Diagnóstico de laboratorio de
CRYPTOSPORIDIOSIS
INTESTINAL Curso No. 8008-C
LIBRO DE TRABAJO DE AUTO-APRENDIZAJE DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS* Curso No. 8008-C
Dr.P.H Sandra L. Bullock-Iacullo. Sucursal de desarrollo de método de laboratorio División de entrenamiento Oficina de Programas de entrenamiento y laboratorio *Nota: Pese a que este manual se desarrolló originalmente para ser utilizado con los especimenes que se otorgaban para los ejercicios, la información que se da en este libro de trabajo es útil, útil, aún sin estos especimenes de trabajo. Los estudiantes pueden realizar los procedimientos utilizando testigos de su propio laboratorio y materiales de compañías comerciales. Mayo 1988
U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Public Health Service Centros para el control y prevención de enfermedades Atlanta, Georgia 30333
*Actualizado de la versión impresa original en Dic 2 000. i
LIBRO DE TRABAJO DE AUTO-APRENDIZAJE DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS* Curso No. 8008-C
Dr.P.H Sandra L. Bullock-Iacullo. Sucursal de desarrollo de método de laboratorio División de entrenamiento Oficina de Programas de entrenamiento y laboratorio *Nota: Pese a que este manual se desarrolló originalmente para ser utilizado con los especimenes que se otorgaban para los ejercicios, la información que se da en este libro de trabajo es útil, útil, aún sin estos especimenes de trabajo. Los estudiantes pueden realizar los procedimientos utilizando testigos de su propio laboratorio y materiales de compañías comerciales. Mayo 1988
U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Public Health Service Centros para el control y prevención de enfermedades Atlanta, Georgia 30333
*Actualizado de la versión impresa original en Dic 2 000. i
RECONOCIMIENTO
Deseo expresar un agradecimiento especial al Sr. Richard Green y al Sr. Don Howard por su fotomicrografía experta, a la Sra. Sara Cote por su ayuda en la preparación de las ilustraciones, a la Sra. June Sumpter por corregir el manuscrito pacientemente y a la Sra. Shirley Holmes cuya magia en la computadora produjo la versión final de este manual.
Dr. P.H. Sandra L. Bullock-Iacullo.
El uso de nombres de marcas es únicamente para identificación y no constituye un aval del Public Health Services o del US. Department Department of Health and Human Services.
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DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL Instrucciones previstas: auto-estudio. Nivel intermedio. La instrucción se limita al diagnóstico de laboratorio; las referencias para la información clínica se enumeran en la última sección de este libro de trabajo. La instrucción está dirigida hacia su uso en un ambiente de práctica de parasitología en el laboratorio. SE PROPONE PARA LAS SIGUIENTES PERSONAS: Técnicos de laboratorio con suficiente experiencia en parasitología diagnóstica que puedan identificar correctamente quistes de Giardia lamblia ( sin. Giardia intestinalis) en frotis directos con solución salina, laminillas teñidas con lugol y tricrómica. Con las instrucciones escritas y el equipo y materiales necesarios, los técnicos de laboratorio serán capaces de realizar la tinción ácido-resistente y la técnica de concentración con formalina-acetato de etilo. TIEMPO REQUERIDO PARA COMPLETAR EL PAQUETE DE ESTUDIO: Aproximadamente 6 horas, tomando en consideración que el equipo y materiales estén listos para usarse. MATERIALES QUE SE PROVEEN EN EL PAQUETE DE ESTUDIO: 1. Libro de trabajo 2. Seis viales con heces en formol (un testigo positivo y cinco “desconocidos” **) MATERIALES Y EQUIPO NECESARIOS: 1. Microscopio binocular equipado con el equivalente a una lámpara de halógeno de 20 watts, con objetivos de 40 X y 100X con aceite de inmersión, un filtro azul para luz de día y un ocular micrométrico calibrado. 2. Aceite de inmersión. 3. Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 50 mm, aproximadamente 20. 4. Cubreobjetos, grosor #1, 22 x 22 mm, aproximadamente 20. 5. Formol neutral buferado al 10%, aproximadamente 100 ml (la misma que para la técnica de concentración; ver instrucciones de preparación en la página 14). 6. Solución de lugol Dobell y O'Conner, aproximadamente 10 ml, fresco (ver instrucciones de preparación en la página 14). 7. Aplicadores de madera, aproximadamente 40. 8. Pipetas Pasteur con bulbos de hule, aproximadamente 20. **No se ofrece en la versión del libro de trabajo en CD-ROM. 1
9. Materiales y soluciones para hacer la técnica de concentración de formalinaacetato de etilo (ver las instrucciones en la página 15). 10. Materiales y soluciones para hacer las técnicas de tinción modificada de Kinyoun o ácido-resistente de auramina O ó ambas (ver instrucciones en las páginas 18 y 21). OBJETIVOS: Al completar este programa de estudio y ofreciendo todos los materiales y el libro de estudio necesarios, los participantes serán capaces de: 1. Describir la morfología de los oocistos de Cryptosporidium en frotis directo con preparaciones de solución salina y solución de lugol, y las preparaciones con tinción tricrómica y ácido-resistente. 2. Describir los tipos de especimenes fecales que tienen más probabilidades de contener oocistos y cuáles deben ser examinados rutinariamente para la presencia de oocistos. 3. Realizar la técnica de concentración de formalina-acetato de etilo en una muestra fecal que contenga oocistos y que se demuestre la presencia de estos al microscopio en un frotis fecal teñido con solución de lugol. 4. Utilizando el concentrado del #3 descrito arriba, realizar la técnica modificada de Kinyoun o ácido-resistente de auramina O ú ambas y demostrar la presencia de oocistos al microscopio. Para evaluar la realización de los objetivos de arriba, los participantes elaborarán pruebas en los oocistos de Cryptosporidium de los cinco viales de contenido “desconocido” del paquete de estudio. Los participantes deben informar sobre la presencia o ausencia de oocistos en cada muestra. Se considerará como desempeño satisfactorio (80%) cuando se ofrezcan reportes correctos para cuatro de las cinco muestras. NOTA IMPORTANTE ACERCA DE Isospora belli : Aunque este programa de estudio se enfoca específicamente al diagnóstico de laboratorio de los oocistos de Cryptosporidium, los procedimientos que se han dado, especialmente la tinción ácido-resistente, pueden ser utilizados para el diagnóstico de los oocistos de Isospora belli . La información adicional acerca de los oocistos de Isospora belli sobre la tinción ácido-resistente, se da con cada técnica de tinción y se ofrece en la sección del libro de trabajo (sección azul). Referencias para la información clínica de Cryptosporidium, se incluyen también en la última sección del libro de trabajo. * No se incluye en la versión en CD de este libro de trabajo. 2
MEDIDAS DE SEGURIDAD: Las muestras fecales en este programa de estudio están conservadas en formol neutro buferado al 10% y lo más seguro es que no sean infecciosas**. Sin embargo, TODOS LOS ESPECIMENES, especialmente los especimenes sin conservadores, deben ser tratados como infecciosos capaces de transmitir infecciones de importancia. Las heces pueden contener virus, bacterias, protozoarios e incluso algunos helmintos, los cuales son inmediatamente infecciosos. Por favor siga de cerca las medidas de seguridad de su laboratorio para manejar y muestrear los especimenes médicos. Las siguientes referencias pueden ser útiles para conocer las medidas de seguridad y pruebas en especimenes médicos: Centros de Control de Enfermedades. Recommendations for prevention of HIV transmission in health-care settings. . Morbidity and Mortality Weekly Report (MMWR), 1987;36(2S) :3S-18S. Miller BM, Groschel DHM, Richardson JH, et al ., editores. Laboratory safety: principles and practices. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1986:372. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Protection of laboratory workers from infectious disease transmitted by blood and tissue; proposed guideline. Villanova, PA: NCCLS, 1987; NCCLS Documento M29-P. Richardson JH, Barkley WE, editores. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 1s ed. Atlanta, GA: Centros de Control de Enfermedades-Institutos Nacionales de Salud, PHS, HHS, 1984; HHS publicación no. (CDC) 86-8395. ** No se ofrecen en la versión del libro de trabajo en CD-ROM.
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Cryptosporidium:
MORFOLOGÍA Y DETECCIÓN El diagnóstico de laboratorio de cryptosporidiosis usualmente requiere de un mayor esfuerzo que para otros parásitos intestinales. El oocisto, que es la etapa diagnóstica en coccidias, son muy pequeños e incoloros y no se detectan fácilmente en los exámenes de rutina. Muy frecuentemente, se requiere de procedimientos especiales (un examen microscópico meticuloso en un aumento mayor o técnicas de tinción diferentes), para hacer una identificación positiva de estos oocistos tan pequeños. Este programa de auto-aprendizaje provee instrucciones y prácticas para obtener la experiencia visual para detectar desde un número reducido, hasta un gran número de oocistos en un espécimen dado, además de que provee los protocolos e instrucciones para las tinciones especiales‡.
Usted debería ahora ESTUDIAR ahora la información en las siguientes páginas sobre la morfología y la detección de oocistos. Una vez que tenga una imagen mental clara de cómo se ven los oocistos y en qué especimenes es más factible que los encuentre, vaya a la siguiente sección del libro de trabajo y siga las instrucciones y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE. A través de la PRÁCTICA usted será competente y obtendrá la confianza para detectar eficientemente oocistos en muestras fecales.
‡
Muchos procedimientos publicados se utilizan para la recuperación y detección de oocistos. Aquellos que se escogieron aquí, parecen ser los más exitosos y más económicos para la mayoría de los laboratorios.
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MORFOLOGÍA DEL OOCISTO: Su rango de tamaño es de 4-6 µm; la mayoría son de 5-6 µm. Su forma es usualmente esférica, rara vez oval. Es inmóvil. La pared del oocisto es muy delgada y de apariencia delicada. Los oocistos maduros contienen 4 esporozoítos “desnudos” (no presenta esporoquistes) y un solo cuerpo “residual”obscuro. Los esporozoítos son altamente refráctiles a la luz. Variaciones que se observan en el microscopio óptico de campo claro: En infecciones agudas, se excreta frecuentemente un número grande de lo que parecen oocistos inmaduros. Estas formas presentan las características descritas arriba con la excepción que los esporozoítos individuales no se observan. En cambio, el material que da lugar a los esporozoítos se observa sin división y se sujeta a la pared del oocistos, dando la impresión de una “dona” o “media luna” pequeña y muy refráctil. Los cuerpos residuales son generalmente grandes y visibles en estas formas. La pared del oocisto se puede ver pero es muy delgada y frecuentemente se colapsa unilateralmente. En infecciones que se están resolviendo y en infecciones crónicas, los oocistos presentan una morfología típica, sin embargo no todos los esporozoítos son visibles en los oocistos. Además de que generalmente hay un número significativamente menor de oocistos presentes. Apariencia de los oocistos en diferentes tipos de preparaciones: SOLUCIÓN SALINA: La morfología es como se describe anteriormente. La característica más notable es que a un aumento de 400 X los oocistos son más refráctiles que las estructuras similares en tamaño y forma que la rodean. En aumento con el objetivo 1000 X con aceite de inmersión, se observan muchas, aunque no todas, de las estructuras antes descritas. Con una observación cuidadosa, los oocistos se pueden diferenciar de levaduras comunes con base a la forma, grosor de la pared celular, y la apariencia de los contenidos internos. Las levaduras son ovales, con pared celular gruesa y su citoplasma está lleno de gránulos oscuros. 5
SOLUCIÓN DE LUGOL DE DOBELL Y O'CONNER: Los oocistos típicamente no se tiñen con lugol, pero permanecen claros y muy refráctiles a la luz, aún cuando se les deje en la solución por un largo período. Las levaduras rápidamente se tiñen de un color café-amarillento y por lo tanto se distinguen fácilmente de los oocistos. Generalmente el aumento 400 X es suficiente para ver la diferencia. NOTA 1:
Una levadura degenerada (levadura "fantasma") consiste en una pared celular gruesa y escaso contenido interno que no acepta la tinción de lugol. El examen en aumento de 1000 X mostrará una pared gruesa en la levadura sin teñir.
NOTA 2:
Algunos oocistos atípicamente aceptarán la tinción de lugol en un tiempo relativamente corto; algunos la aceptan en pocos minutos después del contacto. La causa es desconocida, por lo que los especimenes deben examinarse tan pronto se sometan a la solución de lugol.
TINCIÓN TRICRÓMICA: Los oocistos generalmente no se tiñen con tinción tricrómica y aparecen como “huecos” en el fondo fecal. Sin embargo, ocasionalmente algunas cepas de oocistos adquieren un color de rosa a rojo pero NO SE RECOMIENDA EL USO DE TINCIÓN TRICRÓMICA PARA EL DIAGNÓSTICO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium. TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE MODIFICADA DE KINYOUN: Los oocistos de Cryptosporidium son alcohol ácido-resistentes y adquieren un color rojo-oscuro con la tinción. La mayoría se observan como bolas, pequeñas y sólidas. Algunas veces, solo los esporozoítos dentro del oocistos maduro retienen la tinción y por lo tanto aparecen como cuatro pequeñas salchichas juntas. El encontrar estas formas que contienen esporozoítos confirma que estas estructuras son oocistos. Muchas levaduras y otras estructuras adquieren la coloración de la tinción de contraste, generalmente verde o azul. TINCIÓN ÁCIDO-RESISTENTE DE AURAMINA O: Esta es una tinción fluorescente y requiere de un microscopio de fluorescencia. Aquí los oocistos ácido-resistentes adquieren un color naranja-amarillento brillante y se observan como un cuerno sólido o con apariencia de cráter. Algunas veces se pueden observar esporozoítos individuales. Los materiales que no son ácido-resistentes o parcialmente ácido-resistentes fluorescentes adquieren un color pálido. La mayoría de las levaduras no se tiñen.
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DETECCIÓN DE OOCISTOS: Tipos de heces: Recuerde que las heces están clasificadas con base a la consistencia: FORMADA
SUELTA
SUAVE
ACUOSA
En cryptosporidiosis aguda (frecuente en niños inmunocomprometidos), por lo general en cuanto más líquida sea la evacuación, mayor número de oocistos. Frecuentemente las evacuaciones acuosas y sueltas que contienen un gran número de oocistos son de color claro, (ej. amarillo pálido, café o verde) y se ven homogéneas. Las heces suaves usualmente contienen menos oocistos. Las heces formadas contienen muy pocos oocistos. En infecciones crónicas (usualmente en personas inmunocomprometidas, como las que tienen síndrome de inmunodeficiencia adquirida), los oocistos presentan un rango de muchos a escasos, aún en heces líquidas. Todas las muestras de heces de personas que se sabe o se sospecha estén inmunocomprometidas deben examinarse para oocistos de Cryptosporidium. Sistema sugerido para recuperar y detectar oocistos: Los oocistos se pueden recuperar de heces frescas sin conservantes o de heces conservadas con formol neutral buferada al 10% (es importante que esté buferada para una concentración de oocistos efectiva), fijador MIF, fijador SAF, o fijador PVA. Puesto que la preservación con formol permite que los oocistos se tiñan mejor con el lugol o las tinciones ácido-resistentes, se recomienda su uso de rutina. Además, puesto que los oocistos de Cryptosporidium son infecciosos al ser excretados, la preservación con formol antes del examen probablemente reduce la posibilidad de transmisión de la infección. Todas las muestras de heces del programa de estudio están conservadas en formol neutral buferado al 10%. Cuando se reciben especimenes con la solicitud de un examen de rutina para parásitos, el primer paso es determinar la consistencia de las heces cuando se eliminan. Si el espécimen no está conservado, esto se hace fácilmente al ver las heces y compararlas con las imágenes arriba. Si el espécimen está conservado, el envase o la solicitud deben estar marcados con la consistencia original de la muestra. Aunque el saber cuál es la consistencia de la muestra no es imperativo para el examen, aumenta la eficacia del trabajo. No es necesario y es poco práctico realizar un procedimiento especial para cada espécimen. Como se explicó anteriormente, la cantidad de oocistos que se pueden obtener de una muestra formada es muy escasa. 8
Como rutina, todos los especimenes sin formar o acuosos, y aquellas personas que son o se sospecha que están inmunocomprometidas, deben ser revisados para oocistos de Cryptosporidium. Así mismo, todos los especimenes con una solicitud especial para Cryptosporidium, se deben examinar, sin importar la consistencia de las heces. La experiencia de aquellos que hacen los exámenes determinarán hasta que grado y cómo se van a analizar estos especimenes. Algunos laboratorios revisan visualmente con lugol todos los especimenes candidatos y usan tinción (es) ácido-resistente(s) para confirmar aquellos especimenes sospechosos y/o para tener un registro permanente de los especimenes positivos. Otros laboratorios realizan como rutina la tinción ácido-resistente en todos los especimenes. Esto, por supuesto, requiere más tiempo y energía pero reduce la probabilidad de perder aquellos especimenes con pocos oocistos. Cada laboratorio debe evaluar sus propias capacidades y recursos, y es usualmente la población de pacientes la que decide cuál es el sistema más apropiado. Sin importar el sistema de detección que ha seleccionado el laboratorio, todos los especimenes deben ser concentrados antes de ser examinados al microscopio. Aunque hay técnicas especiales para concentrar oocistos, se ha demostrado que la técnica mas popular para concentrar muestras fecales para parásitos es la de la formalina-acetato de etilo (FAE), que también concentra oocistos de Cryptosporidium. Por eso, la formalina-acetato de etilo, es la técnica que recomendamos y utilizamos en este programa de estudio. Después de la concentración, el sedimento resultante puede ser examinado por una, dos o una combinación de tres diferentes técnicas. Estas son: 1. Examen microscopio meticuloso con un gran aumento, usando la solución de lugol de Dobell and O'Conner. 2. Tinción ácido-resistente modificada de Kinyoun. 3. Tinción ácido-resistente de auramina O. Cada técnica es más útil que otras en determinadas circunstancias. Para crear una rutina, por ej. el examen con lugol para heces sueltas o acuosas, es el método más fácil y económico, pero requiere de una gran experiencia y no es tan sensible como otros. Si la experiencia de los técnicos de laboratorio es limitada, deberán realizar la tinción ácido-resistente en estos especimenes para poder detectar de pocos a escasos oocistos. Para otros especimenes, que no estén en el examen de rutina, se requiere la tinción ácido-resistente. La tinción modificada de Kinyoun es fácil y deja un registro permanente, pero no es tan confiable como la tinción de auramina O para teñir oocistos. Además es más difícil detectar a los oocistos cuando son escasos en preparaciones con Kinyoun que con auramina O. 9
Auramina O es una prueba bastante sensible y fácil de hacer, pero se requiere de microscopio de fluorescencia para examinar las muestras, y a veces hay restos pequeños que se parecen a los oocistos. Para disminuir el riesgo de confundir los restos con oocistos, el técnico de laboratorio debe revisar, por otro método cualquier espécimen que tenga de pocas a escasas “estructuras parecidas” a los oocistos que no presenten esporozoítos internos. La otra técnica debe evidenciar suficientes características de los oocistos para permitir una identificación positiva.
EL PRACTICAR CADA TÉCNICA LE AYUDARÁ A DECIDIR CUAL UTILIZAR EN SU LABORATORIO, ASÍ QUE PASE A LA SIGUIENTE SECCIÓN DEL PROGRAMA DE ESTUDIO Y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE.
**Nota: Este ejercicio de auto-aprendizaje se publicó antes del uso de la técnica de antígenos marcados con fluoresceína para diagnosticar Cryptosporidium.
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EJERCICIOS DE ESTUDIO ASEGÚRESE DE TENER TODOS LOS MATERIALES Y EL EQUIPO LISTOS PARA USARSE. NO OLVIDE LOS MATERIALES PARA EL EJERCICIO DE CONCENTRACIÓN Y TEÑIDO. 1. Prepare las laminillas sin teñir y teñidas con lugol a partir de la muestra positiva usando el procedimiento siguiente: a. Identifique apropiadamente una laminilla 76 x 50 mm. b. Utilice la pipeta Pasteur, coloque de 1/3 a 1/2 de gota (una gota completa es mucho) de solución salina a un lado de la laminilla y una
cantidad similar de solución de lugol en el otro lado c. Agite bien el vial con el espécimen, y usando una pipeta Pasteur
limpia, coloque de 1/3 a 1/2 de gota del testigo positivo a un lado del diluyente. d. Utilizando la esquina del cubreobjetos, mezcle la solución salina y el espécimen y coloque el cubreobjetos encima de la mezcla. e. Utilizando un segundo cubreobjetos, repita el procedimiento anterior con el lado de lugol-espécimen. Estas preparaciones deben ser suficientemente delgadas. Puede usted voltear el portaobjetos hacia abajo y el cubreobjetos se mantendrá en su lugar. Si esto no es posible inténtelo de nuevo con cantidades menores de diluyente y espécimen. f. Las orillas de estas preparaciones se pueden sellar con una mezcla 1:1 de vaselina:parafina derretidas, para prevenir la desecación durante algunas horas. El sellado también permite estabilizar el material para ser observado con aceite de inmersión. Sin embargo, como usted observará sus preparaciones de inmediato y éstas son delgadas el sellado no es esencial. 11
2. Observe cuidadosamente el espécimen en lugol a un aumento de 400 X. Durante la observación debe usted rotar el micrométrico casi continuamente. Al hacer esto usted podrá ser capaz de ver claramente objetos altamente refráctiles de 5 µm aproximadamente, que contrastan con el fondo amarillo. Enfoque claramente para localizar uno, colóquelo en el centro del campo y cambie al objetivo 100X con aceite de inmersión. A este aumento (1000 X), usted debería poder ver los detalles internos. Si usted puede observar una pared celular delgada, esporozoítos y cuerpos residuales, está usted viendo oocistos de Cryptosporidium. Compare con la fotografía de la sección anterior del libro de trabajo. Observe varios para adquirir un rango de variabilidad. 3. Después de observar varios oocistos en las preparaciones con lugol, observe las preparaciones con solución salina. Aunque no se detecta fácilmente a los oocistos en solución salina, el ejercicio tiene el propósito de obligar a que sus ojos observen la característica refracción. Cuando domine usted la detección observando la refracción, podrá usted detectar exitosamente oocistos en frotis directos. Asegúrese de observar a los organismos con los aumentos 400 X y 1000 X. 4. Ahora regrese a la preparación con lugol y PRACTIQUE, PRACTIQUE, PRACTIQUE. 5. Siguiendo las instrucciones de la página 17, realice la técnica de concentración de formalina-acetato de etilo en un testigo positivo. Al final del procedimiento, asegúrese de drenar todo el fluido del sedimento y retire todos los restos de acetato de etilo de la pared del tubo. Cualquier residuo de acetato de etilo puede hacer que el material se disperse en la laminilla y resultar en una mala preparación. Después de quitar el fluido, agregue 2-4 gotas de formol neutral al 10% y mezcle bien con una pipeta Pasteur limpia. Para prevenir la evaporación tape el tubo. Finalmente, prepare las preparaciones con solución salina y lugol y observe los oocistos al microscopio bajo los aumentos 400 X y1000 X. Note que se observa un mayor número de oocistos por campo que en el frotis directo del espécimen; la técnica de formalina-acetato de etilo concentra los organismos. 6. Usando el mismo sedimento para la técnica de formalina-acetato de etilo, realice cualquiera de las técnicas de tinción ácido-resistente descritas en las páginas 18 y 21. Usted seleccionará la técnica (s) apropiada (s) para su laboratorio. Compare los oocistos teñidos con las imágenes de la página 7. 7. Cuando complete los ejercicios de arriba y sienta confianza en la detección de oocistos, pruebe los cinco especimenes “desconocidos” que se le dieron en el paquete de estudio. Use la técnica, o una combinación de técnicas que utilizará posteriormente en su laboratorio. 8. Registre los resultados de cada espécimen en la parte posterior del libro de trabajo. Por favor siga las instrucciones descritas en la forma de la cuantificación de organismos; también siga las instrucciones en el formulario provisto en cuanto al doblado y envío por correo con la dirección incluida. 12
El completar exitosamente el programa de estudio, por ejemplo cuatro de los cinco especimenes “desconocidos” correctos, le otorga 0.6 unidades CDC de educación continuaŧ
ŧ
No se aplica para la versión en CD de este libro de trabajo.
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TÉCNICAS Y REFERENCIAS
I. Preparación de la solución de lugol de Dobell y O'Connor Prepare mensualmente una cantidad fresca: Yodo (cristales en polvo) Yoduro de potasio Agua destilada
1 gm 2 gm 100 ml
Disuelva el yoduro de potasio en agua. Agregue los cristales de yodo y agite cuidadosamente. Puede ser que los cristales no se disuelvan completamente, la solución deberá adquirir un color café-rojizo o de té fuerte. Decante en una botella ámbar con gotero u otro tipo de botella ámbar. Ya que la mayoría de los laboratorios no utilizan toda la solución en un mes, se sugiere el siguiente procedimiento. 1. Prepare 500 ml de yoduro de potasio al 2% (10 g en 500 ml de agua destilada). 2. Guarde la solución base de yoduro de potasio en una botella ámbar con tapón de vidrio. Se mantendrá por varios meses. Vierta una pequeña cantidad (20-30 ml) en un matraz o vaso de precipitado y agregue cristales de yodo (aproximadamente 0.2-0.3 g; la cantidad exacta no es importante) agite hasta que la solución adquiera el color apropiado. Renuévela cada mes.
II. Preparación de formol neutral buferado al 10% La preparación comercial de formaldehído tiene aproximadamente una concentración de 40% por volumen, lo que significa que 10% de formol es cerca de 4% de formaldehído. Na2HPO4 NaH2PO4 Formaldehído Agua (de la llave o destilada)
6.10 g 0.15 g 800 .0 ml 7,200.0 ml
Mezcle el formaldehído y el agua. Agregue las sales buferadas y mezcle bien. Se hacen 8 litros de formol neutral al 10%. Ésta solución se mantiene indefinidamente.
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III. Técnica de concentración de formol-acetato de etilo A. Materiales y soluciones necesarios: 1. Vasos de papel pequeños (100 a 120 ml) (PARA ESPECIMENES FRESCOS SOLAMENTE) 2. Aplicadores de madera 3. Copas de papel cónicas con el ápice cortado ó embudos pequeños 4. Gasa o tela de cedazo del #50 5. Tubos para centrífuga (15 ml, vidrio o polipropileno) 6. Tapones para tubos de centrífuga 7. Centrífuga 8. Pizetas para agua y formalina-acetato de etilo. La botella de acetato de etilo requiere un tapón. 9. Reloj o cronómetro 10. Hisopos de algodón (no estériles) 11. Pipetas Pasteur con bulbos 12. Laminillas de vidrio para microscopio de 76 x 50 mm 13. Cubreobjetos de grosor #1, 22 x 22 mm 14. Agua de la llave 15. Acetato de etilo, grado certificado 16. Formol neutral buferado al 10%. Ver la fórmula de preparación en la página 14. B. Técnica para especimenes en fresco 1. Mezcle bien una porción de las heces del tamaño aproximado de una canica con agua suficiente para hacer una suspensión de tal manera que 10 ml de ésta resulte en un ml de sedimento posterior a la centrifugación. La suspensión se puede preparar en un vaso pequeño de papel. 2. Pase por el colador aproximadamente 9 ml de la suspensión a través del pequeño embudo con dos capas simples de gasa o una capa de cedazo. Para conservar materiales de vidrio, se puede sustituir el embudo con un vaso cónico de papel sin ápice. 3. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Decante el sobrenadante. Debe quedar un 1 ml de sedimento. Si la cantidad es mucho mayor o mucho menor, ajuste a la cantidad adecuada con los siguientes métodos: a. Cantidad excesiva. Resuspenda el sedimento en agua y elimine una porción. Por ejemplo, si la cantidad es el doble de la deseada, elimine la mitad de la suspensión. Agregue agua para tener un nivel de fluido de 10 ml y centrifugue nuevamente. 15
b. Cantidad escasa. Vierta el sobrenadante y cuele una segunda porción de la suspensión original de heces en el tubo. La cantidad por colar puede determinarse por el sedimento, si es aproximadamente la mitad de lo necesario, cuele otros 10 ml en el tubo. Centrifugue nuevamente. No es necesario tener la cantidad exacta de sedimento en el tubo, pero la cantidad debe ser aproximada a lo indicado anteriormente. Si la cantidad de sedimento es demasiada o muy poca puede resultar en una concentración ineficiente. 4. Resuspenda el sedimento en agua fresca, centrifugue, y decante como antes. 5. Agregue 9 ml de formol neutral al 10% al sedimento, mezcle bien, y permita que repose por 5 minutos o más. En este punto, la mezcla debe ser cerrada y guardarse hasta más tarde. 6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo y mezcle vigorosamente cuando menos por 30 segundos, manteniendo el tubo invertido. Retire el tapón cuidadosamente. 7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrán cuatro capas: (1) capa de acetato de etilo, (2) tapón de deshechos, (3) capa de formol, y (4) sedimento. 8. Libere el tapón de deshecho desde los lados del tubo introduciendo un aplicador y decante las tres capas superiores. Antes de regresar el tubo a la posición vertical, utilice un hisopo para limpiar los desechos y trazas de acetato de etilo de las paredes del tubo para evitar que se sedimenten. La presencia de acetato de etilo en el sedimento final puede causar problemas para elaborar un frotis directo adecuado. 9. Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se tiene 0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espécimen estará muy diluido como para hacer una preparación satisfactoria. Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede guardar por algún tiempo (meses). Desde luego que no se debe permitir que el sedimento se seque.
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10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga las preparaciones con lugol y frotis sin teñir como acostumbre para su examen microscópico. C. Técnica para conservar especimenes en formol 1. Mezcle bien o revuelva el espécimen en formol. 2. De acuerdo a la densidad del espécimen, cuele una cantidad suficiente a través de dos capas de gasa simple o una capa de cedazo obtenga en un tubo de centrifuga la cantidad adecuada de sedimento como se indica abajo. Usualmente es suficiente de 2 a 3 ml de heces a no ser que la suspensión esté muy diluida. 3. Agregue agua de la llave hasta tener 9 ml de suspensión, mezcle bien, y centrifugue a 500 x g por 10 minutos. 4. Decante el sobrenadante. La cantidad de sedimento debe ser aproximadamente de 0.5 ml. Si la cantidad es poca o mucha, ajuste la cantidad siguiendo el mismo método descrito en el paso 3 para especimenes frescos. En aquellos especimenes conservados en formol estos se han aclarado en algún grado, y aclararán más principalmente por el acetato de etilo. De tal manera que la reducción del sedimento es menor que en heces frescas y la cantidad inicial debe ser menor. 5. Agregue 9 ml de 10% formol neutral al sedimento y mezcle bien. 6. Agregue 4 ml de acetato de etilo, tape el tubo, mezcle en posición invertida por 30 segundos. Retire el tapón cuidadosamente. 7. Centrifugue a 500 x g por 10 minutos. Se obtendrán 4 capas. Ver la descripción en el paso 7 para especimenes frescos. 8. Libere el tapón de deshechos de los lados del tubo por medio de un aplicador y decante cuidadosamente las tres capas superiores. Antes de regresar el tubo a la posición vertical, utilice el hisopo para limpiar los desechos y todos los restos de acetato de etilo de las paredes del tubo para prevenir que se sedimente. La presencia de acetato de etilo en el sedimento final puede causar problemas para elaborar un frotis directo adecuado.
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9.
Con una pipeta, agregue el doble de la cantidad de formol neutral al 10% que la cantidad final de sedimento. Por ejemplo, si se tiene 0.2 ml de sedimento final, agregue 0.4 ml de formol. Tenga cuidado de no agregar mucho, de lo contrario el espécimen estará muy diluido como para hacer una preparación satisfactoria. Una vez agregado el formol, el tubo se debe tapar y se puede guardar por algún tiempo (meses). Desde luego que no se debe permitir que el sedimento se seque.
10. Con una pipeta Pasteur, mezcle el sedimento y el formol y haga las preparaciones con lugol y frotis sin teñir como acostumbre para su examen microscópico. Ver la página 11.
IV. Tinción ácido-resistente modificada de Kinyoun para oocistos Cryptosporidium* en muestras de heces Las tinciones ácido-resistentes son útiles para distinguir los oocistos de Cryptosporidium de otros organismos que se encuentran en las heces, particularmente levaduras. Los oocistos son ácido-resistentes y retienen el color rojo de la tinción de carbol-fucsina después de la decoloración ácida. Puesto que muchas levaduras no son ácido-resistentes, se decoloran al someterlas al decolorante ácido, por lo que adquieren la tinción de contraste. La técnica que se presenta aquí es un método modificado en frío adaptado por Marilyn S. Bartlett, del Departamento de Microbiología/Patología del Centro Médico de la Universidad de Indiana, basado en la tinción ácido-resistente de Kinyoun modificada para Nocardia. *Esta técnica puede utilizarse también para teñir oocistos de Isospora belli A. Materiales y soluciones necesarias: 1. Laminillas de vidrio, 76 x 26 mm 2. Pipetas Pasteur con bulbos 3. Vasos de Coplin, con capacidad de 50 ml 4. Pinzas para manipular las laminillas 5. Reloj o cronómetro 6. Papel secador 7. Medio para montar laminillas 8. Cubreobjetos, de espesor #1, 22 x 22 mm 9. Microscopio (descripción en la página 1) 10. Agua corriente de la llave (chorro suave) 11. Alcohol metílico absoluto
18
12. Tinción ácido-resistente: Carbol-fucsina modificada Kinyoun a. Tinción comercial: Carbol-fucsina modificada Kinyoun Fórmula, EMDS/Harleco #7645X b. Preparación: Fucsina básica, índice de color No.42510 Alcohol etílico, 95% Fenol, líquido Agua destilada
4g 20 ml 8 ml 100 ml
Se coloca el colorante de fucsina básica en un matraz Erlenmeyer de 500 a 1,000 ml. Se agrega el alcohol lentamente, mezclando constantemente para disolver el polvo. (La fucsina básica tiende a “hervir” cuando se agrega el alcohol; es importante agregar el alcohol lentamente y mezclar constantemente.) Agregar el fenol y el agua a la solución colorante. Mezcle bien. Guarde en una botella con tapa de rosca. 13. 50% Alcohol etílico Alcohol etílico Agua destilada
50 ml 45 ml
Mezcle bien. Guarde en una botella de vidrio con tapón de vidrio. 14. Decolorante ácido Ácido sulfúrico, concentrado Alcohol etílico, 95%
10 ml 90 ml
Mezcle el ácido con el alcohol. Guarde en una botella de vidrio con tapón de vidrio. 15. Tinción de contraste: Verde malaquita Verde malaquita, índice de color No. 42000 . Agua destilada
3g 100 ml
Disuelva el colorante en agua. Guarde en una botella de vidrio con tapón de vidrio. 19
B. Técnica: 1. Haga un frotis delgado de una muestra de heces en una laminilla de 76 x 26 mm. El frotis puede hacerse de heces frescas, sin conservar o de heces conservadas con formol neutral al 5% o 10%. Los frotis hechos del sedimento después de la concentración de formalina-acetato de etilo puede dar un buen número de oocistos. 2. Deje secar el frotis al aire a temperatura ambiente, o puede acelerar el proceso de secado incubando a 37-42 °C. 3. Fije el frotis con alcohol metílico absoluto por 30 segundos. Mantenga la laminilla inclinada, utilizando una pizeta o gotero, permita que el alcohol bañe la laminilla, O sumerja la laminilla en un vaso de Coplin con alcohol metílico. Permita secar. 4. Coloque la laminilla en la tinción de carbol-fucsina (en vaso de Coplin) por 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 6. Enjuague con alcohol etílico al 50% alcohol etílico (en vaso de Coplin) por 5 segundos agitando suavemente. 7. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 8. Decolore con alcohol H2SO4 al 10% (en vaso de Coplin) por 1-2 minutos. Ajuste el tiempo dependiendo del grosor del frotis. 9. Enjuague en agua corriente de la llave. 10. Sumerja la laminilla en la tinción de verde malaquita por 2 minutos. 11. Enjuague brevemente en agua corriente de la llave. 12. Seque perfectamente limpiando la parte de atrás de la laminilla y suavemente golpeando el frente. 13. Cubra con el cubreobjetos del #1 utilizando un medio para montar adecuado. 14. Examine con el microscopio de campo brillante en aumento de 400 X y 1000 X. Los oocistos de Cryptosporidium se tiñen de rojo. A veces se pueden observar esporozoítos individuales teñidos de rosa a rojo dentro de la pared del oocisto o en grupos de cuatro sin una pared del oocisto. Los oocistos de Isospora belli también se tiñen, pero no por completo. La masa germinal dentro del oocisto se tiñe de rojo y aunque la pared no se tiñe, a veces se precipita la tinción alrededor, delineando la estructura total. Frecuentemente, la pared del oocisto se colapsa, pero en presencia de otros oocistos, el parásito todavía se puede reconocer.
20
V.
Tinción ácido-resistente de Auramina O para oocistos de Cryptosporidium* en heces.
Desde la demostración de que los oocistos de Cryptosporidium son naturalmente ácido-resistentes, se ha utilizado una variedad de tinciones ácidoresistentes para distinguir las coccidias de levaduras, otros protozoarios y la materia fecal normal. Ésta técnica emplea auramina O, un tinte utilizado para tinción general y procedimientos de microscopía fluorescente. Esta es una auténtica tinción ácido-resistente y no se debe confundir con el procedimiento de anticuerpos fluorescentes (FA). Es una adaptación del procedimiento de auramina O utilizado para detectar Mycobacterium spp. en algunos laboratorios clínicos. *Esta técnica también es efectiva para teñir oocistos de Isospora belli . A. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Materiales y soluciones necesarias: Laminillas de vidrio para microscopio, 76 x 26 mm Pipetas Pasteur con bulbos Platina caliente eléctrica a 65 °C (PARA ESPECIMENES FRESCOS) Incubadora a 37-42 °C (PARA ESPECIMENES EN FORMOL) Tren de tinción Pinzas para manipular laminillas. Reloj o cronómetro Microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación BG-12 y un filtro de barrera OG-l, o un sistema equivalente. 9. Agua de la llave 10. Alcohol metílico absoluto 11. Tinción ácido-resistente Auramina O, índice de color No. 41000 Alcohol etílico, 95% Fenol, cristales Agua destilada
0.1 g 10.0 ml 3.0 gm 87.0 ml
Disuelva la auramina O en alcohol etílico. Disuelva los cristales de fenol en agua. Mezcle las dos soluciones juntas. Guarde en una botella oscura. 1. Decolorante ácido
2.
Ácido hidroclorhídrico, concentrado Alcohol etílico 70% Agregue con cuidado el ácido al alcohol. Tinción de contraste Permanganato de potasio Agua destilada Disuelva el permanganato de potasio en agua. 21
0.5 ml 100.0 ml 0.5 g 100.0 ml
B.
Técnica:
1. Prepare un frotis delgado de la muestra fecal en una laminilla 76 x 26 mm. El frotis se puede hacer a partir de heces frescas, sin conservar o de heces en 5% y10% de formol neutral. Los frotis hechos del sedimento después de la concentración de formalinaacetato de etilo puede dar un buen número de oocistos. Los frotis hechos de muestras de heces sin conservar se deben fijar con calor por lo menos una hora a 65 °C en la platina caliente. Los frotis conservados con formol pueden fijarse con calor a 37-42 °C hasta que el frotis se seca o puede ser secado al aire por 2-3 horas. 2. Fije todos los frotis con alcohol metílico absoluto por 30 segundos. Deje secar. 3. Coloque la laminilla en el tren de tinción e inunde con auramina O por 15-20 minutos a temperatura ambiente. Asegúrese que la tinción cubra el frotis. 4. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua. 5. Cubra el frotis con alcohol ácido y decolore por 2 minutos. 6. Enjuague con agua y elimine el exceso de agua. 7. Inunde la laminilla con la tinción de contraste, permanganato de potasio por 2 minutos. 8. Enjuague el frotis, elimine el exceso de agua y seque al aire. 9. Examine el frotis en el microscopio de fluorescencia observando detalladamente con el objetivo 20-25 X y observe críticamente con el objetivo 40-63 X. Los oocistos de Cryptosporidium se tiñen de naranja-amarillento, donde los materiales que no son ácido-resistentes o son parcialmente ácido-resistentes se observan pálidos, con un color menos brillante. Los oocistos de Isospora belli se tiñen de manera parecida a los oocistos de Cryptosporidium en cuanto a color e intensidad, pero desde luego, muestran su morfología típica de la especie en relación con el tamaño, forma y contenidos internos.
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VI. Bibliografía Angus KW. Cryptosporidiosis in man, domestic animals and birds: a review. J R Soc Med. 1983; 76:62-70. Ash LR, Orihel TC. Parasites: a guide to laboratory procedures and identification. 1a ed. Chicago: Prensa ASCP, 1987:328. Baxby D, Blundell N. Sensitive, rapid, simple methods for detecting Cryptosporidium in faeces. Lancet. 1983;ii:1149. Bogaerts J, Lepage P, Rouvroy D, et al . Cryptosporidium spp., a frequent cause of diarrhea in Central Africa. 1984;20:874-6. Bronsdon MA. Rapid Dimethyl Sulfoxide-modified acid-fast stain of Cryptosporidium oocysts in stool specimens. J Clin Microbiol. 1984;19:952-3. Brooke MM, Melvin DM. Morphology of diagnostic stages of intestinal parasites of humans. 2a ed. Atlanta, Georgia: Centros de Control de Enfermedades, 1984; DHHS publicación No. (CDC)84-8116. Brooke MM, Melvin DM, Healy GR. Common intestinal protozoa of humans: life cycle charts. 2a ed. Atlanta, Georgia: Centros de Control de Enfermedades, 1983. Campbell PN, Current WL. Demonstration of serum antibodies to Cryptosporidium sp. in normal and immunodeficient humans with confirmed infections. J Clin Microbiol. 1983;18:165-9. Casemore DP, Armstrong M, Sands RL. Laboratory diagnosis of cryptosporidiosis. J Clin Pathol. 1985;38:1337-41. Casemore DP, Sands RL, Curry A. Cryptosporidium species: a "new" human pathogen. J Clin Pathol. 1985; 38:1321-36. Current WL, Reese NC, Ernst JC, et al . Human cryptosporidiosis in immunocompetent and immunodeficient persons: studies of an outbreak and experimental transmission. N Engl J Med. 1983;308:1252-7. DeHovitz JA, Pape JW, Boncy M, et al . Clinical manifestations and therapy of Isospora belli infection in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med. 1986;315:87-90. 23
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25
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE CRYPTOSPORIDIOSIS INTESTINAL
ACTUALIZACIÓN – ENERO 1991*
*Actualización de la versión impresa original de 2001.
ACERCA DEL ORGANISMO
1. Desde que se imprimió éste libro de trabajo, la especie denominada parvum ha sido aceptada en su generalidad para identificar al Cryptosporidium recuperado de humano, ej. Cryptosporidium parvum. 2. Se agregó el diagrama del ciclo biológico de Cryptosporidium. Las siguientes definiciones pueden ayudar a la comprensión del ciclo: a. Oocistos- es el organismo enquistado producto de la fertilización del macrogameto y microgameto. b. Esporozoíto- es un organismo delgado, en forma de huso que es el estadio infectante de los parásitos esporozoíto. c. Esporogonia- la parte sexual del ciclo biológico de los parásitos esporozoíto en donde el cigoto enquistado (oocisto) sufre múltiples divisiones, dando lugar a los esporozoítos. d. Esquizontes- es el estadio de desarrollo de los parásitos esporozoíto después que el núcleo del trofozoíto se divide en varios núcleos de tamaño menor. e. Esquizogonia- la parte asexual del ciclo biológico que resulta de la formación de merozoítos. f. Merozoíto- el final del estadio de esquizogonia (reproducción asexual), que es capaz de infectar células del mismo huésped. g. Gametogenesis- el desarrollo de células sexuales masculinas y femeninas o gametos. h. Microgametocito- el gametocito macho que produce microgametos. i. Macrogametocito- el gametocito hembra que madura en un macrogameto. j. El cigoto es la célula que resulta de la unión de los gametos masculino y femenino, es el huevo fertilizado. 3. La fotografía del extremo superior derecho de la página 7 no está completa. Le estructura en la mitad superior está ligeramente hacia la derecha del centro de este oocisto maduro, y los esporozoítos se detectan en un examen cuidadoso. Las levaduras en gemación están en la mitad inferior ligeramente hacia la izquierda del centro. 2
ACERCA DE LAS TÉCNICAS 1.
2.
3.
4.
5.
6.
Aunque la mayoría de las levaduras no son ácido-resistentes y toman el color de la tinción de contraste en los procesos ácidos-resistentes, se pueden encontrar ocasionalmente levaduras que son ácido-resistentes. Si no se observan cuidadosamente se pueden confundir con oocistos de Cryptosporidium parvum. Las características diferenciales entre los oocistos de Cryptosporidium, es que estos contienen esporozoítos mientras que las levaduras no. En las preparaciones ácido-resistentes, observe cuidadosamente la presencia de esporozoítos (“salchichas rosadas”) en aquellos organismos sospechosos de ser oocistos. Si encuentran esporozoítos, aunque sean pocos en algunos oocistos, puede usted hacer una identificación positiva de Cryptosporidium. Las instrucciones para la técnica ácido-resistente indican que se debe realizar un frotis “delgado” a partir de las heces concentradas. Un frotis "delgado" es cuestión de juicio, generalmente significa más delgado que el frotis directo para el examen de heces concentradas. No significa que sea tan delgado que se cuestione si la preparación está en la laminilla. La materia fecal debe ser visible. Otras tinciones útiles para detectar oocistos de Cryptosporidium incluyen la técnica ácido-resistente de Ziehl-Neelsen, la tinción fluorescente de auramina-rodamina y la técnica de safranina-azul de metileno. Cualquiera de estas se pueden utilizar además de este libro de entrenamiento, si esto acelera el proceso de aprendizaje. Las técnicas que se presentan en el libro de trabajo representan aquellas que son confiables, fáciles de utilizar y económicas. Cualquiera que sea la técnica, asegúrese de que sea capaz de detectar esporozoítos individuales en algunos de los oocistos teñidos. Una prueba comercial que detecta oocistos de Cryptosporidium con anticuerpos monoclonales/fluorescencia directa informa una sensibilidad de 100% y una especificidad de 100%. Sin embargo, se requiere de un microscopio de fluorescencia y el costo por prueba es relativamente más elevado que los otros métodos que se han ofrecido aquí. Los oocistos de Cryptosporidium han sido recuperados de otros órganos además de las heces como: biopsias de pulmón, esputo, vesicular biliar, aspirado duodenal y otros especimenes directa o indirectamente asociados con el tracto gastro-intestinal. La detección de oocistos en estos especimenes se puede realizar utilizando técnicas similares a las que se han ofrecido en este paquete, las instrucciones específicas para dichas técnicas no están contempladas aquí. Existen pruebas comerciales para detectar coproantígenos de oocistos de Cryptosporidium.
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