extrato alcoólico de pigmentos para a tira de papel de ltro, depositando-a na marca feita anteriormente (Fig.3-B). 6. Pipetar 1mL de éter de petróleo e em seguida mais 1mL de hexano para uma proveta de 50mL, depositando os solventes diretamente no fundo da proveta. Evite que os solventes toquem nas paredes laterais da proveta. 7. Cuidadosamente, coloque o papel de ltro dentro da proveta, com a marca onde foi colocado o extrato, voltada para baixo. Evite que a marca onde foi colocado o extrato mergulhe no solvente (Fig. 3-C) 8. Cubra a proveta com um vidro de relógio e observe a ascenção dos solventes arrastando os pigmentos.


9. Antes da frente do solvente atingir o topo do papel de ltro (a cerca de 2cm), retire o papel de ltro da proveta e observe o ocorrido. 10. Anote as observações e apresente as suas conclusões. OBS.: Repetir o mesmo processo utilizando um dos solventes abaixo, ou a mistura de dois deles. S Hexano Éter de petróleo Clorofórmio Etanol

A

C D 1,89 4,34 4,87 24,3

B

C

F 3. Representação das etapas envolvidas na realização de uma cromatograa unidimensional em papel.


III. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E. ALBUQUERQUE, E.L.; BARRETO, L.P. Introdução às técnicas cromatográcas. Recife: UFRPE, 2000. 43p.

BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Introdução a métodos cromatográcos . Campinas-SP: Ed. da UNICAMP, 1995. 279p.


D ETERMINAÇÃO EM

DE

C LOROFILA

TECIDO F OLIAR

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO I. I NTRODUÇÃO A fotossíntese é um processo metabólico realizado pelos vegetais, e essencial para a manutenção da vida no planeta Terra. Este processo se desenvolve em organelas celulares denominadas de cloroplastos que ocorrem predominantemente no mesólo foliar. A clorola é um composto orgânico formado por carbono, hidrogênio, nitrogênio e contendo no centro de sua molécula um átomo de magnésio. Em todos os vegetais superiores existem dois tipos de clorola: a clorola a e a clorola b. A clorola a possui cor verde-azulada, com pico de absorção de luz em 420nm e 663nm, enquanto que a clorola b tem cor verde-amarelada e apresenta absorção de luz máxima em 453nm e 645nm. As clorolas podem ser extraídas de estruturas fotossintéticas com solventes orgânicos como acetona, etanol, etc. Vale salientar que o éter não é um bom solvente para extração de clorola. De um modo geral, as folhas apresentam teores de clorola total , isto é, o somatório da clorola a e clorola b , entre 0,9 e 1,9mg.g-1 de tecido fresco.


24

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Colocar em uma placa de Petri, cerca de 5 A 10 folhas frescas, com o auxílio de um bisturi remover e desprezar a nervura central e cortar o restante em pequenos pedaços com cerca de 3 a 5mm. 2. Pesar 200mg das amostras de folhas e transferir para um tubo de ensaio de tamanho grande e paredes grossas. 3. Adicionar 5mL de acetona a 80% e triturar em um homogeneizador de tecido vegetal. 4. Filtrar para um balão volumétrico de 25mL, usando uma tela de náilon de malha na. 5. Lavar o rotor do homogeneizador e tubo de ensaio, usando mais 5mL do mesmo solvente e transferir, sob ltração, o material para o balão volumétrico. 6. Repetir a operação anterior mais três vezes, e em seguida completar o volume do balão volumétrico com o mesmo solvente. 7. Agitar e recolher uma alíquota de cerca de 10mL do ltrado e centrifugar por 5 minutos a 2000g. 8. Zerar o espectrofotômetro com acetona a 80% e fazer as leituras das amostras nos comprimentos de ondas de 645nm e 663nm. 9. Com o auxílio das equações a seguir, calcular a concentração de clorola a , clorola b e o total das duas e expressar os resultados em mg.g-1 de tecido fresco.

128 | Análises Química s e Bioquímicas em Plantas

clorofla a (mgL-1) = 12,72 A663 - 2,59 A645 clorofla b (mgL-1) = 22,88 A645 - 4,67 A663

Sendo A645 e A663 respectivamente as absorbâncias a 645nm e 663nm.

III. B IBLIOGRAFIA ARNON, D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidases in Beta bulgaris. Plant Physiology , v.24, n.1, p.1-15, 1949. MACKINNEY, G. Absorption of light by chlorophyll solutions. J. Biol. Chem. 140: 315-322, 1941.


25

D ERMINAÇÃO EM

S UCO

DE

DA

ACIDEZ

FRUTAS

I. I NTRODUÇÃO Frutas e hortaliças, assim como outros produtos vegetais, têm a sua composição alterada ao longo do tempo, quando armazenadas ou transportadas por longo período, bem como por ação de agentes patológicos. Uma das alterações bastante comuns e que pode ser considerada indesejável diz respeito ao grau de acidez de certos frutos, o qual contribui de forma positiva como componente das características organolépticas. O sabor de certas frutas, como o da goiaba, por exemplo, no momento da colheita, quando a fruta é colhida próximo à maturação (de vez) é bem diferenciado do seu sabor no estágio de maturação plena. Por conseguinte, é importante mencionar que a determinação da acidez auxilia na avaliação do estado de conservação do alimento. Um processo de decomposição, seja por hidrólise, respiração ou fermentação (oxidações) quase sempre altera a concentração dos íons hidrogênio no fruto. A avaliação do sabor exige a participação de técnico treinado ou de equipe de provadores, o que torna este processo até certo ponto lento e oneroso. Outra forma de se avaliar a acidez, mais precisa e rápida, é através da medição do pH e


determinação da acidez titulável dos frutos. O pH de um suco de fruta, por exemplo, representa a concentração dos íons H livres no suco, enquanto que a acidez total titulável (ATT) estima a participação dos ácidos, orgânicos ou não, presentes no meio. Em ambos os casos, as determinações potenciométricas apresentam a vantagem sobre as determinações colorimétricas, devido a não interferência da cor do produto que está sendo analisado.

+

II. M ARCHA A NALÍTICA PARA D ETERMINAÇÃO DE ATT EM S UCO DE L IMÃO OU L ARANJA 1. Espremer a fruta e recolher o suco, ltrando-o para um béquer ou erlenmeyer de 100 ou 200mL; 2. Pipetar 10mL do trado para um erlenmeyer de 125mL; 3. Acrescentar 20mL de água destilada e em seguida 2 gotas do indicador fenolaleína; 4. Com o auxílio de uma bureta contendo hidróxido sódio 0,1 N, titular o conteúdo do erlenmeyer até a mudança da cor para rosa claro; 5. Anotar o volume do hidróxido de sódio gasto na titulação e proceder aos cálculos. O a. No caso de sucos muito ácidos, como o de limão por exem-


plo, recomenda-se usar na titulação um volume menor do suco, como 2mL, por exemplo. b. No caso de um suco pouco ácido, uma alternativa é usar um volume maior do ltrado na titulação, como 20 ou 50mL e não diluir. c. Outra alternativa, no caso de um suco pouco ácido, é empregar na titulação uma solução de hidróxido de sódio 0,01 N, em vez de 0,1 N. d. Empiricamente algumas pessoas preferem converter e expressar os resultados da acidez titulável para a massa de um dado ácido orgânico componente da fruta, como o ácido cítrico ou málico por exemplo. É importante ressaltar que as frutas possuem diversos ácidos orgânicos como componentes que contribuem para a acidez das mesmas, que a participação de cada um desses ácidos varia com uma série de fatores, até mesmo com o cultivar e com a massa molecular de cada ácido orgânico, além de que alguns ácidos são monohidroxilados enquanto outros são dihidroxilados ou trihidroxilados. Tudo isto acarreta uma série de distorções que mascaram a interpretação dos resultados, notadamente quando se deseja compará-los. f. Alternativamente a dosagem da ATT pode ser feita potenciometricamente, empregando-se o peagâmetro. Neste caso, em vez de acrescentar o indicador ao suco contido no erlenmeyer, introduz-se o eletrodo de um peagâmetro previamente cali-


brado, e procede-se a titulação com o hidróxido de sódio 0,1 N até que o pH atinja o valor 8,1 (Instituto Adolfo Lutz, 2008).

III. C ÁLCULOS Admitindo o exemplo de pipetar 10,0mL do suco da fruta, gastar 5,0mL de NaOH 0,1 N na titulação, e que a referida base tem um fator de correção da sua normalidade igual a 1,05. ATT =

Vb x Fpb x 100 Vs x C

ATT = acidez titulável total, expressa em mL de NaOH 1,0 N V b = volume em mililitros da base gastos na titulação Fpb = fator da padronização da base 100 = constante da expressão dos resultados para 100mL do suco Vs = volume em mililitros do suco empregado na titulação C = correção da base para padronizar os resultados em NaOH 1,0 N. Se usar uma base 0,1 N o valor de c será igual a 10. Se usar uma base 0,01 N, o valor de c será igual a 100. ATT =

5,0mL x 1,050 x 100 10,0ml x 10

= 5,25mL / 100mL


IV. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Indicador fenolaleína a 0,1%. Pesar 0,100g de fenolaleína, dissolver em etanol e completar o volume com o mesmo solvente para 100mL. Solução de hidróxido de sódio 0,1 N. Pesar 4,10g de NaOH, dissolver em água destilada e completar o volume para 1000mL. Padronizar a solução com ácido oxálico (veja anexo) e determinar o fator da padronização (fpb). O a. No caso de se desejar analisar uma fruta oleaginosa, como coco ou abacate por exemplo, a acidez titulável é decorrente principalmente dos ácidos graxos livres, os quais são lipossolúveis, portanto a sua extração deve ser feita com etanol. b. Embora a metodologia descrita anteriormente, rera-se a limão ou laranja, a mesma pode ser empregada para qualquer fruta. No entanto, quando se tratar de uma fruta menos suculenta do que o limão ou laranja, a exemplo do mamão, no preparo do suco são necessárias algumas modicações, conforme descritas a seguir. 1. Descascar a fruta e macerar a polpa em um almofariz; 2. Centrifugar uma alíquota de cerca de 100g da polpa, por meia hora a 3000rpm;


3. Recolher o sobrenadante e ltrar em papel de ltro, com sistema a vácuo. 4. Recolher uma alíquota de 10mL do ltrado e titular conforme descrito anteriormente. 5. Padronização da solução de hidróxido de sódio. A determinação da acidez titulável em suco de frutas é realizada usualmente com solução de hidróxido de sódio 0,1 N. Neste caso, para se realizar a análise com precisão, é necessário que a solução de hidróxido de sódio seja padronizada previamente, haja vista que tal base não é um padrão primário. A padronização de solução de hidróxido de sódio é feita com solução padrão de ácido oxálico 0,1 N.

V. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e sicoquímicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores). Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais .

Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.


26

D ETERMINAÇÃO EM

S UCO

DE

DO P H

FRUTAS

I. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO 1. Espremer a fruta e recolher o suco em um béquer, ltrando o mesmo em tecido de náilon de malha na; 2. Pipetar 10mL do suco para um recipiente estreito, como um tubo de ensaio ou frasco com cerca de 2 a 2,5cm de diâmetro; 3. Introduzir no frasco, o eletrodo do peagâmetro previamente calibrado com soluções tampão 4,0 e 7,0; 4. Agitar suavemente, observar no mostrador do aparelho o valor do pH e anotar o valor. O Alguns aparelhos já possuem dispositivo para a compensação automática da temperatura, a qual é convencionalmente expressa a 25°C. Caso o peagâmetro utilizado não disponha desse recurso, utilize uma tabela para proceder tal correção.


II. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e sicoquímicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores).

Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais. Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.


27

D ETERMINAÇÃO EM

S UCO

DE

DE SST

FRUTAS

I. I NTRODUÇÃO A determinação do teor de sólidos solúveis totais (SST) tem sido tradicionalmente realizada com o emprego de densímetros ou aerômetros, nas análises de caldo de cana-de-açúcar, álcool, vinagre, etc. Os resultados obtidos desta análise são expressos em graus Brix ou percentagem do soluto empregado na calibração. Para trabalhos de campo, em análise de caldo de cana-deaçúcar, os refratômetros manuais têm sido bastante empregados, os quais também expressam os resultados em graus Brix e corresponde a percentagem da sacarose, soluto predominante no caldo de cana, e portanto empregado na calibração dos mesmos. A tecnologia de fabricação dos refratômetros evoluiu bastante, de forma que já se encontram facilmente no comércio, refratômetros portáteis digitais. Os refratômetros têm sido amplamente empregados para determinar SST no suco de diversas frutas, como uma variável auxiliar na identicação do ponto de colheita das mesmas. A determinação refratométrica dos SST é bastante prática, haja vista que consta apenas em se colocar uma ou duas gotas do suco da fruta, ou caldo de cana, em um compartimento apro-


priado do instrumento, fechar o mesmo e fazer a leitura diretamente no mostrador. Não se dispondo de tal equipamento, pode se determinar o teor de SST gravimetricamente.

II. M ARCHA A NALÍTICA PARA D ETERMINAÇÃO DE SST EM S UCO DE L IMÃO OU L ARANJA POR G RAVIMETRIA 1. Espremer a fruta e ltrar o suco em papel de ltro; 2. Com o auxílio de uma pipeta volumétrica, pipetar 20mL do suco para um pesa-ltro previamente seco e tarado; 3. Colocar o pesa-ltro (aberto) em uma estufa com circulação de ar, regulada para 80°C, e manter por duas horas; 4. Após este período, regular a estufa para 105°C e manter o aquecimento por mais uma hora; 5. Ainda na estufa, tampar o pesa-ltro, transferir o mesmo para um dessecador, deixar esfriar por 20 minutos e pesá-lo; 6. Calcular a percentagem de SST conforme a equação seguinte: SST =

(PPF + PSS) - TPF x100 Va

SST = sólidos solúveis totais (em percentagem) PPF + PSS = peso do pesa-ltro mais peso dos sólidos solúveis (em gramas) TPF = tara do pesa-ltro (em gramas)


Va = volume do suco (em mL) 100 = constante da percentagem

III. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Análises bioquímicas e sicoquímicas em pós-colheita. In: OLIVEIRA, S.M.A. de et al (editores). Patologia pós-colheita: frutas, olerícolas e ornamentais tropicais .

Brasília-DF: EMBRAPA, 2006, p. 443-472. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.

OHLWEILER,O.A. Química analítica quantitativa. vol.2. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Cientícos, 1988. 226p.


D ETERMINAÇÃO DE EM

M ÉTODO

DE

VITAMINA C

S UCO

DE

FRUTAS

TILLMANS

I. I NTRODUÇÃO A vitamina C, além de sua conhecida propriedade de aumentar a resistência do organismo às infecções, ajuda ao crescimento e é um fator de regeneração e formação do sangue. Também é importante para a saúde dos dentes e das gengivas. Encontra-se em verduras e legumes, mas principalmente nos frutos ácidos como o caju, uva, limão e laranja. Atualmente, sabe-se que a acerola é um fruto bastante rico nessa vitamina, contendo dezenas de vezes mais vitamina C do que qualquer das frutas citadas acima. Quimicamente, a vitamina C é o ácido ascórbico, o qual se comporta como um composto bastante instável. Por oxidação, facilmente se converte em ácido desidroascórbico (Figura 4), propriedade esta que diculta sua análise química.


28

O HO HO H HO H

C C O C C C H C OH H

O O O H HO H

H2

ácido L-ascórbico

C C O C C C H C OH H

ácido L-deidroascórbico

F 4. Fórmulas estruturais dos ácidos L-ascórbico e L-desidroascórbico.

A vitamina C pode ser analisada em suco de frutas pelo método de Tillmans (Bezerra Neto e Barreto, 2004), o qual consta da titulação do ácido ascórbico presente no suco da fruta, utilizando uma solução de 2,6-diclorofenol-indofenol, previamente padronizada com uma solução de ácido ascórbico. O método de Tillmans está descrito a seguir, modicado no sentido de se usar solução de ácido oxálico como solvente e estabilizador da vitamina C, em substituição ao ácido metafosfórico, tradicionalmente utilizado neste método (Instituto Adolfo Lutz, 2008).

II. M ARCHA A NALÍTICA a. Preparo do suco da fruta. Extrair o suco da fruta a ser analisada e ltrar em tecido de náilon de malha na. Pipetar três alíquotas de 5mL da solução de ácido oxálico para erlenmeyers


de 50mL, e em seguida, adicionar a cada erlenmeyer, 2mL do suco da fruta. b. Padronização do diclorofenol indofenol. Encher uma bureta de cor âmbar com a solução de diclorofenol indofenol e, em seguida, zerá-la. Pipetar 5mL da solução de ácido oxálico para um erlenmeyer de 50mL, adicionar 2mL da solução de ácido ascórbico e titular com a solução de diclorofenol indofenol. O ponto nal desta titulação é reconhecido com a mudança de cor para o rosa claro, e a persistência desta cor por um a dois segundos. Após padronizar o diclorofenol indofenol, proceder à prova em branco. Para isto, transferir 5mL da solução de ácido oxálico para erlenmeyer de 50mL, adicionar 2mL de água destilada e titular com a solução de diclorofenol indofenol. Esta operação deve ser efetuada com três repetições, e em seguida calcular a média aritmética dos valores gastos nas titulações. c. Titulação da amostra. Titular as amostras referidas no item a, com a solução de diclorofenol indofenol. O ponto nal da titulação da amostra é reconhecido com o surgimento da cor rosa claro e a persistência desta cor, não mais retornando para incolor. Na análise de frutas como laranja e limão por exemplo, pode ser feita a titulação do suco da fruta sem necessitar de diluição. Já no caso da acerola, a qual contém bastante vitamina C, recomenda-se que seja feita uma diluição de 100 vezes.


III. P REPARO D OS R EAGENTES a. Ácido Oxálico 1,6% em ácido acético. Pesar 8,0g de ácido oxálico, dissolver em um béquer contendo 200mL de água destilada e 40mL de ácido acético glacial. Completar o volume para 500mL e guardar em frasco apropriado. b. Solução padrão de indofenol. Dissolver 0,042g de bicarbonato de sódio em 50mL de água destilada e adicionar 50mg de 2,6-diclorofenol indofenol (sal dissódico). Agitar vigorosamente e, em seguida, completar o volume para 200mL com água destilada. Filtrar a solução, guardá-la em frasco escuro, hermeticamente fechado e sob refrigeração. Recomenda-se que antes do preparo desta solução, o diclorofenol indofenol na forma cristalizada seja mantido por pelo menos duas horas em um dessecador contendo um agente higroscópico bastante ativo. c. Solução padrão de ácido ascórbico (1000mg.L-1). Pesar exatamente 100mg de ácido ascórbico (P.A.), transferir para um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com a solução do ácido estabilizante (ácido oxálico) utilizado no preparo do suco da fruta a ser analisada. Imediatamente após o preparo desta solução, manter a mesma ao abrigo da luz e padronizar a solução de indofenol, conforme descrito acima.


IV. C ÁLCULOS Adotando-se as condições de trabalho acima descritas, isto é, utilizando o mesmo volume (2,0mL por exemplo) de ácido ascórbico na padronização do indofenol, e da amostra (suco da fruta por exemplo), o teor de vitamina C pode ser calculado pela seguinte fórmula: C=

Via - Vib x 100 Vip

Onde: C = mg de ácido ascórbico/100mL do suco da fruta. Via = volume de indofenol gasto na titulação da amostra. Vib = volume de indofenol gasto na prova em branco. Vip = volume de indofenol gasto na padronização do mesmo.

V. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.


29

D ETERMINAÇÃO

DE

M ÉTODO

P RÚSSIA

DO

A ZUL

DA

FENÓIS TOTAIS

I. I NTRODUÇÃO Taninos são compostos do metabolismo secundário dos vegetais, de natureza fenólica, e que precipitam ao interagir com proteínas. Como resultante desta propriedade, os taninos proporcionam o sabor adstringente, e quando em elevada concentração diminui a digestibilidade dos alimentos. Há muito tempo os taninos têm sido empregados no curtume de couro, atividade esta explorada industrialmente e que gera divisas para o Brasil. Os taninos também são empregados com ns medicinais, além do emprego como xadores de corantes e anticorrosivo na indústria naval. Existem dois tipos de taninos, os taninos condensados (proantocianidinas) e os taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos). Do ponto de vista agronômico, as principais vantagens do tanino são: barreira para herbívoros (ex: ataques de pássaros em sorgo), resistência a fungos causadores da podridão no grão antes da colheita (ex.: sorgo) e resistência a insetos. A principal desvantagem do tanino na alimentação animal é o seu efeito antinutricional, causado pelo complexo tanino-proteína, que quando em elevada concentração diminui


a digestibilidade das forragens. Existem diversos métodos para se quanticar taninos, no entanto, nenhum deles pode ser considerado completamente satisfatório. Segundo Magalhães et al. (1997), o método de Folin-Denis superestima a quantidade de taninos, enquanto que o método do azul da Prússia é o que apresenta melhor correlação com o desempenho de aves que se alimentam com ração rica em taninos. Ambos quanticam fenóis totais e se usam o ácido tânico como padrão por tratar-se do tanino mais representativo do grupo. O método do azul da Prússia se baseia na reação de óxido-redução entre os compostos fenólicos e íons ferro. Grupos hidroxifenólicos reduzem íons Fe 3+ a Fe2+ , os quais são complexados com ferricianeto, produzindo pigmentos de coloração azul.

II. M ARCHA A NALÍTICA P  . 1. Pesar 0,5g da amostra e transferir para um erlenmeyer de 125mL; 2. Adicionar 10mL de HCl a 1% em metanol e tampar; 3. Agitar suavemente em mesa agitadora por 20 minutos; 4. Centrifugar a 1.000rpm, durante dez minutos, ou ltrar em papel de ltro qualitativo; 5. Guardar em refrigerador até o momento da análise.


D  . 1. Pipetar 2mL de água destilada para tubos de ensaio devidamente identicados para receber os padrões e amostras; 2. Acrescentar 1mL de cloreto férrico (FeCl 3) 50mM e agitar suavemente o tubo de ensaio por 10 segundos; 3. Imediatamente acrescentar 1mL de ferricianeto de potássio, agitar suavemente o tubo de ensaio e deixar em repouso por exatamente 20 minutos a partir da adição do cloreto férrico. 4. Efetuar a leitura espectrofotométrica a 720nm. 5. Calcular o teor de tanino nas amostras por comparação com as leituras de soluções padrões de ácido tânico. OBS.: Exatamente 30 segundos após a adição do cloreto férrico ao primeiro tubo de ensaio, proceder da mesma forma com o segundo tubo de ensaio, assim sucessivamente, de forma que antes de atingir o tempo necessário para efetuar as leituras espectrofotométricas (20 minutos), é possível promover a reação em 40 tubos de ensaio, incluindo padrões de trabalho e amostras.

III. P REPARO D OS R EAGENTES Ácido clorídrico a 1% em metanol. Pipetar para um balão volumétrico de 1.000mL, 27mL de HCl conc. (d = 1,19 g.mL -1) e completar o volume com metanol (P.A.). Solução estoque de ácido tânico (1000mg.L-1). Pesar 100mg


de ácido tânico, dissolver em HCl a 1% em metanol, e completar o volume para 100mL. Padrões de trabalho de ácido tânico. Pipetar separadamente 0,25; 0,50; 1,00 e 2,00mL da solução estoque de ácido tânico (1000mg.L-1) e completar o volume para 10mL com solução de HCl a 1% em metanol, obtendo-se respectivamente 25, 50, 100 e 200mg.L-1 de ácido tânico. O branco (padrão zero) corresponde à solução de HCl a 1% em metanol. Cloreto férrico (FeCl3) 50 mM. Calcinar FeCl3.6H2O a 200°C, por 3 horas. Em seguida levar a um dessecador e após 15 minutos, pesar 0,6488g, dissolver com água destilada e completar o volume para 500mL. Ferricianeto de potássio [K3Fe(CN)6] 8mM. Pesar 1,3170g de ferricianeto de potássio [K 3Fe(CN)6], dissolver com água destilada e completar o volume para 500mL.


MAGALHÃES, P.C.; RODRIGUES, W. A.; DURÃES, F.O.M. Tanino no grão de sorgo: bases siológicas e métodos de determinação. Sete

Lagoas: EMBRAPA-CNPMS, 1997. 26p. (EMBRAPA-CNPMS. Circular técnica, 27).


30

D ETERMINAÇÃO TOTAIS M ÉTODO

DE

E

TANINOS

DE

F OLIN -D ENIS

FENÓIS

I. I NTRODUÇÃO Os compostos fenólicos são enquadrados como compostos do metabolismo secundário, e podem ser subdivididos em três grupos: avonóides, ácido salicílico e taninos. É importante ressaltar que a lignina é um composto de natureza fenólica, porém não faz parte dos compostos do metabolismo secundário, haja vista sua participação como componente da parede celular, o que lhe confere a função estrutural. Os taninos são compostos do metabolismo secundário dos vegetais, de natureza fenólica, e que precipitam ao interagir com proteínas. Como resultante desta propriedade, os taninos proporcionam o sabor adstringente, característico de certos frutos verdosos, como caju, tamarindo, uva, banana, etc. Compostos fenólicos simples como ácido hidroxi-cinâmico, catequinas e antocianinas não causam o sabor adstringente, enquanto que dímeros de avanas apresentam esta característica (Van Buren, 1971). Admite-se que os taninos são produzidos pelas plantas como um mecanismo de defesa, contra ataque de pragas e doenças. A

150 | Análise s Químicas e Bioquímicas em Plantas

síntese de toalexinas bem como a síntese de taninos também são consideradas como modalidades de RAS (Resistência Sistêmica Adquirida). O acúmulo de compostos fenólicos tem sido constatado, atuando diretamente na inibição de crescimento de fungo, criando ambiente totóxico, em raízes de tomateiro tratado com quitosana (Benhamou et al., 1994). Quimicamente existem dois tipos de taninos: os taninos condensados (avolanas) e os taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos). Alguns autores consideram os taninos como polifenóis, outros preferem considerá-los como compostos oligoméricos com múltiplas unidades que apresentam grupos fenólicos livres e peso molecular variando entre 500 e 20.000 Daltons. São solúveis em água, com exceção de algumas estruturas de elevado peso molecular. Os mesmos são componentes dos extrativos da madeira, que em algumas árvores podem ser extraídos e comercializados como uma boa fonte de renda, destacando-se seu emprego na indústria de curtume de couro. Os taninos também têm aplicação medicinal, na produção de toterápicos. A seguir são citadas algumas espécies arbóreas que apresentam um conteúdo relativamente elevado de taninos: barbatimão ( Stryphnodendro adestringens (Mart.) Coville), acácia negra ( Acacia mearnsii De Wild.), angico verdadeiro (Piptadenia rigida Benth.), angico vermelho ( Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan.), mangue branco (Laguncularia racemosa L.), canafístula (Senna ferruginea Schrad.), goiabeira (Psidium guajava L.), jurema preta (Mimosa


hostilis Benth.),

etc. A principal desvantagem do tanino na alimentação animal é o seu efeito antinutricional, causado pelo complexo tanino-proteína, que quando em elevada concentração diminui a digestibilidade das forragens. Existem vários métodos para a determinação de taninos e fenóis totais em tecidos vegetais, porém, todos eles têm suas limitações (Magalhães et al., 1997). O método de Folin-Denis é um método colorimétrico que determina fenóis totais (Horwitz, 1980). Tal método baseia-se na redução em meio alcalino do fosfomolibdato-fosfotungstato pelos fenóis, a molibdênio, o que proporciona o desenvolvimento da coloração azul. O método de Folin-Denis também pode ser empregado para se determinar o teor de taninos em amostras vegetais. Para isto, determina-se primeiro o teor de fenóis totais no extrato vegetal, e em seguida procede-se à precipitação dos taninos com o uso de proteína ou PVP. Após a precipitação dos taninos presentes no extrato vegetal, determina-se no sobrenadante o teor de fenóis não tânicos, e por diferença calcula-se o teor de taninos.

II. M ARCHA A NALÍTICA P   a. Cortar em placa de Petri uma amostra de casca de árvore (goiabeira, por exemplo) em fragmentos de cerca de 2mm; b. Pesar 0,2g da amostra, transferir para um erlenmeyer de


50mL e acrescentar 20mL de etanol a 80%; c. Fechar o erlenmeyer e colocar para agitar por 30 minutos; d. Filtrar para um balão volumétrico de 50mL e lavar o resíduo com água destilada; e. Completar o volume do balão volumétrico, homogeneizar o extrato e transferir para um frasco rosqueável; f. Colocar uma identicação no frasco e manter sob refrigeração até o momento do desenvolvimento da cor. P   a. Pipetar para um tubo de ensiao 1,0mL do extrato vegetal; b. Acrescentar cerca de 50mg de caseína (ou PVP), fechar o tubo de ensaio e agitar vigorosamente por cerca de um minuto; c. Deixar em repouso por 24 horas em refrigerador; d. No dia seguinte, centrifugar por 10 minutos a 2000g e em seguida proceder o desenvolvimento da cor. D   a. Pipetar para tubos de ensaio 0,2mL do extrato ou solução padrão de ácido tânico; b. Acrescentar 5mL de água destilada; c. Acrescentar 1,0mL da solução saturada de carbonato de sódio; d. Acrescentar 0,5mL do reagente de Folin-Denis; e. Agitar suavemente e deixar em repouso por 30 minutos;


f. Realizar a leitura espectrofotométrica a 760nm. g. Realizar os cálculos, com base na curva padrão de ácido tânico e expressar os resultados em termos de mg de taninos por grama de material analisado.

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Reagente de Folin-Denis. Transferir 380mL de água destilada para um béquer, acrescentar 50g de tungstato de sódio (Na2WO4.2H2O), 10g de ácido fosfomolíbdico e 25mL de ácido fosfórico. Colocar para reuxar por duas horas e completar o volume para 500mL com água destilada. Esta solução tem validade de um mês. Solução saturada de carbonato de sódio. Pesar 35g de car bonato de sódio (Na2CO3), dissolver em 100mL de água destilada a quente. Deixar esfriar, provocar precipitação com cristais de carbonato de sódio e em seguida ltrar. Solução padrão de ácido tânico (solução estoque 2,5g.L-1). Pesar 0,500g de ácido tânico, dissolver em água destilada e completar o volume para 200mL. Preparar soluções padrões novas a cada determinação. Soluções padrões diluídas. Pipetar para balões volumétricos de 100mL: 1, 2, 4, e 8mL da solução estoque de ácido tânico (2,5g.L-1) e completar o volume com água destilada. Com este procedimento, estarão preparadas as soluções padrões de ácido


tânico nas concentrações respectivas de 25, 50, 100, e 200mg.L -1. O padrão zero corresponde à água deionizada.

IV. B IBLIOGRAFIA HORWITZ, W. Ocial methods of analysis of the association of ocial analytical chemists. Association of Ocial Analytical

Chemists. 13ª ed. Washinton, 1980. 1018p. MAGALHÃES, P.C.; RODRIGUES, W. A.; DURÃES, F.O.M. Tanino no grão de sorgo: bases siológicas e métodos de determinação. Sete

Lagoas: EMBRAPA-CNPMS, 1997. 26p. (EMBRAPA-CNPMS. Circular técnica, 27). VAN BUREN, J. Fruit Phenolics. In: HULME, A.C. The biochemistry of fruits and their products. v. 1, p. 269-304. London: Academic

Press. 1971.


31

D ETERMINAÇÃO

DE

C ARBONO

O RGÂNICO TOTAL EM

TECIDO VEGETAL

I. I NTRODUÇÃO Em estudos de ciclagem do carbono na natureza é necessário se conhecer uma metodologia para determinação do carbono em tecidos vegetais. Em algumas situações, por limitação dos laboratórios, o teor de carbono é estimado por meio do uso de fatores de conversão, que são multiplicados pelo teor de matéria orgânica. No entanto, é importante salientar que o teor de carbono na matéria orgânica varia com a natureza da mesma, isto é, de sua composição química. A depender da predominância de um determinado composto ou outro na matéria orgânica, um dado fator de conversão pode se tornar inviável. Por exemplo, o fator de conversão com base na fórmula molecular da glucose, celulose e ácido oxálico é respectivamente 2,25; 2,50 e 3,75. O método descrito a seguir baseia-se na oxidação da matéria orgânica em presença de ácido sulfúrico e dicromato de potássio, e posterior dosagem, por titulação, do excesso de dicromato, com solução padrão de sulfato ferroso amoniacal.


O carbono da matéria orgânica é oxidado a CO2 enquanto que o cromo é reduzido de Cr +6 para Cr +3.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 0,1g da amostra vegetal pré-seca e transferir para um erlenmeyer de 500mL; 2. Adicionar 20mL* de dicromato de potássio 1 N e em seguida 40mL de ácido sulfúrico concentrado; 3. Tampar o erlenmeyer com vidro de relógio, aquecer por cinco minutos em fervura branda, em seguida agitar suavemente por um minuto e deixar em repouso por 30 minutos; 4. Adicionar 200mL de água destilada, em seguida 10mL de ácido fosfórico concentrado e 1mL de difenilamina; 5. Titular o excesso do oxidante com solução de sulfato ferroso amoniacal 0,5 N, até viragem da cor púrpura para verde. * OBS.: Usar pipeta de alta precisão, tipo volumétrica.

III. C ÁLCULOS Cada mililitro de dicromato de potássio 1 N reduzido equivale a 3mg de carbono oxidado. Com base nesta estequiometria e na quantidade de amostra pesada, calcula-se a percentagem de carbono na amostra pré-seca que deve posteriormente ser corrigida para a matéria seca absoluta.


EXEMPLO: Admitindo que se pesou 200mg de uma amostra pré-seca, com 10% de umidade, e que esta foi oxidada em um erlenmeyer com 20mL de dicromato de potássio 1 N. Após a oxidação da matéria orgânica, titulou-se o excesso de dicromato gastando-se 5,2mL de sulfato ferroso amoniacal 0,5 N. Calcular a percentagem de carbono total na matéria seca da amostra referida. Como o excesso de dicromato foi titulado com sulfato ferroso amoniacal a 0,5 N e não a 1,0 N, deve-se primeiramente dividir por 2 o volume desse reagente gasto na titulação, assim 5,6mL/2 é igual a 2,6mL.

Dicromato de potássio consumido na oxidação: 20,0 mL - 2,6 mL = 17,4 mL Quantidade total de carbono na amostra: 3mg x 17,4mL = 52,2mg Percentagem de C na amostra pré-seca: 200mg (amostra) ------- 52,2mg de C 100 (de % ) -------------- X X = 100x52,2 =26,1% de C na matéria seca. 200


Percentagem de matéria seca da amostra: 100% - % de umidade 100% - 10% = 90 % Percentagem de C na matéria seca: 90% de MS ------------ 26,1% de C 100% de MS ----------- Y Y = 100x26,1 = 29,00% de C na matéria seca. 90

IV. R EAGENTES Dicromato de potássio 1 N. Pesar 49,04g de dicromato de potássio (K 2Cr2O7), previamente seco em estufa regulada a 120°C por 2 horas, dissolver em água destilada e completar o volume para um litro. Este reagente deve ser P.A. Ácido fosfórico a 85%. Corresponde ao ácido ortofosfórico concentrado (H3PO4); Difenilamina. Pesar 0,5g de difenilamina e dissolver em 20mL de água destilada, em seguida acrescentar 100mL de ácido sulfúrico concentrado; Sulfato ferroso amoniacal 0,5 N. Dissolver 196,05g de sulfato ferroso amoniacal [Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O] em 500mL de água destilada, acrescentar 7,5mL de ácido sulfúrico concentrado e completar o volume para um litro. Este reagente deve ser recém preparado. Recomenda-se padronizar previamente


esta solução com a solução de dicromato de potássio de mesma normalidade.

V. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p.

MENDONÇA, E.S.; MATOS, E. da S. Matéria orgânica do solo: métodos de análises. Ponte Nova-MG: D&M Gráca e Editora Ltda, 2005. 107p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.

TEDESCO, M.J. Análises de solo, plantas e outros materiais . Porto Alegre: UFRS, 1995. 174p.


D IGESTÃO N ITRO -P ERCLÓRICA PARA DE

A NÁLISE

E LEMENTOS M INERAIS

I. I NTRODUÇÃO A digestão nitro-perclórica é utilizada quando se deseja realizar determinações analíticas da maioria dos nutrientes minerais presentes nas plantas (P, K, Ca, Mg, Cu, Fe, Mn, Zn, etc.), excetuando os elementos N e Cl. Durante a digestão a matéria orgânica da amostra vegetal é oxidada com ácidos minerais concentrados sob aquecimento. As misturas de ácidos minerais mais utilizadas são as seguintes: HNO3 + HClO4 (3:1 ou 5:1), HNO3 + HClO4 + H2SO4 (3:1:1) e HCl + HNO3 (3:1). A desvantagem do uso do ácido sulfúrico refere-se à inviabilidade de se analisar Ca e S, pois o primeiro precipita como CaSO 4 e o segundo é constituinte do H 2SO4.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 0,5g da amostra pré-seca e transferir para um tubo digestor; 2. Adicionar ao tubo digestor 5mL de ácido nítrico concentrado


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e 1mL de ácido perclórico concentrado e deixar em repouso de um dia para o outro; 3. Colocar para aquecer em bloco digestor localizado em uma capela, obedecendo a seguinte seqüência de tempo e temperatura: 1h a 80°C, 1h a 120°C, 1h a 150°C e 1h a 180°C; 4. Aguardar esfriar e transferir quantitativamente o digerido para um balão volumétrico de 50mL: com o auxílio de água deionizada e um bastão policial, lavar o tubo digestor pelo menos três vezes, transferindo o líquido de lavagem para o balão volumétrico e em seguida completar o volume; 5. Transferir o extrato para frascos, proceder às análises recomendadas ou guardar sob refrigeração para posterior análise. OBSERVAÇÕES 1. Se ao nal das três horas de aquecimento e posterior esfriamento do material, se constatar que a amostra não foi perfeitamente digerida, isto é, não estiver de cor clara, esbranquiçada ou translúcida, adicionar cerca de 3mL de ácido nítrico e colocar para aquecer novamente por 1 hora a 180°C. 2. Alternativamente, pode se obter o volume nal do extrato, com base na massa, isto é, por pesagem. Neste caso, transferese quantitativamente o digerido para um frasco de polietileno previamente tarado. Com o auxílio de água deionizada e um bastão policial, lavar o tubo digestor pelo menos três vezes, transferindo o líquido de lavagem para o frasco até conseguir


cerca de 50mL de extrato. Em seguida pesar o frasco de plástico contendo o extrato vegetal, proceder às análises recomendadas ou guardar sob refrigeração para posterior análise. O fator de diluição da amostra será igual ao quociente entre o peso do extrato (frasco + extrato - tara do frasco) e o peso da amostra.


III. B IBLIOGRAFIA BEZERRA NETO, E.; BARRETO, L.P. Métodos de análises químicas em plantas. Recife: Imprensa Universitária da UFRPE, 2004. 149p. MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. Piracicaba: POTAFOS, 1989. 201p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos de plantas. Ciência e Cultura, v.36, n.11, p.1953-1958, 1984. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992. 17p. (IAPAR. Circular, 74). SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas. Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


D ETERMINAÇÃO DE

F ÓSFORO

M ÉTODO C OLORIMÉTRICO DO M OLIBDO - VANADATO I. I NTRODUÇÃO O fósforo é um macronutriente vegetal cuja concentração total em tecidos vegetais pode variar de 1 a 15g kg -1 da matéria seca. Sua determinação pode ser feita colorimetricamente pelo método do molibdo-vanadato, o qual apresenta uma sensibilidade relativamente boa na faixa de 0,1 a 20ppm. Este método sofre interferência do Fe2+ e Cl- quando em concentrações superiores a 100ppm e 75ppm respectivamente. A colorimetria baseia-se na comparação da intensidade de cor de soluções de concentrações desconhecidas (amostras), com a intensidade de cor de soluções padrões de um dado elemento ou composto, responsável pela cor destas soluções. A intensidade de cor das soluções é medida em aparelhos denominados colorímetros, cujos resultados das leituras (absorbância) são correlacionados com as concentrações do elemento ou composto em estudo, possibilitando o cálculo de sua concentração nas soluções problemas.


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A primeira etapa da análise de fósforo em tecido vegetal é a digestão da amostra, a qual pode ser feita por via úmida ou por via seca. Por via úmida, usa-se uma mistura de ácido nítrico com ácido perclórico e põe-se a amostra para aquecer por quatro horas. Por via seca, procede-se a calcinação da amostra, conforme descrito na determinação de cinzas (R.M.). O extrato vegetal devidamente preparado apresenta-se como uma solução incolor. Para a sua análise por um método colorimétrico, faz-se necessário adicionar um reagente especíco (molibdato de amônio mais vanadato de amônio), o qual reage com o fósforo formando um complexo de cor amarelada. A intensidade de cor formada é proporcional à concentração de fósforo e pode ser medida em um colorímetro e em seguida correlacionada com soluções padrões de fósforo.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pipetar para tubos de ensaio, separadamente, mL dos padrões de fósforo (0; 25; 50; 75; 100 e 200mg.L -1) ou do extrato vegetal (nitro-perclórico ou das cinzas); 2. Acrescentar a cada tubo de ensaio, 5mL de água deionizada e 1mL do reagente especíco, formado pela mistura de volumes iguais de molibdato de amônio a 5% e vanadato de amônio a 0,25%; 3. Deixar em repouso por 5 minutos, fazer a leitura em colorí-


metro com ltro azul ou em espectrofotômetro a 470nm; 4. Elaborar um gráco, colocando no eixo x os valores dos padrões de fósforo e no eixo y as leituras obtidas com os mesmos, e em seguida calcular a equação de regressão linear; 5. Calcular a concentração de fósforo na amostra vegetal e expressar os resultados em g kg-1. Observação: O colorímetro tipo Kle-Summerson fornece as leituras em unidades Kles (u.k.), as quais equivalem a absor bância multiplicada pelo fator 500.

III. R EAGENTES Molibdato de amônio ((NH4)6Mo7O24). Solução aquosa a 5%. Pesar 26,55g do sal tetra hidratado, dissolver em água destilada e completar o volume para 500mL. Vanadato de amônio (NH4VO3). Solução a 0,25%. Pesar 1,25g do sal e dissolver em cerca de 250mL de água destilada quente. Deixar esfriar e em seguida adicionar 175mL de ácido nítrico concentrado. Completar o volume para 500mL e guardar em frasco escuro. Solução padrão de fósforo. Preparar uma solução estoque contendo 1.000mg.L-1 de fósforo. Pesar 2,195g de fosfato monobásico de potássio (KH2PO4) seco em estufa, dissolver em 150mL de água destilada e em seguida adicionar 5mL de ácido


sulfúrico 10 N. Completar o volume para 500mL com água destilada e guardar em frasco escuro. Padrões de trabalho (curva padrão). Pipetar para balões volumétricos, de 100mL, separadamente, 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0mL da solução estoque de fósforo (1.000mg.L -1). Adicionar cerca de 50mL de água destilada e em seguida 4,0mL de ácido sulfúrico 10 N. Completar o volume e transferir para frascos apropriados. As soluções preparadas conforme descritas acima contêm respectivamente 25, 50, 75, 100 e 200mg.L-1 de fósforo. O padrão zero é preparado de forma semelhante aos demais, porém sem a adição da solução estoque de fósforo.



MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas : princípios e aplicações. Piracicaba:

POTAFOS, 1989. 201p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas . Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


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D ETERMINAÇÃO DE

E NXOFRE

M ÉTODO TURBIDIMÉTRICO DO S ULFATO DE B ÁRIO I. I NTRODUÇÃO O enxofre é um macronutriente vegetal constituinte dos aminoácidos cisteína, cistina e metionina e portanto das proteínas. Desse modo, em condições de deciência de enxofre a síntese de proteína é inibida, levando à queda na produtividade das culturas. O teor de enxofre nas plantas varia de 1 a 15g kg -1 da matéria seca. Para cafeeiro, cana-de-açúcar e pessegueiro, teores da ordem de 2g kg-1 na matéria seca são considerados adequados. Por outro lado, o milho, a soja e tomateiro exigem 3g kg -1 de S na matéria seca. A determinação turbidimétrica do enxofre fundamenta-se na turbidez produzida pela reação do enxofre com o cloreto de bário, formando sulfato de bário. Esta turbidez pode ser medida em colorímetro ou espectrofotômetro na forma de transmitância ou absorbância.


II. M ARCHA A NALÍTICA a. O  - 1. Em tubo de ensaio de 10mL adicionar 2mL das soluções-padrão de enxofre (0, 10, 15, 20, 25, 30, 40 e 50mg.L -1 de S). 2. Adicionar 0,2mL da solução de HCl 6N contendo 20mg.L -1 de S. 3. Juntar cerca de 100mg de cristais de BaCl 2.2H2O namente moído e deixar em repouso por 1 minuto. 4. Agitar durante 30 segundos, dissolvendo os cristais, e fazer a leitura em até 8 minutos após a adição do cloreto de bário, em espectrofotômetro a 420nm. b. N   1. Transferir 2mL do extrato nítrico-perclórico para tubo de ensaio de 10mL e em seguida proceder conforme descrito para a obtenção da curva-padrão. 2. Calcular a concentração de enxofre na amostra preparada, expressando o resultado em grama por quilograma.

III. P REPARO

DOS

R EAGENTES

Solução-estoque de enxofre (contendo 1.000mg.L-1 de S). Pesar 5,434g de K2SO4 P.A , seco em estufa, dissolver em água deionizada e completar o volume para 1.000mL.


Soluções-padrão de enxofre. Pipetar para balões volumétricos de 100mL, separadamente, 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0 ; 4,0 e 5,0mL da solução-estoque de enxofre (1.000mg.L -1), e em seguida completar o volume com água deionizada. O branco (padrão zero) corresponde à água deionizada. Solução de HCl 6N contendo 20mg.L -1 de S. Adicionar em um béquer de 1.000mL, 200mL de água destilada, 500mL de HCl P.A (d= 1,19g.L-1) e 0,1087g de K2SO4 P.A., previamente seco em estufa. Agitar até dissolver o sulfato de potássio, transferir para um balão volumétrico de 1000mL e completar o volume com água destilada.


MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações . Piracicaba:

POTAFOS, 1989. 201p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


D ETERMINAÇÃO DE M ÉTODO

DE

C LORETO

M OHR

I. I NTRODUÇÃO O cloro é um micronutriente dos vegetais superiores encontrado em abundância nas águas dos oceanos e mares, assim como em solos salinos. É componente fundamental dos fertilizantes cloreto de potássio e cloreto de amônio. Nas plantas, esse micronutriente participa da fotossíntese atuando sobre a fotólise da água, e também do processo de osmorregulação. Seu conteúdo nos vegetais varia em função de diversos fatores, principalmente do meio onde as plantas são cultivadas. De um modo geral, pode se considerar como teores adequados para a maioria das culturas, de 340 a 1200mg.kg-1 de matéria seca. Vários são os métodos empregados para se analisar o íon cloreto. O método descrito neste capítulo consta de uma extração com água quente, partindo de uma amostra pré-seca, e posterior quanticação pelo método volumétrico de Mohr.


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II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Pesar 1,0g da amostra pré-seca; 2. Transferir para um erlenmeyer de 50mL; 3. Adicionar 25mL de água deionizada e tampar o mesmo; 4. Colocar para aquecer a 90°C por 20 minutos; 5. Deixar esfriar e ltrar em tecido de náilon de malha na; 6. Pipetar uma alíquota de 10mL do extrato obtido acima, para um erlenmeyer de 50mL; 7. Adicionar 1mL de cromato de potássio a 5%; 8. Titular com solução padronizada de nitrato de prata 0,025 N. O 1. Estequiometricamente, 1,0mL de nitrato de prata 0,025 N equivale a 0,8863mg de cloreto. 2. Veja exercício proposto no ANEXO IV.

III. R EAGENTES Solução de nitrato de prata 0,025 N. Pesar 4,2468g de nitrato de prata (P.A.), dissolver em água destilada, completar o volume para um litro e em seguida padronizar a mesma, titulando com uma solução padrão de cloreto de sódio 0,05 N. Guardar em frasco escuro. Solução de cromato de potássio a 5%. Pesar 50,0g de cro-


mato de potássio (K 2CrO4) dissolver em água destilada e completar o volume para um litro. O Alguns detalhes envolvendo a análise de cloreto pelo método de Mohr P  : • Encher a bureta com AgNO 3 0,025 N e em seguida zerá-la; • Pipetar 10mL de água deionizada para um erlenmeyer de 50mL; • Adicionar 1,0mL de cromato de potássio a 5%; • Titular e anotar o volume gasto. P    : Realizar esta operação com três repetições. • Pipetar 5,0mL de solução padrão de NaCl 0,05 N, para um erlenmeyer de 50mL; • Adicionar 5,0mL de água deionizada; • Acrescentar 1,0mL de cromato de potássio; • Titular e anotar o volume. T    : • Pipetar 10mL do extrato para um erlenmeyer de 50mL; • Acrescentar 1,0mL de cromato de potássio; • Titular com AgNO3 0,025 N padronizado, e em seguida anotar o volume gasto para os devidos cálculos.


IV. B IBLIOGRAFIA MALAVOLTA, E. Elementos de nutrição mineral de plantas . São Paulo: Editora Agronômica Ceres, 1980. 251p.: il. MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. (2nd edition). London: Elsevier Ltd., 1995. 674p. OHLWEILER, O.A. Química analítica quantitativa. 2. ed. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Cientícos, 1988. v.2, 226p.: il. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


D ETERMINAÇÃO DE

B ORO

Método Espectrofotométrico da Azometina-H

I. I NTRODUÇÃO O boro é um micronutriente essencial às plantas. É absorvido na forma de ácido bórico (H 3BO3). Na planta se comporta como pouco móvel ou imóvel. Sua deciência ocorre em tecidos de crescimento, enquanto que os sintomas de toxidez aparecem em tecidos mais velhos. O boro possui papel na formação da parede celular, divisão celular, crescimento celular e transporte de carboidratos. O teor considerado como tóxico varia com a espécie vegetal, assim para o cafeeiro 200mg.kg-1 nas folhas, estão associados com os sintomas de clorose malhada (Malavolta, 2006). Fageria (1999) estudando arroz, feão, milho, soja e trigo concluiu que os níveis adequados na planta variaram de 10 a 75mg. kg-1 e os tóxicos de 20 a 153mg.kg -1 , dependendo da cultura. A análise de boro em tecidos vegetais é importante para o diagnóstico de deciência ou toxicidade. A determinação de boro pode ser feita por vários métodos colorimétricos, baseados em reações com corantes orgânicos como azometina-H, curcu-


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mina, carmina e quinalizarina (Sah & Brown, 1997). Dentre os métodos colorimétricos o mais utilizado é o da azometina-H, por ser menos susceptível a interferências, mais rápido e mais sensível, o único inconveniente é o preço do reagente que é um pouco elevado (Bataglia et al., 1983). A metodologia com azometina-H baseia-se na formação de um complexo de coloração amarelada, resultante da reação do ácido bórico, com o reagente azometina-H. Os possíveis interferentes para o método são partículas em suspensão, que possam aumentar a turbidez, ou interferir na coloração, a presença de Fe e a contaminação de borossilicatos devido à utilização de vidrarias. Deve ser efetuada a digestão seca por calcinação, uma vez que a digestão por via úmida provoca perda de ácido bórico por volatilização (Malavolta et al., 1997).

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO 1. Pesar em cadinho de porcelana 0,250g da amostra vegetal (m.s.); 2. Colocar para calcinar a 650°C por 2 horas; 3. Deixar esfriar e em seguida dissolver as cinzas com 10mL* de HCl 0,1 N. 4. Transferir 1,0mL* do extrato ou solução padrão de boro, para tubo de ensaio (material plástico); 5. Adicionar 2,0mL* da solução tampão e homogeneizar;


6. Adicionar 2,0mL* da solução de azometina-H, agitar e aguardar 30 minutos para o desenvolvimento da cor (amarela); 6. Efetuar a leitura em espectrofotômetro a 420nm, ajustando o zero com solução de HCl 0,1 N. 7. Proceder aos cálculos com base na equação de regressão gerada a partir da correlação entre a absorbância e concentração de boro na curva padrão. Expressar os resultados em mg.kg-1 de matéria seca da amostra vegetal. *OBS:. Usar pipetas de alta precisão.

III. R EAGENTES Solução de ácido L-ascórbico a 1%. Dissolver 1g de ácido ascórbico em 100mL de água deionizada; Solução tampão acetato. Dissolver 125g de acetato de amônio e 7,5g de EDTA (sal dissódico) em 200mL de água destilada, adicionar 62,5mL de ácido acético glacial e completar o volume para 250mL com água deionizada; Solução de azometina-H 0,45%. Dissolver 0,45g de azometina-H em 100mL de uma solução de ácido ascórbico a 1%. Guardar em frasco escuro, no refrigerador, conservando por no máximo uma semana; Solução de ácido clorídrico 0,1 N. Pipetar 8,3mL de HCl concentrado (12 N) para um balão volumétrico de 1000mL contendo cerca de 500mL de água destilada, homogeneizar, completar o


volume com água destilada e acondicionar em frasco plástico; Solução padrão de boro (solução estoque 50mg.L -1). Dissolver 0,286g de ácido bórico P.A. (H 3BO3) em HCl 0,1 N, completar o volume para 1L e acondicionar em frasco plástico. Soluções padrões de trabalho. Pipetar para balões volumétricos de 100mL 2,0; 4,0; 8,0; 12,0 e 16,0mL da solução estoque e completar o volume com HCl 0,1 N, guardando em frascos plásticos. Essas soluções contêm respectivamente 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 e 8,0mg.L-1 de B. O branco (padrão zero) corresponde à solução de HCl 0,1 N.

IV. B IBLIOGRAFIA BATAGLIA, O.C; et al. Métodos de análises químicas de plantas . Campinas: Instituto Agronômico, 1983. 48p. (Boletim Técnico, 78). BROWN, J.C.; HU, H. Phloem boron mobility is species dependent: evidence for phloem mobility in sorbitol-rich species. Ann. Bot., v.77, p.459-505, 1996. FAGERIA, N.K. Níveis adequados e tóxicos de boro na produção de arroz, feão, milho, soja e trigo. R. Bras. Eng. Agríc. Ambiental , Campina Grande, v.3, n.1, p.30-33, 1999. LIU, L.; SHELP, B.J.; SPIERS., G.A. Boron distribuition and retranslocation in eld-grown broccoli (Brassica oleracea var. Italica). Can. J. Plant Sci., v.73, p.587-600, 1993.


MALAVOLTA, E. Manual de nutrição mineral de plantas . São Paulo: Ed. Agr. Ceres, 2006. 631p. MALAVOLTA, E.; VITTI. G.C.; OLIVEIRA, S.A.; Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2a Edição. Associação

Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato, 1997. 319p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). RA, B.van; BATAGLIA, O.C. Análise química de solo. In: FERREIRA, M.E.; CRUZ, M.C.P. eds. Micronutrientes na agricultura. Piracicaba: POTAFOS/CNPq, 1991. p.333-356. SAH, R.H.; BROWN, P.H. Techiniques for boron determination and their application to the analysis of plant and soil samples. Plant and Soil , v.193, p.15-33, 1997.

SRIVASTAVA, P.C.; GUPTA, U.C. Trace elements in crop production. Lebanon: Science Publishers, 1996. 356p.


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D ETERMINAÇÃO DE

S ILÍCIO

M ÉTODO E SPECTROFOTOMÉTRICO DO A ZUL DE M OLIBDÊNIO I. I NTRODUÇÃO O silício (Si) é o segundo elemento em abundância na crosta terrestre, depois do oxigênio. Embora o silício seja encontrado em todas as plantas em quantidades variáveis, sua essencialidade não foi ainda demonstrada, mesmo com a utilização de renadas técnicas de cultivo por hidroponia. Entretanto, as pesquisas efetuadas por diversos autores mostram que principalmente para gramíneas, o Si exerce alguns efeitos benécos como: melhora na arquitetura da planta, impedimento à toxidez devido ao excesso de Mn, diminui a taxa de transpiração, confere maior atividade fotossintética e aumenta a resistência das plantas às pragas e moléstias. O Si é absorvido pelas plantas na forma de ácido monossilícico não dissociado. A maior proporção do Si na planta está na forma de sílica amorfa hidratada, SiO2nH2O. O ácido monossilícico é móvel nas plantas, mas quando o Si se solidica na forma de sílica, se torna imóvel.


Em geral, são consideradas plantas acumuladoras de silício, aquelas que possuem teor foliar acima de 1%, e não acumuladoras plantas com teor de silício menor que 0,5%. Na planta, o silício concentra-se nos tecidos de suporte, do caule e nas folhas, podendo ser encontrado em pequenas quantidades nos grãos. Em geral, o conteúdo médio de silício das raízes é menor se comparado com o caule e folhas, em alguns casos, como por exemplo, a soja, o teor de Si na raiz é maior do que nas folhas. O silício aparece naturalmente em altas concentrações nas folhas de certas culturas. Na cana-de-açúcar, por exemplo, as concentrações podem variar desde valores muito baixos em folhas jovens (0,14% de Si) até valores muito altos em folhas velhas (6,7% de Si). O método espectrofotométrico, baseado na formação do complexo molibdo-silícico reduzido, tem sido o mais utilizado para a determinação de silício em plantas. O composto azul de molibdênio resulta da redução do ácido molíbdico-silícico obtido pela condensação, em meio ácido, dos ânions silicato e moli bdato. O sucesso desse método está condicionado à dissolução da sílica presente nos materiais vegetais, utilizando-se comumente NaOH. Devido à contaminação através da sílica contida nos vidros, toda vidraria deve ser evitada. Dos elementos contidos em cinzas de material vegetal, somente o fósforo tem sido considerado interferente na determinação de silício pelo método colorimétrico do azul de molibdênio. Dentre os complexan-


tes recomendados para a eliminação da possível interferência, o ácido tartárico e o oxálico são os mais empregados.

II. P ROCEDIMENTO A NALÍTICO P   1. Tarar um cadinho previamente seco e pesar no mesmo 1,0g da amostra pré-seca; 2. Carbonizar em fogareiro elétrico e em seguida calcinar por 4 horas a 600°C; 3. Deixar esfriar, acrescentar 5mL de NaOH a 1%, e como auxílio de um bastão de vidro, dissolver a cinza; 4. Transferir quantitativamente ltrando para um balão volumétrico de 25mL; 5. Acrescentar ao cadinho, mais 5mL de NaOH a 1% para lavar o mesmo, e transferir o líquido (quantitativamente e ltrando) para o mesmo balão volumétrico mencionado no item anterior; 6. Repetir por mais três vezes a operação anterior, e em seguida remover o funil e completar o volume para 25mL; 7. Homogeneizar o extrato e em seguida transferir para um frasco de plástico devidamente limpo, seco e identicado. D   1. Pipetar para tubos de ensaio de plástico, separadamente, 5mL


da solução padrão de silício e dos extratos das amostras; 2. Acrescentar 1,0mL de ácido sulfúrico (0,5 M) a cada tubo de ensaio; 3. Acrescentar 1,0mL de molibdato de amônio a 2%; 4. Agitar suavemente e esperar 5 minutos; 5. Acrescentar 1,0mL de acido oxálico a 2%; 6. Acrescentar 1,0mL de ácido sulfúrico (1,5 M); 7. Acrescentar 1,0mL de ácido ascórbico a 2%; 8. Agitar suavemente, aguardar 20 minutos e fazer a leitura espectrofotométrica a 660nm. 9. Proceder aos cálculos com base na equação de regressão gerada a partir da correlação entre a absorbância e concentração de silício na curva padrão. Expressar os resultados em mg.kg-1 de matéria seca da amostra vegetal.

III. R EAGENTES Solução de ácido sulfúrico 1,5 M. Pipetar 21mL de H 2SO4 concentrado (18 M) para um balão volumétrico de 250mL contendo cerca de 200mL de água destilada, homogeneizar e completar o volume; Solução de ácido sulfúrico 0,5 M. Pipetar 7mL de H 2SO4 concentrado (18 M) para um balão volumétrico de 250mL contendo cerca de 200mL de água destilada, homogeneizar e completar o volume;


Solução de ácido L-ascórbico a 2%. Pesar 2,0g de ácido ascórbico, dissolver em água destilada e completar o volume para 100mL; Solução de molibdato de amônio a 2%. Pesar 2,0g de (NH4)6.Mo7O24.4H2O, dissolver solução de H 2SO4 0,5 M e completar o volume para 100mL com o H 2SO4 0,5 M; Solução de hidróxido de sódio 1%. Pesar 2,5g de NaOH, dissolver em água destilada e completar o volume para 250mL; Solução padrão de Si (1000mg.L -1). Pesar 0,4345g de silicato de sódio P.A. (Na 2SiO3), dissolver em 10mL de hidróxido de sódio a 1% e em seguida completar o volume para 100mL com água destilada; Soluções padrões de trabalho. Pipetar para balões volumétricos de 100mL, 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução padrão de silício (1000 mg.L-1) e completar o volume com água destilada. Essas soluções contêm respectivamente 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 10mg.L-1 de Si. OBS.: Todas as soluções devem ser guardadas em recipientes de polietileno.


IV. B IBLIOGRAFIA EPSTEIN E.; BLOOM, A.J. Nutrição mineral de plantas; princípios e perspectivas. 2.ed. Londrina: Editora Planta, 2006. 403p. MALAVOLTA, E.; VITTI. G.C.; OLIVEIRA, S.A.; Avaliação do estado nutricional das plantas: princípios e aplicações. 2a Edição. Associação

Brasileira para Pesquisa da Potassa e do Fosfato, 1997. 319p. MARSCHNER, H. Mineral nutrition of higher plants. (2nd edition). London: Elsevier Ltd., 1995. 674p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


38

D ETERMINAÇÃO E

POTÁSSIO

POR

EM

DE

S ÓDIO

TECIDOS VEGETAIS

F OTOMETRIA

DE

C HAMA

I. INTRODUÇÃO O potássio é um macronutriente absorvido pelas plantas sob a forma de K , o qual se encontra nos tecidos vegetais na concentração de 2 a 110g kg-1 da matéria seca. Embora o sódio não seja considerado um elemento essencial para as plantas de metabolsimo fotossintético do tipo C 3 , ele é elemento essencial (micronutriente) para as plantas C4 e também para as plantas CAM, tendo em vista a sua participação na regeneração do fosfoenolpiruvato. No caso das halótas, plantas nativas de habitats salinos, esse elemento é exigido em grandes quantidades sendo, portanto um macronutriente para as mesmas (Epstein e Bloom, 2006; Larcher, 2006). A fotometria de chama é uma técnica espectroscópica de emissão em que a amostra em solução é introduzida na chama em forma de aerosol (nebulizada). A função da chama neste caso é excitar eletronicamente os constituintes da amostra. Os metais alcalinos e alcalinos terrosos são os elementos mais facilmente excitados à temperatura das chamas. A excitação de +


um átomo resulta da modicação temporária na posição dos elétrons. Quando um elétron absorve energia, ele salta do seu nível para outro de maior energia (mais distante do núcleo). Ao voltar para seu estado original, quando o átomo (cátion) alcança uma região menos quente na chama, ele devolve a energia absorvida em forma de ondas luminosas monocromáticas. A radiação emitida é então quanticada através de uma célula fotoelétrica, a qual conectada a um galvanômetro, provoca o desvio de um ponteiro, permitindo a avaliação da concentração do elemento que fora excitado, por comparação com soluções padrões. Para que a radiação originária de um determinado elemento seja tanto quanto possível a única a sensibilizar a célula fotoelétrica, ela deverá atravessar um ltro que, idealmente, absorva todas as radiações, com exceção, da que interessa. Este tipo de ltro é denominado de ltro de interferência. Os fotômetros, no geral, são providos de um ltro para sódio, outro para potássio, outro para cálcio, outro para magnésio, etc.

II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Ligar o fotômetro de chama dez minutos antes de realizar as leituras; 2. Zerar e ajustar o fotômetro para a faixa de leitura e em seguida proceder à leitura das soluções padrões com o aparelho


ajustado para Na e K . Anotar os valores das leituras referentes às soluções padrões; 3. Proceder à leitura com o extrato da amostra usado para a determinação de fósforo, ou extrato nitro-perclórico. Se necessário, isto é, se a leitura for superior ao ponto máximo da curva padrão, proceder à diluição do extrato, tomando 2mL do mesmo e completando o volume para 25mL com água deionizada; 4. Anotar o valor da leitura referente a Na e K no extrato da amostra. 5. Proceder aos cálculos para encontrar a concentração de potássio e sódio na amostra preparada (pré-seca). +

+

+

III. P REPARO

DOS

+

R EAGENTES

Solução padrão (estoque) de sódio e potássio 1000mg.L -1. Pesar 0,1907g de cloreto de potássio e 0,2541g de cloreto de sódio (ambos P.A.), dissolver em água deionizada e completar o volume para 100mL. Curva padrão. Preparar uma curva padrão de sódio e potássio contendo 0, 5, 10, 15, 20 e 25mg.kg-1 de cada um destes elementos, partindo de uma solução estoque de 1.000mg.L -1. Para isto, pipetar para balões volumétricos de 200mL (separadamente) as quantidades de 0, 1, 2, 3, 4 e 5 mL da solução estoque e em seguida completar o volume com água deionizada.



EPSTEIN, E.; BLOOM, A.J. Nutrição mineral de plantas; princípios e perspectivas. 2.ed. Londrina: Editora Planta, 2006. 403p. LARCHER, Walter. Ecosiologia vegetal. São Carlos: Rima, 2006. 531 p. MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas : princípios e aplicações. Piracicaba:

POTAFOS, 1989. 201p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos de plantas. Ciência e Cultura , v.36, n.11, p.1953-1958, 1984. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas . Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370p.


39

DETERMINAÇÃO DE

NUTRIENTES MINERAIS

POR DE

ESPECTROFOTOMETRIA

A BSORÇÃO ATÔMICA

I. I NTRODUÇÃO A determinação analítica de grande parte dos nutrientes minerais essencias às plantas tais como cálcio, magnésio, cobre, ferro, manganês e zinco, é realizada através da espectrofotometria de absorção atômica. Esta técnica analítica foi desenvolvida pelo australiano Alan Walsh, em meados da década de 1950, para superar o problema de que grande quantidade dos elementos químicos não era excitada pela temperatura das chamas (exceção feita para os metais alcalinos) e se encontravam no estado fundamental e portanto, e não poderiam ser determinados pela técnica de espectroscopia de emissão de chama. A espectroscopia de absorção atômica fundamenta-se na absorção de energia radiante (e consequente excitação) por elementos químicos em estado fundamental. Na absorção atômica, o elemento a determinar é levado à condição de uma dispersão atômica gasosa, através da qual se faz passar um feixe de


radiação com comprimento de onda que possa ser absorvido. Sabe-se que uma certa espécie atômica neutra e no estado fundamental é capaz de absorver radiações em comprimentos de onda iguais aos que ela, quando excitada, é capaz de emitir. D D E D A A Os componentes do equipamento incluem uma fonte primária, a qual emite o espectro do elemento a determinar, um dispositivo para a vaporização da amostra, um monocromador para isolar a raia analítica, um detector de radiação e um sistema adequado para medir o sinal. F  R As fontes de radiação mais empregadas são as lâmpadas de vapor e as de cátodo oco. As lâmpadas de vapor são tubos de descarga de baixa pressão, que contêm vapor ao menos parcialmente composto do elemento de interesse. Por outro lado, as lâmpadas de cátodo oco são tubos de descarga de neônio ou argônio a baixa pressão, em que o vapor do elemento a excitar é produzido por volatilização catódica durante a descarga. Este tipo de dispositivo consiste em um tubo de vidro com paredes grossas, contendo o gás nobre sob pressão (1-2atm), provido de um cátodo, em uma das extremidades, confeccionado ou reco berto com o elemento de interesse, comumente sob a forma de um cilindro fechado, e um ânodo na forma de um o de tungs-


tênio. Existem lâmpadas de cátodo oco para um único elemento, e também lâmpadas multielementos, as quais contêm vários elementos em uma única estrutura de cátodo oco (ex.: Ca e Mg; Cu e Mn, Cu e Zn; e Cr, Co, Cu, Fe, Mn e Ni). D  V  A (A  C) Serve para dispersar a amostra em forma de partículas atômicas neutras no feixe de emissão do cátodo oco, para que isso ocorra é necessária a remoção do solvente e as moléculas convertidas em átomos simples, isto pode ser feito por uma chama, em forno de grafite (aquecimento sem chama) ou por forno de plasma. O atomizador de chama é formado por : Nebulizador: do tipo pneumático em que o fluxo dos gases através de um orifício cria um vácuo que arrasta a amostra através de um tubo capilar. A mistura ar-amostra emerge do nebulizador para o interior de uma câmara (câmara de nebulização) em forma de aerossol, que se mistura com o combustível, em geral acetileno. A mistura torna-se turbulenta devido à ação de deflectores e finalmente, chega ao combustor. As gotículas maiores são coletadas na câmara de mistura e removidas por um dreno, e assim apenas as partículas menores e homogêneas chegam à chama em fluxo constante.


Queimador: em geral é do tipo pré-mistura, com uma câmara especial onde a amostra é misturada com os gases antes da queima. Possuem fenda longa e são fabricados com titânio para conferir maior resistência às soluções ácidas, estabilidade e inércia. Os combustíveis utilizados para produzir a chama são acetileno e hidrogênio, enquanto os oxidantes são ar, oxigênio e óxido nitroso (Quadro 39.1). Q39.1. Temperatura (oC) de combustão no queimador em função do combustível e oxidantes empregados em espectroscopia de absorção atômica.

COMBUSTÍVEIS Acetileno Hidrogênio

O X I D A N T E S (°C) Óxido Ar Oxigênio Nitroso 2200 3050 2955 2100 2780 -

M A função primordial do monocromador é isolar a raia analítica do elemento de interesse das raias emitidas pela lâmpada de cátodo oco que não são absorvidas (raias vizinhas), assim como a radiação de fundo da chama. D  I Em geral são empregados tubos fotomultiplicadores para detectar a energia radiante e converter em sinal elétrico, e são idênticos aos utilizados em espectrofotômetros UV-visível.


T  I Existem dois tipos de espectrofotômetros, os de feixe simples e os de duplo feixe. No sistema de feixe simples, a modulação da fonte produz uma corrente alternada no detector. O sistema ca submetido aos efeitos da variabilidade na emissão da fonte e na sensibilidade do detector. É necessário um certo tempo de espera para a estabilidade da emissão. Por outro lado, no sistema de feixe duplo com corrente alternada, o modulador divide a luz da fonte em dois feixes, o feixe da amostra que passa através da chama e o de referência que circunda a chama, e ao nal os feixes são recombinados. Particularmente para as análises de cálcio e magnésio há a necessidade da adição de solução de cloreto de estrôncio ou de cloreto de lantânio (que contenha de 2,0 a 5,0g de Sr ou La por litro de solução) para evitar interferências provocadas pela presença de fosfatos e aluminatos. Tanto o estrôncio como o lantânio têm a capacidade de impedir a formação de compostos termicamente estáveis (óxidos refratários) entre magnésio ou cálcio com fosfatos e aluminatos, os quais não são decompostos pela chama ar/acetileno. Desse modo, o estrôncio e o lantânio exercem o papel de agente liberador do cálcio e do magnésio, pois formam compostos quimicamente mais estáveis com os interferentes.


II. M ARCHA A NALÍTICA 1. Conectar a lâmpada de catodo oco, correspondente ao elemento a ser analisado, ao espectrofotômetro de absorção atômica (EAA). Marca CGB, modelo AA7000; 2. Ligar o EAA e deixar aquecendo por cerca de 15 minutos; 3. Ajustar o comprimento de onda (ajuste grosso) de acordo com o elemento a ser analisado. Para isto, consulte o quadro 39.2; 4. Selecionar a lâmpada a ser utilizada (bocal nº 1 ou nº 2) e entrar com o valor da corrente em mA; 5. Ajustar o tempo de integração para três segundos, e também a abertura da fenda conforme o quadro 39.2; 6. Fazer os ajustes horizontal e vertical do feixe luminoso e posteriormente efetuar o ajuste no do comprimento de onda; 7. Regular a pressão de saída do ar comprimido para 3,4 bar; 8. Ligar o sistema de exaustão dos gases e em seguida acender a chama; 9. Fazer a calibração do aparelho, utilizando os padrões de tra balho relativos ao elemento em análise. Esta calibração é realizada em absorbância; 10. Aspirar o branco e depois zerar o aparelho; 11. Passar o EAA para o modo de concentração e proceder à leitura dos padrões de trabalho e logo em seguida a leitura das amostras; 12. Após ler todas as amostras, apagar a chama, desligar o


aparelho, fechar as saídas dos gases e desligar o sistema de exaustão. OBS.: A amostra para o caso de tecidos vegetais é o extrato nitro-perclórico Quadro 39.2. Corrente a ser empregada na lâmpada, abertura da fenda e comprimento de onda para calibração do EAA correspondente a cada elemento químico a analisar.

Elemento Químico Ca Mg Cu Fe Mn Zn

Corrente da Lâmpada* 4,0 4,0 4,0 6,0 5,0 5,0

Abertura da Fenda 0,5 0,5 0,5 0,2 0,2 0,5

Comprimento de Onda 422,7 285,2 324,7 248,3 279,5 213,9

OBS.: Estes valores podem ser alterados em função do modelo de aparelho e do tempo de uso (idade) da lâmpada.

III. R EAGENTES a. Soluções padrões de cálcio Solução estoque 1.000 mg.L -1 de Ca. Pesar 2,4970g de CaCO3 seco, dissolver em 25mL de ácido clorídrico (d=1,18 ≡ 12N) e completar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (0; 2; 4; 6; 8 e 10mg.L -1 Ca). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000mg.L -1 Ca) e com-


pletar o volume com solução de cloreto de estrôncio 1,52%. O branco (padrão zero) corresponde à solução de cloreto de estrôncio 1,52%. b. Soluções padrões de magnésio Solução estoque 1.000 mg.L -1 de Mg. Pesar 1,0000g de magnésio metálico, dissolver em 50mL de ácido clorídrico 5 N e completar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (2; 4; 6; 8 e 10 mg.L -1 Mg). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000 mg.L -1 Mg) e completar o volume com solução de cloreto de estrôncio 1,52%. O branco (padrão zero) corresponde à solução de cloreto de estrôncio 1,52%. OBS.: Recomenda-se que os extratos vegetais obtidos por digestão nitro-perclórica sejam diluídos (0,5+10) com solução de cloreto de estrôncio 1,52%.

c. Soluções padrões de cobre Solução estoque 1.000 mg.L -1 de Cu. Pesar 1,0000g de co bre metálico, dissolver em 50mL de ácido nítrico 6 N e completar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (1; 2; 3; 4 e 5mg.L -1 Cu). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000mg.L -1 Cu) e completar o


volume com água deionizada. O branco (padrão zero) corresponde à água deionizada. d. Soluções padrões de ferro Solução estoque 1.000mg.L-1 de Fe. Pesar 1,0000g de ferro metálico, dissolver em 20mL de ácido clorídrico 5N e 5mL de ácido nítrico 6 N, e completar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (0; 2; 4; 6; 8 e 10mg.L -1 Fe). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0mL da solução estoque (1.000 mg.L -1 Fe) e completar o volume com água deionizada e. Soluções padrões de manganês Solução estoque 1.000 mg.L -1 de Mn. Pesar 1,0000g de manganês metálico, dissolver em 50mL de ácido nítrico 6 N e completar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (0; 1; 2; 3; 4 e 5mg.L -1 Mn). Transferir para balões volumétricos de 100mL alíquotas de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000 mg.L-1 Mn) e completar o volume com água deionizada. f. Soluções padrões de zinco Solução estoque 1.000 mg.L-1 de Zn. Pesar 1,0000g de zinco metálico, dissolver em 40mL de ácido clorídrico 5 N e comple-


tar para um litro com água deionizada. Padrões de trabalho (0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 e 2,5mg.L -1 Zn). Transferir para balões volumétricos de 200 mL alíquotas de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 e 0,5mL da solução estoque (1.000mg.L -1 Zn) e completar o volume com água deionizada. g. Solução de Cloreto de Estrôncio 1,52%. Pesar 15,2g de cloreto de estrôncio hexahidratado P.A. (SrCl 2.6H2O), dissolver em água deionizada e completar a um litro.



EWING, G. W. Métodos Instrumentais de Análise Química . 5ª reimpressão. Vol.1, São Paulo: Editora Edgard Blucher L.T.D.A. 1989. 296p. MALAVOLTA, E.; VITTI, G.C. e DE OLIVEIRA, S.A. Avaliação do estado nutricional das plantas : princípios e aplicações. Piracicaba:

POTAFOS, 1989. 201p. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Avaliação de métodos com e sem digestão para extração de elementos em tecidos de plantas. Ciência e Cultura , v.36, n.11, p.1953-1958, 1984. MIYAZAWA, M.; PAVAN, M.A.; BLOCH, M. de F.M. Análise química de tecido vegetal. Londrina: Instituto Agronômico do Paraná, 1992.

17p. (IAPAR. Circular, 74). OHLWEILER, O.A. Fundamentos de Análise Instrumental. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Cientícos, 1988. 486 p. SARRUGE, J.R.S. e HAAG. H.P. Análises químicas em plantas . Piracicaba: USP-ESALQ, 1974. 65p. SILVA, F.C. da. Manual de análises químicas de solos, plantas e fertilizantes. Brasília: EMBRAPA, 1999. 370 p.


C ONSELHOS Ú TEIS PARA EM

TRABALHOS

L ABORATÓRIO

1. Tenha em mente que o laboratório é um lugar de trabalho e que sempre envolve riscos. Preserve o silêncio, o respeito aos colegas e evite brincadeiras. Se necessário, lembre este item ao companheiro; 2. Prepare-se para qualquer experiência, lendo as orientações e a metodologia do manual antes de vir para o laboratório; 3. Siga rigorosamente as instruções do professor e realize somente experiências prescritas pelo mesmo; 4. Evite fumar no laboratório, bem como sentar nas bancadas; 5. Procure usar bata ou avental apropriado; 6. Evite contato de qualquer substância com a pele, e se isto ocorrer, procure imediatamente lavar a pele com bastante água e em seguida comunique ao professor, informando tam bém sobre qualquer acidente que ocorra; 7. Caso seja necessário testar o odor de algum produto químico, não coloque o frasco sob o nariz. Abane lentamente com a mão os vapores desprendidos pelo frasco, até suas narinas; 8. Observe cuidadosamente o rótulo dos frascos que contêm o dado reagente, e antes de retirar qualquer porção do conte-


1 O X E N

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údo, leia o rótulo duas vezes, certicando-se de que tem o frasco certo; 9. Zele pela organização do laboratório e evite trocar as tampas dos frascos, bem como trocar pipetas em uso; 10. Mantenha sempre a aparelhagem e bancadas limpas. Evite derramamentos, mas se cair alguma coisa, limpe-a imediatamente com água e detergente ou pano úmido. O: Se estes conselhos forem seguidos rigorosamente por todos os alunos, entre outros benefícios que podem ser proporcionados, podemos enumerar os seguintes: segurança, eciência, economia, maior aprendizagem e gratidão do professor.


I NSTRUÇÕES

PARA DE

DE

E LABORAÇÃO R ELATÓRIOS

A NÁLISES Q UÍMICAS

I. Faça uma breve introdução descrevendo sobre o material analisado, sua importância agrícola, industrial, etc. Ainda neste item, descreva, brevemente, acerca da análise em foco, enfatizando sua importância e/ou objetivo, bem como o fundamento ou princípio em que a mesma é baseada. M E M. Descreva neste item a marcha analítica, isto é, o roteiro utilizado na execução da análise. Faça constar neste item todo o material de laboratório utilizado para a realização da análise (vidrarias, equipamentos, reagentes químicos, etc.). R  D. Nas análises quantitativas, realize os cálculos necessários, apresentando os resultados em percentagem, g.kg-1 , ppm, mg.kg-1 , ou na unidade convencionalmente mais adequada para cada caso. Compare os resultados obtidos pelo seu grupo com o que há na literatura especializada (livros, revistas cientícas, etc.). C. Neste item, procure dar uma interpretação aos seus resultados.


2 O X E N

A

O a. Se consultar alguma literatura, acrescente ao relatório mais um item denominado R B , onde deverá constar a literatura consultada. Procure seguir as normas da ABNT ao referenciar a bibliograa. b. Ao escrever cada relatório, use os verbos na 3ª pessoa do singular ou plural, de forma impessoal, utilizando a voz passiva.


TRANSFORMAÇÕES DE

DE

R ESULTADOS

A NÁLISES Q UÍMICAS

A composição química dos vegetais varia com o teor de umidade dos mesmos. A quantidade absoluta de um determinado constituinte como proteína, carboidrato, etc., presente em uma amostra, não depende diretamente do seu teor de umidade. Porém, o conteúdo relativo (concentração) de qualquer componente de uma amostra, varia com o teor de umidade da mesma. Por isto, é de fundamental importância, quando se expressar a composição de qualquer constituinte vegetal, indicar qual o teor de umidade do mesmo. No geral, a composição química dos vegetais é expressa em relação à matéria seca, isto é, à condição de umidade zero. A matéria seca é, portanto, um referencial bastante útil para se comparar a concentração de qualquer constituinte vegetal. Conhecendo-se a composição química de uma amostra em relação à matéria seca, é possível converter os valores para outras condições, como as condições de campo (matéria fresca), por exemplo. Para tal, basta saber o teor de umidade que a referida amostra apresenta nas condições de campo. Esse tipo de conversão, ou transformação de resultados, baseia-se no fato de que, retirada a umidade de qualquer amostra vegetal, o que resta é a matéria seca. Desta forma, todos os demais


3 O X E N

A

constituintes de qualquer amostra vegetal são os que formam a matéria seca e, portanto, estão contidos nela.


E XERCÍCIOS P ROPOSTOS D ETERMINAÇÃO

DE UMIDADE

1. Calcule a percentagem de umidade de uma amostra sabendo que: a. Tara do pesa-ltro ..................................... 26,4300g b. Peso do pesa-ltro + amostra úmida......... 31,4300g c. Peso do pesa-ltro + amostra seca............ 27,6300g 2. Calcule a percentagem de umidade de uma amostra vegetal que apresentou os seguintes dados de análise: a. Tara do pesa-ltro .................................... 41,1340g b. Peso do pesa-ltro + amostra úmida ........ 45,1340g c. Peso do pesa-ltro + amostra seca ...........42,1340g 3. Em uma determinação de umidade de uma amostra vegetal, obteve-se os seguintes dados: a. Tara do pesa-ltro ................................. 44,2560g b. Peso do pesa-ltro + amostra úmida ..... 48,2560g c. Peso do pesa-ltro + amostra seca ....... 44,7560g Calcular a percentagem de umidade da amostra acima. 4. Em uma análise vegetal, colocou-se 6,0000g de uma amostra em um pesa-ltro de tara igual a 42,3890g e em seguida foi levada à estufa até completa desidratação. Sabendo-se que ao


4 O X E N

A

sair da estufa o conjunto pesa-ltro mais amostra seca pesava 47,5490g, calcule a percentagem de umidade que continha a amostra.

TRANSFORMAÇÕES

DE RESULTADOS DE ANÁLISES

QUÍMICAS

1. Uma amostra preparada de mandioca apresenta 12,00% de umidade e 40,00% de amido. Calcule a percentagem de amido que a referida amostra tem nas condições de campo, sa bendo-se que a umidade de campo da mesma é 70,00%. 2. Consideremos duas amostras preparadas de uma planta forrageira. A amostra A contendo 17,60% de proteína e 20,00% de umidade (Uap), enquanto que a amostra B contendo 18,70% de proteína e 15,00% de umidade (Uap). Calcule: a. Qual das duas amostras contém mais proteína em relação à matéria seca? b. Qual das duas amostras contém mais proteína nas condições de campo, sabendo-se que nas condições de campo a amostra A contém 70,00% de umidade e a amostra B contém 80,00% de umidade? c. Quantos quilos de cada uma das forragens acima, nas condições de campo, um animal precisaria comer para


ingerir um quilo de proteína? Admitir que o animal se alimentaria somente com um tipo de forragem ( A ou B). 3. Sabendo-se que uma amostra preparada contém 27,00% de proteína e 10,00% de umidade, pede-se para calcular: a. A percentagem de proteína desta amostra nas condições de campo, sabendo-se que a umidade de campo da referida amostra é 90,00 %; b. A percentagem percentagem de de proteína proteína da referida referida amostra em relação à matéria seca. 4. Uma amostra vegetal contém 45,00% de bra em relação à matéria seca. Calcule a percentagem de bra que contém esta amostra nas condições de campo e na amostra preparada, sabendo-se que a mesma apresenta 82,00% de umidade de campo e 12,00% de umidade na amostra preparada. 5. Uma amostra vegetal nas condições de campo, com 83,00% de umidade, contém 2,55% de carboidratos. Calcule qual a percentagem de carboidratos que contém esta amostra em relação à matéria seca e em relação à amostra preparada com 11,00% de umidade. 6. A análise de uma amostra preparada de uma forragem apresentou os seguintes seg uintes resultad resu ltados: os:

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Paes Barretos | 211 211

Uap = 16,00% RM = 9,00% ENN = 44,00% PB = 15 15,00% ,00% EE = 5,00% FB = 11 11,00% ,00% Pede-se para calcular a composição da amostra acima, em relação à matéria seca e nas condições de campo, sabendo-se que a umidade de campo é 79,00%. 7. Os valores abaixo representam repres entam a composição química qu ímica de uma amostra vegetal em relação à matéria seca: ENN = 25,00% PB = 26,00% EE = 10 10,00% ,00% FB = 34,00% RM = 5,00% Pede-se para expressar a composição desta amostra nas condições de campo ca mpo com 74,00% 74,00% de umidade e na amostra preparada, com 13,00'% de umidade. u midade. 8. Abaixo temos a composição química de uma amostra vegetal, nas condições de campo. Pede-se para transformar estes resultados resultados de análise análi se para a matéria seca e para amostra preparada com 20,00% de umidade. Uc = 75,00% RM = 1,00% ENN = 5,00% FB = 9,00% EE = 4,00% PB = 6,00% 9. Uma amostra vegetal com a composição química abaixo, é

212 212 | Análises Anális es Químicas Química s e Bioquímicas Bioquími cas em Plantas Planta s

colocada em uma estufa até completa completa desidratação. Pede-se Pede-se para expressar a sua composição quando a mesma sair da estufa. Uc = 60,00% RM = 2,00% ENN = 8,00% FB = 14,00% EE = 6,00% PB = 10 10,00% ,00%

D ETERMINAÇÃO

D E RESÍDUO MINERAL

1. Na análise do resíduo mineral de uma amostra vegetal, foram obtidos os seguintes seg uintes resultados: resultados: • Tara do cadinho cadin ho 21,3690g 21 ,3690g • Peso do cadinho cadin ho mais amostra 23,8690g • Peso do cadinho cadin ho mais RM 21,5690g 21 ,5690g Calcule a percentagem de cinzas da amostra acima. 2. Em uma determinação de cinzas de uma amostra vegetal, pesou-se 1,8000g da amostra em um cadinho de tara igual a 26,4830g e em seguida foi colocada na mua até completar a calcinação. Calcule a percentagem de de cinzas cin zas da amostra analisada, sabendo-se que o conjunto, cadinho mais cinzas, ao sair da mua pesava 26,5730g. 3. Uma amostra preparada de uma forragem foi analisada e obtidos os seguintes segu intes resultados: resultados:

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Paes Barretos | 213

• Tara do cad cadin inho ho 23,91 23,9140 g • Peso do cadinho cadi nho mais amostra 26,11 26, 1140 40 g • Peso do cadinho mais cinzas cinza s 24,0020 24, 0020 g Calcule a percentagem de cinzas na amostra analisada, determine ainda quantos quilos de cinzas são produzidos por hectare com a queima completa da referida forragem, sabendo-se que a umidade da amostra preparada é de 20,00%, a umidade de campo ca mpo é 87,00% 87,00% e a produtividade da forragem é de 13 toneladas por hectare.

D ETERMINAÇÃO

D E AÇÚCARES REDUTORES

PELO MÉTODO D E

E YNON - L A N E

1. Em uma dosagem de açúcar invertido, pesou-se 20,0g de caldo de cana e transferiu-se para um balão de 200mL. Depois de claricado, completado o volume e ltrado, foi feita a titulação, sendo gasto no ensaio denitivo 45mL do ltrado para reduzir 10mL da solução de Soxhlet, volume este que corresponde a 50,9mg de açúcar invertido. Calcule a percentagem de açúcar invertido no caldo analisado. 2. Para uma análise de caldo de cana foi pesado 25,0g do caldo, sendo o mesmo transferido para uma balão volumétrico de 250mL, claricado, completado o volume e em seguida ltrado. Com o ltrado, foi titulado 10mL da solução de Soxhlet,

214 | Análises Anális es Químicas Química s e Bioquímicas Bioquími cas em Plantas Planta s

gastando-se 30mL do mesmo. Calcule a percentagem de açúcar invertido existente no caldo analisado, sabendo-se que de acordo com a tabela de Eynon-Lane, 30mL de solução analisada corresponde a 50,5mg de açúcar invertido. 3. Em uma análise de caldo de cana, pesou-se 20,0g do mesmo, transferiu-se para para um balão balão volumétrico volumétrico de 200mL, 200mL, claricou-se, completou o volume e em seguida ltrou-se. Com o ltrado foi feita uma titulação da solução de Soxhlet, sendo gasto menos que 15mL do ltrado para reduzir 10mL da solução de Soxhlet. Então foi feita uma diluição da solução ltrada, tomando-se 50mL da mesma e completando o volume para 100mL com água destilada. Desta solução diluída foi feita uma nova titulação, sendo gastos 25mL da mesma para reduzir 10mL da solução de Soxhlet. Calcule a percentagem de açúcar invertido do caldo analisado, sabendo-se que segundo a tabela de Eynon-Lane, 25mL de solução analisada coresponde a 50,4mg de açúcar invertido.

D ETERMINAÇÃO D E D E E YNON - L A N E

SACAROSE PELO MÉTODO

1. Para determinar o teor de sacarose de uma amostra de caldode-cana, foi pesado 20,0g do mesmo, transferido para um balão volumétrico de 200mL, 20 0mL, claricado, cla ricado, ltrado e completado completado o

Egídio Bezerra Bezerr a Neto • Levy Paes Barretos | 215

volume. Do ltrado foi feita a titulação de 10mL da solução de Soxhlet, para determinar o açúcar invertido previamente existente no caldo, gastando-se 35mL, o que na tabela de EynonLane corresponde a 50,7mg de açúcar invertido. Do ltrado tomou-se 50mL para determinação de açúcar invertido total, transferindo-se para um balão de 500mL, sendo usada esta solução diluída para titulação da solução de Soxhlet, e gastando-se 25mL, o que corresponde a 51,2mg de açúcar invertido. Calcule a percentagem de sacarose no caldo analisado. 2. Em uma determinação de sacarose pelo método de EynonLane, foi pesado 30,0g de caldo de cana, transferido para um balão volumétrico de 250mL, claricado, completado o volume e ltrado. Na determinação do açúcar invertido previamente existente no caldo, gastou-se 40mL do ltrado para reduzir 10 mL da solução de Soxhlet, o que corresponde a 50,8mg de açúcar invertido. Para provocar a hidrólise da sacarose foi usado 100mL do ltrado e diluído para um balão de um litro, sendo gasto na titulação do açúcar invertido total 21mL, volume este que corresponde a 51mg de açúcar invertido. Calcule: a. A percentagem de sacarose no caldo analisado; b. Quantas toneladas de caldo de cana são necessárias para se obter 450kg de sacarose, admitindo o rendimento industrial de 100%.


3. Em uma dosagem de sacarose pelo método de Eynon-Lane, pesou-se 20,0g de caldo de cana, transferiu-se para um balão de 200mL, claricou-se, completou-se o volume e ltrou-se. Com o ltrado encheu-se uma bureta para a dosagem do açúcar invertido previamente existente no caldo. Enquanto isto, tomou-se 25mL do ltrado e provocou-se a hidrólise da sacarose, completou-se o volume para 250mL e dosou-se o açúcar invertido total. Na dosagem do açúcar invertido previamente existente no caldo, gastou-se 40mL da solução, o que corresponde a 50,8mg do açúcar invertido; na dosagem do açúcar invertido total gastou-se 28mL do hidrolisado, o que corresponde a 51,4mg de açúcar invertido. Calcule: a. A percentagem de sacarose no caldo analisado; b. Quantas toneladas do caldo acima são necessárias para se obter 500kg de sacarose; c. Quantos quilos de sacarose poderia se obter com 2 toneladas do caldo de cana acima. 4. Em uma determinação de sacarose pelo método de EynonLane, obteve-se os seguintes resultados de análise: • Peso da amostra 25,0g; • Volume para o qual foi diluído a amostra: 250mL; • Volume do ltrado usado para a hidrólise da sacarose: 25mL; • Volume para o qual foi completado o hidrolisado: 200mL; • Volume gasto do ltrado para dosagem do açúcar inverti-


do previamente existente no caldo: 42mL (correspondente a 50,8mg de açúcar invertido); • Volume gasto do hidrolisado para dosagem do açúcar invertido total: 24mL (correspondente a 51,2mg de açúcar invertido). De posse destes dados, calcule: a. A percentagem de sacarose do caldo; b. Quantas toneladas de caldo de cana são necessárias para produzir 450kg de sacarose; c. Quantos quilos de sacarose são obtidos a partir de 4,5 toneladas de caldo de cana.

D ETERMINAÇÃO DE DE E YNON -L ANE

AMIDO PELO MÉTODO

1. Em uma determinação de amido, pesou-se 4,0g de uma amostra, provocou-se a hidrólise da mesma, transferiu-se para um balão volumétrico de 500mL e completou-se o volume com água. Em seguida, ltrou-se e com o ltrado foi titulado 10mL da solução de Soxhlet, gastando-se 25mL, quantidade esta que equivale a 49,8mg de glicose. Pede-se para determinar a percentagem de amido na amostra analisada. 2. Em uma determinação de amido, foi pesado 5,0g da amostra, procedida a hidrólise e transferida para um balão de 500mL. Em seguida foi clarificado, completado o


volume e filtrado. com o filtrado foi titulada a solução de Soxhlet, gastando-se menos de 15mL. Então foi feita uma diluição tomando-se 100mL do filtrado e completando para um volume de 200mL com água destilada, e em seguida feita uma nova titulação, gastando-se 40mL da solução diluída, o que na tabela de Eynon-Lane corresponde a 50,6mg de glicose. Calcule a percentagem de amido no material analisado. 3. Em uma determinação de amido, pesou-se 5,0g de uma amostra preparada de mandioca, procedeu-se a hidrólise, em seguida transferiu-se para um balão de 500mL e completou-se o volume com água destilada. Em seguida ltrou-se e com o ltrado foi titulada a solução de Soxhlet, gastando-se 30mL do ltrado, volume este que equivale a 50,1mg de glicose. Calcule: a. A percentagem de amido na amostra analisada; b. Quantas toneladas são necessárias da amostra acima para se obter 300kg de amido; c. Quantas toneladas de amido poderá se obter a partir de um hectare de mandioca, sabendo-se que sua produtividade é de 20 toneladas por hectare, a umidade da amostra preparada é 10,00% e a umidade de campo da amostra é 60,00%.


D ETERMINAÇÃO

DE EXTRATO ETÉREO

1. Em um trabalho de pesquisa foram pesados 4,0g de semente de soja e colocados para extrair o óleo, obtendo-se os seguintes resultados: • Tara do balão coletor = 39,1250g • Peso do balão coletor + E.E. = 39,8450g De posse desses resultados pede-se para calcular: a. A percentagem de óleo na semente de soja; b. Quantos quilogramas de óleo se obtém a partir de uma tonelada de semente; c. Quantas toneladas de semente são necessárias para se obter 270kg de óleo. 2. Em uma análise de semente de amendoim foram pesados 15,0g do fruto (vagem), descascados e separadas as amêndoas (sementes) das cascas, obtendo-se 6,75g de cascas. Das amêndoas foram pesados 2,5g e colocadas para extrair o óleo, obtendo-se os seguintes resultados: • Tara do balão coletor = 54,0420g • Peso do balão coletor + E.E. = 55,2170g Com base nos resultados acima, pede-se para calcular: a. Percentagem de cascas e de amêndoas nos frutos; b. Percentagem de óleo nas amêndoas e nos frutos, admitindose que as cascas não contêm óleo.


3. Em uma análise de semente de milho, pesou-se 3,0 g da mesma e colocou-se para extrair o óleo, sendo o mesmo recebido em um balão coletor de tara igual a 45,2860g. Após a extração completa de óleo, o balão foi pesado com o óleo, obtendo-se 45,4360g. Calcule: a. A percentagem de óleo na semente analisada; b. Quantas toneladas de semente são necessárias para se obter 800kg do óleo. 4. Em uma análise de semente de arroz foram pesados 12,0g da semente, descascada e separadas as cascas dos grãos, obtendo-se 4,80g do grão descascado. Sabendo-se que a percentagem de óleo no grão (descascado) é de 3,00%, pede-se para calcular: a. A percentagem de casca na semente; b. A percentagem de grão na semente; c. A percentagem de óleo na semente (com casca), admitindo que as cascas não contêm óleo.

D ETERMINAÇÃO

DE FIBRA BRUTA

1. Na análise de uma forragem, pesou-se 5,0g da amostra preparada e colocou-se para extrair o óleo, encontrando-se 8,00% de óleo neste material. Em seguida o resíduo da determinação de óleo (torta), foi tratado para a determinação da bra


bruta (F.B.), obtendo-se os seguintes resultados: • Tara do pesa-ltro + papel de ltro = 27,4523g • Peso do pesa-ltro + papel de ltro + F.B. = 31,2243g Pede-se para calcular: a. A percentagem de bra bruta na amostra preparada. b. A percentagem de bra bruta na amostra desengordurada c. Quantos quilogramas desta forragem precisam-se colher no campo para se obter 300kg de bra bruta, sabendo-se que a umidade da amostra preparada é de 12,00% e a umidade de campo é de 84,00%.

D ETERMINAÇÃO

DE PROTEÍNA BRUTA

1. Calcule a porcentagem de proteína bruta determinada pelo método de Kjeldahl, sabendo-se que foi pesado 0,1g de uma amostra vegetal, e que após a digestão, o destilado foi titulado com 1,8ml de ácido sulfúrico 0,05 N. 2. Numa análise de proteína bruta (PB) pelo método de Kjeldahl, utilizou-se 100mg de uma amostra vegetal e gastou-se 0,5ml de ácido sulfúrico 0,2 N na titulação da amônia. Calcule a percentagem de proteína bruta na amostra. 3. Na determinação de proteína bruta de uma leguminosa, foi pesado 0,1g da amostra preparada, digerida e, em se-


guida, destilada. Após a destilação, foi efetuada a titulação, gastando-se 1,5ml de ácido sulfúrico 0,1 N para titular a amônia. Calcule a percentagem de proteína na amostra analisada. 4. Admita que a amostra referente ao problema anterior tratase de uma amostra preparada com 10,00% de umidade, e que a mesma foi obtida de uma planta leguminosa a ser utilizada como adubo verde, e que nas condições de campo ela contém 70,00% de umidade. Com base nestas considerações e nos dados do problema anterior, calcule quantos quilogramas de nitrogênio se adiciona ao solo em 5,0 hectares de área plantada, com a incorporação total da biomassa, sabendo-se que a referida cultura apresenta uma produtividade de 6 toneladas por hectare. 5. Deduza a equação para se calcular diretamente a percentagem de proteína bruta (PB), em função do volume do ácido gasto na titulação, conhecendo-se as condições padrões de trabalho, as quais são fornecidas abaixo: Usar 100mg da amostra e titular a amônia destilada com H2SO4 0,05 N.


D ETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA MÉTODO DE B RADFORD

SOLÚVEL PELO

1. Pesou-se 200mg de uma amostra vegetal e procedeu-se a extração utilizando-se um total de 20mL do solvente (etanol a 80%). Após a centrifugação do extrato bruto, procedeu-se a cromatograa de partição para remover os pigmentos fotossintéticos e em seguida recolheu-se 200µL da fase aquosa para um tubo de ensaio. Acrescentaram-se 4mL do reagente coomassie brilliant blue e procedeu-se a leitura espectrofotométrica, da mesma forma que foi realizado com as soluções padrões. Calcule o teor de proteína solúvel da amostra (mg.g-1 de matéria fresca), sabendo-se que a leitura espectrofotométrica referente a amostra foi 0,125, e que as leituras com soluções de BSA nas concentrações de 0 e 200µg.mL -1 foram respectivamente 0 e 0,250. 2. Para determinar a concentração de proteína solúvel em braquiária (Brachiaria humidicula), pesou-se 250mg de folhas frescas, desprezando-se a nervura principal e triturou-se em presença de 20mL de etanol a 80%. Posteriormente, centrifugou-se e recolheu-se 2mL do sobrenadante. Procedeu-se a cromatograa de partição para remoção dos pigmentos fotossintéticos, desprezando-se a fase orgânica e transferindo a fase aquosa para tubo de Eppendorf. Após o desenvolvi-


mento da cor devido a reação do coomassie brilliant blue com as proteínas, obteve-se uma leitura espectrofotométrica de 0,139. Tendo em vista que as leituras dos padrões de BSA (0 a 500µg.mL-1) proporcionaram uma equação cujo coeciente angular foi 0,1 e o coeciente linear 0,2, calcule o teor de proteína solúvel na braquiária em questão, expressando o resultado em mg.g-1 de matéria fresca.

D ETERMINAÇÃO

DE AMINOÁCIDOS LIVRES TOTAIS

1. Na determinação de aminoácidos livres totais, pesou-se 500mg de tecido vegetal fresco e triturou-se utilizando 10mL de etanol 80%. Procedeu-se a ltração e depois adicionou-se mais 10mL de etanol a 80% para lavar o resíduo da ltração. Posteriormente, fez-se a cromatograa de partição para remoção dos pigmentos, e com o extrato aquoso procedeu-se o desenvolvimento da cor com auxílio do revelador. A leitura espectrofotométrica correspondente à amostra foi 0,230. As soluções padrões de leucina, nas concentrações de 0 e 25mg.L-1 , após o desenvolvimento da cor, proporcionaram respectivamente as leituras de 0 e 0,500. Calcule o teor de aminoácidos livres na amostra, expressando o resultado em mg.g-1 de material fresco.


D ETERMINAÇÃO

DE NITRATO

1. Com o objetivo de determinar o teor de nitrato em folhas de alface (Lactuca sativa L.), pesou-se 500mg de folhas frescas e triturou-se em homogeneizador de tecidos na presença de 10mL de etanol a 80%. Em seguida, o macerado foi ltrado utilizando-se mais 10mL de etanol a 80%. Adicionou-se 20mL de clorofórmio e agitou-se, desprezando a fração mais densa e recolhendo a menos densa em tubo rosqueável. Pipetou-se para um tubo de ensaio: 0,2mL do extrato aquoso e 0,8mL de ácido salicílico a 5% em H 2SO4. Agitou-se e mediu-se a absor bância encontrando-se uma leitura igual a 0,200. Sabendo-se que as leituras efetuadas com as soluções padrões de nitrato produziram a equação y = 0,01x – 0,1, calcule a concentração de nitrato nas folhas de alface analisadas.

D ETERMINAÇÃO

DA ATIVIDADE

DA NITRATO REDUTASE

1. Utilizando os dados fornecidos abaixo, referentes a um ensaio com a nitrato redutase, represente gracamente, a atividade da enzima em função do tempo de reação. Expresse a atividade em termos de µmol do produto da reação por grama de tecido.


Dados referentes às soluções Dados referentes padrões à amostra Curva Padrão L. E. T.R. L.E. (µM de nitrito) (abs. x 103) (minuto) (abs. x 103) 0 0 10 200 10 200 20 350 20 400 30 450 30 600 40 530 40 800 50 580 50 1000 60 600 L.E.: leitura espectrofotométrica; T.R.: tempo de reação Para o exemplo acima, foram pesados 250mg da amostra (folha) e incubada em 5,0mL do meio de incubação. 2. Utilizando os métodos de Michaelis-Menten, LineweaverBurk e Eadie-Hofstee, represente gracamente e determine os valores de KM e Vmax da enzima cujos resultados de sua atividade são representados na tabela abaixo. Identique que tipo de inibidores são os que atuam sobre a enzima do exemplo abaixo. C  P  R E E  M, A 5 E 10 S   I  R,  A   P  I.


C.S. (mM) 1 2 4 6 10 15

S I C I A 5 seg. 10 seg. 5 seg. 10 seg. 0,223 0,445 0,167 0,333 0,363 0,727 0,286 0,572 0,533 1,067 0,444 0,888 0,632 1,263 0,546 1,092 0,741 1,482 0,667 1,333 0,811 1,622 0,750 1,500

C I B 5 seg. 10 seg. 0,185 0,370 0,303 0,607 0,444 0,888 0,527 1,053 0,618 1,235 0,676 1,352

C.S.: concentração do substrato; 5 e 10 seg. signicam respectivamente 5 segundos e 10 segundos após o início da reação.

D ETERMINAÇÃO

DE CLOROFILA

PELO MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

1. Com o objetivo de quanticar o teor de clorola em folhas de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill), pesou-se 200mg de folhas frescas, transferiu-se para um tubo de ensaio apropriado e adicionou-se 10mL de acetona a 80%. Posteriormente este material foi triturado e ltrado para um balão volumétrico de 25mL, completando-se o volume com o mesmo solvente utilizado na etapa de trituração. Calcule a concentração de clorola A e clorola B nas folhas de tomateiro, expressando os resultados em mg de clorola por grama de folhas frescas.


D ETERMINAÇÃO

DE VITAMINA

C

1. Calcule o teor de vitamina C no suco de um limão, sabendose que 2,0mL do mesmo foi titulado gastando-se 4,1mL de indofenol. Para a padronização do indofenol, usou-se 2,0mL de solução de ácido ascórbico (1000 mg.L -1), gastando-se 16,0mL do indofenol. Na realização da prova em branco, gastou-se 0,1mL do indofenol. 2. Para a determinação de vitamina C em suco de acerola, três frutas foram espremidas e em seguida ltradas em tecido de náilon de malha na. O suco foi diluído, tomando-se 1,0mL do mesmo e completando-se o volume para 100mL com água destilada. Em seguida, 2,0mL do suco diluído foi titulado, gastando-se 3,2mL de indofenol. Calcule o teor de vitamina C no suco da acerola acima, sabendo-se que na prova em branco gastou-se 0,1mL de indofenol e que na padronização do indofenol foi gasto 15,5mL do mesmo. Para a padronização do indofenol, foram usados 2,0mL de ácido ascórbico na concentração de 1,0mg.mL-1.

D ETERMINAÇÃO

DE FÓSFORO

1. Para a análise do teor de fósforo de uma amostra vegetal, pesou-se 200mg da amostra preparada, procedeu-se a calci-


nação da mesma e em seguida o resíduo mineral foi diluído para 50mL. Calcule a percentagem de fósforo desta amostra, sabendo-se que a leitura colorimétrica do extrato da amostra foi igual a 100 (Absorbância x 10 3). As soluções padrões de 20 e 60mg.L-1 de P apresentaram respectivamente as leituras 50 e 150 (A x 103). 2. Em uma determinação de cinzas pesou-se 2,5000g de uma amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 375mg de R.M. Desta cinza foi feita uma diluição para um volume de 100mL e em seguida os procedimentos necessários para a análise do teor de fósforo. A leitura colorimétrica do extrato foi igual a 96 (Absorbância x 10 3). Calcule a percentagem de fósforo na amostra acima, bem como nas cinzas, sabendo-se que a equação referente às leituras com as soluções padrões foi y = a.x, o coeciente angular foi igual a 3,5. Considere que as leituras colorimétricas com as soluções padrões foram obtidas com unidades de concentração em partes por milhão. 3. Em uma determinação de fósforo pesou-se 1,6000g de uma amostra preparada, procedeu-se a digestão da mesma e em seguida o extrato foi diluído, completando-se o volume para 200mL. A leitura colorimétrica com o extrato da amostra foi igual a 50 (Absorbância x 103) e as leituras colorimétricas com soluções padrões em concentrações expressas em ppm, pro-


duziram a equação y = 2,5x. Calcule: a. Quantos ppm de fósforo tem a amostra preparada. b. Qual a percentagem de fósforo na amostra preparada. c. Quantos gramas de fósforo contém 1,4 quilogramas de amostra preparada. d. Quantos miligramas de fósforo contém em 8 gramas de matéria seca, sabendo-se que a umidade da amostra preparada é de 20,00%. 4. Em uma determinação de fósforo pesou-se 2,0000g de uma amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 0,2000g de R.M. As cinzas foram solubilizadas e diluídas para um volume de 50mL. Com este extrato, procedeu-se as operações necessárias à análise de fósforo, obtendo-se uma leitura colorimétrica de 144 (Absorbância x 10 3). Sabendo-se que as soluções padrões de 10 e 50mg.L -1 produziram uma leitura colorimétrica de 30 e 150 (A x 10 3), respectivamente, pede-se para calcular: a. A percentagem de P e de P2O5 na amostra acima; b. A percentagem de P e de P2O5 nas cinzas. 05. Admitindo-se que a amostra referente ao problema anterior (nº 4) trata-se de uma amostra preparada que contém 16,00% de umidade, e que a umidade de campo da mesma é de 79,00%, calcule quantas toneladas de P2O5 são “incorporadas”


ao solo em uma área de 5,0 hectares com a queima da cultura em apreço, nas condições naturais. Considere que no período da queima, a produtividade da biomassa (matéria fresca) é de 60 toneladas por hectare. 6. Para a análise do teor de fósforo de uma amostra vegetal, pesou-se 300mg da amostra preparada, procedeu-se a calcinação da mesma e em seguida o resíduo mineral foi diluído para 50mL. Calcule a percentagem de fósforo desta amostra, sabendo-se que a leitura colorimétrica do extrato da amostra foi igual a 120 (Ax103). As soluções padrões de 30 e 50mg.L-1 de P apresentaram respectivamente as leituras 60 e 140 (Ax10 3). 7. Em uma determinação de resíduo mineral pesou-se 3,7000g de uma amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 436mg de R.M. Desta cinza foi feita uma diluição para um volume de 100mL e em seguida os procedimentos necessários para a análise do teor de fósforo. A leitura colorimétrica do extrato foi igual a 72 (Absorbância x 10 3). Calcule a percentagem de fósforo na amostra acima, bem como nas cinzas, sa bendo-se que a equação referente às leituras com as soluções padrões foi y = ax. O coeciente angular foi igual a 2,5. Considere que as leituras colorimétricas com as soluções padrões foram obtidas com unidades de concentração em mg.L -1.


8. Na determinação de fósforo pesou-se 1,5000g de uma amostra preparada de folhas de goiabeira (Psidium guajava), prodeceuse a digestão da mesma e em seguida o extrato foi diluído, completando-se o volume para 200mL. A leitura colorimétrica com o extrato da amostra foi igual a 80 (Ax103) e as leituras colorimétricas com soluções padrões em concentrações expressas em mg.L-1 , produziram a equação y = 2,5x. Calcule: a) Quantos mg.kg-1 de fósforo tem a amostra preparada. b) Qual a percentagem de fósforo na amostra preparada. c) Quantos gramas de fósforo contém 3,7 quilogramas de amostra preparada. d) Quantos miligramas de fósforo contém em 6 quilogramas de matéria seca, sabendo-se que a umidade da amostra preparada é de 18,00%. 9. Em uma determinação de fósforo pesou-se 2,2000g de uma amostra vegetal, a qual após a calcinação resultou em 0,2000g de R.M. As cinzas foram solubilizadas e diluídas para um volume de 50mL. Com este extrato, procedeu-se as operações necessárias à análise de fósforo, obtendo-se uma leitura colorimétrica de 144 (Ax103). Sabendo-se que as soluções padrões de 10 a 50mg.L-1 produziram uma leitura colorimétrica de 30 e 150 (Ax103), respectivamente, pede-se para calcular: a) A percentagem de P e de P 2O5 na amostra acima; b) A percentagem de P e de P2O5 nas cinzas.


10. Considerando que a amostra referente ao problema anterior (nº 9) trata-se de uma amostra preparada contendo 13,00% de umidade e que a umidade de campo da mesma é de 82,00%, calcule quantos megagramas de P2O5 são “incorporados” ao solo em uma área de 8,0 hectares com a queima total da cultura em questão, nas condições naturais. Considere que no período da queima, a produtividade da biomassa (matéria fresca) é de 70 toneladas por hectare.

D ETERMINAÇÃO

DE ENXOFRE

1. Para a determinação de enxofre em uma amostra vegetal, pesou-se 0,5g de uma amostra pré-seca, procedeu-se a digestão e em seguida a diluição do extrato nitro-perclórico para um volume nal de 50mL. No extrato nitro-perclórico procedeu-se as etapas necessárias à leitura espectrofotométrica, cuja absorbância foi 0,250. Calcule o teor (g kg-1) de enxofre na amostra analisada, sabendo-se que as leituras obtidas com as soluções padrões de enxofre foram 0,100; 0,200; 0,300; 0,400 e 0,500 respectivamente para as concentrações de 10, 20, 30, 40 e 50mg.L-1. 2. Na determinação do teor de enxofre de uma amostra preparada de folhas de sorgo forrageiro (Sorghum bicolor (L.) Moench) encontrou-se os seguintes resultados:


• Peso da amostra preparada que foi digerida quimicamente: 2,0g; • Peso nal do extrato, após a adição de água destilada: 100g; • Equação de regressão linear obtida a partir das leituras dos padrões de S: y = 0,01x; • Leitura do extrato da amostra (em absorbância): 0,200. Calcule a concentração de enxofre na amostra preparada, expressando os resultados em g kg-1. Qual o teor de S nas condições de campo, sabendo que a umidade da amostra preparada foi de 10% e nas condições de campo a umidade foi de 55%.

D ETERMINAÇÃO

DE CLORETO

Calcule o teor de cloreto na amostra (m.s.), admitindo que para a sua determinação, pesou-se 500mg da mesma (m.s.), procedeu-se a extração e o volume nal do extrato foi completado para 25mL com água deionizada. Na titulação de 10mL do extrato, gastou-se 4mL de nitrato de prata 0,025 N. Expressar o resultado em mg.g-1 (m.s.). OBS.: Estequiometricamente, 1,0mL de nitrato de prata 0,025 N equivale a 0,8863mg de cloreto.


D ETERMINAÇÃO

DE SÓDIO E POTÁSSIO

1. Calcule o teor de sódio e de potássio em uma amostra vegetal que apresentou os seguintes resultados de análise: a. Quantidade da amostra analisada: 2,00g; b. Diluição das cinzas (volume total do extrato): 100mL; c. Leitura referente a sódio no extrato concentrado (antes da diluição): 2; d. Leitura referente a potássio no extrato diluído (após a diluição de 1:50): 15; e. Valores das leituras da curva padrão de sódio e potássio: 0mg.L-1 = 0 4mg.L-1 = 8 8mg.L-1 = 16 2mg.L-1 = 4 6mg.L-1 = 12 10mg.L-1 = 20 2. Para a análise dos elementos minerais, foi pesado 2,5000g de uma amostra, feita a calcinação e em seguida o resíduo mineral foi diluído e completado o volume para 200mL. Com este extrato foi realizada a leitura fotométrica para sódio, obtendo 7,5. Para obter a leitura fotométrica referente ao potássio, foi necessário proceder uma diluição no extrato, na proporção de 1:100. Após esta diluição, a leitura fotométrica para potássio foi igual a 4,5. Calcule o teor destes dois elementos minerais na amostra analisada, sabendo-se que a leitura fotométrica com as soluções padrões de Na e K na faixa de 0 a 10mg.L -1 produziram a equação y = 1,5 x. +


+

3. Considere que a amostra do problema anterior trata-se de uma amostra preparada de batata inglesa (Solanum tuberosum) contendo 12,00% de umidade, e que a mesma amostra nas condições de campo apresentou 47,20% de umidade. Com base nestes dados e resultados do problema anterior, calcule quantos quilogramas de potássio são exportados do solo pela colheita da batata inglesa, em uma área de 2 hectares, admitindo que a produtividade desta cultura é de 25 toneladas por hectare.

DETERMINAÇÃO DE

NUTRIENTES MINERAIS POR EAA

1. Em uma determinação de cálcio em folhas de mangueira ( Mangifera indica L.), pesou-se 0,5g da amostra foliar pré-seca e promoveu-se a digestão nitro-perclórica. Após a digestão, o material digerido foi transferido quantitativamente para um frasco de plástico de tara igual a 10,0000g. Em seguida o con junto frasco de plástico mais extrato foi pesado resultando em 60,0000g. As leituras (em concentração) dos padrões de cálcio no espectrofotômetro de absorção atômica produziram uma equação de regressão linear igual a y = 0,9637x – 0,02214 (r = 0,9988). O extrato nitro-perclórico foi diluído (1:25) em cloreto de estrôncio. A leitura do extrato nitro-perclórico diluído foi igual a 0,2336. Calcule o teor de cálcio nas folhas da mangueira, expresse o resultado em g kg-1.


2. Na análise da concentração de magnésio em folhas de goia beira (Psidium guajava L.), pesou-se 0,5g da amostra foliar pré-seca e promoveu-se a digestão nitro-perclórica. Posteriormente, o material digerido foi transferido quantitativamente para um frasco de plástico de tara igual a 9,6090g. Em seguida o conjunto frasco de plástico mais extrato foi pesado resultando em 58,8245g. As leituras (em concentração) dos padrões de magnésio no espectrofotômetro de absorção atômica produziram uma equação de regressão linear igual a y = 0,9985x – 0,03362 (r = 0,9998). A leitura do extrato nitroperclórico diluído 21 vezes em cloreto de estrôncio 1,52% foi igual a 0,2336. Calcule o teor de magnésio nas folhas da goia beira, expresse o resultado em g kg-1. 3. Para analisar o teor de micronutrientes metálicos em amostra de palma forrageira (Opuntia fcus-indica , Mill) pesou-se 400mg da amostra pré-seca e procedeu-se a digestão nitroperclórica. Com o digerido preparou-se 52g de extrato. As leituras efetuadas no espectrofotômetro de absorção atômica (em modo concentração) revelaram os seguintes resultados:


MN Cobre Ferro Manganês Zinco

E  R Y = 1,0189 X – 0,003792 Y = 0,70048 X – 0,03567 Y = 1,1970 X + 0,03696 Y = 0,9897 X + 0,01259

L  E N-P 0,1248 0,3847 0,2458 0,6348

Com base nestes resultados calcule o teor de cada nutriente analisado, expressando os resultados em mg.kg -1 de matéria seca.


5 O X E N

PADRONIZAÇÃO DE

S OLUÇÕES

A I. I NTRODUÇÃO Solução padrão é considerada aquela cuja concentração é rigorosamente precisa, de forma que a mesma possa ser empregada como referencial para a análise quantitativa de determinados compostos ou íons. Nem todos os reagentes químicos devem ser usados para se preparar, a priori , uma solução padrão. Para se preparar uma solução padrão, deve-se partir de um composto (reagente químico) considerado como padrão primário. Para que uma substância possa servir como padrão primário, são necessários alguns requisitos, como: o reagente deve ser bastante estável, isto é, que não seja higroscópico, não se oxide e nem se decomponha com facilidade, deve ser bastante solúvel, além de outras qualidades desejáveis.

II. S OLUÇÃO PADRÃO DE C ARBONATO DE S ÓDIO N A 2 CO 3 0,05N 1. Pegar uma cápsula de porcelana* e acrescentar cerca de 5 gramas de carbonato de sódio anidro (Na 2CO3 , Eq.: 52,995) e P.A.; 2. Colocar em estufa reguladora a 105°C por duas horas;


3. Transferir para um dessecador contendo sílica-gel bem ativada e deixar esfriar por cerca de 30 minutos; 4. Pesar exatamente 2,6500 gramas do carbonato de sódio anidro, transferir para um béquer de 250mL e dissolver com água deionizada; 5. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 1000mL e completar o volume com água deionizada; 6. Homogeneizar e transferir para um frasco de vidro âmbar devidamente etiquetado; * Toda vidraria utilizada nas operações de preparo de solução padrão deve ser rigorosamente lavada e seca. Também é recomendado o máximo de rigor e precisão possível em todas as operações envolvendo o preparo de uma solução padrão.

III. P REPARO DA S OLUÇÃO PADRÃO DE H 2 SO 4 0,05N C: Volume total a preparar: 2 litros; Fonte: ácido sulfúrico (P.A.) concentrado (36N) Cálculo do volume de ácido concentrado: N . V = N’ . V’ 36N . V = 0,05N . 2000mL V = 2,777mL


P 1. Pegar um balão volumétrico 2000mL, adicionar cerca de 1000mL de água deionizada e em seguida acrescentar 2,8mL de H2SO4 (36N). Neste caso pode ser empregada uma pipeta graduada, mas não deve ser pipetado com a boca; 2. Completar o volume do balão volumétrico com água deionizada, homogeneizar bastante e em seguida padronizar.

IV. PADRONIZAÇÃO DO Á CIDO S ULFÚRICO CO M C ARBONATO DE S ÓDIO 1. Enxaguar uma bureta devidamente limpa, com uma solução padrão de carbonato de sódio (0,05 N); 2. Encher e zerar a bureta com o carbonato de sódio mencionado no item anterior; 3. Pipetar para um erlenmeyer de 50mL, 10,0mL da solução do ácido sulfúrico a ser padronizada (0,05N). Neste caso é recomendado usar uma pipeta volumétrica; 4. Acrescentar duas ou três gotas do indicador vermelho de metila ou alaranjado de metila; 5. Titular a solução de ácido sulfúrico com o carbonato de sódio (padrão) até a mudança de cor; 6. Anotar o volume gasto e repetir a titulação mais duas vezes; 7. Tirar a média do volume de carbonato de sódio gasto e proceder com o cálculo da normalidade empregando a equação de


volumetria: N.V = N’.V’. Se necessário corrigir a concentração do ácido. Do contrário, anotar a normalidade exata e guardar o ácido padronizado em frasco escuro ou utilizar conforme a necessidade.

V. P REPARO DE S OLUÇÃO PADRÃO DE Á CIDO O XÁLICO 0,05 N. 1. Preparar 1000mL. Pesar 3,1525g de ácido oxálico dihidratado; 2. Transferir para um béquer de 500mL, acrescentar cerca de 200mL de água deionizada e dissolver com o auxílio de bastão de vidro; 3. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 1000mL, completar o volume do balão volumétrico com água deionizada; 4. Homogeneizar e transferir para um frasco de vidro limpo e devidamente etiquetado. OBS.: Ácido oxálico dihidratado (C2H2O4.2H2O), PM=126,1 e Eq=63,05

VI. P REPARO E PADRONIZAÇÃO DE H IDRÓXIDO DE S ÓDIO 0,05 N P  1000 L     0,05N 1. Pesar 0,21g de hidróxido de sódio (P.A.);


2. Transferir para um béquer de 500mL; 3. Dissolver em cerca de 200mL de água deionizada; 4. Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 1000mL e completar o volume com água deionizada. P    . 1. Encher uma bureta com ácido oxálico 0,05 N (padrão) e em seguida zerar a mesma; 2. Pipetar para um erlenmeyer de 50mL, exatamente 10mL da base a ser padronizada. Neste caso é recomendado usar uma pipeta volumétrica; 3. Acrescentar duas ou três gotas do indicador fenoaleína; 4. Titular a até a mudança de cor (vermelho para incolor); 5. Anotar o volume gasto e repetir a titulação mais duas vezes; 7. Tirar a média do volume gasto e proceder com o cálculo da normalidade empregando a fórmula N.V = N’.V’. Se necessário corrigir a concentração da base. Do contrário, anotar a normalidade exata e guardar a base padronizada em frasco escuro ou utilizar conforme a necessidade. Esta solução não tem muita durabilidade, portanto deve ser usada em menos de uma semana. OBS.: Alternativamente pode-se titular potenciometricamente até pH 8,0. Solução de fenolaleína. Dissolver 1,0g de fenolaleína em 60mL de etanol e em seguida completar o volume para 100mL.


Este indicador é incolor em pH abaixo de 8,3 e vermelho em pH acima de 9,8.

VII. B IBLIOGRAFIA ASSUMPÇÃO, R.M.V.; MORITA, T. Manual de soluções, reagentes e solventes. São Paulo: Edgard Blücher, 1969. 627p.

OHLWEILER, Oo Alcides. Química analítica quantitativa . 2. ed. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Cientícos, 1988. v. 2, 226p.: il.


6 O X E N

A

C OMPOSIÇÃO B ROMATOLÓGICA A PROXIMADA

DE

A LGUMAS

H ORTALIÇAS , FRUTAS DE

E

C ULTURAS

L ARGA E SCALA

C Abóbora Alface Batata ingl. Beterraba Cenoura Chuchu Pepino Melancia Rabanete Repolho Tomate Abacate Abacaxi Banana Coco

U (%) 96,10 95,00 83,00 87,00 88,00 97,00 96,00 95,00 94,00 92,00 94,00 n.a. n.a. n.a. 12,00

RM (%) n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.

PB (%) 1,20 1,20 1,80 3,00 1,20 0,90 0,07 n.a. traços 1,40 1,00 2,15 0,40 1,40 5,70


CHO (%) 9,80 2,30 17,60 9,00 10,70 7,70 2,70 n.a. 2,80 4,30 3,40 5,63 13,70 26,00 27,90

EE (%) 0,30 0,20 0,10 0,10 0,30 0,20 0,07 n.a. n.a. n.a. 0,30 n.a. 0,20 0,25 50,60

FB (%) 1,30 1,10 0,40 1,10 1,80 1,70 0,70 0,50 n.a. n.a. 1,00 n.a. n.a. n.a. n.a.

C (C.)

Goiaba Mamão Manga Arroz Batata doce Feão Mandioca Milho

U (%) n.a. n.a. n.a. 12,00 70,00 13,00 60,00 10,00

RM (%) n.a. n.a. n.a. 1,20 1,30 3,50 0,50 1,60

PB (%) 0,75 0,20 1,00 7,50 1,92 22,89 2,00 11,80

CHO (%) 7,98 14,50 27,6 76,00 32,00 61,93 33,00 70,00

EE (%) n.a. n.a. n.a. 1,90 0,50 1,49 0,20 4,50

FB (%) n.a. n.a. n.a. 0,60 1,30 3,00 n.a. 2,00

OBS.: Valores expressos em relação à matéria fresca. Compilado de diversos autores. n.a. = não apresentado


7 O X E N

A

P RINCÍPIOS BÁSICOS

DE

A NÁLISES

E SPECTROFOTOMÉTRICA A espectrofotometria é uma técnica de análise química em que se determina a concentração de espécies químicas (íons, átomos, moléculas) pela absorção de energia radiante (energia luminosa ou luz). A energia luminosa tem propriedades ondulatórias e corpusculares e se propaga no espaço a grandes velocidades, em geral em linha reta. As características ondulatórias são definidas entre outros parâmetros pelos diversos comprimentos de onda (representados pela letra grega lambda (λ), e geralmente expresso em termos de nanômetro (nm = 10-9 m). Por outro lado, as propriedades corpusculares referem-se ao fato da radiação ser constituída por partículas de energia, denominada de fótons, cuja energia é denominada de energia quântica e é calculada pela expressão: E = hν , em que E representa a energia (expressa em Joules), a letra grega ni ( ν) a freqüência de onda (em Hertz, Hz) e h a constante de Planck, cujo valor é 6,6256 x 10 -34 Js. Sabe-se também que ν = c/λ , onde o valor de c corresponde a velocidade de uma onda eletromagnética no vácuo, conhecido também como a velocidade da luz, que possui o valor de 3 x 10 10 cm.s-1. Daí, percebe-se que um fóton de alta freqüência (baixo compri-


mento de onda) é mais energético do que um fóton de baixa freqüência (alto comprimento de onda). A faixa de comprimento de onda das várias regiões do espectro eletromagnético encontra-se no quadro a seguir. C  O (nm) 0,1 - 100 100 - 400 400 - 800 800 - 5000 5000 - 30000

R  E L Raios X Ultravioleta Visível Infravermelho Microonda

A luz tem a propriedade de interagir com a matéria e quando isso ocorre uma parte de sua energia é absorvida por elétrons dos átomos que compõem as moléculas e a outra parte não é absorvida e simplesmente atravessa a matéria e é transmitida. O estudo quantitativo da absorção da energia radiante por soluções coloridas fundamenta-se no princípio geral conhecido como Lei de Lambert-Beer, segundo a qual a absorvância (tam bém chamada de absorbância) é proporcional à concentração da espécie química absorvente, mantendo-se constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores. A lei de Lambert-Beer é expressa por: A = D.O. = a.b.c = log I 0/I


Onde A = absorvância D.O. = densidade ótica I0 = intensidade de radiação incidente na solução I = intensidade de radiação emergente (ou transmitida) a = coeciente de absorção (ou índice de absortividade), característico do soluto b = espessura da camada de solução atravessada pelo feixe luminoso c = concentração do soluto na solução. A escala de transmitância (T%) é dada por: T = 100 I / I 0 Nota-se, portanto que quando a absorbância é igual a zero, não há absorção da luz devido à substância ser totalmente incolor (na sensibilidade do aparelho), apresentando cem por cento de transmitância. O oposto ocorre quando o valor da absorbância tende ao innito, com absorção completa, no caso de solução preta, tendo-se então valor zero de transmitância. Uma solução de uma dada cor absorverá preferencialmente, a radiação luminosa da cor complementar, conforme o quadro de escala de cores a seguir.


T 1. Comprimentos de ondas referentes às cores da radiação visível C C C  O (nm) 400 - 465 Violeta Verde-amarelo 465 - 482 Azul Amarelo 482 - 487 Azul-esverdeado Alaranjado 487 - 493 Turquesa Vermelho alaranjado 493 - 498 Verde-azulado Vermelho 498 - 530 Verde Vermelho púrpura 530 - 559 Verde-amarelado Púrpura-avermelhado 559 - 571 Amarelo-verde Púrpura 571 - 576 Amarelo-esverdeado Violeta 576 - 580 Amarelo Azul 580 - 587 Laranja-amarelado Azul 587 - 597 Alaranjado Azul-esverdeado 597 - 617 Laranja-avermelhado Turquesa 617 - 780 Vermelho Turquesa FONTE: EWING. Gelen Wood. Métodos instrumentais de análise química. v.1. Ed. Edgard Blücher, Sao Paulo. 296 p. 1972.

Assim, da expressão anterior pode-se deduzir: I / I0 = T / 100 I0 /I = 100 / T Desse modo, log (I0 / I) = log (100 /T) Então A = log 100 – log T E nalmente, A = 2 – log T. O equipamento utiliado para medir a intensidade de radiação transmitida por uma solução é chamado de espec-


trofotômetro, ou simplesmente fotômetro (Figura 1), o qual é constituído pelos seguintes componentes: •Uma fonte luminosa, que pode ser uma lâmpada de tungstênio ou de hidrogênio (deutério); •Um seletor de comprimento de onda, que pode ser um filtro ótico ou monocromador à base de prisma ou de rede de difração. Quando o aparelho é provido de filtro ótico ele é chamado de fotocolorímetro ou fotômetro, por outro lado, quando é provido de monocromador de prisma ou de rede de difração é denominado de espectrofotômetro. •Um compartimento para a amostra, onde se coloca a cubeta, de quartzo para leituras na região do ultravioleta abaixo de 350nm, ou de vidro para leituras em comprimentos de onda de 350nm a 2µm; • Uma célula fotoelétrica (detectores de radiação visível e ultravioleta, são transdutores que convertem a energia radiante em sinal elétrico); • Um sistema de amplificação, constituído de tubos fotomultiplicadores de medida do sinal elétrico (potenciômetro, medidor de potencial elétrico); • Um mostrador com a finalidade de expor as leituras espectrofotométricas (absorbância ou tramitância). Geralmente estes aparelhos podem ser acoplados à um registrador, impressora ou computador.


F 1. Esquema dos componentes de um espectrofotômetro ou colorímetro. FM = fotomultiplicador ou fototubo.

B IBLIOGRAFIA HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. 7ª Ed. São Paulo: LTC, 2008. 886p. KOBAL JÚNIOR, J.; SARTORIO, L. Manual de Análise Instrumental. 1ª Ed. São Paulo: Moderna, 1978. 68p. MENDHAM, J., DENNEY, R.C.; BARNES, J.D. Vogel – Análise Química Quantitativa. 6ª Ed.. São Paulo: LTC, 2002. 464p.

OHLWEILER, Oo Alcides. Fundamentos de Análise Instrumental. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Cientícos, 1988. 486p. ROBYT, J.F.; WHITE, B.J. Biochemical techniques: theory and practice. London: Academic Press. 1990. 407p.


8 O X E N

A

TABELA

A NÁLISE 10 ML V.S.A. (mL)

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

EYNON -L ANE

DE DE

DA

PARA

AÇÚCARES, TITULANDO

SOLUÇÃO

DE

SOXHLET

Sacarose contida em 100 mL da solução Glicose (mg) 0g 1g 5g 10 g 25 g mg de açúcar invertido 50,5 49,9 47,6 46,1 43,4 49,1 50,6 50,0 47,6 46,1 43,4 49,2 50,7 50,1 47,6 46,1 43,4 49,3 50,8 50,1 47,6 46,1 43,3 49,3 50,8 50,2 47,6 46,1 43,2 49,4 50,9 50,2 47,6 46,1 43,2 49,5 51,0 50,3 47,6 46,1 43,2 49,5 51,0 50,3 47,6 46,1 43,1 49,6 51,1 50,3 47,6 46,1 43,0 49,6 51,2 50,3 47,6 46,1 42,9 49,8 51,2 50,4 47,6 46,0 42,8 49,8 51,3 50,4 47,6 46,0 42,8 49,9 51,4 50,4 47,6 46,0 42,7 49,9 51,4 50,5 47,7 46,0 42,7 50,0 51,5 50,5 47,7 46,0 42,6 50,0 51,5 50,5 47,7 46,0 42,5 50,1 51,6 50,6 47,7 45,9 42,5 50,2 51,6 50,6 47,7 45,9 42,4 50,2 51,7 50,6 47,7 45,9 42,3 50,3


Cont.

V.S.A. (mL)

34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

Sacarose contida em 100 mL da solução Glicose (mg) 0g 1g 5g 10 g 25 g mg de açúcar invertido 51,7 50,6 47,7 45,8 42,2 50,3 51,8 50,7 47,7 45,8 42,2 50,4 51,8 50,7 47,7 45,8 42,1 50,4 51,9 50,7 47,7 45,7 42,0 50,5 51,9 50,7 47,7 45,7 42,0 50,5 52,0 50,8 47,7 45,7 41,9 50,6 52,0 50,8 47,7 45,6 41,8 50,6 52,1 50,8 47,7 45,6 41,8 50,7 52,1 50,8 47,7 45,6 41,7 50,7 52,2 50,8 47,7 45,5 41,6 50,8 52,2 50,9 47,7 45,5 41,5 50,8 52,3 50,9 47,7 45,4 41,4 50,9 52,3 50,9 47,7 45,4 41,4 50,9 52,4 50,9 47,7 45,3 41,3 51,0 52,4 50,9 47,7 45,3 41,2 51,0 52,5 51,0 47,7 45,2 41,1 51,1 52,5 51,0 47,7 45,2 41,0 51,1

V.S.A.: volume da solução analisada. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Métodos físico-químicos para análise de alimentos. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz, 2008. 1020p.


9 O X E N

A

CONCENTRAÇÃO COMUNS

DE A LGUNS Á CIDOS

EM L ABORATÓRIOS

Á

% em peso

Ácido acético glacial DAB. 6 96 Ácido acético glacial 99-100% 99-100 Ácido acético diluídoDAB. 6 30 Ácido clorídrico DAB. 6 25 Ácido clorídrico conc. 32 Ácido clorídrico conc. 36 Ácido clorídrico fumegante 38 Ácido fórmico 98-100 Ácido fosfórico DAB. 6 25 Ácido fosfórico conc. 85 Ácido fosfórico conc. 89 Acido nítrico DAB. 6 25 Acido nítrico concentrado 65 Ácido nítrico fumegante 99* Ácido sulfúrico concentrado 95-96 Ácido sulfúrico diluído DAB. 6 16 Ácido sulfúrico fumegante ** Anidrido acético 90

D (g/mL)

1,06 1,06 1,04 1,12 1,16 1,18 1,19 1,22 1,15 1,69 1,75 1,15 1,40 1,51 1,84 1,11 1,99 1,07

° Be

N

8 17 8 18 5,4 5 16 8 20 10 22 12 23 12,5 26 26 19 9 59 45 62 48 18,6 5 41 14 49 21 66 36 14 4 72 10 -

* valores aproximados. ** ≈ 65 % SO3 F: E. MERCK AG. Tabelas Auxiliares. Darmstad: E. Merck, s.d. 22 p.


TEORES A DEQUADOS

DE N UTRIENTES 0 1

MINERAIS

NAS F OLHAS

O X E N

PARA D IVERSAS C ULTURAS A C

Abacate Abacaxi Abóbora(a) Alface Algodão Alho Amendoim Arroz Aspargo Banana Batata Cacau Café Cana de açúcar Cebola Cenoura Citros Coco Couve-or Feão arranca Feão corda Goiaba

N

P

K

Ca

Mg

S

g Kg-1 17,5-18,5

0,8-2,5

7,5-20,0

10,0-30,0

2,5-8,0

2,0-6,0

20,0-22,0

2,1-2,3

25,0-27,0

3,0-4,0

4,0-5,0

2,0-3,0

30,0-35,0

6,0-7,0

24,0-26,0

48,0-49,0

9,0-10,5

-

34,0-40,0

4,0-6,0

50,0-80,0

14,0-20,0

3,0-7,0

-

32,0

1,7

15,0

20,0

5,0

4,0

30,0-0,0

3,0

20,0-0,0

1,0-6,0

1,5-3,0

3,0-15,0

40,0

2,0

15,0

20,0

3,0

2,5

30,0-40,0

1,4-2,7

14,0-28,0

1,6-3,9

1,2-2,1

1,7-2,0

29,5-49,0

1,8-3,5

11,6-26,4

8,6-17,6

2,7-7,0

-

26,0

2,2

28,0

6,0

3,0

2,0

55,0-65,0

3,5-5,5

45,0-65,0

10,0-20,0

3,0-5,0

-

28,0

2,0

33,0

3,0

4,0

3,0

28,0

1,2

18,0

10,0

3,5

2,0

16,0

1,2

12,0

4,0

2,0

2,0

25,0-35,0

2,5-4,0

25,0-50,0

15,0-35,0

3,0-5,0

-

26,0

3,1

29,0-33,0

14,0-30,0

3,0-5,5

-

22,0

1,2

10,0

30,0

3,0

2,0

17,0

1,0

5,0

5,0

3,0

-

25,0

5,0

25,0

35,0

-

-

30,0-50,0

2,0-3,0

20,0-25,0

15,0-20,0

4,0-7,0

5,0-10,0

18,0-22,0

1,2-1,5

30,0-35,0

50,0-55,0

5,0-8,0

1,5-2,0

22,0-26,0

1,4-1,9

14,0-20,0

7,0-15,0

2,5-4,0

2,5-3,5


C (.)

N

P

Abacate Abacaxi Alface Algodão Alho Amendoim Arroz Aspargo Banana Batata Cacau Café Cana-de-açúcar Cebola Cenoura

Ca

Mg

S

g Kg-1

Mamão/limbo 45,0-50,0 51,0-58,0 Mandioca 12,0-13,0 Manga 40,0-50,0 Maracujá 27,5-32,5 Milho 30,0-35,0 Pepino(a) 30,0-45,0 Pimentão 45,0-55,0 Soja 13,0-15,0 Sorgo 30,0 Tomate 15,0-25,0 Videira/limbo (a) folha com pecíolo

C

K

5,0-7,0

25,0-30,0

20,0-22,0

10,0

4,0-6,0

3,0-5,0

13,0-20,0

7,5-8,5

2,9-3,1

2,6-3,0

1,2-1,4

4,0-6,0

30,0-33,0

5,0-6,0

1,6-1,8

4,0-5,0

35,0-45,0

15,0-20,0

3,0-4,0

3,0-4,0

2,5-3,5

17,5-22,5

2,5-4,0

2,5-4,0

1,5-2,0

6,-–7,0

24,0-26,0

48,0-49,0

9,0-10,5

-

3,0-7,0

40,0-54,0

4,0-6,0

10,0-17,0

-

2,6-5,0

17,0-25,0

4,0-20,0

3,0-10,0

2,5

4,0-8,0

25,0-30,0

4,0-6,0

4,0-6,0

8,0-10,0

3,5

40,0

14,0–18,0

4,0

3,0

2,0-4,0

12,0-20,0

20,0-35,0

3,0-6,0

-

B

Cu

Fe mg Kg-1

M

Zn

15-100

5-15

50-200

30-500

30-150

30-40

9-12

100-200

50-200

10-15

25-55

10-80

50-500

30-200

25-150

50

8

-

-

30

50

25

200

100

75

140-180

-

-

110-440

-

-

-

89-193

237-744

22-161

25-211

6-11

-

72-173

16-30

15

8

70

-

20

30-60

6-20

70-150

50-300

20-60

32

15

-

-

30

40

6

70

50

10

10

6

100

50

10

30-45

6-20

-

-

20-55

29-35

5-7

120-350

190-350

20-50


C (.)

B

Cu

Fe mg Kg-1

M

Zn

Citros Couve-or Feão de arranca Feão corda Goiaba Mamão/limbo Mandioca Manga Maracujá Milho Pimentão Soja Sorgo Tomate Videira/limbo

50

6

60

25

25

40

5

-

60

-

30-60

10-20

100-450

30-300

20-100

150-200

5-7

700-900

400-425

40-50

20-25

10-40

50-150

80-180

25-35

15

11

291

70

43

30-60

6-10

120-140

50-120

30-60

30

30

70

120

90

40-50

10-20

120-200

400-600

25-40

15-20

6-20

50-250

50-150

15-50

40-100

10-20

-

26-300

35-260

21-55

10-30

51-350

21-100

21-50

20

10

200

100

20

50-70

10-15

500-700

250-400

60-70

25-40

12-20

60-180

80-120

25-60

F: CAVALCANTI, F.J. de A. et al. Recomendações de adubação para o estado de Pernambuco. Recife: Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA. 2008. p 64.


9 O X E N

A

1 8 1 5 8 3 3 1 6 1 1 2 2 , 9 3 , 0 7 3 5 5 7 9 9 1 2 C ,4 R ,1 K , 9 N 3 L 0 F , 9 9 a 9 i 8 H r 0 s 7 b 0 2 9 5 2 2 2 8 1 5 8 3 4 4 1 ,9 2 8 3 6 7 8 0 0 4 0 2 6 R 7 B , 6 S , 0 C , 3 M 1 B , 2 2 r 8 a 1 g a 3 e 4 a 2 5 8 3 4 2 8 1 2 7 8 9 4 2 9 3 7 A 8 L , 9 Y , 9 S 1 , 0 5 c c 9 1 a 5 6 7 9 4 4 1 2 2 1 0 7 7 8 H ,2 Z , 9 T 2 ,4 2 r 0 i 9 f 4 5 7 9 1 2 2 9 1 5 1 0 3 8 3 2 3 0 4 8 , 0 2 T 0 , N 9 V , 9 T 9 , 0 ,1 C 0 b 4 a h e 2 4 6 3 2 8 8 7 9 4 5 2 5 9 1 2 1 4 5 2 1 4 9 8 3 1 4 , , 3 0 1 P 9 C M , 8 W 9 , 9 P 4 9 a 0 r 5 o 6 r 7 7 9 2 1 2 4 5 9 1 6 5 9 3 5 8 4 3 2 4 0 6 , 8 U 4 M T 9 ,2 R , 0 ,2 N 3 n c e d 8 4 4 7 4 1 1 2 9 1 6 2 9 6 0 4 5 6 3 3 4 1 0 O 1 R 5 7 N 7 P , 8 F ,2 , 4 m p s 0 7 u 7 e 2 9 1 6 1 7 1 4 5 2 9 4 4 5 2 5 8 7 2 I 7 0 , 2 P 0 S 2 ,2 r , , 9 R 9 3 C u 3 5 m 0 h 3 o 5 7 1 2 4 5 2 9 1 1 6 8 5 9 4 8 5 0 6 8 5 P , 1 E 3 3 A 6 P 7 N , , 0 ,4 d 1 m 9 i 9 t 6 u 7 1 1 4 6 2 9 1 6 2 9 9 0 7 3 9 6 5 4 4 7 6 7 , 7 C , G C , 9 A , 8 A 5 2 d 4 u m 5 7 g 6 u 7 8 1 4 6 9 1 6 2 2 3 0 0 1 8 5 7 5 5 4 0 0 2 , 8 7 B , T 3 Z H C , , 5 g 4 7 n k 9 9 0 d 2 b 4 3 2 2 8 1 4 6 1 1 5 9 1 6 2 1 6 0 5 1 1 9 9 3 0 8 6 6 , , 8 B 4 4 , 7 G 9 A 1 C 2 D , 3 T , 8 I , 5 8 n 2 f y a 2 l 1 1 7 l 2 5 3 1 2 2 1 8 1 7 6 1 6 2 9 6 0 2 2 8 4 2 0 2 1 7 5 9 4 7 P 8 S , 5 G , 0 S , 0 C 4 E , H , 6 ,1 9 1 s 9 e 8 9 b 9 n 6 i 1 3 o 8 2 2 1 1 5 3 1 7 3 7 1 1 6 3 2 0 5 1 4 3 0 5 4 0 6 8 8 B 1 3 F 0 7 E A , 9 P , 0 , 9 , 7 S , 9 0 N 2 2 r 7 b m , 6 8 i 5 7 2 s 4 1 2 1 3 1 8 7 8 1 1 6 5 8 3 2 6 5 1 4 2 4 2 0 6 9 2 5 , S , 0 S , 9 O 0 P 7 6 M 1 8 , 6 T 9 , 9 T 6 e 6 9 m o e 0 9 4 d 3 4 2 2 3 1 1 9 1 1 7 8 1 5 7 2 9 5 3 5 1 7 8 5 0 7 , 4 N 2 3 Y 0 0 A 5 6 I 3 , 9 B , 4 C 9 F , , 0 r 5 l 9 t 9 o 0 9 0 8 3 4 b 4 2 1 4 2 7 5 8 3 3 1 2 2 8 1 1 1 0 , 0 2 1 4 3 6 9 8 0 5 6 3 0 7 , , , 2 1 X 8 K 9 A 7 L 3 4 L 1 0 H R , 3 4 0 r 8 N 3 e w , 9 u n 8 e r e 3 0 7 2 2 3

D O S

E

L E M E N T O S

Q U Í M I C O S

T A B E L A

P

E R I Ó D I C A

S Cecília Amoroso

No imenso campo do mundo, Tu és um semeador. Semeia, mestre, semeia Cada vez com mais amor. Não digas que o solo é mau. Que chove frequentemente. Ou o sol castiga a terra Ou que não serve a semente. Enfrenta as diculdades, Não podes desanimar. Aqui, no campo do mundo, Teu dever é semear. Tua palavra é semente, Teu exemplo, teu perdão. É semente todo zelo Com que dás tua lição. É semente teu sorriso, O teu aperto de mão. É semente tudo, tudo Que vem do teu coração. Não esperas recompensa Mas recompensa terás. E nem, pensas em riqueza Mas rico sei que serás. Porque trabalhas num reino Onde perder é ganhar, Onde dar é receber. Vamos, mestre, semear. Semeia, semeia sempre. Cada vez com mais amor. No imenso campo do mundo, Tu és um SEMEADOR.

Analises Em Plantas -Neto

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