INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC Departamento Departamento de Ingeniería química y bioquímica
ING DE BIORREACTORES
INSTRUMENTACION Y CONTROL DEL BIORREACTOR. SENSORES QUMICOS
PROFESOR: Salvador Aguilar
ALUMNOS: Agredano de la Garza Cindy Sacnithe Bravo Garnica Iris Paloma Coronado Partida Leonardo Daniel Sojo Aguiar Yocasta Irais
Fecha: 08 de Noviembre 2011. Las proteínas del
INSTRUMENTACION Y CONTROL DEL BIORREACTOR. SENSORES QUMICOS
El diseño de biorreactores es una tarea de ingeniería bastante compleja. Los microorganismos o células son capaces de realizar su función deseada con gran eficiencia bajo condiciones óptimas. Las condiciones ambientales de un biorreactor tales como flujo de gases (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono, etc.), temperatura, pH, oxígeno disuelto y velocidad de agitación o circulación, deben ser cuidadosamente monitoreadas y controladas. La mayoría de los fabricantes industriales de biorreactores usan recipientes, sensores, controladores y un sistema de control interconectados para su funcionamiento en el sistema de biorreacción. Sensor químico
Es un dispositivo que está formado por un sistema de reconocimiento y un transductor. El sistema de reconocimiento también se conoce con el nombre de receptor. Este receptor puede estar formado por membranas sensibles a gases o también puede estar formado por microorganismo, enzimas inmovilizadas. Cuando los sistemas de reconocimiento tienen características biológicas se les llama biosensores, sino se les llama simplemente sensores químicos.
DISEÑO E INSTRUMENTACIÓN DE BIORREACTORES
La instrumentación y control de un biorreactor requiere de sensores que midan las variables de un proceso fermentativo, y sistemas que ajusten el equipo a un punto óptimo de operación. Idealmente, los sensores deben de estar en línea, para medir las propiedades físicas del cultivo, estos sensores deben ser esterilizables para asegurar la asepsia del proceso. Sin embargo, no todas las mediciones pueden ser hechas en línea, algunas medidas fuera de línea, requieren de tomar muestras y analizarlas, lo cual consume tiempo y hace lenta la respuesta de control (biomasa, sustrato, metabolitos, etc.). Los sensores de propiedades físicas pueden ser monitoreados continuamente, y son la temperatura, presión, poder de agitación, velocidad de agitación, viscosidad del medio, flujo y concentración de gases y fluidos, espuma, volumen y masa. Los utilizados en el prototipo son de agitación, temperatura y nivel de líquido.
Para la medición de las propiedades químicas se utilizan electrodos esterilizables al vapor, de pH, redox, oxígeno disuelto y CO2. El más utilizado es el de pH, aunque no tiene utilidad para todas las fermentaciones, sólo en las de tipo continuo donde se necesita mantener un valor estable de acidez o basicidad. Para ello, contamos con sensores de pH y oxígeno disuelto. Cuadro 1. Instrumentos de medición VARIABLE pH O2 disuelto CO2 disuelto O2 fase gaseosa CO2 fase gaseosa Análisis de gases
EQUIPO Electrodo de referencia de vidrio combinado. Electrodo polarográfico. Electrodo. Análisis paramagnético. Análisis infrarrojo. Espectroscopia de masas.
Los biorreactores están equipados con distintos instrumentos. Estos se utilizan para facilitar el registro y análisis de variables de operación y de parámetros específicos que sirven para mantener, dentro de ciertos intervalos de valores, las condiciones de operación de la biorreacción con fines de maximizar la productividad y garantizar el éxito de la biorreacción. La instrumentación ha sido definida como “una ventana al proceso” y su objetivo es mantener al mínimo la diferencia entre el valor medido y un valor deseado. El control de un parámetro particular se lleva a cabo a través de un sistema que consta de un sensor (o electrodo), un medidor y un controlador: el sensor es un dispositivo que transforma una magnitud de una propiedad que se quiere medir, en otra que facilita su medida. El medidor recibe la medida del valor de la propiedad que emite el sensor. El controlador compara dicha medida con un valor fijo. Del resultado de la comparación, el controlador toma una decisión enviando una señal (generalmente eléctrica) a algún dispositivo que ajustará el valor medido de la propiedad hasta el valor predeterminado o de control (“set point”). La señal implica usualmente la modificación del estado de una válvula, el encendido o apagado de una bomba dosificadora, la modificación de la velocidad de giro de un motor de algún equipo, etc. Si, por ejemplo, se hace necesario el uso de una determinada fuerza para modificar el estado de una válvula, se requerirá de un “transductor” y de un “actuador”. El transductor es un dispositivo que convierte un tipo de energía en otro tipo de energía, mientras que los actuadores son dispositivos capaces de generar una fuerza a partir de energía eléctrica, gaseosa o líquida. Existen tres tipos de actuadores: 1. Hidráulicos 2. Neumáticos 3. Eléctricos Los actuadores eléctricos son usados para manejar aparatos electrónicos o mecatrónicos. Los hidráulicos se usan cuando lo que se necesita es potencia, mientras que los neumáticos son simples posicionamientos. Los sensores pueden estar conectados directamente al biorreactor (en contacto directo con la masa líquida o sólida de fermentación), en cuyo caso se dice que están “en línea”, si no están conectados directamente al biorreactor entonces se dice que están “fuera de línea”.
Debido a la naturaleza de la biorreacción, se requiere que la gran mayoría de los “sensores en línea” reúnan, entre otros, los siguientes requisitos: i) que sean capaces de resistir el proceso térmico al que se somete el caldo de cultivo en el biorreactor (esterilización con calor húmedo); ii) que sean capaces de resistir las presiones de operación; iii) que sean de fácil calibración; iv) que muestren valores estables; v) que su mantenimiento sea fácil y económico y vi) que tengan una adecuada vida media útil. Estos sensores (en línea), se utilizan, básicamente, para medir propiedades físicas o variables de operación tales como temperatura, presión, intensidad de agitación o velocidad de giro de los impulsores, velocidades de flujo de líquidos y gases, y para medir ciertas propiedades químicas como pH, concentración de oxígeno disuelto y gaseoso, concentración de dióxido de carbono disuelto y en el gas, concentración de azúcares disueltos, concentración de algunos productos celulares, etc. Para conocer el estado de una variable de operación o de un parámetro específico con sensores “fuera de línea”, se deberá tomar asépticamente una muestra para que en ella se mida la propiedad. Por los tiempos y necesidades de los Bioprocesos, es fácil concluir que los sensores en línea son mucho más adecuados para controlar el valor de una propiedad en una biorreacción.
MEDICIÓN Y CONTROL DE PH
El pH es una medida de la actividad de los iones hidronio (H +) en una disolución acuosa y está definida por la siguiente ecuación: pH = - log10 [H+] Para la medición y control del valor de pH, se utiliza un electrodo de vidrio colocado, en forma aséptica, en el biorreactor y que está directamente en contacto con el caldo de fermentación. El electrodo, normalmente esterilizable, se conecta directamente a un medidor-controlador de pH, con el cual se puede establecer el valor de control (Set Point) o ajustar el valor de la lectura que proporcione el electrodo de medición.
Un electrodo de pH consiste de dos celdas: un elemento sensor del pH y un elemento de referencia. El elemento sensor consiste de un alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer (usualmente de pH 7), en un tubo sellado que termina con un fino bulbo de vidrio sensible al pH. El elemento de referencia consiste de otro alambre de plata cubierto con cloruro de plata inmerso en una solución buffer saturada de cloruro de potasio y un diafragma poroso que comunica con la sustancia a la que se medirá el pH. Dicho electrodo comúnmente se construye como una sola unidad, con el sensor de referencia construido en una parte anular del elemento sensor, tal como puede apreciarse en la figura 1.
El método se fundamenta en la existencia de una diferencia de potencial entre las dos caras de la membrana de vidrio, expuestas a disoluciones acuosas que difieren en su valor de pH. A temperatura constante, la magnitud de esta diferencia de potencial es directamente proporcional a la diferencia de pH entre dichas disoluciones.
Debido a que el electrodo de vidrio y los electrodos de referencia comerciales tienen un comportamiento imperfecto, es preciso calibrar el dispositivo de determinación del pH con dos disoluciones patrón antes de usarlos en los biorreactores. Para ello, se sumergen los electrodos sucesivamente en dos disoluciones patrón con valor conocido denominados P1 y P2, a la misma temperatura que la disolución problema y seleccionadas de forma que el valor de pH de la disolución problema esté comprendida entre los valores de pH P1 y P2. Como el valor del pH del caldo de fermentación puede cambiar después de ser esterilizado, por causas del drástico tratamiento térmico, se recomienda recalibrar el electrodo. Para esto, se hace necesario tomar asépticamente una muestra del caldo de fermentación y medirle, con un medidor y un electrodo “fuera de línea”, su valor de pH. En caso de que el valor que muestre el electrodo “en línea” sea distinto del que marca el “fuera de línea”, se ajustará el valor de aquél con el equipo de medición empleado en el biorreactor. Una vez realizado todo lo anterior, se está en posibilidades de medir y controlar el valor del pH de una biorreacción en un biorreactor. Si el valor medido del pH es diferente al valor del Set Point, entonces el controlador emitirá una señal eléctrica con la cual se podrá activar alguna bomba para adicionar “ácido” o “álcali”, dependiendo de la diferencia entre el valor medido y el Set Point.
MEDICIÓN Y CONTROL DEL OXIGENO DISUELTO
El oxígeno disuelto es muy importante para el desarrollo de una biorreacción aeróbica, por lo que su medición y control es un parámetro importante para el desarrollo y producción económicamente rentable de bioproductos. El oxígeno disuelto generalmente proviene del aire que es introducido en el fondo del caldo de biorreacción. Una parte del oxígeno contenido en el aire se disuelve en el caldo y otra parte sale tal cual con el aire agotado. El oxígeno disuelto es el que utilizarán los microorganismos para vivir y para realizar el proceso de transformación de la materia prima a producto. Por esta razón es importante distinguir entre “oxígeno disuelto” y “oxígeno en el gas”.
La medición del oxígeno disuelto se realiza de forma “amperométrica”, por la reducción del oxígeno en la superficie del cátodo y la formación de cloruro de plata en el ánodo. Una solución electrolítica une al ánodo estableciéndose un voltaje de polarización entre ellos. Cuando un fluido que contiene oxígeno disuelto se pone en contacto con el electrodo, el oxígeno difunde a través de una membrana semipermeable estableciéndose la siguiente reacción:
Cátodo:
O2 + 2H2O + 4e-
Ánodo:
4A + 4Cl-
4OH4A Cl + 4e-
El resultado es una corriente eléctrica que es proporcional a la actividad del oxígeno disuelto o presión parcial de oxígeno disuelto. En el comercio especializado existen distintos tipos de electrodos y de medidores controladores de oxígeno disuelto que los usuarios podrán elegir. El control del oxígeno disuelto en una biorreacción ocurre a través de la modificación del flujo de gas (aire u oxígeno puro) o de la intensidad de agitación del caldo de cultivo.
MEDIDORES DE MAGNITUDES FISICOQUIMICAS
PH
Corrientemente la medición de PH en los fermentadores se realiza por medio de sondas ingold (Ch-8902Urdorf -Zurich) se trata de electrodos combinados (medición-referencia) de vidrio, que pueden soportar presión y esterilización. Algunos de ellos están montados en un dispositivo que lleva una válvula de la bola y una cámara de esterilización. Así es posible retirar la sonda aislando totalmente el fermentador. Esto permite, en caso de fallas, reemplazar la sonda sin comprender la asepsia de la fermentación.
POTENCIAL RED-OX
Los procesos microbianos se acompañan siempre de reacciones de oxidoreduccion. Es mediante este tipo de reacciones que los microorganismos obtienen la energía química que necesitan para realizar la síntesis de sus constituyentes y para reproducirse. Es particularmente interesante en el caso de los procesos microbianos no aerobios, medir el potencial red-ox del medio. Esta medida se hace aplicando la ley de Nernst con la ayuda de sondas presurizables y esterilizables, de metales nobles, tales como el platino. La señal de salida en mili volts (=500 mV ó±1,000mV) da una información global interesante, pero difícil de aprovechar en la regulación por ejemplo dada la complejidad del medio y de las numerosas reacciones producidas por el microbio. Complementariamente el potencial RED-OX del medio, la determinación por fluorometria, del potencial RED-OX intracelular proporciona interesante enseñanza sobre la actividad celular misma. En efecto esa actividad está ligada al estado de óxido reducción de las enzimas respiratorias. La enzima reducida NADH fluoresce, emitiendo una luz de longitud de onda 660 nm cuando es irradiada a 340nm.La forma oxidada no produce tal fenómeno (Harrison y Hanes 1972). Raramente se hace esta medición dado el precio del aparato que se necesita. Además las burbujas de gas y la partícula en suspensión en el medio de fermentación perturban estos fenómenos.
OXÍGENO DISUELTO
Sensores oxigeno disuelto
Este es un parámetro muy importante en todos los procesos microbiológicos aerobios. Permite evaluar las capacidades de transferencia de oxigeno del biorreactor y permite regular de continuo la cantidad de oxigeno adecuada a las necesidades del cultivo, modificando el gasto del gas de oxigenación. Lee y tsao (1979) han descrito detalladamente las bases y las formas de funcionamiento asi como las características de los diferentes electrodos de oxígeno disuelto. Se dispone de 2 tipos de electrodos, ambos provistos de membrana permeable al oxigeno: Los electrodos polarograficos (amperometricos) (ingold) constituidos por un ánodo de platino, en tanto que el cátodo esta hecho de un anillo de plata/oxido de plata. El electrolito es un gel de metilcelulosa que contiene KCl. Los dos electrodos están alimentados por una tensión constante continua. La reducción del oxigeno en el cátodo modifica la intensidad de la corriente del circuito así constituido, proporcionalmente a la cantidad presente. Este tipo de electrodo se puede esterilizar en el fermentador o un autoclave. La duración de su vida es siempre relativamente baja, siendo posible cambiar la cabeza, independiente del resto del electrodo. Los electrodos galvánicos (potenciometricos) (biolafitte-78300 poissy) no necesitan ser puestos bajo tensión ya que la reducción del oxigeno se efectúa en el cátodo. Es donde están los sistemas autoalimentados. El cátodo está constituido por un metal noble como oro, platino o plata. El ánodo es de zinc, plomo o cadmio. A diferencia de las sondas polarograficas, el electrolito en el caso de las sondas galvánicas no participa en la reacción. Por el contrario, el ánodo es oxidado poco a poco. La reducción del oxígeno en el cátodo provoca, en este caso, una modificación de la tensión entre los dos electrodos. Cualquiera que sea el tipo de sonda, la señal es amplificada antes de ser utilizada. El sensor de oxígeno disuelto galvánico utiliza una membrana rugosa del Teflon de 5 milipulgadas para resistir abrasiones y los rasgones mecánicos. La membrana sirve como barrera permitir que el oxígeno molecular difunda en la célula de la reacción donde se reduce, produciendo una pequeña corriente que sea proporcional a la concentración del oxígeno.
EL ANÁLISIS DEL GAS
El análisis del gas que sale del biorreactor asociado a la determinación de su gasto y a la del oxígeno disuelto, permite deducir datos muy útiles sobre la fisiología del cultivo, tales como el cociente respiratorio (CO 2 rechazado/O2 consumido), o aun sobre las capacidades de transferencia de oxígeno en el biorreactor mediante la aplicación del balance gaseoso. La compañía Schlumberger(91302 massy) ha propuesto analizadores de gas bien adaptados al caso de los biorreactores. La determinación de CO 2 se basa en la propiedad de este gas que se absorbe las radiaciones infrarrojas. En cuanto al oxigeno para dosificarlo se utilizan propiedades paramagnéticas. Se puede utilizar una sonda de oxigeno instalada en la canalización de salida del gas y medir la presión parcial del oxigeno. Aun no se dispone de una sonda para medir el CO 2 gaseoso, pero su desarrollo está casi terminado.
LOS SUBSTRATOS Y LOS METABOLITOS
Para seguir con precisión el desarrollo de una fermentación es necesario realizar mayor número de determinaciones. Así es interesante conocer cómo evoluciona la concentración del substrato. Con frecuencia se tiene el recurso de efectuar una determinación química sobre una muestra que se toma con cierta periodicidad. Este método no es del todo conveniente, tiene el riesgo de provocar contaminaciones al tomar las muestras. Se ha pensado en la forma de reducir al mínimo sus desventajas. Por ejemplo se instala una válvula de membrana y una protección de vapor sobre la canalización. Cuando esto es posible se prefiere efectuar determinaciones automáticamente y de continuo. Se ha llegado también a emplear auto analizadores para dosificar de continuo la glucosa, por ejemplo en un medio de fermentación. Generalmente el método de dosificación que se efectúa usado una reacción colorida; la respuesta no es instantánea, hay que esperar cierto tiempo necesario para que la reacción se efectué, lo que origina un desfasamiento. Esto no es grave, si ese tiempo es corto, dada la relativa lentitud de los procesos microbianos. Si se cuenta con los resultados de las determinaciones se puede intervenir en el proceso. Se pueden acoplar a las fermentaciones técnicas precisas, de gran resolución, tales como la cromatografía en fase gaseosa o liquida aun la espectrometría de masas. Al generalizarse el uso de sus reguladores se permitirá en los próximos años reducir la dilatación en la respuesta y tener, en tiempo real, en forma precisa los diferentes parámetros característicos del sistema. El principio de estos electrodos se basa con frecuencia en la falta de una reacción electroquímica específica del
compuesto cuya dosificación se busca. La selectividad se puede obtener de modo físico con la ayuda de una membrana semipermeable o de forma química gracias a los reactivos que se utilizan.
CONTROL DE pH (potencial de hidrógeno) El sistema controla el pH del medio de cultivo; que es generada por los productos de desecho y el metabolismo propio del cultivo celular o microorganismos. Un sistema de control de acidez consta de: Dos subsistemas mecánicos servo controlados
Sistema Dispensador de Ácido: que consta de
Filtro microporo en línea Manguera flexible resistente al ácido Bomba peristáltica Dispensador aséptico de ácido (HCl)
Sistema Dispensador de Álcali: que consta de
Dispensador aséptico de álcali (NaOH); Filtro microporo en línea Manguera flexible resistente al álcali Bomba peristáltica
Las mangueras flexibles se deben conectar al sistema (birreactor) mediante un tubo de adición de reactivo para cada una de ellas.
Un sistema de control formado por:
Controlador de pH: ordena y regula la acción del motor que controla a las bombas peristálticas que suministran el ácido y el álcali.
Un sistema de medición: formado por:
Sensor de pH: sonda o probeta electroquímica que mide la acidez y “dice” al controlador de pH, la situación del medio. pH Óptimo: toda célula y microorganismo poseen un rango de acidez (pH) dentro del cual, es posible su crecimiento con normalidad; dentro de ese rango, existe un pH óptimo en el cual el crecimiento es máximo y muy bien definido.
SISTEMA DE DIFUSIÓN DE OXÍGENO DISUELTO
Debe optimizar al máximo la transferencia de oxígeno disuelto al medio líquido. El sistema consta de dos partes mecánicas: boquilla y difusor de aire; una parte de medición: sensor de oxígeno disuelto y una de control: controlador de oxígeno disuelto. Difusor de aire: los cultivos aeróbicos requieren que la corriente de aire estéril se difunda en la forma de miles de pequeñas burbujas, desde el difusor de aire, hacia el volumen del líquido; esta acción se realiza mediante un plato o domo cilíndrico de acero inoxidable finamente perforado. Alternativamente y si el sistema es pequeño o mediano en escala, se puede utilizar un difusor de material cerámico poroso el cual, tiene la ventaja de que, provee una cama más fina de burbujas (de menor diámetro) y mayor área de transferencia (volumen de burbujas). Control y regulación del flujo de aire: las membranas que filtran el aire tienen un punto de burbuja y un flujo máximo por encima del cual, se rompen; por eso, se debe regular el flujo de aire y controlar la presión en la línea de aire. La forma más económica de hacerlo es manualmente, con un manómetro para presión. Existe
también la versión digital, más costosa, pero que, controla de forma automática el flujo de aire y la presión, según se escoja Control y medición del oxígeno disuelto (OD): además de regular el flujo y la presión del aire en la línea o tubería, se debe controlar el valor y la concentración del oxígeno disuelto (OD) dentro del medio líquido; variable que puede medirse en dos formas (parámetros) a) Oxígeno disuelto (OD): es la concentración de oxígeno disuelto requerido para la reducción química de un equivalente en iones sulfito (de sodio) a la cantidad de materia orgánica presente en el medio líquido que se debe oxidar. b) Demanda bioquímica oxígeno (DBO): es la taza de oxidación biológica o demanda bioquímica de oxígeno disuelto requerida por el microorganismo o célula en cultivo para oxidar la materia orgánica presente en el medio líquido. Una probeta o electrodo OD es un sensor que mide la concentración de oxígeno disuelto en el medio líquido. Similarmente, una probeta o electrodo BOD mide la concentración de oxígeno disuelto en el medio líquido en equilibrio con el gas. ) En ambos casos, el material de su construcción debe ser acero inoxidable y su especificación es por la longitud de inmersión (H) y diámetro (D) de la probeta.
BIBLIOGRAFIA
SCRIBAN, Bioingeniería, cap 5. pag 232,237
http://www.medigraphic.com/pdfs/inge/ib-2003/ib031h.pdf
http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Manual%20de %20pr%C3%A1cticas%20del%20laboratorio%20de%20biorreactores2.pdf http://es.scribd.com/doc/31787823/Biorreactor-de-tanque-agitado-Morgan-GVasquez-2010# http://www.directindustry.es/prod/quantum/aparatos-de-medicion-de-oxigenodisuelto-do-14006-26498.html http://es.scribd.com/doc/56374285/118/Sensores-quimicos
