TEMA 6. CULTIVOS CELULARES ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………….…… 2 2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES ………………………………………….….. 3 2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares …………………………………….. 3 2.2 Tipos de cultivos celulares ……………………………………………………… 4 2.4 Tipos especiales de cultivos celulares ……………………………………………6 2.4.1 Cultivos de células madres …….……………………………………… 6 2.4.2 Hibridomas …………………….……………………………………… 7 2.5 Ventajas e inconvenientes del uso de cultivos celulares en experimentación ……8 2.6 Morfología y tipos de crecimiento de las células de cultivo …………………….. 9 2.7 Fases de cultivo celular …………………………………………………………. 10
3. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS EN CULTIVO …………………………………... 10 4. FUENTES CONSULTADAS ………..………………………………………………… 11
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1- INTRODUCCIÓN La técnica de cultivos celulares se comenzó a utilizar a principios de este siglo como un método para estudiar el comportamiento de las células animales o vegetales sin la influencia de las múltiples variables que implicaba un organismo entero. Desde entonces dichas técnicas han sido mejoradas, extendidas y aplicadas por un número creciente de biólogos y actualmente son muy utilizadas en investigación médica y biológica. Se entiende por cultivo
celular un conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de
células in vitro , preservando al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas. Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: de órganos, de explantes, cultivos primarios o secundarios... Podemos dividir el
cultivo de tejidos en dos grupos de técnicas:
El cultivo de órganos: se puede definir como el mantenimiento de fragmentos de tejidos u órganos completos in vitro . Este tipo de cultivos mantienen la estructura tridimensional del tejido u órgano pero no proliferan, por lo tanto es necesario partir en cada experimento de nuevo material animal lo que conlleva una elevada heterogeneidad. Explantes primarios: son fragmento de tejidos u órganos que se adhieren a una superfície y la que proliferan las células de la periferia del explante. El cultivo de células: supone una disgregación celular del tejido u ógano original. La suspensión celular obtenida puede ser cultivada tanto en suspensión como en monocapas sobre cristal o plástico. Por lo tanto en este tipo de cultivos se pierde la organización espacial tridimensional propia del tejido original, las interacciones entre distintos tipos celulares y entre las células y la matriz extracelular y las células carecen de los componentes sistémicos de regulación implicados en la regulación de la homeostasis “in vivo”, especialmente los sistemas nervioso y endocrino. Además se pierde la heterogeneidad celular de partida. La mayoría de células animales y vegetales pueden vivir, proliferar e incluso diferenciarse si se las cultiva en placas de plástico y con medios de cultivo adecuados. En estas condiciones las células en cultivo se han convertido en una herramienta ampliamente utilizada en biología molecular y celular, proporcionando un excelente sistema modelo para diferentes estudios, como por ejemplo: •
Investigar el comportamiento fisiológico y/o bioquímico de las células. Por ejemplo
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estudios del metabolismo celular, envejecimiento, interacción y señalización celular. •
Testar el efecto de diferentes drogas o compuestos químicos sobre un tipo de células en concreto (normales o tumorales) para analizar su posible efecto tóxico, carcinogénico o terapéutico.
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Estudios biotecnológicos de generación de tejidos artificiales.
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Estudios de producción de agentes biológicos útiles, producidos por cultivos celulares a gran escala (bioreactores), como por ejemplo: vacunas, anticuerpos monoclonales o proteínas terapéuticas producidas por cultivos celulares genéticamente manipulados.
2. CULTIVOS DE CÉLULAS ANIMALES 2.1 Métodos de obtención de cultivos celulares. El primer paso para obtener células aisladas de un mismo tipo a partir de un tejido u órgano, consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para ello es necesario tratar la muestra con diversas enzimas proteolíticas que degradarán las proteínas de la matriz (por ej. tripsina y colagenasa) y con agentes quelantes que secuestran calcio (como el EDTA, acido etilendiaminotetraacètico), del cual depende la adherencia celular. De esta forma y mediante una agitación suave se conseguirá una suspensión de todas las células del tejido. El siguiente paso consiste en la separación de los distintos tipos celulares del tejido. Para ello se pueden usar varios métodos: - Por centrifugación, que permite separar las células por tamaño. - Según su capacidad de adherencia al vidrio o plástico. - Mediante anticuerpos específicos contra determinados componentes celulares de membrana. Estos anticuerpos pueden estar conjugados a una matriz o soporte sólido permitiendo su separación por inmunoprecipitación o cromatografía de afinidad, o bien con anticuerpos marcados con fluorescencia permitiendo su selección por citometría de flujo (ver Tema 55). - Por microdisección de captura por láser (LCM). Esta metodología consiste en la disección de un grupo de células a partir de una sección de tejido preparada para microscopía. La región que contienen las células de interés es irradiada con un láser y posteriormente trasnferidas a un contenedor para su posterior análisis. Esta metodología es muy utilizada para el aislamiento 3
de células tumorales de un tejido.
2.2 Tipos de cultivos celulares. Se distinguen tres tipos principales de cultivos celulares: Es importante diferenciar los siguientes conceptos: •
Cultivo Primario: se denominan así aquellos cultivos obtenidos directamente por tripsinización del tejido original. Pueden iniciarse sin o con fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En este tipo de cultivos las células aisladas se mantienen vivas y conservan sus características originales pero su proliferación es limitada. En estas condiciones las células pueden mantenerse hasta su confluencia pudiendo entonces subcultivarse para la obtención de cultivos secundarios. Aunque potencialmente se puede obtener un cultivo primario a partir de cualquier tipo de tejido, normalmente los tejidos embrionarios y tumorales dan los mejores resultados, debido a que su grado de diferenciación es menor y su capacidad de división mayor. Es importante diferenciar entre:
Cultivo primario. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano. Estas células mantienen su viabilidad un período de tiempo limitado y no se reproducen en cultivo.
Línea primaria. Cultivo a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con capacidad de proliferar en el cultivo. Por ejemplo: fibrobalstos dérmicos, células endoteliales del cordón umbilical (HUVEC), etc… •
Cultivo Secundario: Si uno o varios tipos de células de un cultivo primario se resiembran (sub-cultivo), el cultivo obtenido se denomina cultivo secundario. En este caso
la heterogeneidad celular es menor y puede seleccionarse que células se desarrollarán mediante el cultivo con medios selectivos. •
Líneas celulares: son las que se obtienen por sub-cultivo y selección de cultivos secundarios. 4