Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
EFEK MUTAGEN EKSTRAK ETANOL BUAH CABE JAWA Piper retrofractum Vahl. ) ) ( Piper Ani Isnawati, Sri Endreswari, Pudjiastuti, Murhandini* Puslitbang Farmasi dan Obat Tradisional, Balitbangkes * Badan Pengawas Obat dan Makanan
Abstract Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.) fruit has been used as jamu. On the other hand, it was reported that it could cause abortion in rats and contraction isolated organ test. Referring to this side effect, and for long lasting administration, as safety evaluation must be completed to the possibility of mutagenic effect. The research, had been done using 50% ethanol extract of Cabe Jawa with Ames method base on back mutagen system, using 5 strain of mutagen experimented bacteria i.e.: Salmonella thypi TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 and Escherichia coli WP2 uvrA with and without S-9 metabolic activator. Negative and positive controls to detect appear of “point of mutation” had been used. The result showed that there was no mutagenic effect of 50% ethanol extract of Cabe Jawa. Key Words: Cabe Jawa, Mutagenic effect, ethanol extract.
PENDAHULUAN Mutasi adalah suatu perubahan yang terjadi pada gen atau kromosom. Mutasi ini dapat menyebabkan kelainan–kelainan yang beragam seperti: kerusakan sel secara serius yang dapat menyebabkan kelainan fetus, teratogenik bahkan kanker. Selain dapat terjadi secara spontan, mutasi juga dapat diinduksi oleh berbagai faktor seperti: radiasi, virus, dan senyawa kimia tertentu. Faktorfaktor yang dapat menginduksi mutasi gen/ kromosom disebut mutagen. Obat tradisional yang telah digunakan sejak bertahun-tahun dan secara turun-temurun, selain mempunyai khasiat yang diharapkan karena adanya kandungan senyawa kimia yang bermacam-macam, juga di sisi lain dapat menyebabk menyebabkan an efek toksik tergantung dari sifat toksik intrinsik senyawa yang dikandungnya. Sehingga untuk evaluasi keamanannya perlu dilakukan serangkaian uji toksisitas untuk mendeteksi adanya efek yang merugikan termasuk uji mutagenesitas guna mengetahui kemungkinan adanya senyawa yang bersifat mutagen (1,2) Informasi adanya efek mutagen dari obat tradisional sangat diperlukan, khususnya untuk obat tradisional yang mengandung senyawa yang analog dengan senyawa mutagen, banyak digunakan sebagai komponen jamu dan digunakan dalam jangka waktu yang lama, digunakan untuk wanita hamil, dan adanya informasi yang berkaitan dengan efek teratogenik seperti dapat menyebabkan aborsi pada hewan uji, dan lain-lain (1,2). Seperti diketahui Obat tradisional mengandung satu atau lebih campuran simplisia, di antara simplisia tersebut yang banyak digunakan
sebagai komponen jamu yaitu: buah Cabe Jawa (Piper retrofractum Vahl.) dari Familia Piperaceae. Buah Cabe Jawa mengandung senyawa asam amino bebas, piperin, piperatin, β-sitosterol dan lain-lain. Banyak digunakan sebagai obat demam, mulas perut, dan lain-lain, namun dilaporkan dapat menyebabkan aborsi pada tikus dan kontraksi terisolasi (4,5) Berdasarkan hal tersebut di atas, maka untuk mendeteksi adanya efek mutagenik, perlu dilakukan uji mutagenesitas dengan metode Ames berdasarkan sistem mutasi balik untuk mendeteksi adanya “point of mutation”. Uji mutagenik dengan metode Ames merupakan uji skrining primer untuk mendeteksi adanya efek mutagenik, berdasarkan penelitian menggunakan metode ini ada korelasi yang cukup tinggi antara karsinogen dan mutagen yaitu kurang lebih 83 %. Sehingga uji Ames direkomendasikan untuk mendeteksi adanya efek mutagenik (2). Pada penelitian ini akan dilakukan penelitian adanya efek mutagenik dengan metode Ames terhadap ekstrak buah Cabe Jawa dengan menggunakan lima galur bakteri uji. TUJUAN PENELITIAN: Menetapkan efek mutagen dengan sistem mutasi balik (metode Ames) ekstrak simplisia buah Piper retrofractum Vahl (Cabe Jawa).
BAHAN DAN CARA Bahan Sampel adalah simplisia buah Cabe Jawa yang diperoleh dari BPTO Tawangmangu dengan spesifikasi asal tanaman sebagai berikut: tempat kultivasi dengan jenis tanah Andosol, warna hitam, 63
Efek Mutagen … (Ani Isnawati dkk.)
pH asam, bahan organik cukup dan tekstur tanah gembur. Cuaca tempat penanaman suhu minimum 15 o C dengan curah hujan 3000 mm/th dan kelembaban 75 %. Tanaman dipanen pada bulan Januari 2001 pada ketinggian 200 m di atas permukaan laut. Penanganan pasca panen yaitu bahan simplisia yang telah bersih dikeringkan di bawah sinar matahari langsung dan sebagai alas pengering dibuat dari bambu (kepang). Setelah kering simplisia diserbuk dengan menggunakan blender dan diayak menggunakan derajat ayakan nomor 40. Bahan Uji Mutagen Biakan murni Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 yang diperoleh dari DR. Bruce N. Ames, University of California, Berkley, USA dan Escherichia coli WP2 uvrA diperoleh dari National Institute of Hygienic Sciences, Tokyo, Japan. Media bakteri nutrient broth (oxoid), agar oxoid, bacto agar, glukosa, natrium klorida, L-histidin HCl, L-triptofan, D-biotin, natrium hidroksida, magnesium sulfat, asam sitrat, dikalium hipofosfat, natrium amonium fosfat, dinatrium hipofosfat, magnesium klorida, kalium klorida, dimetil sulfoksida, Alat Cawan Petri, penghitung koloni, inkubator, alat vortex, jarum ose dan alat gelas lain yang lazim digunakan dalam laboratorium mikrobiologi. Cara Kerja 1. Keabsahan tanaman dilakukan melalui determinasi tanaman baik secara makroskopis maupun secara mikroskopis. 2. Pembuatan ekstrak 50 % secara perkolasi 3. Serbuk simplisia buah Cabe Jawa ditimbang lebih kurang 250 gram dibasahi pelarut etanol 50 % hingga basah dan didiamkan selama 4jam dalam wadah tertutup. Masa basah tersebut kemudian dimasukkan ke dalam perkolator yang terbuat dari gelas, dan ditambahkan pelarut yang dialirkan sedemikian rupa hingga di atas permukaan masih tersisa pelarut setinggi 0,5 cm dan dibiarkan selama 24 jam. Kemudian keran perkolator dibuka, dibiarkan mengalir dengan kecepatan alir lebih kurang 40 tetes, dan ditambahkan pelarut sehingga pelarut di atas permukaan bahan dipertahankan seperti semula yaitu lebih kurang 0,5 cm. Ekstrak cair yang diperoleh hendaknya sejumlah lima kali bobot serbuk yang disari, kemudian diuapkan dalam cawan porcelain yang telah ditara dan diuapkan di atas penangas air
64
dengan suhu lebih kurang 40 o C hingga diperoleh ekstrak kental. 4. Penetapan Uji Mutagenesitas Uji Pendahuluan Uji pendahuluan dilakukan untuk menetapkan dosis uji yang akan digunakan pada uji utama. Uji pendahuluan menggunakan 1 galur bakteri uji yaitu Salmonella typhimurium TA 100 dengan dan tanpa penambahan campuran aktivator metabolik S-9 Uji Utama Jumlah zat uji yang telah ditentukan berdasarkan hasil uji pendahuluan yaitu dosis yang memberikan jumlah koloni revertan terbesar, ditetapkan sebagai dosis untuk pengujian selanjutnya. Uji ini dilakukan dengan menggunakan sejumlah zat uji dengan dosis bertingkat yaitu 31,25; 62,50; 125; 250 dan 500 ug/lempeng (lp) dan dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO). Untuk masing-masing sediaan uji digunakan 5 galur bakteri uji yaitu Salmonella typhimurium TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 dan Escherichia coli WP2 uvrA. Disiapkan sejumlah biakan semalam agar dengan kepekaan 1-2 x 10 9 sel/ml dari masing-masing bakteri uji dan campuran S-9 yang berisi glukosa 6-fosfat, BNADPH, kalium klorida, magnesium klorida, dapar fosfat, B-NADPH, kalium klorida, magnesium klorida, dapar fosfat, S-9 dan lempeng agar dalam cawan Petri steril; serta sejumlah agar cair yang ditambah histidin, biotin dan triptofan sesaat sebelum pengujian dilakukan. Ke dalam beberapa tabung reaksi, secara berturut-turut dimasukkan sediaan uji dari masing-masing dosis 0,5 ml, campuran S-9 dan pengujian tanpa menggunakan campuran S-9 yaitu 0,5 ml dapar fosfat pH 7,4 serta 0,1 ml biakan semalam bakteri uji segar. Kemudian diinkubasikan dalam penangas udara penggojok pada suhu 37 o C selama 20 menit, setelah itu ke dalam setiap tabung dimasukkan 2 ml agar dengan suhu 45 o C dihomogenkan dengan alat Vortex, disebarkan secara merata pada lempeng agar, dibiarkan pada suhu kamar selama lebih kurang 1 jam, dan diinkubasikan pada suhu 37o C selama 48 jam. Kelompok kontrol negatif menggunakan pelarut sediaan uji dan sebagai kelompok kontrol positif menggunakan beberapa senyawa mutagen pembanding yang sesuai untuk masing-masing bakteri uji. Jenis senyawa mutagen pembanding yang digunakan seperti tertera pada Tabel 1
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
Tabel 1. Senyawa Mutagen Pembanding Untuk Bakteri Uji Bakteri Uji
TA 100
TA 98
TA 1535
TA 1537
WP2 uvrA
(-) S-9
AF-2 (0,02 ug) 2 AA (2 ug)
AF-2 (0,05 ug) 2 AA (2 ug)
ENNG (3 ug) 2 AA (2 ug)
9AA (80 ug) 2 AA (2 ug)
AF-2 (0,02 ug) 2 AA (2 ug)
(+) S-9 Keterangan :
2 AA: 2 Amino antrasena; 9 AA: 9 Amino akridina,; ENNG: N- etil- N’- nitro- N-nitrosoguanidin; AF-2: 2-(2-Furil)-3-(5nitro-2-furil) akrilamida
Pengujian dilakukan secara simultan dengan cara yang sama seperti pada kelompok sediaan uji. Koloni revertan bakteri yang tumbuh pada setiap lempeng dihitung. Potensi mutagen mutagenik sediaan uji ditetapkan dengan membandingkan jumlah koloni revertan pada lempeng kontrol negatif. Hasil uji dinyatakan positif apabila diperoleh hubungan dosis respon pada sekurang-kurangnya terdapat 3 dosis uji dengan koloni revertan pada dosis uji paling tidak 2 kali revertan kontrol negatif.
HASIL PENELITIAN Determinasi Determinasi simplisia secara makroskopis buah Cabe Jawa adalah sebagai berikut: Buah majemuk. Berbentuk lonjong. Warna kecoklatan, biji berukuran 2 mm sampai 2.5 mm. Keabsahan tanaman telah dideterminasi di BPTO Tawangmangu.
Tabel 2. Data Pengujian Rutin Kontrol Negatif dan Kontrol positif pada Beberapa Bakteri Uji di Laboratorium Galur TA 98 TA 100 TA 1535 TA 1537 WP2 uvrA
Kontrol negatif (-) S-9 (+) S-9 11,0 + 2,45 23,25 + 8,54 156,58 + 64,45 163,25 + 28,9 11,67 +5,12 12,71 + 4,97 3,66 + 0,58 17,75 + 5,25 16,50 + 4,20 17,75 + 5,25
Uji mutagenesitas Hasil pengujian rutin kontrol negatif dan kontrol positif menghasilkan jumlah koloni revertan dari masing-masing bakteri uji dengan dan tanpa penambahan metabolik S-9, dapat dilihat pada Tabel 2. Hasil pengujian rutin kontrol negatif dan kontrol positif pada bakteri uji masih berada dalam rentang data pengujian rutin, sehingga berdasarkan data tersebut semua galur bakteri uji dianggap masih valid digunakan untuk pengujian. Adapun data hasil uji mutagenesitas sediaan uji ditunjukkan dengan banyaknya atau jumlah koloni revertan dari setiap bakteri uji pada masing-masing lempeng kontrol negatif, kontrol positif dan 5 dosis sediaan uji, dengan dan tanpa penambahan aktivasi metabolik S-9. Hasil dapat dilihat pada Tabel 3. Sedangkan dosis respon koloni revertan yang ditunjukkan dari kelima dosis ekstrak buah Cabe Jawa, dapat dilihat pada Gambar 1. Dari data di atas dapat diketahui bahwa jumlah revertan yang dihasilkan oleh masing-masing
Kontrol positif (-) S-9 (+) S-9 135,25 + 62,32 1532,5 + 746,64 1343,30+1030,47 1813,00+529,69 467,50 + 383,46 200,75 + 96,02 578,75 + 153,62 108,30 + 57,81 335,75 + 244,91 811,50 + 400,9
galur bakteri pada lempeng sediaan uji dari tiap dosis, hampir semua memberikan jumlah revertan lebih kecil, sama atau lebih besar (tidak lebih dua kali) bila dibandingkan terhadap jumlah koloni revertan yang dihasilkan oleh lempeng kontrol negatif, kecuali untuk dosis 62,50 ug/lempeng yang dihasilkan oleh bakteri TA98 dan TA 1537 serta dosis 500 ug/lempeng yang dihasilkan bakteri TA1537 dengan penambahan metabolik S-9, sedangkan tanpa penambahan metabolik dosis 62,50 dan 250,0 ug/lempeng yang dihasilkan bakteri WP2uvrA dan dosis 500,0 ug/lempeng yang dihasilkan bakteri TA98 memberikan jumlah koloni revertan dua kali atau lebih, namun tidak menunjukkan dosis respon. Untuk menetapkan adanya efek mutagenik koloni revertan sediaan uji paling sedikit harus mencapai dua kali revertan kontrol negatif dan menunjukkan adanya dosis respon sekurang kurangnya pada tiga dosis (Ames). Berdasarkan data di atas hasil penelitian tersebut efek mutagenik ekstrak buah Cabe Jawa negatif baik dengan dan tanpa aktivator metabolik S-9 65
Efek Mutagen … (Ani Isnawati dkk.)
Tabel 3. Jumlah Koloni Revertan Bakteri Uji Mutagenesitas Ekstrak Buah Cabe Jawa
+ S9
(+S9)
Kontrol negatif 31,25 62,50 125,0 250,0 500,0 Kontrol positif
(- S9 )
Jumlah Koloni Revertan Per Lempeng
Konsentrasi Zat Uji (ug/lempeng)
Kontrol Negatif 31,25 62,50 125,0 250,0 500,0 Kontrol positif
Mutasi Substitusi pasangan basa TA 100 TA 1535 WP2 uvrA Rata-rata Rata-rata Rata-rata
Mutasi Pergeseran Kerangka TA98 TA 1537 Rata-rata Rata-rata
116 ± 5,657
8,5 ± 0,707
18 ± 5,659
25 ± 4,243
11 ± 2,828
118 ± 7,071 114 ± 2,828 113 ± 9,899 110,5 ± 3,535 116 ± 1,414
13 ± 9,89 3,5 ± 2,121 5,5 ± 3,536 9 ± 1,414 5 ± 4,243
18,5 ± 4,949 23 ± 5,657 20 ± 2,828 18,5 ± 0,707 14 ± 4,243
30 ± 2,828 27 ± 8,485 33,5 ± 2,121 26 ± 11,313 32,3 ± 3,536
4 ± 2,828 6 ± 2,828 10 ± 1,414 8 ± 4,243 7,5 ± 0.707
1472 ± 33,941
40 ± 5,657
201 ± 16,970
1436 ± 226,27
139,5 ± 7,778
160 ± 2,828
3,5 ± 0,707
12 ± 4,243
24,5 ± 3,536
9,5 ± 2,121
113 ± 14,142 149 ± 2,828 149 ± 4,243 160,5 ± 20,506 143,5 ± 9,192 1100 ± 96,167
4,5 ± 2,121 4 ± 1,4142 4,5 ± 2,121 5,5 ± 0,707 3,5 ± 2,21 104 ± 4,243
10,5 ± 0,707 19 ± 5,657 10 ± 4,2426 19,5 ± 2,121 15,5 ± 0,707 511,5 ± 4,949
27,5 ± 0,707 29 ± 2,828 30 ± 7,071 32 ± 4,243 11,5 ± 3,536 311,5 ± 204,35
15 ± 5,656 5 ± 1,414 11,5 ± 2,121 4,5 ± 2.121 5 ± 1,414 139,5 ± 7.778
180
TA100+S9
160
TA1535+S9 WP2uvrA+S9
g 140 n e p p 120 m e l / n 100 a t r e v 80 e r i n 60 o l o k . l 40 m u J
TA98+S9 TA1537+S9 TA100-S9 TA1535-S9 WP2uvrA-S9 TA98-S9
20
TA1537-S9
0 k on tr ol n ega ti f
do si s 31 .25
do sis 6 2.5 0
do si s 12 5. 0
do sis 2 50. 0
d osi s 50 0.0
DOSIS
Gambar 1. Hubungan dosis dengan jumlah koloni revertan dari masing-masing bakteri uji pada uji AMES ekstrak buah Cabe Jawa dengan dan tanpa S-9
PEMBAHASAN Sebagai sediaan untuk uji mutagenik digunakan pelarut etanol yang bersifat polar dengan kadar 50 %, dimaksudkan agar senyawa yang bersifat nonpolar maupun polar dapat tersari, sehingga 66
mendekati sediaan yang biasa digunakan secara empirik yaitu sebagai rebusan dalam air yang bersifat polar. Uji pendahuluan dilakukan guna menetapkan dosis sediaan uji yang akan dipakai pada uji utama.
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 1, No. 2, Juli 2002
Pada uji pendahuluan ditetapkan 5 dosis sediaan uji bertingkat. Yaitu 31,25; 62,50; 125; 250 dan 500 ug/lempeng (lp). Pengujian rutin laboratorium terhadap bakteri uji yang akan digunakan dengan menggunakan kontrol negatif dan kontrol positif penting dilakukan untuk mengetahui bahwa semua galur bakteri masih valid digunakan. Uji mutagenesitas dari sediaan uji dilakukan dengan sistem mutasi balik menggunakan lima galur bakteri uji yang telah dimutasikan dengan cara pergeseran kerangka dan perubahan pasangan basa DNA, untuk mendeteksi kemungkinan adanya efek mutagenik pada simplisia yang diuji. Bakteri Salmonella typhi TA 98 dan TA 1537 untuk mendeteksi kemungkinan adanya mutasi pergeseran kerangka, sedangkan penggunaan bakteri TA 100, TA 1535 dan E. coli WP2 uvrA untuk mendeteksi kemungkinan adanya mutasi pasangan basa. Penambahan aktivator metabolik S-9 dimaksudkan untuk mengetahui apakah efek mutagenik disebabkan oleh metabolitnya. Hasil pengamatan pada uji mutagenesitas, jumlah koloni revertan yang dihasilkan oleh masing-masing galur bakteri uji pada setiap dosis sediaan uji walaupun ada yang memberikan jumlah koloni revertan lebih besar dua kali dari yang dihasilkan kontrol negatif, namun tidak menunjukkan adanya dosis respon. Sehingga berdasarkan hasil penelitian dengan metode Ames, simplisia Cabe Jawa menghasilkan efek mutagenik negatif. Mengingat titik akhir dari efek mutagenik di samping adanya perubahan DNA juga adanya kerusakan kromosom maka perlu dilakukan uji aberasi kromosom secara in vitro dan uji micronucleus secara in vivo sebagai skrining sekunder. Perlu diperhatikan bahwa data yang diperoleh dari uji mutagenesitas dengan uji Ames merupakan uji skrining primer in vitro, tidak mencerminkan adanya kerusakan toksisitas jangka lama secara in vivo, namun apabila hasil uji terhadap
adanya kerusakan kromosom positif sudah merupakan indikasi bahwa obat tradisional tersebut membahayakan bila digunakan untuk pengobatan. KESIMPULAN Hasil penelitian uji mutagenesitas menggunakan metode Ames dengan kondisi penelitian yang telah dilakukan terhadap ekstrak etanol 50 % buah Cabe Jawa hasilnya negatif SARAN Mengingat hasil penelitian uji mutagenesitas dengan metode Ames negatif, maka perlu dilakukan skrining sekunder dengan uji aberasi kromosom atau uji micronucleus. DAFTAR PUSTAKA 1. Hayes, A.W, 1984, (ED), Principles and Methods of Toxicology, Raven Press, Book ltd, New York. 2. WHO, 1993, Research Guidelines for Evaluation the Safety and Efficacy of Herbal Medicinal, Manila. 3. Nurendah, PS, 1983, Laporan Penelitian Sifat Ekbolik Komponen Jamu Yang Digunakan Terhadap Uterus, Puslitbang Farmasi, Badan Litbangkes. 4. Bakar, S, et al, 1980, Pengaruh Beberapa Komponen Jamu Pengatur Haid Terhadap Uterus Terisolasi, Risalah Simposium Penelitian Tumbuhan Obat III. 5. Maron, D.M.B.N, 1983, Ames Revised Methods for Salmonella Mutagenity Test , Mutation Res, 113. 6. Lily, M, Perry, 1980, Medicinal Plants of East and Southeast Asia, The Mitt Press, London. 7. Depkes, R.I, 1977, Materia Medika Indonesia, Dirjen Pengawasan Obat dan Makanan, Jilid I, Jakarta.
67
