La urea es una sustancia con alto contenido en nitrógeno que se produce cuando el cuerpo metaboliza las proteínas y aminoácidos. Se produce en el hígado; y el riñón es el encargado de eliminarla del cuerpo a través de la orina. Su concentración la determinamos en una muestra, utilizando un kit enzimático que cuantifica dicha concentración a través de la denominada reacción de Berthelot modificada (donde los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato para formar un complejo de color verde). El objetivo de esta prueba diagnóstica es determinar si los riñones funcionan en su normalidad, si ha empeorado una enfermedad renal existente; también, para llevar el seguimiento de una enfermedad renal o para determinar si una persona se encuentra o no deshidratada .
INTRODUCCIÓN
Es de vital importancia mantener el organismo en un constante equilibrio, uno de tantos órganos que ayudan a esta nivelación son los riñones, los cuales están constantemente excretando orina. El compuesto más abundante en la orina es la urea, ésta se forma a partir del amoníaco a nivel hepático. La urea es el producto normal de la degradación de las proteínas. En el presente informe se determinará la concentración de urea en una muestra de orina, con el fin de valorar la función renal; para ello utilizaremos un kit enzimático que cuantifica dicha concentración a través de una reacción de Berthelot modificada (donde los iones amonio reaccionan con hipoclorito y salicilato para formar un complejo color verde). Además, se pretende dar a conocer la relación de la concentración plasmática de urea y otros compuestos nitrogenados, como son creatinina y ácido úrico con la función de los riñones. Valores normales en cuanto a la concentración de urea fluctúan entre 20-40 mg/dl. Alteraciones en este rango puede llevar por ejemplo, a una elevación de este compuesto en la sangre que puede deberse: a deshidratación, obstrucciones renales, fallo renal, entre otros. El presente informe tiene por objetivo conocer la técnica para el análisis cuantitativo de urea en una muestra de orina por medio de reacciones colorimétricas enzimáticas a realizar.
Materiales Para realizar este trabajo se necesitara:
Espectrofotómetro ajustado a 578 nm. Cubetas de plástico de 1,5 ml. Material volumétrico. Micro-pipetas de 100µl y de 1000µl Tubos de ensayo. Muestra de suero. Kit para la determinación enzimática de urea en orina. Timer o cronometro.
Método Para realizar las mediciones de las concentraciones de urea presente en la orina se necesitan preparar previamente unas diluciones de ésta, debido a que se encuentra muy concentrada. Se preparan 3 soluciones en tubos de ensayos distintos de la siguiente forma:
En el primer tubo se agregan 10 µl de orina mas 490 µl de agua, la cual resulta en una disolución de 500 de dilución 1/50. En el segundo tubo se prepara una dilución extrayendo 100 µl de la dilución anterior (1/50) más 100 µl de agua quedando 200 µl de dilución 1/100. Por último en el tercer tubo se agregaran 100 µl de la dilución anterior (1/100) más 100 µl de agua quedando 200 µl de dilución 1/200.
Teniendo los tres tubos listos con sus respectivas diluciones, se prepararan de la siguiente manera para su posterior medición:
Tubo N°1: (blanco) contienen 10 µl de H2O más 1mL de reactivo 1. Tubo N°2: (estándar) contienen 10 µl de estándar de urea más 1mL de reactivo 1. Tubo N°3: (dilución 1/50) contienen 500 µl de la dilución más 1mL de reactivo 1. Tubo N°4: (dilución 1/100) contienen 200 µl de dilución más 1mL de reactivo 1. Tubo N°5: (dilución 1/200) contienen 200 µl de dilución más 1 mL de reactivo 1.
Después de agregar los compuestos en cada tubo, estos se mezclan por agitación y se dejan incubar durante 10 minutos y se agrega 1 mL de reactivo 2 en cada uno de los tubos, se agitan y se dejan incubar otros 10 minutos más. Luego se toma 1 mL de cada tubo y son dejados en las cubetas en las cuales serán medidas las absorbancias en el espectrofotómetro.
Resultados Los cálculos se realizaran según la siguiente forma:
Concentración Urea (mg/dL) = Δ Absorbancia de la muestra x 80 Δ Absorbancia del Estándar
Donde: Abs. tubo blanco Δ Absorbancia del Estándar= Abs. del tubo estándar - Abs. tubo blanco. Δ Absorbancia de la muestra= Abs. de los tubos –
1).- Resultados de Absorbancia y Transmitancia a 578nm; como se indica en tabla correspondiente a la determinación de urea. Muestras
T%
Absorbancias
Blanco
78,5
0,105
Estándar urea
7,4
1,130
Orina dilución 1/50
12,2
0,915
Orina dilución 1/100
34,1
0,467
Orina dilución 1/200
51,3
0,290
2).- Para llevar a cabo la medición correcta de las concentraciones de urea se debe tomar en cuenta los factores de dilución, para desarrollar los cálculos
Tubo 3 (dilución 1/50)
Concentración urea (mg/dL) = ((0,915 - 0,105)/2) x 80 = 31,61 mg/dL 1,025
Tubo 4 (dilución 1/100)
Concentración urea (mg/dL) = (0,467- 0,105) x 200 = 28,25 mg/dL 1,025
Tubo 5 (dilución 1/200)
Concentración urea (mg/dL) = ((0,290- 0,105) x 2) x 80 = 28,88 mg/dL 1,025
Discusión
Es importante señalar que tal cual se pensaba, efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbancia-concentración fue directamente proporcional; debido a que el muestra estándar (tubo 2) debía ser el que presentara una absorbancia mayor en comparación con las demás muestra, lo cual se cumplió. En el caso de los tubos 3, 4 y 5 en donde corresponden a los muestras con orina diluida al 1:50, 1:100 y 1:200 respectivamente; al igual como ocurrió en el caso anterior; lo que se creía fue efectivamente comprobado. Luego de leer las absorbancias de estas muestras nos arrojó que la muestra 3 (1:50), que es el tubo que tuvo mayor concentración de orina fue el que presento una absorbancia mayor en comparación a las dos restantes muestras con orinas mas diluidas. Por consiguiente fue la muestra 5 (1:200) el que presento una absorbancia menor; sin considerar y dejando claro que indudablemente nuestro tubo blanco será nuestra muestra que arroje valores siempre menores de absorbancia. Tal como se ha realizado en trabajos anteriores; en este trabajo también se ocupo el método “colorimétrico enzimático” el cual nos sigue colocando en manifiesto los hechos mencionados anteriormente, los cuales nos dejan en evidencia mediante el cambio de color de las muestras a una tonalidad verde, que la intensidad de color varia según la concentración de urea presente siendo proporcional, por este motivo es la muestra 2 la que presenta un cambio de color a verde de mayor intensidad, mientras que nuestra muestra 1 que es nuestro tubo blanco no debía presentar cambios de color lo cual efectivamente así sucedió.
Preguntas Anexas 1. ¿Qué se entiende por uremia? Por uremia se entiende síndrome producido por la acumulación en la sangre de los productos tóxicos que en estado general normal, son eliminados por el riñón y que se hallan retenidos por un trastorno del funcionamiento renal.
2. ¿Cuáles son los valores normales para los métodos descritos en el práctico? Los valores normales descritos en el práctico son entre 10 – 50 mg/dl.
3. Relación entre excreción de productos nitrogenados y función renal. La relación que existe es que la capacidad de excretar productos nitrogenados va directamente relacionada con la función renal, ya que si hay retención de productos de desechos quiere decir que se encuentra afectada la capacidad filtradora del riñón acumulándose este metabolito principalmente en la sangre.
4. Respecto al método de análisis usado en este practico: ¿Por qué es colorímetro enzimático?, ¿Qué diferencia tiene con el método, también colorímetro enzimático utilizado en el practico anterior? Es colorímetro enzimático porque que requiere de reacciones enzimáticas para poder obtener un compuesto de color a partir de un sustrato (urea en esta oportunidad). Y la diferencia con el practico anterior es que necesitamos de dos reactivos (reactivo 1 y reactivo 2) los cuales incubamos en dos ocasiones (10 minutos primero, 10 minutos después).
5. ¿Cómo es la concentración de los sustratos en relación al Km de la enzima, porque? La concentración del sustrato es directamente proporcional al producto final generado por la enzima.
6. ¿En qué porción de la curva de Michaelis-Menten estamos trabajando? ¿Porque? Cuando se trabaja con concentraciones de sustrato muy grandes con respecto al Km se trabaja en la parte superior de la curva de Michaelis-Menten, si se trabaja a concentraciones menores de sustrato, se trabaja en la parte inferior, y si la concentración es infinita se trabaja a una Vmáx. En este caso y en estas condiciones está trabajando a un nivel máximo de sustrato, o sea, que la muestra se saturó.
7. ¿Cuál es el producto que absorbe a la longitud de onda en que haremos la determinación? El producto que absorbe la longitud de onda en que haremos la determinación es el indofenol (colorante obtenido por una reacción de oxidación, al mezclar para-aminofenol y de un fenol), en donde cuya intensidad de color es proporcional a la cantidad de urea presente en la muestra obtenida.
8. ¿Qué entiende por de uso de enzimas como herramientas para determinación de sustratos? El uso de enzimas como herramientas para la determinación de sustratos se entiende como el fin de dar la propiedad de absorber luz a moléculas que se deseen medir, mediante reacciones enzimáticas que producen cambios bioquímicos de gran importancia en las moléculas para que presenten una absorbancia debidamente realizada.
9. ¿En que se basa el cálculo de concentración de un sustrato, mediante una reacción enzimática colorimétrica, utilizando un estándar de concentración conocida? En que la absorbancia obtenida del estándar corresponde a su respectiva concentración y se relaciona en proporción con las absorbancias obtenidas de las muestras.
CONCLUSIÓN Para valorar la función renal es de vital importancia la cuantificación de concentración de urea en la orina, ya que hay una directa relación de la capacidad de este órgano, ya sea, a modo de filtración, como también en la excreción. Por otro lado, es importante recordar que la urea es el principal producto terminal del metabolismo de proteínas en el ser humano y en los mamíferos en general. Un adulto elimina de 25 a 39g de este compuesto diariamente. Acumulaciones de este producto final del metabolismo, puede provocar graves afecciones, entre otras la uremia, que es producida por la acumulación en la sangre de los productos tóxicos que generalmente, son eliminados por el riñón y que se encuentran suspendidos por un trastorno del funcionamiento renal. En el práctico al obtener los resultados, logramos comprobar que tal cual se pensaba, efectivamente la lectura de la absorbancia y la relación absorbancia-concentración fue directamente proporcional; debido a que el muestra estándar que utilizamos (tubo 2), debía ser el que presentara una absorbancia mayor en comparación con las demás muestras, lo cual se verificó. El método colorimétrico enzimático ejecutado en este laboratorio, indica que es de gran utilidad para la medición de la concentración de urea en la muestra de orina. Por otro lado, además de ser muy exacto en las mediciones realizadas de las distintas soluciones, no presenta problemas en cuanto a la maniobra, lo que lo hace un método bastante expedito y preciso, de acuerdo a la realización.
Bibliografía
http://es.scribd.com/doc/35196414/CAPITULO08-Enzima-Km-y-Vmax http://www.fmvuba.org.ar/grado/medicina/ciclo_biomedico/segundo_a %C3%B1o/bioquimica/Seminario%206-Enzimas.pdf
http://blogs.ya.com/tzuvicioqodontolog/files/Guias_Laboratorio_ODON_0007__2008.pdf Guía de trabajos prácticos Bioquímica para tecnología médica. Determinación de urea.
