Acción de agentes físicos y químicos sobre la partícula viral

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Acción de agentes físicos y químicos sobre la partícula viral ASIGNATURA

:

Virología DOCENTE

:

Dra. Graciela Albino Cornejo. ALUMNO

:

Rómulo Aycachi Aycachi Inga.

CICLO

:

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

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Acción de los agentes físicos y químicos sobre la partícula viral I.

INTRODUCCIÓN : Los virus reaccionan de diferentes maneras a los agentes tanto físicos como químicos y esto depende tanto de su naturaleza, su composición (con o sin envoltura) y muchos otros factores mas. Por lo general, en lo referente al calo calorr y frío, frío, los los viru virus s icos icosaé aédr dric icos os tien tiende den n a ser ser esta establ bles es y pier pierde den n poca poca infectividad después de varias horas a 37º C y los virus cubiertos son mucho mas termolábiles, además la infecciosidad viral generalmente desaparece por calent calentami amient ento o de 50 a 60 ºC durant durante e 30 minuto minutos, s, aunque aunque existe existen n alguna algunas s excepc excepcion iones es notab notables les (virus (virus de la hepat hepatiti itis s B, poliom poliomavi avirus rus,, agent agente e de la encefa encefalit litis is espon espongif giform orme). e). Los virus virus que resist resisten en a la liofili liofilizac zación ión resist resisten en temperaturas mayores cuando se calientan en estado seco. Los virus envueltos tienden a perder la infecciosidad luego de almacenamiento prolongado incluso a -90 ºC y son partic particula ularme rmente nte sensib sensibles les a congel congelaci ación ón y descon descongel gelaci ación ón repentinos. En cuanto al pH, los virus son generalmente estables a valores de entre 5.0 y 9.0. Algunos virus (p.ej. enterovirus) resisten condiciones ácidas. Todos se destruyen en condiciones alcalinas. En las reacciones de hemoaglutinación, las variaciones menores de una unidad de pH pueden influir el resultado. Con respecto a la radiación, los rayos UV, rayos X y las partículas de alta energía, estas inactivan a los virus, aunque las dosis varían para diferentes virus; además las partículas irradiadas incapaces de replicarse pueden aun expresar algunas funciones específicas en la célula huésped. En la refere referente nte a los agent agentes es químic químicos os tenemo tenemos s p. ej. la inacti inactivac vación ión fotodinámica, en la cual los virus pueden dejarse penetrar en grado variable por colorantes vitales, como el azul de toluidina, rojo neutro y proflavina. Estos colorantes se unen al ácido nucleico viral, y el virus adquiere susceptibilidad a la inactivación por la luz visible. Comúnmente se usa el rojo neutro. También los virus son susceptibles al éter y mediante esto se puede distinguir un virus que posee cubierta del que no lo posee. Los detergentes son también agentes químicos que pueden afectar a los virus p. ej. los detergentes no aniónicos como como el Nonide Nonidett P40 y Tritón ritón X-100 X-100 solub solubili ilizan zan el elemen elemento to lipídi lipídico co de la membrana viral. Liberan (desnaturalizan) las proteínas virales de la envoltura. Los detergentes aniónicos como el dodecilsulfato de sodio también solubilizan la envoltura viral; además, fragmentan las cápsides en polipéptidos separados. Por último, el formaldehído también puede afectar a la partícula viral, ya que suprime la infectividad del virus al reaccionar con su ácido nucleico. Los virus virus que contiene contienen n una sola sola caden cadena a se inacti inactivan van con mucha mucha facilida facilidad d en com comparac aració ión n con con aqu aquello ellos s cuyo uyo gen genoma oma contie ntiene ne dos caden adenas as.. El formaldehído demuestra efectos adversos mínimos sobre la antigenicidad de las proteínas, por eso se lo emplea con frecuencia en la producción de vacunas a base de virus inactivados. i nactivados.





II I.

Materiales:

Material Biológico: -

Parti rticulas virales Cepa pr problema

Material de Laboratorio: -

Agar Tr Triptosa. Agar Agua. Caldo triptosa Pipetas. Placas Pe Petri. Mechero. Lámpara UV UV. Agente Agentes s quím químico icos s (éter (éter,, cloro clorofor formo, mo, formal formaldeh dehído ído). ). Baño María. Asas Asas Bac Bacteri teriol ológ ógic ica as.

IV.

Procedimiento:

A. Acción Acción del Calor Calor sobre sobre la partícula partícula viral viral : • •

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B.

Distribuir en 4 tubos un inóculo viral a título conocido. Se distribuye en cada tubo 0.5 ml. de suspensión vírica a titulo conocido. Luego, colocar a Baño María (60 ºC por 30 min.), considerara este momento como Tiempo cero. Cada 15 minutos retirar un tubo y dejar a medio ambiente por 20 minutos cada tubo conforme se retiren. Rotularlos los tubos como T15, T30, T45, T60. Luego titular: tomar 4 tubos con Agar Agua diluido y a cada uno de ellos agregarles 0.1 ml. de suspensión vírica, mantenerlos a 45°C. Agregar luego 4 a 5 gotas de la bacteria (4 - 6 horas de desarrollo). Mezclar y verter en placa con Agar Triptosa. Incubar a 37 ºC por 18 a 24 h Pasado el tiempo hacer la lectura correspondiente.

Acción de la Radiación UV sobre la partícula viral : •

Usar inóculo viral (10-5)





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Luego Luego exponer exponer las placas placas a la luz UV. UV. A una distanci distancia a de 20 – 30 cm., las placas deben estar destapadas en esta área, se contabiliza como tiempo cero (T0). Cada 5 min. retirar una placa. Luego titular: tomar 4 tubos con Agar Agua diluido. Agregar luego de 4 a 5 gotas de la bacteria (4 - 6 horas de desarrollo). Mezclar y verter en placa con Agar Triptosa Triptosa ( que quede sobre toda la superficie). Luego, incubar a 37 ºC por 18 a 24 h Pasado el tiempo observar.

C. Acción Acción del Formaldehíd Formaldehído o sobre la partíc partícula ula viral viral : • •

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Diluir el formaldehído 1/1000 (0.25:250 ml) En un tubo tapa rosca colocar 1 ml. de formaldehído diluido (1/1000) y mezclarlo con 1 ml. de la suspensión del virus a titulo conocido. Al mezclar marcar con Tiempo cero (T 0) y de inmediato el tubo lo enviamos a estufa (37 ºC por 15 min.), esto cada 15 min. hasta completar los 60 min. Luego se retira el tubo y titular: tomamos 0.1 ml.; lo llevamos a un tubo con Agar Agua, se agrega 3 - 4 gotas de la cepa y se coloca sobre Agar Triptosa Triptosa en placa. Una vez hecho esto, se lleva a estufa a 37°C/15’ más. Se repite lo mismo y se lleva a estufa, se repite lo mismo cada 15’ hasta completar la hora (un total de 3 repeticiones más). Se marcan los tubos como T15, T30, T45 y T60. Hacer la lectura, después de incubado.

D. Acción Acción del Cloroform Cloroformo o sobre sobre la partícula partícula viral viral : • •

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E.

En un tubo tapa rosca colocar 0.5 ml de cloroformo (50 µl). Luego agregar 1 ml. de la suspensión vírica y luego agitar por 10 min. Se obse observa rvará rá en el tubo tubo la form formac ació ión n de 2 capa capas: s: supe superf rfic icia iall y profunda (el cloroformo y la suspensión vírica). Pasado el tiempo, dejar el tubo en reposo por 15 min. (se observará en el tubo la formación de 2 capas: superficial y profunda, o sea, el cloroformo y la suspensión vírica), transcurrido ese tiempo, titular. Coger 0.1 ml. de la suspensión viral y llevar a Agar Agua, agregar luego 3 a 4 gotas de la bacteria. Mezclar y verter en placa con Agar Triptosa Triptosa (que quede sobre toda la superficie). Luego, incubar a 37 ºC por 24h y observar.

Acción del éter sobre la partícula viral :





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Llevar a refrigeración con el tubo semiabierto para que esta vez si se volatilice el éter. Esto es por toda una noche. De lo que ha quedado, recoger el filtrado y pasar 0.1 ml del filtrado a un tubo (con agar agua) y agregar de 4 a 6 gotas de cepa Luego pasar a placa (agar triptosa). Incubar a 37 ºC por 24 horas y luego observar. observar.

IV. Resultados: -

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V.

Con resp respecto ecto a la acc acción ión del calor lor, en la titu titula lac ción ión no se obtu obtuv vo formación de calvas en ninguno de los tiempos (t15, t30, t45, t60). Con resp respect ecto o a la acción acción de de la radiac radiación ión UV UV sólo sólo se obtuv obtuvo o la formac formación ión de calvas en la primera placa (una calva tubo t5), en los otros tubos (t10, t15, t20), no se obtuvo la formación de calvas. Con res respect pecto o a la acció cción n del for formald aldehíd ehído, o, se obtu obtuv vo los los sgte sgtes s. resultados: 15 min. = 10 calvas 30 min. = 1 calva 45 min. = No calvas 60 min. = No calvas Con Con resp respec ecto to a la acció acción n del del cloro lorofo form rmo, o, al titu titula larr la susp suspen ensi sión ón se obtuv obtuvo o form formac ació ión n de calva calvas s en la plac placa a de titul titulac ació ión n (no (no se pudo pudo determinar el número exacto de calvas). Con resp respect ecto o a la acción acción del del éter éter,, de la titula titulació ción n de la suspe suspensi nsión ón no se se obtuvo formación de calvas en la placa de titulación.

Conclusiones: •

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La acción del calor afectó considerablemente a la partícula viral, lo que demuestra la gran susceptibilidad de las partículas virales a la desnaturalización e inactivación por calor. calor. Los Los rayos rayos UV tamb tambié ién n afec afecta tan n cons consid ider erab able leme ment nte e a los los fago fagos, s, mientras más exposición, más afectado se ve el fago, esto se puede explicar porque los rayos UV alteran el ácido nucleico de la partícula viral, volviéndola no infectiva. El formaldehído tubo una efecto parcial en la partícula viral, por lo visto en los resultados, a más exposición, más afectado se verá la partícula viral, esto se puede deber a que bloquea la infectividad del fago ya que reacciona directamente con el ácido nucleico. La acción del cloroformo no tuvo ningún efecto en las partículas virales en este caso, ya que al realizar la titulación se obtuvieron un gran número de calvas. El éter tuvo supuestamente una acción letal en nuestras partículas





afecto a la partícula viral, lo que nos hace suponer que un hubo un error de manipulación.

Referencias:

VI. •

JAWE JAWETZ TZ E., E., J. MELN MELNIC ICK, K, E. SDEL SDELBE BERG RG (199 (1996) 6) Micr Microb obio iolo logí gía a Médica. 15º edic. Edit. El Manual Moderno. México D.F. D.F.

Anexos:







ALGUNAS VISTAS DE LOS RESULTADOS EN PLACA DE LOS EFECTOS DE LOS EGENTES FISICOS Y QUIMICOS

Acción de agentes físicos y químicos sobre la partícula viral

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