Facultad de Veterinaria Universidad de Zaragoza
Métodos en Biotecnologí a CULTIVOS CELULARES I.I.- PRINCIPIOS Y MÉ MÉTODOS BÁ BÁSICOS II.- TÉCNICAS Y APLICACIONES Ana Isabel Alcalde José Emilio Mesonero
TEMARIO 1.- Monitorización animal
2.- Cultivo celular I 3.- Cultivo celular II 4.- Separaci ón celular 5.- Viabilidad celular 6.6.- Clonació Clonación, transformació transformaci ón y transfecció transfecci ón 7.7.- PCR, tipos. Secuenciaci Secuenciación 8.- Separaci ón de prote í nas nas y prote í nas nas recombinantes 9.9.- Western, Southern, Southern, Northern blot y marcaje radioactico 10.10.- Inmunohistoquí Inmunohistoquí mica, mica inmunocitoquí mica mica, inmunocitoquí mica y enzimoinmunoensayo
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Bibliograf í ía • Cultivo de células animales. Morgan and Darling. Darling. (Ed Acribia) Acribia) • Casas comerciales: Sigma (www.Sigma-Aldrich.com) Invitr Invitroge ogenn (www.invitrogen.com)
• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/tecnicas_ de_cultivo_celular.htm • http://www.protocolonline.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/
http:// www.unizar.es www.unizar.es / depfarfi depfarfi / / unidad_fisiologia unidad_fisiologia / DOCENCIA METODOS EN BIOTECNOLOG ÍA TEORÍA PROGRAMA CULTIVOS CELULARES I Y II
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Bibliograf í ía • Cultivo de células animales. Morgan and Darling. Darling. (Ed Acribia) Acribia) • Casas comerciales: Sigma (www.Sigma-Aldrich.com) Invitr Invitroge ogenn (www.invitrogen.com)
• http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/tecnicas_ de_cultivo_celular.htm • http://www.protocolonline.org/prot/Cell_Biology/Cell_Culture/
http:// www.unizar.es www.unizar.es / depfarfi depfarfi / / unidad_fisiologia unidad_fisiologia / DOCENCIA METODOS EN BIOTECNOLOG ÍA TEORÍA PROGRAMA CULTIVOS CELULARES I Y II
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CULTIVOS CELULARES I.- PRINCIPIOS Y MÉTODOS BÁSICOS
INTRODUCCIÓN
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Concepto de cultivo celular Conjunto de té técnicas que permiten el mantenimiento de las células “in vitro” vitro”, conservando el má máximo de sus propiedades fisioló fisiológicas, bioquí bioquí micas micas y gené genéticas
Evolución histórica 1885 células de embrió embrión de pollo 1907 médula espinal embrionaria de anfibios 1916 tripsina para disociar las cé células 19201920-1940 esterilidad y antibió antibióticos 1952 primera lí lí nea nea celular estable (HeLa (HeLa,, Henrietta Lacks, Lacks, tumor cervix) cervix)
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/
European Collection of cell of cell cultures: http:// www.ecacc.org.uk www.ecacc.org.uk
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Aplicaciones del cultivo celular
, Efecto proteí proteí nana-proteí proteí na) na)
Áreas de investigación en las que son útiles los cultivos celulares - Fisiologí a y biologí a celular - Virologí a - Investigación del cáncer - Inmunologí a (Ac monoclonales) - Ingenierí a de proteí nas nas (sí ntesis) ntesis) - Aplicaciones diagnósticas - Aplicaciones médicas (tejidos para transplante) - Aplicaciones industriales y agronómicas
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VENTAJAS
DESVENTAJAS
- Control preciso del medio
- Técnica sensible (asepsia)
ambiente extracelular - Cantidad y coste - Homogeneidad de la muestra - Inestabilidad (pasajes) - Economí - Validez del modelo “in vitro” Economí a vitro” (ECVAM - Motivaciones éticas European Center for Validation of Alternative Methods, Methods, etc)
ASPECTOS TÉCNICOS
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Tipos de cultivos - Órganos - Explantes primarios - Cultivo celular
Métodos de separación celular • Centrifugación • Capacidad de adherencia al vidrio o plástico • Mediante unión a anticuerpos especí ficos ficos para determinados componentes celulares • Unión a anticuerpos acoplados a marcaje fluorescente • Microdisección de captura por láser
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Separació Separación de cé células marcadas por fluorescencia utilizando lá láser y campo eléctrico
Biologí a de la célula en cultivo
1.- Selección por disgregaci ón, adhesi ón y proliferaci ón 2.- Selección por tasa de crecimiento hasta confluencia
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EQUIPAMIENTO Y PRÁCTICA GENERAL
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EQUIPAMIENTO BÁSICO: - CABINA DE CULTIVO CELULAR - ESTUFA - INCUBADOR DE CO 2 - MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES INVERTIDO - CENTRÍFUGAS - AUTOCLAVE - CONGELADORES - INSTALACIONES DE CRIOGENIA (N 2 LÍQUIDO) - PIPETEADORES
CABINA DE CULTIVO CELULAR
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ESTUFA - INCUBADOR DE CO2
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES INVERTIDO
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PIPETEADORES
MATERIAL PLÁSTICO
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MEDIOS DE CULTIVO Caracterí sticas: sticas: Medio nutritivo tamponado e isotónico Composición: Sales inorgánicas (Ca2+ y Mg2+) Fuente de energí a y aminoácidos Suplementos : Suero, glutamina y antibióticos
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO BME DMEM RPMI
Medio básico Eagle Medio de Eagle modificado por Dulbecco Medio para cultivo de células en suspensión
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Tipos de lí neas neas celulares establecidas 1.- Adherentes: derivadas de órganos músculo hí gado gado células nerviosas epitelios renal e intestinal origen neuronal 2.- Suspensión: células inmunitarias a.- Células primarias (cultivo primario y lí nea nea primaria) b.- Células inmortales c.- Células transformadas
CULTIVOS PRIMARIOS Y LÍ NEAS NEAS PRIMARIAS Cultivo primario. Cultivo establececido a partir de un tejido u órgano. Las células mantienen la viabilidad un periodo de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo. En general en cultivo presentan una reducción en el número total de células vivas a lo largo del tiempo. Ejemplos : hepatocitos obtenidos de hígado adulto, neuronas, etc... Línea primaria. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células en el cultivo. Ejemplos : fibroblastos dérmicos, queratinocitos, células endoteliales de aorta bovina (BAEC), células endoteliales de cordón umbilical (HUVEC), etc...
Línea inmortal. Cultivo establecido mediante células que pueden proliferar indefinidamente para lo cual se manipulan genéticamente con el fin de hacerlas inmortales.
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Cultivo primario
Lí Lí nea nea primaria
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Cultivo primario / linea primaria y linea estable Finita Diploide / Euploide Normal NoNo-tumorogé tumorogénica Si Si
Continua Heteroploide / Aneuploide Transformada Tumorogé Tumorog énica No No
Si
No
Mantenimiento
Cí clico clico
Requerimientos de suero Eficiencia de clonaje
Elevados Baja Pueden expresar marcadores especificos Se mantienen Baja (24 a 96 h tiempo de replicació replicación) Bajo (<10E6 cé células/ ml, <10E5 cél/cm2)
Posible mantenerlas quiescentes Bajos Elevada Cromosomales , enzimá enzimáticos.. se pierden Se suelen perder
Ploidia Transformaci ón Tumorogenicidad Dependencia de anclaje Inhibici ón por contacto Limitació Limitación de de crecimiento por densidad
Marcadores Funciones especializadas Tasa de crecimiento Rendimiento en cultivo
Rápida (12 a 24 h) Alto (>10E6 cél/ml, >10E5 cél/cm2)
PROTOCOLO BÁSICO Extracció Extracción del órgano o discriminació discriminación tisular
Disgregación celular mec ánica y enzim ática (tripsina)
Selección por centrifugaci ón
Siembra y mantenimiento del cultivo
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1.- Métodos de aislamiento: especí ficos ficos de cada tipo celular
A.- Aislamiento de fibroblastos de pollo - 1010-12 embriones - Se extrae el embrió embrión y se eliminan los órganos internos y la cabeza - Trituració Trituración y agitació agitación con tripsina - Centrifugació ó n Centrifugaci y el precipitado se resuspende con SFB y medio - Incubació Incubación en hielo para dispersió dispersión mecá mecánica - Filtració Filtración con tamiz y se centrifugan y el precipitado se resuspende en DMEM DMEM y 10%SFB - Recuento y siembra
1.- Métodos de aislamiento: especí ficos ficos de cada tipo celular
B.B.- Aislamiento de hepatocitos de pollo (supervivencia corta) - Disgregar el hí hí gado gado por digestió digestión enzimá enzimática y EDTA (perfusió (perfusión) - Extracció Extracción y corte mecá mecánico - Centrifugació Centrifugación y el precipitado contiene alta tasa de hepatocitos (Separació (Separación de hepatocitos de cé células de Kupffer, Kupffer, endoteliales y biliares) - Lavado y recuento de hepatocitos y siembra
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2.- Inmortalización de células primarias A.- Transfección con genes inmortales (oncogenes de origen ví rico) rico) gen T grande SV40 (antí geno geno T), virus DNA de 5Kb
Induce la sí ntesis ntesis de DNA y la replicación en células quiescentes
Problema: ¿siguen siendo el mismo tipo celular?
Fibroblastos humanos
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Células en cultivo. A) Micrografías de contraste de fase de fibroblastos en cultivo. B) Micrografías de mioblastos en cultivo mostrando las células fusionadas para formar células musculares multinucleadas. C) Células precursoras de oligodendrocitos en cultivo. D) Células de tabaco en cultivo
QUERATINOCITOS
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HEPATOCITOS DE RATA
HEPATOCITOS DE PERRO
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HEPATOCITOS DE MONO
HEPATOCITOS HUMANOS
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EPITELIO PIGMENTARIO HUMANO DE LA RETINA
CELULAS ENDOTELIALES DE CORDON UMBILICAL HUMANO
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CELULAS DE MUSCULATURA LISA HUMANA
LÍ NEAS NEAS CELULARES CONTINUAS
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Protocolo de manejo 1.1.- Preparaci Preparación - Acondicionar la cabina (esterilidad: UV) - Medios de cultivo y suplementos a 37º 37ºC - Material plá plástico al alcance de la mano
2.- Control de los cultivos celulares - Observar el color del medio del cultivo (amarillento, rojo pú púrpura, turbidez) (tapiz, grado de confluencia, etc) - Observació Observación al microscopio (cé (células redondas y membranas lisas)
Protocolo de manejo
3.3.- Disgregació Disgregación y Recuento de cé c élulas - Cámara de Neubauer - Dilució Dilución con Tripá Tripán azul
Recuento Viabilidad
-Células en suspensió suspensión:
Dilució Dilución 1:1 con Tripá Tripán Azul
- Células adherentes:
Lavado con PBS TripsinaTripsina-EDTA Medio y centrifugació centrifugación Resuspensió Resuspensión Tripan azul 2:1
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SECUENCIA DE DESPEGUE DE LAS CÉ CÉLULAS
Cuadrí cula cula de la cámara de Neubauer
Nº de cé células = 10.000 x dilució dilución x cé células contadas
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Protocolo de manejo
4.4.- Subcultivo de cé células - Células en suspensió suspensión: 105 /ml /ml-8x105 /ml
- Células adherentes entre 2,5x105 y 5x105 para una caja de 25 cm2
y entre 4x10-4 y 5x104 /pocillo en una caja de 24 pocillos
Tabla de guí a para la siembra recipiente
Placa 90 mm Placa 60 mm Placa 35 mm 24 pocillos 12 pocillos 6 pocillos Frasco 25 cm2 Frasco 75 cm2 Frasco 162 cm2
Área de Número de Volumen crecimiento células de medio adherentes cm2 ml 6 x 10 49 1 10 21 0.4 5 8 0.15 3 2 0.04 1 4.5 0.09 2 9.6 0.2 3-4 25 0.5 5-10 75 1.5 1515-30 162 3 3030-50
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Congelación de las células de un determinado pasaje Material:
Viales de crioconservación (2 ml) Glicerol (concentraci ón final 10%) Medio de cultivo con SFB elevado (30%)
Concentración celular:
entre 1 y 3 x10 6 células/1,5 ml
Protocolo de manejo manejo
5.- Elaboración de una curva de crecimiento
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Protocolo de manejo manejo
5.- Elaboración de una curva de crecimiento
Lí neas neas celulares derivadas de gliomas humanos. Caracterizaci ón inmunofenotí pica pica y molecular
LN405, PGFA+
H4, PGFA -
PGFA
T98, p53 +
H4, p53 -
p53
T98, EGFR +
SW1783, EGFR +
EGFR
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3T3-SA FIBROBLASTOS DE RATÓN
3T3-L1 FIBROSBLASTOS DE RATÓN
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M6 CARCINOMA DE COLON
MDCK EPITELIO INTESTINAL DE PERRO
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SH-SY5Y NEUROBLASTOMA
HepG2-HEPATOMA
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Células COS (riñón mono)
CHO-K1 (Ovario de hamster chino)
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