Nama : Moudityo Moudityo Kurnia Bikadias (1520038) Kelas : 2-E (PMIP)
Validasi Metode Uji Penetapan Kadar Protein Dalam Mi Instan Secara Titrimetri
1. Ruang Lingkup :
Standar ini menetapkan cara uji kadar protein dalam mi instan. Mi instan dicirikan dengan adanya penambahan bumbu dan memerlukan proses rehidrasi untuk siap dikonsumsi. Jenis metode uji : Pengujian metode absolut SNI 3551:2012 2. Cara Kerja 2.1 Prinsip
Contoh di destruksi dengan H2SO4 menggunakan CuSO4 sebagai katalis dan K 2SO4 untuk meningkatkan titik didihnya bertujuan melepaskan nitrogen d ari protein sebagai garam ammonium. Garam ammonium tersebut diuraikan menjadi NH3 pada saat destilasi menggunakan NaOH. NH3 yang dibebaskan diikat dengan asam borat menghasilkan ammonium borat yang secara kuantitatif dititrasi dengan larutan baku asam sehingga dipe roleh total nitrogen. Kadar protein diperoleh dari hasil kali total nitrogen dengan 6,25. Reaksi :
- Proses destruksi (CHON)n (s) + H2SO4 (aq) (Katalis selen)
(NH4)2SO4 (aq) + CO2 (g) + H2O (l)
- Proses destilasi (NH4)2SO4 (aq) + 2NaOH (aq) NH3 (g) + H3BO3 (aq)
Na2SO4 (aq) + 2NH3 (g) + 2H2O (l) (NH4)3BO3 (aq)
- Proses titrasi (NH4)3BO3 (aq) + 3HCl(aq)
H3BO3 (aq) + 3NH4Cl (aq)
- Standardisasi HCl Na2B4O7 (s) + 2 HCl(aq) + 5 H2O(l)
2 NaCl(aq) + 4 H3BO3 (aq)
2.2 Peralatan
Labu Kjeldahl 100 mL Destilator dan kelengkapannya Pemanas listrik / alat destruksi dilengkapi dengan penghisap asap Neraca analitik terkalibrasi dengan ketelitian 0,1 mg Buret 10 mL terkalibrasi Batu didih
2.3 Bahan
Mi instan Asam sulfat (H2SO4) pekat Kalium sulfat (K 2SO4) Selenium oksida (SeO2) Tembaga sulfat (CuSO4.5H2O) Indikator methyl red , bromocresol green dan fenolftalein Etanol 95% Asam borat H3BO3 Air suling (aquades) Hablur Natrium hidroksida (NaOH) Asam klorida (HCl) pekat Natrium tetraborat (Na2B4O7.10H2O)
2.4 Persiapan uji A. Persiapan sampel
Mi instan dimasak dan diberi bumbu sesuai prosedur yang terdapat dalam kemasan B. Preparasi Sampel a. Ditimbang 1 g contoh kedalam labu kjeldahl, 1 g campuran katalis selen, 8 butir sampai dengan 10 batu batu didih dan 25 mL H2SO4 pekat. b. Campuran dipanaskan dalam pemanas listrik sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijau-hijauan. Pemanasan dilakukan dalam lemari asam atau alat destruksi dilengkapi dengan unit penghisap asap. c. Dibiarkan hingga dingin, lalu encerkan dengan aquades secukupnya
C. Pembuatan larutan
Pembuatan katalis selen Dicampurkan 4 g serbuk SeO2, 150 g K 2SO4 dan 30 g CuSO4.5H2O Pembuatan indikator Conway Dilarutkan 0,2 g methyl red dengan etanol 95% menjadi 100 mL. Dilarutkan 1 g bromocresol green dengan etanol 95% menjadi 500 mL. Dicampurkan 1 bagian larutan methyl red dan 5 bagian larutan bromocresol green dalam gelas piala lalu dipindahkan dalam botol bertutup gelas. Pembuatan larutan asam borat, H 3BO3 4% Dilarutkan 40 g H3BO3 dengan aquades menjadi 1.000 mL dan ditambahkan 3 mL larutan indikator Conway (larutan akan berwarna k uning terang) dan dipindahkan ke dalam botol bertutup gelas. Pembuatan larutan natrium hidroksida, NaOH 30% Dilarutkan 600 g hablur NaOH dengan air suling menjadi 2.000 mL, disimpan ke dalam botol bertutup karet Pembuatan larutan indikator fenolftalein (PP) 1% Dilarutkan 1 g serbuk indikator PP dengan alkohol 95% dan encerkan menjadi 100 mL Pembuatan larutan asam klorida, HCl 0,1 N Dipipet dengan hati-hati 8,60 mL HCl pekat (36,5% sampai dengan 38%) ke dalam labu ukur 1 L dan diencerkan dengan aquades sampai tanda garis dan ditentukan normalitasnya
2.5 Prosedur uji a. Prosedur uji standardisasi Ditimbang 3,8137 g Na2B4O7.10H2O dan dilarutkan dalam100 mL H2O mendidih. Kemudian larutan Na2B4O7.10H2O dipipet dalam volume tertentu (tercatat), dititrasi dengan larutan HCl 0,1 N. b. Prosedur uji penetapan kadar protein dalam mi instan a. Sampel yang telah dipreparasi ditambahkan 75 mL larutan NaOH 30% (diperiksa dengan indikator PP sehingga larutan menjadi basa) b. Disuling selama 5 menit sampai dengan 10 menit atau saat larutan destilat telah mencapai kira-kira 150 mL, dengan penampung destilat adalah 50 mL larutan H3BO3 4 % c. Ujung pendingin dibilas dengan aquades d. Larutan campuran destilat dititar dengan larutan HCl 0,1 N yang telah distandardisasi dan dikerjakan penetapan blanko. Rumus : e. Perhitungan Normalitas HCl
NHCl=
,8,8× ××
Keterangan : 3,8137 adalah bobot Na2B4O7, yang dinyatakan dalam gram 381,37 adalah bobot molekul Na2B4O7 2 adalah bilangan oksida boraks VP adalah volume Na2B4O7 VB adalah volume HCl 0,1 N Perhitungan kadar protein dalam mi instan
Kadar protein (%)
1−××14,007×6,5×100%
Keterangan : V1 adalah volume HCl 0,1 N untuk titrasi contoh, dinyatakan dalam mililiter (mL) V2 adalah volume HCl 0,1 N untuk titrasi blanko, dinyatakan dalam mililiter (mL) N adalah normalitas larutan HCl, dinyatakan dalam Normalitas (N) W adalah bobot contoh, dinyatakan dalam miligram (mg) 14,007 adalah bobot atom Nitrogen 6,25 adalah faktor konversi untuk protein
3. Parameter dan Tahapan Validasi Metode Uji
No.
Parameter Uji
Syarat Keberterimaan %RSD < 5%
Bahan Uji
Keterangan (sumber)
1.
Presisi
Sampel
SNI 3551:2012
2.
Akurasi
%Recovery (97% - 105%)
sampel + spike standar protein
3.
MDL ( Method Detection Limit )
Larutan warna ungu
Blanko sampel + spike standar protein
4.
LOQ ( Limit of Quantitation)
%RSD < 5%
Blanko sampel + spike standar protein
Riyanto,Ph.D.2014.Validasi dan verifikasi metode uji.Deepublish, Yogyakarta Candra Irawan .2009. Pengantar Kimia Organik II.Politeknik AKA bogor SNI 3551:2012
5.
Robutness
Fhitung < Ftabel thitung < ttabel
Sampel
6.
Estimasi ketidakpastian pengukuran
U < 10% Nilai uji
Sampel
Riyanto,Ph.D.2014.Validasi dan verifikasi metode uji.Deepublish, Yogyakarta Herawati. 2017. Desain Validasi Metode uji. Politeknik AKA, Bogor
1. Prosedur pengujian presisi Lakukan tujuh kali pengujian terhadap sampel sesuai prosedur uji, kemudian nilai %RSD ( Relative Standard Deviation) hasil pengujian dihitung menggunakan rumus sebagai berikut. Rumus
∑ =
∑ − = √ − % ×% Keterangan : xi adalah nilai kadar protein dalam sampel yang didapat dari penetapan, yang dinyatakan dalam % n adalah banyaknya pengulangan adalah nilai rata-rata kadar protein dalam sampel dari penetapan, yang dinyatakan dalam % s adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel, yang dinyatakan dalam %
̅
Syarat keberterimaan presisi yaitu %RSD < 5%
2. Prosedur pengujian akurasi Sampel mi instan ditetapkan kadar proteinnya seban yak tujuh kali ulangan sesuai prosedur uji, kadar yang didapat merupakan kadar sampel awal (C2) Sampel yang sama diujikan sebanyak tujuh kali yang sebelumnya ditambahkan standar protein (BSA atau Bovine Serum Albumin) sebanyak 5% dari sampel, yang dinyatakan sebagai kadar spike (C1), kemudian dianalisa dan kadar yang didapat merupakan kadar sampel setelah diberi spike (C3) Nilai akurasi ditetapkan sebagai % recovery dengan rumus sebagai berikut
% − ×% Rumus
Keterangan C1 adalah kadar standar protein yang ditambahkan kedalam sampel, yang dinyatakan dalam % C2 adalah kadar protein dalam sampel, yang dinyatakan dalam % C3 adalah kadar protein dalam sampel yang telah ditambahkan standar protein, yang dinyatakan dalam % Syarat keberterimaan akurasi yaitu (97% %recovery 105%)
≤
≥
3. Prosedur pengujian MDL ( Method Detection Limit ) Lakukan persiapan blanko sampel dengan ditambah standar protein (BSA atau Bovine Serum Albumin) sebanyak 0,02%, 0,1% dan 1%. Lakukan 10 kali pengulangan untuk masing-masing kadar standar protein, kemudian preparasi blanko standar yang telah ditambahkan standar. Tambahkan 2 mL larutan NaOH 10% dan 3 tetes larutan CuSO4 0,1%. Diamati warna yang terbentuk. Syarat keberterimaan dari pengujian MDL adalah terbentuk larutan berwarna ungu
4. Prosedur pengujian LOQ ( Limit of Quantitation) lakukan penambahan standar protein (BSA atau Bovine Serum Albumin) sebanyak 1% kedalam blanko sampel, kemudian lakukan tujuh kali pengujian seperti pada prosedur uji. Kemudian nilai %RSD hasil pengujian dihitung menggunakan rumus sebagai berikut. Rumus
∑ =
√ ∑=−− % ×% Keterangan : xi adalah nilai kadar protein dalam sampel yang didapat dari penetapan, yang dinyatakan dalam % n adalah banyaknya pengulangan adalah nilai rata-rata kadar protein dalam sampel dari penetapan, yang dinyatakan dalam % s adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel, yang dinyatakan dalam %
̅
Syarat keberterimaan LOQ yaitu %RSD < 5%
5. Prosedur pengujian Robutness Lakukan penetapan kadar protein dalam mi instan dengan waktu penyulingan yang divariasikan dengan 7 kali ulangan pada masing-masing kondisi pengujian. Kemudian hasil uji dibandingkan dengan data penetapan kadar protein sesuai prosedur uji dan diolah secara statistik untuk menentukan keberterimaan presisi dan akurasi yang. Uji F untuk presisi dan uji t untuk akurasi, dengan rumus sebagai berikut.
Rumus
∑ =
∑ √ =−− Uji-F Hipotesis :
H0 : Presisi metode diterima H1 : Presisi metode tidak diterima
;
Kriteria uji : tolak H0 jika Fhitung>Ftabel Uji-t Hipotesis :
H0 : Akurasi metode diterima H1 : Akurasi metode tidak diterima
− ++−− √
√
Kriteria uji : tolak H0 jika thitung>ttabel Keterangan : xi adalah nilai kadar protein dalam sampel yang didapat dari penetapan, yang dinyatakan dalam % n adalah banyaknya pengulangan adalah nilai rata-rata kadar protein dalam sampel dari penetapan, yang dinyatakan dalam % s adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel, yang dinyatakan dalam % s1 adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel dengan nilai yang lebih besar dari s2, yang dinyatakan dalam % s2 adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel dengan nilai yang lebih kecil dari s1, yang dinyatakan dalam %
̅
Syarat keberterimaan R obutness yaitu Fhitung < Ftabel; thitung < ttabel
6. Prosedur pengujian estimasi ketidakpastian pengukuran Lakukan tujuh kali penetapan kadar protein dalam sampel mi instan dan evaluasi hasilnya dengan estimasi ketidakpastian pengukuran kadar protein dalam mi instan. Lakukan estimasi sesuai proses berikut. Bagan Kerja Standardisasi HCl 0,1 M 3,8137 g 100 mL + H2O mendidih Na2B4O7.10H2O
pipet
Titrasi dengan larutan HCl 0,1 N
Rumus
NHCl=
,8,8× ××
Keterangan : 3,8137 adalah bobot Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam gram 381,37 adalah bobot molekul Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam g/mol 2 adalah bilangan oksida Na2B4O7.10H2O yang dinyatakan dalam mol/grek VP adalah volume Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam L VB adalah volume HCl, yang dinyatakan dalam L Simbol
Keterangan
Nilai
Satuan
m
Bobot Na2B4O7.10H2O
3,8137
g
BM
Bobot molekul Na2B4O7.10H2O
381,37
g/mol
VP
Volume Pipet
VLT
Volume Labu takar
VB
Volume Buret
L
N
Normalitas HCl
N
P
Kemurnian Na2B4O7.10H2O
%
FP
Pengenceran
L 0,1
L
Fish Bond VB
FP
kal
kal
VLT
kal
VP
efek T
efek T efek T
Kadar Protein (%) kal
m
BM
PM
P
Rumus
1. Rumus penentuan ketidakpastian asal penimbangan (m)
Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi neraca yang terdapat p ada sertifikat, yang dinyatakan dalam gram k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian kalibrasi neraca
2. Rumus penentuan ketidakpastian asal penimbangan (P)
Keterangan :
adalah ketidakpastian dari kemurnian Na2B4O7.10H2O yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam % k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian kemurnian 3. Rumus penentuan ketidakpastian baku asal BM (BM)
∑ ×
Keterangan : Q adalah ketidakpastian dari berat atom penyusun Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam gram/mol n adalah jumlah atom k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian berat molekul
× × ℎ
4. Rumus penentuan ketidakpastian asal buret (VB)
√
ℎ Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi buret yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam mL adalah besar koefisien muai air yang dinyatakan dalam °C-1 adalah volume rata-rata HCl yang diturunkan dari buret, yang dinyatakan dalam mL adalah besar selisih suhu ruangan tempat dilakuk annya standardisasi dengan suhu optimum penggunaan buret pada sertifikat, yang dinyatakan dalam °C k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian hasil kalibrasi buret 5. Rumus penentuan ketidakpastian asal Faktor pengenceran (VFP)
× ( ) ( ) × × ℎ √ × × ℎ √
Pipet
Labu takar
ℎ Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi pipet yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam mL adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi labu takar yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam mL adalah besar koefisien muai air yang dinyatakan dalam °C-1 V p adalah volume pipet yang dinyatakan dalam mL VLT adalah volume labu takar yang dinyatakan dalam mL adalah besar selisih suhu ruangan tempat dilakukannya penetapan kadar dengan suhu optimum penggunaan buret pada sertifikat, yang dinyatakan dalam °C k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian hasil kalibrasi
∑ =
6. Rumus penentuan ketidakpastian asal Presisi Metode (PM)
∑ − = √ − % ×% Keterangan : xi adalah nilai normalitas HCl, yang dinyatakan d alam g/grek n adalah banyaknya pengulangan PM adalah nilai rata-rata normalitas HCl, yang dinyatakan dal am g/grek PM adalah nilai simpangan baku dari normalitas HCl, yang dinyatakan dalam g/grek 7. Rumus penentuan ketidakpastian gabungan (CSx)
×
Keterangan : CSx adalah rata-rata Normalitas HCl, yang dinyatakan dalam N W adalah nilai rata-rata penimbangan Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam gram BM adalah berat molekul Na2B4O7.10H2O yang dinyatakan dalam gram/mol VB adalah nilai rata-rata Volume HCl 0,1 N yang diturunkan dari buret, yang dinyatakan dalam mL PM adalah rata-rata Normalitas HCl, yang dinyatakan dalam N FP adalah factor pengenceran P adalah nilai kemurnian Na2B4O7.10H2O, yang dinyatakan dalam %
2×
8. Rumus penentuan ketidakpastian yang diperluas (U)
9. Pelaporan kadar protein dalam mi instan (CSx U) N
Bagan Kerja penetapan protein 1 g sampel Labu kjeldahl 100 mL
+ 1 g katalis selen +8-10 batu didih + 25 mL H2SO4 (p) Labu destilasi
+ 755−10 mL NaOH 30%
penampung destilat + 40 mL H3BO3 4%
Titrasi dengan larutan HCl 0,1 N
Rumus
Kadar protein (%)
1−××14,007×6,5×100%
Keterangan : V1 adalah volume HCl 0,1 N untuk titrasi contoh, dinyatakan dalam mililiter (mL) V2 adalah volume HCl 0,1 N untuk titrasi blanko, dinyatakan dalam mililiter (mL) N adalah normalitas larutan HCl, dinyatakan dalam Normalitas (N) W adalah bobot contoh, dinyatakan dalam miligram (mg) 14,007 adalah bobot atom Nitrogen 6,25 adalah faktor konversi untuk protein
Simbol
Keterangan
Nilai
Satuan
W
Bobot sampel
1000
mg
V1
Volume titrasi contoh
mL
V2
Volume titrasi blanko
mL
N
Normalitas HCl
grek/L
BST
Bobot atom nitrogen
Fish Bond V1
14,007
V2
BST
kal efek T
gram/grek
kal efek T
Kadar Protein (%) kal
W
N
PM
Rumus
1. Rumus penentuan ketidakpastian asal penimbangan (W)
Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi neraca yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam gram k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian kalibrasi neraca
2. Rumus penentuan ketidakpastian asal penimbangan ( N)
Keterangan : adalah ketidakpastian Normalitas HCl yang dinyatakan dalam N k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan 95% dari ketidakpastian Normalitas HCl yaitu 2 3. Rumus penentuan ketidakpastian baku asal BST (BST)
∑
Keterangan : (berat molekul) adalah ketidakpastian dari berat molekul protein, yang dinyatakan dalam gram/grek k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian berat molekul
× × ℎ √ ℎ
4. Rumus penentuan ketidakpastian asal buret (V2)
Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi buret yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam mL adalah besar koefisien muai air yang dinyatakan dalam °C-1 adalah volume rata-rata HCl yang diturunkan dari buret saat titrasi blanko, yang dinyatakan dalam mL adalah besar selisih suhu ruangan tempat dilakukannya penetapan kadar dengan suhu optimum penggunaan buret pada sertifikat, yang dinyatakan dalam °C k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian
× × ℎ 1 √
5. Rumus penentuan ketidakpastian asal buret (V1)
Keterangan :
adalah ketidakpastian dari hasil kalibrasi buret yang terdapat pada sertifikat, yang dinyatakan dalam mL
ℎ
adalah besar koefisien muai air yang dinyatakan dalam °C-1 adalah volume rata-rata HCl yang diturunkan dari buret saat titrasi sampel, yang dinyatakan dalam mL adalah besar selisih suhu ruangan tempat dilakukannya penetapan kadar dengan suhu optimum penggunaan buret pada sertifikat, yang dinyatakan dalam °C k adalah konstanta dari tingkat kepercayaan dari ketidakpastian
∑ =
6. Rumus penentuan ketidakpastian asal Presisi Metode (PM)
∑ − = √ − % ×%
Keterangan : xi adalah nilai kadar protein dalam sampel yang didapat dari penetapan, yang dinyatakan dalam % n adalah banyaknya pengulangan PM adalah nilai rata-rata kadar protein dalam sampel dari penetapan, yang dinyatakan dalam % PM adalah nilai simpangan baku dari penetapan kadar protein dalam sampel, yang dinyatakan dalam % 7. Rumus penentuan ketidakpastian gabungan (CSx)
× 1
Keterangan : CSx adalah rata-rata kadar protein dalam mi instan, yang dinyatakan dalam % W adalah nilai rata-rata penimbangan sampel, yang dinyatakan dalam gram BST adalah berat molekul protein yang dinyatakan dalam gram/grek V1 adalah nilai rata-rata Volume HCl 0,1 N yang diturunkan dari buret saat titrasi sampel, yang dinyatakan dalam mL V2 adalah nilai rata-rata Volume HCl 0,1 N yang diturunkan dari buret saat titrasi blanko, yang dinyatakan dalam mL PM adalah rata-rata kadar protein, yang dinyatakan dalam % N adalah nilai Normalitas HCl
2×
8. Rumus penentuan ketidakpastian yang diperluas (U)
9. Pelaporan kadar protein dalam mi instan (CSx U) %
Syarat keberterimaan estimasi ketidakpastian adalah U < 10% nilai uji
