DILUCIÓN Y RECUENTO EN PLACA RESUMEN Las bacterias son los más pequeños y numerosos microorganismos que se encuentran en el suelo, suelo, el número de bacterios bacterios en el suelo puede oscilar desde o menos a varios millones, millones, las estimaciones se realizan realizan en cultivos o mediante examen microscópico directo. La técnica de dilución en placa es utilizada utilizada para aislar hongos y bacterias a partir de sustratos sustratos masivos como suelo, compost, alimentos, agua, etc. Para el experimento se tomo una muestra representativa representativa del suelo para hacer el aislamiento se midió 1 ml, Se colocó esta cantidad en un tubo de 9 ml de agua destilada esterilizada, se agitó bien y luego con una pipeta también estéril, se transfirió un ml de la mezcla a un segundo tubo con 9 ml de agua destilada esterilizada, esterilizada, Se repitió este este procedimie procedimiento nto hasta completar completar una serie de diluciones, diluciones, se siembro siembro 1 ml de cada tubo en una caja de petri con medio de cultivo seleccionado. Palabras claves. Dilución, factor de dilución, recuento en placa, cultivo, colonia, bacteria,
INTRODUCCIÓN Las Las bact bacter eria iass son son los los más más pequ pequeñ eños os y num numeros erosos os micr microo oorrgani ganism smos os que que se encu encuen entr tran an en el suel suelo, o, el núme número ro de bacterios en el suelo puede oscilar desde o menos a varios millones, las estimaciones se realizan en cultivos o mediante examen micr micros oscó cópi pico co dire direct cto. o. La técni écnica ca de dilución en placa se usa más frecuen frecuentem tement ente. e. Una suposi suposició ción n en está está técnic técnicaa es que cada cada bacteri bacteriaa viable viable de la suspensión del suelo usado como inoculante se desarrollará en una colonia visible durante la incubación. Los bacter bacterios ios más abundan abundantes tes del suelo suelo son son pequ pequeñ eños os bast baston ones es coco cocoid ides es de morfología variable, (Burges A 1971) Método de dilución (Rivero M 2000) Este proce procedim dimien iento to es utili utilizado zado para para aislar aislar hongo hongoss y bact bacter eria iass a part partir ir de sust sustra rato toss masivos masivos como suelo, suelo, compost, compost, alimentos, alimentos, agua, etc. Se toma una muestra representativa del material del cual se va a hacer el aislamiento y según su estado se mide 1g o 1 ml Se coloca esta cantidad en
un tubo que contenga nga 9 ml de agu agua destilada esterilizada, se agita bien y luego con una pipeta también estéril, se transfiere un ml de la mezcla mezcla a un segundo segundo tubo tubo con 9 ml ml de agua destil destilada ada esteri esteriliz lizada ada.. Se repite este procedimiento hasta completar una serie serie de dilucione dilucioness proporcional proporcional a la la conce concent ntra raci ción ón y/ o cont contam amin inaci ación ón del material en estudio. En caso de trabajar con soluci soluciones ones poco poco densa densa o contami contaminad nadas as o agua una serie serie de 4 a 6 diluciones diluciones puede ser suficiente, pero en caso de tratarse de suelo, es necesario llegar a unas 8 a 10 diluciones. Una vez completa completada da la serie, serie, se procede procede a semb sembra rarr 0.5 a1 ml de cada cada tubo tubo en una caja de pet petri con medio dio de cultivo seleccionado. Esta siembra puede hacerse de dos formas diferentes: diferentes: por mezcla de la muestra con el medio de cultivo tibio para luego luego verti vertirse rse en la caja caja de petri petri o bien esparcido esparcido de la muestra sobre la superfici superficiee del medio de cultivo ya solidificado y frío. Este segundo método es más sencillo y no pone en riesgo el aislamiento por la alta temp temper erat atur uraa del del medi medio. o. Desp Despué uéss de la incu incuba baci ción ón se cuen cuentta el núm número ero de
colonias que se han desarrollado sobre la placa y de este modo se puede calcular el número presente pro gramos de suelo aunque el número así calculado solo puede considerarse equivalente al presente por g de suelo si: Cada colonia desarrollada sobre la placa proceda solo de una bacteria. (Orjuela B H 1989) Todas las bacterias de las muestras del suelo se hallen en suspensión. (Orjuela B H 1989) Todas las bacterias de la suspensión puedan crecer sobre el medio nutritivo utilizado. (Orjuela B H 1989) Una colonia bacteriana ésta formada por la población de bacterias que crece en un mismo lugar y que es originada por la multiplicación sucesiva de las células. Al igual que los hongos es posible apreciar visualmente algunas características de las colonias bacterianas las cuales ayudan a distinguirlas un poco y apreciar el resultado del aislamiento. Entre estas características podemos mencionar. (Rivero M 2000) Color: Suele ser homogéneo en toda la colonia. Aspecto: Se califica como brillante, opaco, filamentoso compacto, mucoide. Elevación: En vista lateral de la colonia puede ser plana convexa, o umbonada cuando presenta una prominencia en el centro. Bordes: Pueden ser enteros, ondulados, lobulados, filamentosos. Consistencia: Se puede apreciar el contacto del asa bacteriológica con la superficie de la colonia y se describe como; butirosa o semejante a la mantequilla, viscosa cuando se adhiere formando hilos, membranosa o cerosa cuando es muy seca. Pigmentos difusibles: pueden producirse pigmentos que se esparcen en el medio de cultivo variando su color característico. El objetivo de este informe es aplicar la metodología de recuento en placa y de
dilución y sembrar utilizando la técnica de siembra por estría en placa.
METODOLOGÍA Se diluyo una muestra de 1 gramo de suelo en agua estéril, esta se agito para homogeneizar la solución, se transfirió con una pipeta estéril 1ml a 9 cc de agua estéril sucesivamente hasta llegar a 9 ml de la solución de agua destilada para obtener el grado de dilución requerido. Para cada dilución se hizo una repetición. Se añadió 0.1 ml de cada dilución en una placa con el medio a través del método de estría en placa.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Factor de dilución: Gramos de la muestra
=
FC
Gramos de la muestra + vol. de la solución
10 g = 0.1 ml 10 g + 90 ml
Nó de colonias * FC
1
*
1
= UFC
ml de la muestra
Tabla No 1 Resultados preliminares.
CUESTIONARIO Datos obtenidos promediados en dos tomas. 1. Consulte y complete la metodología de siembra por estría en placa.
obtención de colonias aisladas. Es una técnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
Estría Múltiple En Superficie
incontable incontable incontable incontable incontable incontable 8 mas dos tipos de hongos. 8 mas dos tipos de hongos.
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no dañar el agar. Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posición invertida. Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado número de bacterias.
Técnica de aislamiento por estría en superficie.
Fig 1 Método de siembra en placa por
Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determinada dilución del cultivo de microorganismos y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de microorganismo. La posición invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la
estría para obtener un cultivo axénico (puro). (a) Se esteriliza el asa y luego se extrae con ella un inóculo del tubo. (b) Se b hacen estrías sobre la placa con el agar estéril, extendiendo los microorganismos. Tras las estrías iniciales se hacen otras estriaciones formando ángulo con las primeras, y el asa cse vuelve a esterilizar entre distintas operaciones. (c) Apariencia de la placa sembrada tras incubación. Adviértase la presencia de colonias aisladas. De tales colonias aisladas se puede obtener normalmente un cultivo axénico (puro). Tomado de Piaggio M 1998.
Dilución Rep. Nó de Colonias 10-7 1 39 + 2 tipos de hogos 2 36+2 tipos de hongos -6 10 1 152 2 101 -5 10 1 47 + gran cantidad de micelio 2 46 + gran cantidad de micelio -4 10 1 82 2 2 10-3 10-2 10-1 Control
1 2 1 2 1 2 1 2
a
2. Explique en que consiste un cultivo axénico El cultivo puro es equivalente a cultivo axénico (xeno = algo extraño) Cultivo libre de microorganismos que no se desean. Cultivo de una sola especie. Cultivo que presenta únicamente un organismo. Consiste en un solo tipo de microorganismo derivado de una sola célula. el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia. En el proceso de identificación de un hongo o una bacteria requiere que estos organismos una vez aislados en el medio de cultivo se separen de los posibles contaminantes que hayan podido crecer en el medio del sustrato. Es muy frecuente que a pesar de que se hayan observado todas las precauciones de asepsia en el proceso de aislamiento, se obtenga más de un organismo en el medio de cultivo porque hay varios microorganismos o porque no se pudo evitar la presencia de contaminantes. La primera etapa para obtener un cultivo axénico es la eliminación de todos los microorganismos de un material. Todos los instrumentos y materiales utilizados para obtener un cultivo axénico deben ser esterilizados, incluyendo el medio de cultivo. (Rivero M 2000)
3. Diferencie Clon, colonia y cepa Clon: uniformidad genética en una línea de descendencia. Población de células que descienden todas de una única célula. O bien, cierto número de copias de un fragmento de DNA obtenidas al dejar que el fragmento original se replique insertado en un fago o plásmido. (Piaggio M 1998)
Cepa: Población celular descendiente de una única célula; clon. Conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo genético. (Piaggio M 1998)
Colonia: población de células que pueden observarse microscópicamente y que crecen en un medio sólido, procedentes de una sola célula. (Piaggio M 1998) desarrollo de un microorganismo en masa, especialmente como un cultivo puro en el laboratorio.
4. Que desventajas se encuentran en la metodología de recuento en placa y dilución. Con estos métodos la población microbiana no puede determinarse con precisión en una muestra dada de suelo. Esta metodología lleva a subestimar el número de bacterias u hongos que se encuentra en el suelo. Puede determinar menor número de bacterias de la cantidad que realmente existen en el suelo (Orjuela B H 1989) Las poblaciones bacterianas del suelo como quedan determinadas con este método de cultivo puede oscilar desde pocos miles de células por gramo de suelo a varios d cientos de millones, valores que se aproximan muy poco a las estimaciones de la población bacterial realizadas mediante procedimientos microscópicos directos que han presentado rangos que oscilan entre dos y 9 mil millones de células vegetales por gramo (Orjuela B H 1989). En hongos del suelo por medio de este método se puede obtener el número de colonias por gramo de suelo seco, sin embargo el número de hongos en el suelo es poco significativo ya que durante al manipulación una sola hifa puede romperse en fragmentos donde cada uno puede contarse como un hongo, además el método se ha considerado muy selectivo
particularmente para especies que esporulan ya que muchos hongos se aíslan raramente en placas.
BIBLIOGRAFÍA Coyne M 1999. Microbiología del suelo: Un enfoque exploratorio. Ed paraninfo. Madrid España. 416 p. Orjuela B H 1989. El suelo: Una visión sobre sus componentes bioorgánicos. Ed Universidad de Nariño. Pasto Colombia. 447 p Rivero C M 2000. Reconocimiento y diagnóstico de enfermedades de plantas. Guías para las prácticas de laboratorio de fitopatología general. Universidad nacional de Colombia. Facultad de agronomía. Bogotá. 52 p http://caldum.um.es/~patricio/Propio/Proye ctos/apuntes/micro/Microbiologia.pdf Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 http://www.analizacalidad.com/bio3.htm Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 Piaggio M 1998 http://micol.fcien.edu.uy/atlas/glos98.htm Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.p df Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005
