5 Metode Marka Molekuler
Metode teknik marka molekular dilakukan dengan cara mengidentifikasi tanaman atas dasar keberadaan sekuens DNA spesifik atau perbedaan kombinasi sekuens antar individu tanaman. Identi Identifik fikasi asi ini tidak tidak selalu selalu memerl memerluka ukan n DNA sequencin sequencing, g, tetapi tetapi juga juga dapat dapat menggun menggunakan akan hibridisasi DNA atau P!. Dari sekian ban"ak metode "ang ada, terdapat beberapa metode "ang popular digunakan, "aitu !#$P, !APD, A#$P, A#$P, %%!, dan %NP. %NP.
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
Metode !#$P diestimasi berdasarkan perbedaan ukuran fragmen DNA. %usunan nukleotida spesifik pada sekuens DNA dipotong dengan en&im retriksi endonuclease berdasarkan ukurann"a. %elanjutn"a hasil pemotongan en&im retriksi endonuclease tersebut dicampur dengan DNA probes dan dilakukan analisis southern bolt. #ragmen DNA "ang komplementer dengan probes akan terhibridisasi dan muncul pada la"er. Polimorphisme dideteksi berdasarkan perbedaan ukuran fragmen "ang muncul. Polimophisme "ang dihasilkan dapat disebabkan karena adan"a mutasi, insersi, delesi, dll. Metode !#$P tidak menggunakan P! dalam pengerjaann"a. 'elebihan metode ini adalah konsistensi "ang tinggi, informasi sifat pe(arisan ko)dominan, dapat diulang tanpa ad a perubahan, tidak memerlukan informasi sekuen, dan relatif mudah diidentifikasi karena perbedaan "ang besar antar fragmen. Akan tetapi metode ini juga mempun"ai beberapa kekurangan "aitu pada beberapa spesies tingkat polimorfisme sangat rendah, men"ita ban"ak tenaga dan (aktu, kuantitas kuan titas dan kualitas DNA "ang diperlukan sangat tinggi, prosedur hibridisasin"a rumit sehingga men"ulitkan otomatisasi, dan memerlukan pustaka probe untuk spesies)spesies tanaman "ang belum pernah dieksplorasi sebelumn"a. Metode !#$P mempun"ai ban"ak kegunaan dalam bidang pemuliaan tanaman modern. Aplikasi metode !#$P antara lain digunakan untuk seleksi karakter agronomi, uji kualitas benih, analisis segregasi pada keturunan, dan evaluasi ev aluasi diversitas genetik untuk koleksi plasma nutfah. !#$P juga digunakan sebagai alat untuk mengetahui variabilitas genetik pada tanaman pangan.
2. RAP (Random Ampli!ied Polymorphic "A).
Metode !APD merupakan metode "ang menggunakan oglionukleotida tunggal pendek *primer+, sepanjang -) basa, untuk membentuk fragmen)fragmen DNA. Metode !APD memanfaatkan P! untuk mengamplifikasi sekuen DNA "ang komplementer terhadap primer. %ekuen DNA "ang komplementer dengan primer akan terhibridisasi secara acak *random+, selanjutn"a dilakukan perban"akan *amplified+ terhadap sekuen)sekuen DNA komplementer tersebut. /ahap selanjutn"a "aitu melakukan elektroforesis pada agarose atau pol"acrilamide gel untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurann"a. 'emudian dilakukan pe(arnaan dengan ethidium bromide dan fragmen)fragmen DNA akan terlihat jika disinari dengan sinar 01. Metode !APD dapat menghasilkan beragam pita pada individu dengan primer tunggal. 1ariasi band "ang terlihat umumn"a disebut random amplified pol"morphic DNA *!APD+ bands. Polimorphisme akan terlihat dan selanjutn"a bisa digunakan sebagai marka genetik. Pemanfaatan metode !APD antara lain untuk deteksi polimophisme sekuens DNA, pemetaan genetik berbagai populasi, keragaman genetik, dan identifikasi varietas serta analisis asal)usul organisme *filogenetik+. Metode !APD mempun"ai keunggulan dan juga kekurangan. 'eunggulan metode !APD "aitu (aktu "ang dibutuhkan singkat, mudah dilaksanakan, lebih murah, dan primer "ang diperlukan sudah ban"ak dikomersilkan sehingga mudah diperoleh. Metode ini dapat digunakan untuk menganalisis ban"ak organisme, karena primer "ang digunakan bersifat universal "ang berarti primer dapat digunakan tanpa perlu mengetahui informasi sekuen DNA terlebih dahulu. 'ekurangan metode !APD "aitu marka *primer+ "ang terlalu umum, sehingga informasi "ang diperoleh kurang akurat. Marka !APD bersifat dominan, dalam arti lain band hasil !APD tidak menunjukkan perbedaan antara keadaan heterosigos dan homosigos. %elain itu terdapat kesulitan untuk memperoleh pola pita "ang identik (alaupun digunakan primer dan materi *DNA+ "ang sama. Masalah lain "ang ditemukan adalah pola pita !APD muncul pada DNA keturunan tetapi tidak muncul pada DNA tetua, dimana fenomena ini biasa disebut heteroduple2 formation. 3al ini mungkin disebabkan karena reaksi !APD dipengaruhi oleh persaingan antar primer sites dalam genom.
#. AFLP (Ampli!ied Fragment Length Polymorphism)
Metode A#$P merupakan penggabungan antara teknik !#$P dan !APD. DNA genomik dipotong dengan e&im restriksi seperti pada !#$P, akan tetapi pada A#$P digunakan dua en&im restriksi "ang berbeda. /ujuann"a adalah memperoleh fragmen dalam jumlah besar. 4eberapa fragmen terseleksi diamplifikasi dengan P! menggunakan primer universal seperti pada !APD, (alaupun sebenarn"a primer "ang digunakan tidak benar)benar dipilih secara acak. Primer "ang digunakan adalah primer "ang komplementer dengan 5adapters6. Adapters merupakan oligonukleotida spesifik "ang komplementer dengan restriction sites sepanjang 7) 8-bp dan menempel pada fragmen DNA "ang dipotong. Polimorphisme kemudian dideteksi dari perbedaan panjang fragmen hasil amplifikasi P! pada pol"acrilamide gel electrophoresis *PA9:+ atau capillar" electrophoresis "ang divisualisasi dengan menggunakan otoradiografi atau
pe(arnaan perak. Pita polimorphik lalu diidentifikasi seperti pada analisis !APD. Pita polimorphik ini bahkan bisa dipotong dari gel dan disekuensi, "ang memungkinkan kita untuk merakit primer P! spesifik. Metode A#$P biasan"a digunakan untuk meneliti variasi genetik diantara individu dalam suatu spesies, mengevaluasi variasi genetik untuk koleksi plasma nutfah d an skrining biodiversitas. Metode A#$P juga sering digunakan untuk membuat peta genetik dan percobaan untuk menemukan gen)gen "ang bertanggung ja(ab terhadap karakter tertentu. 'elebihan metode ini "aitu tidak memerlukan informasi sekuen dari geno m, hasil amplifikasin"a stabil, tingkat pengulangan dan variabilitasn"a sangat tinggi, dan dapat mendeteksi variasi genetik diantara spesies, varietas, atau kultivar "ang berkerabat deka t. 'ekurangan metode ini "aitu pengerjaan "ang rumit dan intensif dibandingkan metode lainn"a, pengadaan alat dan bahan sangat mahal, serta dibutuhkann"a kits "ang berbeda)beda "ang dapat beradaptasi dengan ukuran genom selama analisis.
$. %%R (%imple %e&uence Repeat)
Metode %imple %equence !epeat *%%!+ mempun"ai nama lain metode microsatellite atau %imple /andem !epeat *%/!+. Metode %%! didasarkan atas pengulangan pasangan sekuen mono), di), tri), tetra), penta), dan he2a)nukleotida seperti */9+n atau *AA/+n. Pasangan sekuen ini tersebar mele(ati genom sehingga menghasilkan polimorphisme "ang tinggi. Dalam pengerjaann"a, metode %%! memanfaatkan P! untuk mengamplifikasi sekuen DNA secara individu menggunakan primer spesifik. %ekuen DNA "ang teramplifikasi adalah sekuen DNA "ang komplementer dengan primer "ang digunakan. %elanjutn"a dilakukan elektroforesis pada agarose gel atau pol"acrilamide gel untuk memisahkan fragmen DNA "ang terbentuk berdasarkan panjang ukuran basa. 'emudian dilakukan pe(arnaan pada gel deng an ethidium bromide. /ahap terakhir "aitu visualisasi dengan meletakkan gel diba(ah sinar 01 sehingga fragmen)fragmen DNA akan terlihat. Polimorphisme dideteksi berdasarkan perbedaan ukuran fragmen DNA akibat perbedaan panjang pengulangan pasangan sekuen Perbedaan metode %%! dengan metode !APD terletak pada primer "ang digunakan. Primer %%! merupakan primer tunggal spesifik "ang mengamplifikasi han"a pada satu site tertentu, berbeda dengan !APD "ang menggunakan primer universal, "ang dapat mengamplifikasi pada beberapa site sekaligus. Primer %%! juga merupakan marka ko)dominan "ang dapat membedakan heterosigos dan homosigos sedangkan primer !APD merupakan marka dominan. Perbedaan lainn"a terletak pada pita "ang dihasilkan. Metode %%! biasan"a han"a menghasilkan satu atau dua pita pada tiap individu sedangkan metode !APD dapat menghasilkan beragam pita pada tiap individu. Metode %%! merupakan salah satu alat molekular "ang sering digunakan untuk penelitian diversitas genetik karena keakuratan informasi "ang tinggi dan sangat polimorfik bahkan untuk spesies atau galur "ang berkerabat dekat. 9enetik populasi dan analisis hubungan kekerabatan bisa dilakukan dengan metode %%!. 'elebihan metode ini "aitu primer "ang digunakan untuk satu spesies tertentu dapat digunakan untuk b erbagai macam tanaman dalam satu spesies, kuantitas DNA "ang digunakan sangat kecil, metoden"a relatif sederhana dan dapat dilakukan secara otomatis, dan pasangan primer %%! tersedia dipasaran dalam jumlah "ang besar. %edangkan kekurangan metode ini "aitu kesulitan kloning dan sequencing daerah flanking %%!, bia"a "ang cukup tinggi untuk merancang primer baru "ang spesifik.
5. %"P (%ingle "ucleotide Polymorphism)
%NP umumn"a merupakan variasi DNA "ang berasal dari perubahan satu atau dua basa pada sekuen DNA . %NP juga diartikan sebagai variasi sekuen DNA "ang terjadi ketika sebuah nukleotida tunggal dari sekuen tersebut berbeda dari sekuen DNA pada umumn"a. ;ika %NP terjadi pada sebuah gen, %NP dapat mengganggu fungsi gen, "ang menghasilkan perbedaan alel pada gen tersebut. %NP dapat digunakan secara efektif sebagai penanda karena perbedaan terjadi pada basa tunggal. /idak seperti metode %%!, %NP merupakan bagian sekuen itu sendiri bukan ukuran atau panjang sekuen. Pada genom manusia, %NP umumn"a terjadi setiap -- hingga 8--bp. Prinsip dasar dalam pengerjaan %NP beserta teknik "ang digunakan meliputi< ) A%=3 *Allele)spesific oligonukleotide h"bridi&ation+, teknik terkait< allele)specific P!, 7> nuclease assa", DNA chips, bead based techniques. ) :longasi rantai DNA template)dependent dengan DNA polimerase, teknik terkait< primer e2tension, p"rosequencing. ) Double)strand)dependent ligation, teknik terkait< =$A *oligonucleotide ligation assa"+ "ang digabungkan dengan DNA chips atau bead based techniques. ) Deteksi perbedaan *mismatch detection+, teknik terkait< DA%3 *d"namic allele)specific h"bridi&ation+, D3$P *denaturing high)performance liquid chromatograph"+. Deteksi markah %NP bersifat ko)dominan, berdasarkan pada amplifikasi primer "ang berbasis pada informasi sekuen untuk gen spesifik. 'eunggulan teknik %NP adalah lebih mudah diaplikasikan dibandingkan dengan teknik %%! dan A#$P serta lebih bermanfaat ketika posisi %NP pada lokus sangat berdekatan. 'elemahan d ari teknik %NP adalah memerlukan informasi sekuen untuk suatu gen "ang menjadi target analisis dan untuk pengadaan alat dan bahan memerlukan bia"a "ang sangat tinggi.
AF'AR P%'AA
4ashalkhanov %., Pande" M., !ajora =P. --?. A simple method for estimating genetic diversit" in large populations from finite sample si&es. 4M genetics. -<@ 4iodiversit", three parts for definition< genetics, species, and ecos"stems. http
